專利名稱：一種分子物質(zhì)連接的方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及一種使用銜接頭片段將兩個或更多個分子物質(zhì)連接起來的方法，該銜接頭(adapter segments)片段引起基于富含脯氨酸的氨基酸序列與WW型蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域片段之間的親和力而產(chǎn)生的定向作用。發(fā)明范圍和現(xiàn)有技術(shù)狀況在生物技術(shù)和醫(yī)藥研究、開發(fā)和應用領域中經(jīng)常遇到兩個或更多的分子物質(zhì)之間相互作用的問題。特別是作為分子物質(zhì)的兩個或多個蛋白質(zhì)或肽之間的相互作用通常因此受到考慮。這些相互作用通常作為生物化學和細胞生物學研究的一部分予以探究，例如，細胞外通訊和細胞內(nèi)通訊、分子水平信號轉(zhuǎn)導或蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)相互作用分析(除了別的以外，，使用雙雜交系統(tǒng)及其衍生方法)。而且，生物分子的締合，特別是兩個或更多個蛋白質(zhì)分子在體外合成融合蛋白，對許多生物技術(shù)方法具有重要意義。用這樣方法生產(chǎn)的融合蛋白，如異源雙功能(二價的)抗體(所謂“雙體”(diabodies)；參見，O.Perisic，P.A.Webb，P.Holliger，G.Winters &R.L.Williams，一種雙體——二價抗體片段的晶體結(jié)構(gòu)，Structure 2，pp.1217-1226，1994)，其包含了兩個不同抗體的結(jié)合域(Fab/Fv/scFv片段)。因此，舉例而言，如果抗體的兩個價分別針對腫瘤細胞或自然殺傷細胞，那么雙價雜交融合蛋白于是就可以介導殺傷細胞附著于腫瘤細胞。就免疫毒素來說，抗體結(jié)合了毒性物質(zhì)，細胞毒素借助特異的抗原抗體相互作用進入預定細胞類型(參見M.A.Ghetie &E.S.Vitetta，免疫毒素治療的新進展，Curr.Opin.Immunol.6，707-714，1994)。
在多種蛋白質(zhì)的融合結(jié)構(gòu)或集合體的幫助下，基本上來說任何效應物可以與其它效應物結(jié)合，利用與抗原的適當相互作用或其他生物效應，一個雜交分子可以獲得兩種功能或特性。關(guān)于此點已報道很多實例(J.P.McGrath，X.Cao，A.Schutz，P.Lynch，T.Ebendal，M.J.Coloma，S.L.Morrison & S.D.Putney，神經(jīng)生長因子與一種運鐵蛋白抗體之間的雙功能融合，J.Neurosci.Res.47，123-133，1997；J.M.Betton，J.P.Jacob，M.Hofnung，J.K.Broome-Smith，通過在麥芽糖糊精結(jié)合蛋白中插入β-內(nèi)酰胺酶產(chǎn)生一種雙功能蛋白，Nat.Biotechnol.15，1276-1279，1997；Y.Maeda，H.Ueda，T.Hara，J.Kazami，G.Kawano，E.Suzuki & T.Nagamune，在哺乳動物細胞中表達一種雙功能嵌合蛋白——A-Vargula hilgendorfii螢光素酶，Biotechniques 20，116-121，1996；W.Wels，I.M.Harwerth，M.Zwickl，N.Hardman，B.Groner & N.E.Hynes，一種定向于人erbB-2受體的雙功能單鏈抗體-磷酸酶融合蛋白的構(gòu)建、細菌表達及特性描述，生物工藝學(Biotechnology)(紐約)10，1128-1132，1992)。
異源雙重功能結(jié)構(gòu)通常是通過基因水平上合成融合蛋白而產(chǎn)生。這一般以兩組分間的合適的連接元件(接頭)，以及多肽鏈的可及末端為前提。但在有些不利情況下，組分間融合會導致融合產(chǎn)物失去活性，例如因為融合蛋白不能形成正確的三維折疊拓撲結(jié)構(gòu)。所以，通常值得在體外進行兩種融合組分的連接，更確切地說，是在兩種組分分別合成和折疊之后進行。舉例而言，這種方法也使得單一元件的多種結(jié)合的快速產(chǎn)生和分析成為可能，而不需要每次構(gòu)建新的遺傳結(jié)構(gòu)。對于這些組分的融合而言，銜接頭片段是必需的。通過銜接頭片段，有關(guān)組分間的融合或定向締合過程與其產(chǎn)品分離開來。而且，因此銜接頭元件(結(jié)構(gòu)域或肽序列)必須與有關(guān)組分緊密結(jié)合，并且它們的專一性不能發(fā)生改變。
在其他應用中，希望在兩種分子之間形成短暫但強烈的的相互作用。所以，肽和小的蛋白結(jié)構(gòu)域具有特別重要的作用，因為在蛋白質(zhì)的重組生產(chǎn)過程中，它們可以相對容易地安插在想得到的目的蛋白上。這一方法的應用在于，例如，通過特異的結(jié)合片段純化重組產(chǎn)生的蛋白質(zhì)。通常在鎳螯合柱上結(jié)合一種多聚組氨酸肽片段(參見P.Hengen，從大腸桿菌中純化His-Tag融合蛋白，trends Biochem.Sci.20，285-286，1995)，或在鏈霉親合素上結(jié)合一個稱作Strep-Tag的肽片段(T.G.Schmidt，J.Koepke，R.Frank & A.Skerra，Strep-Tag親和肽與其同源目的物，鏈霉親合素之間的分子間相互作用，J.Mol.Biol.255，753-766，1996)。然而，組氨酸標記法(His-Tag)存在一個缺點，即，多聚組氨酸多肽片段只能與含有鎳離子的結(jié)構(gòu)結(jié)合；而兩個天然蛋白質(zhì)或肽的連接不能使用這種方法。所以，對分子物質(zhì)的連接而言，該方法是不適用的，或者只在例外情況下適用。在用這種方法純化的制劑中，人們也常常在其溶液中發(fā)現(xiàn)鎳離子，這使得這種系統(tǒng)在醫(yī)藥治療應用中不引人注意。對于Strep-標記法(Strep-Tag)，具有結(jié)合作用的組分中介導結(jié)合的區(qū)域相對較大，所以由于空間原因，這種方法不適于多種連接。另外，抗生物素蛋白與鏈霉親合素都含有4個結(jié)合位點，因而在溶液中很難控制兩個不同連接分子物的形成。
除了以這樣的一種方式用于純化標記蛋白外，將蛋白質(zhì)固定在固態(tài)惰性基質(zhì)上也具有很高的的生物技術(shù)重要性，例如在基質(zhì)上將蛋白質(zhì)再折疊以阻止折疊中的聚集過程(參見G.Stempfer，B.Holl-Neugebauer & R.Rudolph，對一種固定化融合蛋白的改良再折疊，Nat.Biotechnol.14，329-334，1996)，或者在生物反應器中酶的固定化。然而，上述方法中提到的到現(xiàn)在為止仍使用的聚離子序列存在一個缺點，即，它們的相互作用嚴重地受到了聚離子存在的干擾，如溶液中的DNA，或者也因為多種可溶性添加劑。
本發(fā)明的目的是提供一種不存在現(xiàn)有技術(shù)上述缺點的一種分子物質(zhì)連接方法。
根據(jù)本發(fā)明，通過基于權(quán)利要求1所述的越過銜接頭片段將兩個或多個分子物質(zhì)相互連接的方法，達到了此目的，其特征在于分子物質(zhì)之一以這樣的一種方式修飾，即，它，至少在其一個區(qū)域作為銜接頭片段，展示一個WW結(jié)構(gòu)域或其衍生結(jié)構(gòu)，另一種分子物質(zhì)以這樣的一種方式修飾，即，它，至少在其一個區(qū)域作為銜接頭片段，展示一個與WW結(jié)構(gòu)域或其衍生結(jié)構(gòu)結(jié)合的富含脯氨酸序列，通過WW結(jié)構(gòu)域或其衍生結(jié)構(gòu)與富含脯氨酸序列的締合，分子物質(zhì)相互間產(chǎn)生相互作用從而實現(xiàn)彼此鍵聯(lián)。
實施本發(fā)明的有利方式公開在所附的權(quán)利要求書及說明書中。發(fā)明概述將兩個或更多不同的分子物質(zhì)(分子種類)連接為一個融合結(jié)構(gòu)，通常是異源雙功能結(jié)構(gòu)，是一種具有重要生物技術(shù)與制藥價值的方法。通常，作為本發(fā)明所適應用的一部分，蛋白質(zhì)和(或)多肽是被用作連接的分子種類，因為本發(fā)明中的銜接頭片段也源于這類化學物質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明，其它具有本發(fā)明中銜接頭片段之一的分子物質(zhì)也是可以使用的。例如，與本發(fā)明一致，一種分子物質(zhì)可以通過特定銜接頭片段加載到一種固態(tài)基質(zhì)上。在多數(shù)情況下，被連接的兩種物質(zhì)必須相互穩(wěn)定、共價地連接起來。相反地，在某些應用中，也期望兩種分子種類之間的相互作用是在有限的時間里，并且可以很快再次解離，例如通過引入添加劑。仍在另外的一些應用中，一種分子物質(zhì)必須固定化一段時間，從而以專一性的方式與基質(zhì)發(fā)生作用，例如在重組蛋白質(zhì)的生產(chǎn)中用于從細胞粗提液中純化蛋白，或用于蛋白質(zhì)的介質(zhì)支持再折疊。本方法正適合于這些應用。
基于本發(fā)明，例如，一種蛋白質(zhì)可以直接包裝于類似病毒外殼的內(nèi)部，或者是兩個或更多不同蛋白質(zhì)可以連接成為一個具有新特性的嵌合蛋白，例如雙價抗體。類似地，這種相互作用還可以用于一種分子物質(zhì)的固定化，例如，用于從混合物中分離這種物質(zhì)。
除了通過銜接頭片段，基于WW結(jié)構(gòu)域與富含脯氨酸序列間的相互作用的連接以外，還可以發(fā)生分子物質(zhì)間的共價鍵連接。這種共價連接例如，通過在兩種分子物質(zhì)的適宜位點人為引入半胱氨酸從而產(chǎn)生二硫鍵，從而在兩種分子物質(zhì)之間產(chǎn)生穩(wěn)固連接。通過二硫鍵，可以產(chǎn)生在生理及各種普通溶劑條件中穩(wěn)定存在的雙功能融合分子，因而也可用于醫(yī)藥、治療、診斷及生物技術(shù)過程。
上述本發(fā)明的可能應用形式也在

圖1中以示范形式給出。
遵照本發(fā)明實現(xiàn)兩種或更多種分子物質(zhì)連接時，應用了被稱為WW結(jié)構(gòu)域的蛋白片段與富含脯氨酸肽序列(在由2至6個氨基酸組成的短肽連續(xù)片段中脯氨酸含量超過50％)。當它們在一起孵育時，這兩種分子表現(xiàn)出非常強的相互作用(解離常數(shù)KD為20至100nM)。兩部分的緩慢解離導致這種相互作用最初是暫時有效的事實。如果不希望這樣，可以通過在結(jié)合組分上引入二硫鍵進行固定來防止解離。人為地將半胱氨酸引入兩個銜接頭片段的適宜位點或銜接頭片段區(qū)。在組分締合之后，通過選擇合適的氧化還原條件氧化半胱氨酸對，以這種方式使組分相互穩(wěn)定地共價結(jié)合。產(chǎn)生的雜交融合蛋白表現(xiàn)出各個組成分子的基本特性。
WW結(jié)構(gòu)域是一個小的球狀蛋白結(jié)構(gòu)域，通常包含30至40個氨基酸(參見M.Sudol，WW結(jié)構(gòu)域與多聚脯氨酸的結(jié)合及其與人類疾病的相關(guān)性，Exp.& Mol.Medicine 28，65-69，1996)，但是，也已知它的截短變體。WW結(jié)構(gòu)域?qū)Ω缓彼岬呐潴w具有很高的自然親和性，它們結(jié)合時的解離常數(shù)為20-100nM。富含脯氨酸的配體是一個脯氨酸含量大于50％，具有與5至15個氨基酸結(jié)合所必須的最短長度的片段，藉此，通常這種直接的相互作用發(fā)生在一個有2至6個氨基酸(脯氨酸含量大于50％)的局部片段中。因此，天然配體幾乎只是其氨基酸序列中包含富含脯氨酸片段的蛋白質(zhì)，而富含脯氨酸的肽也是WW結(jié)構(gòu)域的專一性配體。
WW結(jié)構(gòu)域得名于觀察資料，即，在間隔20至22個氨基酸的區(qū)域內(nèi)存在兩個保守的色氨酸殘基(簡寫為WW)；第二個色氨酸與一些同樣保守的重要的疏水性氨基酸從而形成了富含脯氨酸配體的結(jié)合口袋。在第二個色氨酸之后，間隔2個氨基酸之處，常有一個保守的脯氨酸。已知一系列不同類型的WW結(jié)構(gòu)域，它們目前被分為4類，并且互不相同，特別在優(yōu)先結(jié)合的肽配體方面。原則上，WW結(jié)構(gòu)域可以同SH3-結(jié)構(gòu)域(在結(jié)構(gòu)上不具有相關(guān)性)競爭結(jié)合富含脯氨酸配體，但是SH3-結(jié)構(gòu)域的配體表現(xiàn)出偏差共有序列，所以，與WW結(jié)構(gòu)域?qū)Ｒ恍越Y(jié)合的富含脯氨酸配體可以衍生而來。而且，WW結(jié)構(gòu)域與富含脯氨酸配體的結(jié)合通常強于SH3結(jié)構(gòu)域與之的結(jié)合。下表舉出了WW結(jié)構(gòu)域蛋白的類型及其配體結(jié)合特性的概況。
*與富含脯氨酸序列(脯氨酸含量大于50％)直接臨近的部位，例如，通過I型WW結(jié)構(gòu)域序列中的氨基酸變換L14W(14位亮氨酸變換為色氨酸)和H16G(16位組氨酸變換為甘氨酸)，可以實現(xiàn)將WW結(jié)構(gòu)域從I型轉(zhuǎn)化為II型，并將隨之產(chǎn)生關(guān)于富含脯氨酸的肽的專一性上的改變。I型的一種作用物結(jié)構(gòu)表明(Yes締合蛋白(Yes associated protein，YAP))這類WW結(jié)構(gòu)域包含一個由三條β-鏈組成的β-片層(參見M.Macias，M.Hyvonen，E.Baraldi，J.Schultz，M.Sudol，M.Saraste & Mr.Oschkinat，與富含脯氨酸肽形成復合體的WW結(jié)構(gòu)域之結(jié)構(gòu)，自然382，646-649，1996)。配體結(jié)合口袋是由β-片層的第二個β-鏈與第二個保守色氨酸合作形成。
WW結(jié)構(gòu)域的最主要的生物學作用明顯體現(xiàn)在細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導中。此外，已知WW結(jié)構(gòu)域直接或間接地與一些疾病有關(guān)，如遺傳性Liddle氏綜合征、肌肉萎縮癥與Alzheimers癥；所以，它們是一系列治療戰(zhàn)略的靶點。最后，WW結(jié)構(gòu)域在腎臟的胚期發(fā)育及逆轉(zhuǎn)錄病毒的細胞內(nèi)生命周期中發(fā)揮了生物學作用。
作為本發(fā)明的一部分，人們發(fā)現(xiàn)，吃驚的是，WW結(jié)構(gòu)域在通常的溶劑條件下可以形成一個穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)(折疊的拓撲結(jié)構(gòu))，即使它們是從原始的分子環(huán)境中分離出來遺傳融合進，或根據(jù)情況，融合到其他蛋白上，例如病毒外殼蛋白。例如，這將應用于來自非常小、只有31個氨基酸的形成素結(jié)合蛋白的WW結(jié)構(gòu)域，該WW結(jié)構(gòu)域在這些條件下形成穩(wěn)定結(jié)構(gòu)(折疊的拓撲結(jié)構(gòu))。令人注意的是，在有利條件下，將WW結(jié)構(gòu)域和絲氨酸與甘氨酸組成的接頭片段引入蛋白質(zhì)外部環(huán)，明顯地不會干擾該蛋白的折疊，也不會因此使WW結(jié)構(gòu)域的結(jié)合特性受到負面影響。并且可以表明這也應用于WW結(jié)構(gòu)域的變體，例如，在特定位點其氨基酸被替換為半胱氨酸。這同樣適用于WW結(jié)構(gòu)域衍生而來的附加結(jié)構(gòu)，例如，象幾個連續(xù)通過連貫結(jié)合而型成的WW結(jié)構(gòu)域，它們對連接的貢獻或是分別相加，或是在有利情況下是協(xié)作效應，截短或延長WW結(jié)構(gòu)域，甚或是根據(jù)應用需要，例如使其在富含脯氨酸序列上的結(jié)合比天然蛋白結(jié)構(gòu)域更強或更弱，讓WW結(jié)構(gòu)域帶有單個氨基酸的定點變換。舉例而言，使用當前的噬菌體展示技術(shù)方法通過相互作用篩選，就可以獲得這些被改變的WW結(jié)構(gòu)域。
內(nèi)部含有插入(即，在宿主蛋白多肽鏈的合適環(huán)形區(qū)域引入)或融合[分別位于宿主蛋白的N-端和(或)C-端]的WW結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)對富含脯氨酸序列表現(xiàn)出很高親合性。所以，這些富含脯氨酸序列可以與其他種蛋白質(zhì)、肽以及其它分子物質(zhì)融合。利用附加的相互作用部分(WW結(jié)構(gòu)域和富含脯氨酸序列)，于是可以實現(xiàn)任意兩種分子物質(zhì)的接觸。這種締合首要基于WW結(jié)構(gòu)域與富含脯氨酸配體所介導的疏水相互作用。但是，這種相互作用可以調(diào)節(jié)以便獲得更高專一性和靈活性，例如通過建立離子相互作用或在WW結(jié)構(gòu)域與富含脯氨酸配體間引入共價鍵。所以，通過引入附加的不同電荷性質(zhì)的氨基酸，或通過在銜接頭中或其附近引入點突變，富含脯氨酸配體與WW結(jié)構(gòu)域間的聚集可以加強或更加專一地結(jié)合。反過來，兩種成分間的共價二硫鍵可以使結(jié)合在那的銜接頭片段和分子物質(zhì)可能產(chǎn)生持久且牢固的結(jié)合。
遵照本發(fā)明，兩種以上分子物質(zhì)間的連接也是可能的。
相互作用的動力學參數(shù)，如解離常數(shù)(KD)，可以作為基于表面胞質(zhì)團共振測量法的相互作用測量研究的一部分而被確定。通過這些數(shù)據(jù)，可以看出WW結(jié)構(gòu)域與富含脯氨酸序列之間的相互作用基本上適合于本發(fā)明所述的應用領域。
銜接頭片段相互作用的性質(zhì)排除了異體雜交物的開發(fā)，這種物質(zhì)一部分帶有WW結(jié)構(gòu)域，一部分帶有富含脯氨酸序列。排除了產(chǎn)生同功能分子群(同型二聚體)的可能。利用可比參數(shù)與其他系統(tǒng)進行比較，所用WW結(jié)構(gòu)域突出地具有小而緊湊的優(yōu)點。因而它在很多應用中比其它配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(如脂質(zhì)運載蛋白和抗生成素)具有明顯的優(yōu)勢，如在抗原抗體相互作用中。
此外，可能表明，除了WW結(jié)構(gòu)域與富含脯氨酸序列之間相互作用以外，在WW結(jié)構(gòu)域中與富含脯氨酸的底物中的特定位點引入半胱氨酸，可被用于在締合組分間產(chǎn)生共價結(jié)合，從而使蛋白質(zhì)部分以穩(wěn)定連接方式融合到銜接頭片段上。這樣，即使在不利條件下，例如，非常高或非常低的鹽濃度，或生理極限溫度下，也不會造成相互連接組分的解離。為了達到這個目的，可以在一些位點如Asp8(按形成素結(jié)合蛋白FBP11在WW結(jié)構(gòu)域上的結(jié)合位點算起)或Lys19處替換為半胱氨酸。這些位點只選作例證；在WW結(jié)構(gòu)域的其它位點及其周圍，富含脯氨酸序列及其周圍，引入特異的半胱氨酸也是有用和成功的。
本方法的獨特優(yōu)勢在于，在另一方面，只有異源雙功能物(異二聚體)可以產(chǎn)生，由于WW結(jié)構(gòu)域與富含脯氨酸序列之間的強烈作用，起初只有兩種銜接頭片段的二者之間形成結(jié)合。接著，在氧化條件下形成二硫鍵，從而導致直接形成共價結(jié)合的異源物。由于締合形態(tài)中局部部位半胱氨酸濃度(近似值)很高，在較低還原性條件下，二硫鍵也可以成功形成，從而產(chǎn)生獨特特異性。相反，在隨機形成二硫鍵的情況下，就是說，不存在銜接頭片段相互間的必要的強親合性時(此非本專利所涉及的應用)，在氧化條件下將會以副產(chǎn)物的方式產(chǎn)生不合需要的兩種相互作用組份的同型二聚體。
本發(fā)明所述方法適用于在溶液中(體外)將任意作用組份連接起來，藉此，兩種組份的暫時和永久連接都是可能的。同樣地，本方法也可用于從混合物中專一地分離蛋白質(zhì)、肽或其他分子物質(zhì)，這些物質(zhì)都帶有兩種類型的銜接頭(WW結(jié)構(gòu)域或富含脯氨酸序列)中的一種。這可以通過與已經(jīng)共價結(jié)合各自作用組分的基質(zhì)可逆性的結(jié)合而實現(xiàn)。這種強結(jié)合如此有效使得在苛刻的溶劑條件下分子仍然附著在基質(zhì)上。因而，舉例而言，這種方法使快速有效的從細菌或真核細胞的細胞粗提液中純化重組蛋白成為可能，條件是重組分子(欲被純化的分子)以融合或插入方式帶有兩種銜接頭片段(WW結(jié)構(gòu)域或富含脯氨酸序列)之一，而與該銜接頭片段相對應的另一個銜接頭片段固定于固定相位。
同樣地，這種固定化方法適用于實施特定修飾或使固定在基質(zhì)上的蛋白質(zhì)發(fā)生再折疊，從而避免凝集過程。最后，借助本發(fā)明，也可能實現(xiàn)這些應用，其中分子物質(zhì)簡單且穩(wěn)定的固定化，例如，在生物傳感器或生物反應器中起了關(guān)鍵性作用(參見R.S.Phadke，生物傳感器與酶固定化電極，Biosystems 27，203-206，1992；M.Abdul-Mazid，生物催化和固定化酶/細胞生物反應器，生物反應器技術(shù)領域的前景技術(shù)，生物技術(shù)(Biotechnology)(紐約)11，690-695，1993)。
除了蛋白質(zhì)與多肽，本發(fā)明所述方法也可以應用于其它物質(zhì)。因而，肽衍生物、肽類抗生素、帶有修飾側(cè)鏈的蛋白質(zhì)，如熒光標記、烷基化、乙?；⒑瑤€基物質(zhì)的二硫化物混合物以及類似變化可以以相似方法予以應用。本方法也可以使用蛋白質(zhì)或肽與糖類、核酸或脂類成分的偶聯(lián)物。同樣地，核酸如DNA、RNA，核酶，人工合成核酸如肽核酸，或它們的雜交體可以與一種銜接頭片段連接，例如通過化學方法。這樣，它們同樣適合參與和類似作用組份的相互作用。對這些應用的唯一要求是所使用銜接頭片段之一的穩(wěn)定結(jié)合。
在本發(fā)明所涉及的應用領域中，抗體、抗體類似物、酶、結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)、病毒或噬菌體的殼粒均被特別地看作蛋白質(zhì)。
原則上，WW結(jié)構(gòu)域或富含脯氨酸序列及其衍生結(jié)構(gòu)的插入或附加于一個分子物質(zhì)可以發(fā)生在該分子物質(zhì)的任意位點，只要WW結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)不會因此受到本質(zhì)影響。如果可行，在使用合適的接頭片段時，如實施例1所述應用于PyVP1-WW150蛋白質(zhì)，實施附加或插入有一定優(yōu)點。在插入蛋白質(zhì)的情況下，有利于找到其中不存在像α-螺旋或β-片層這樣的周期性二級結(jié)構(gòu)成分的蛋白結(jié)構(gòu)區(qū)域。而在按照習慣定義存在轉(zhuǎn)角區(qū)或不規(guī)則螺旋區(qū)的蛋白結(jié)構(gòu)中插入WW結(jié)構(gòu)域或富含脯氨酸序列最有益。
兩種銜接頭片段的相互結(jié)合被認為存在幾種不同的物理作用。因而，疏水作用在穩(wěn)定這種相互作用的同時起到控制作用，這將在后面的實施例7中加以解釋。但是，其它作用形式也對結(jié)合有貢獻，如離子相互作用、偶極-離子相互作用、偶極-偶極相互作用、氫鍵、范德華力及分散力。最后，除了前面提到的非共價結(jié)合的范例以外，兩種分子物質(zhì)之間也可以發(fā)生共價連接。于是，相互作用組份的兩個原子之間產(chǎn)生化合的穩(wěn)定原子鍵，優(yōu)選的是兩個參與反應的半胱氨酸側(cè)鏈形成二硫鍵形式。
為了實現(xiàn)一種銜接頭片段(WW結(jié)構(gòu)域或富含脯氨酸序列)的固定化，基質(zhì)可被賦予電荷，例如，可以通過富含脯氨酸序列或WW結(jié)構(gòu)域的氨基端(與基質(zhì)的N-羥基琥珀酰亞氨酯結(jié)合)，或通過富含脯氨酸序列或WW結(jié)構(gòu)域內(nèi)的某一半胱氨酸的一個巰基(與基質(zhì)的碘乙酰胺基團結(jié)合)。基于現(xiàn)有技術(shù)，瓊脂糖及瓊脂糖衍生物、瓊脂糖顆粒、瓊脂糖凝膠、葡聚糖、糖類或類似聚合物都可以用作基質(zhì)。
本發(fā)明的應用在下面的實施例中予以說明，但是，本發(fā)明的保護范圍并不局限于此。
以下是本說明及實施例中參考的圖形。圖1、是本發(fā)明圖示。使用了基于富含脯氨酸序列與WW結(jié)構(gòu)域相互走用為基礎的銜接頭片段及及其衍生結(jié)構(gòu)。(a)兩種分子物質(zhì)A與B通過銜接頭片段的連接。(b)與(a)相似，為兩種分子物質(zhì)A與B的連接，但是增加了二硫鍵以便在組分間形成共價連接。(c)通過銜接頭片段(一種分子代表介質(zhì)或介質(zhì)的一部分)將一種分子物質(zhì)固定在基質(zhì)上(該分子代表基質(zhì)或基質(zhì)的一部分)。銜接頭片段可以附加在分子末端或以插入物形式結(jié)合。圖2、表示(a)通過SDS-PAGE方法，比較了多瘤病毒蛋白質(zhì)VP1的不同變體的蛋白分子量及純化效率，所用變體是PyVP1-CallS-T249C變體(與天然蛋白質(zhì)進行比較)與第150位氨基酸附近的環(huán)形區(qū)域插入了一個WW結(jié)構(gòu)域的PyVP1-WW150變體。實施例1對變體產(chǎn)生與純化進行了全面描述。對所有兩種變體來說，表現(xiàn)出較小分子量的蛋白質(zhì)降解產(chǎn)物通常會出現(xiàn)。(b)PyVP1-WW150變體與PyVP1-CallS-T249C變體的圓二色譜(CD)。在150位插入的WW結(jié)構(gòu)域表現(xiàn)出自然折疊狀態(tài)，因而在CD-譜中β-片層結(jié)構(gòu)的份額有所增加。圖3、根據(jù)實施例2，本圖表現(xiàn)了PyVP1-WW150與帶有固定化富含脯氨酸肽的傳感芯片的結(jié)合情況。根據(jù)表面胞質(zhì)團共振法的三次測量表明溶劑添加劑對相互作用的親合力及專一性有微弱的影響，其中，(b)和(c)中使用的添加劑分別代表復雜的生理混合物。(a)PyVP1-WW150在正常溶劑條件下與傳感芯片表面的結(jié)合。(b)PyVP1-WW150在使用Dulbecco’PBS作為工作緩沖液的條件下與傳感芯片表面的結(jié)合。(c)PyVP1-WW150在添加小牛胎兒血清(FCS)作為生理相關(guān)物質(zhì)混合物模型的條件下與傳感芯片表面的結(jié)合。圖4、為SDS凝膠圖，說明PyVP1-WW150與帶有脯氨酸肽的基質(zhì)的專一性結(jié)合。泳道1所用的VP1-WW150(如實施例1所述進行純化)；泳道2與泳道3不同的洗滌組分；泳道4與泳道5洗脫緩沖液中含有1％SDS的洗脫組分；泳道610kDa的分子量標準。本實施例表明包含WW結(jié)構(gòu)域的蛋白可以被可逆地固定在基質(zhì)上。檢測到的PyVP1變體雙帶代表天然蛋白質(zhì)和在所有制備過程中經(jīng)常出現(xiàn)的蛋白質(zhì)水解形成的降解產(chǎn)物。圖5、為凝膠過濾圖(TSK凝膠G5000PWXL，TosoHaas)，說明一個富含脯氨酸肽與一個具有插入VP1并暴露在衣殼表面的WW結(jié)構(gòu)域的病毒樣衣殼表面的結(jié)合。在實施例4所表明的條件下，可以發(fā)生PyVP1-WW150蛋白裝配進衣殼。富含脯氨酸肽可以結(jié)合在病毒樣衣殼上，這可以通過連接其上的染料的特異性吸收予以證實。左上通過測定260和280nm的吸收，證實了衣殼的形成；衣殼的洗脫體積是6-8ml，未裝配的自由五聚體出現(xiàn)在9-10ml。左下熒光標記肽在490nm處的吸收；該肽的洗脫與衣殼洗脫平行，五聚體洗脫在6-10ml時。大于10ml時，剩余的自由肽與熒光染料一起洗脫出來。右上自由未結(jié)合肽與介質(zhì)不作用，只在大于10ml時洗脫出來。右下左上與左下的色譜圖的疊加圖，以便說明結(jié)合肽與衣殼組分的共洗脫。圖6、顯示出(a)PyVP1-3C-WW1和PyVP1-3C-WW[N-14]變體的純化。SDS凝膠(12％)展現(xiàn)了沒有WW結(jié)構(gòu)域的PyVP1蛋白質(zhì)(泳道2)，來自實施例1的PyVP1-WW150變體(泳道3)，來自實施例8的所有兩種變體(PyVP1-3C-WW1在泳道4和泳道5，PyVP1-3C-WW[N-14]在泳道6)。泳道1和泳道7是分子量標準(梯級為10kDa)。(b)GFP的變體GFP-PLP的純化，SDS(15％)凝膠分析。泳道M，分子量標準(梯級為10kDa)；泳道Int，內(nèi)含肽親和柱的洗滌組分；組分1-9，GFP-PLP蛋白的不同洗脫組分片段。圖7、為分子物質(zhì)在多瘤病毒VP1變體的病毒樣衣殼內(nèi)部的包裝。(a)GFP-PLP包裝進入包含PyVP1-3C-WW1的衣殼中。GFP-PLP在標準條件下進行裝配前，以6倍摩爾量添加GFP-PLP。所示凝膠過濾實驗(TSK凝膠G6000PWXL，TosoHaas)顯示出，衣殼組分(洗脫體積為9ml)被從PyVP1變體的自由的、未裝配五聚體及GFP蛋白質(zhì)(洗脫體積為11-13ml)中分離出來。在衣殼片段內(nèi)存在，通過WW結(jié)構(gòu)域/多聚脯氨酸作用，GFP被導入衣殼內(nèi)部，所以在衣殼組分中存在可檢測量的GFP。(b)N-端帶有WW結(jié)構(gòu)域的GFP殼體化于病毒樣衣殼內(nèi)部，該衣殼由PyVP1-3C-[N-14]-PLP(在截短的N-端具有富含脯氨酸序列)裝配起來的。與(a)中的實施例相似，GFP-WW1與PyVP1-3C-[N-14]-PLP溫育，衣殼在標準條件下通過裝配產(chǎn)生。這樣，通過與WW結(jié)構(gòu)域的親和性，多聚脯氨酸肽被帶入衣殼的內(nèi)部。(c)熒光標記肽(富含脯氨酸的序列)殼體化于病毒樣衣殼內(nèi)部。與(a)中的實施例相似，該肽與PyVP1-3C-WW[N-14]溫育，衣殼在標準條件下通過裝配產(chǎn)生。這樣，通過與WW結(jié)構(gòu)域的親和性，多聚脯氨酸肽被帶入衣殼的內(nèi)部。(d)將C-端帶有富含脯氨酸序列的GFP包裝于病毒樣衣殼內(nèi)部，該病毒樣衣殼是由PyVP1-3C-WW[N-14]裝配而成。與(a)中的實施例相似，GFP-PLP與PyVP1-3C-WW[N-14]溫育，衣殼在標準條件下通過裝配產(chǎn)生。這樣，通過與WW結(jié)構(gòu)域的親和性，GFP-PLP被帶入衣殼的內(nèi)部。圖8、為SDS凝膠結(jié)果，說明從混合物，這里為細胞粗提物中純化帶有WW結(jié)構(gòu)域的蛋白。泳道110kDa分子量標準；泳道2(PyVP1-3C-WW1)-內(nèi)含肽-CBD融合蛋白粗提物；泳道3全蛋白成分；泳道4-10依次為融合蛋白洗脫的不同組分，洗脫緩沖液含有2％SDS。這里的融合蛋白通過一個與富含脯氨酸肽共價結(jié)合的柱子時，發(fā)生固定化。加入粗提物后，用含有2M NaCl、總量為10倍柱體積的緩沖液洗柱子。除了融合蛋白質(zhì)外，還發(fā)現(xiàn)了其降解產(chǎn)物及與PyVP1結(jié)合的陪伴分子。圖9、給出了一種分子物質(zhì)與WW結(jié)構(gòu)域的二硫鍵的形成，為了達到親和純化的目的，這種WW結(jié)構(gòu)域與谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)相融合。為了實現(xiàn)鍵合，使用了WW結(jié)構(gòu)域的兩種變體，其中每種變體的一個位置的氨基酸被替換為半胱氨酸。即，其中一種是D8C變體，其WW結(jié)構(gòu)域第8位處的天冬氨酸被替換為半胱氨酸，另外一種是K19C變體，它的第19位的賴氨酸被替換為半胱氨酸。這里使用的分子物質(zhì)是帶有CSGP8LP序列的富含脯氨酸肽，它在其氨基端的氨基上帶有用于分析的熒光染料(Oregon Green，OG，F(xiàn)irma MolecularProbes)。二硫鍵的形成依實施例7所述方法進行。為了分析鍵的形成，樣品進行反相HPLC(HPLC柱YMC protein-Rp C18工作緩沖液A0.1％ TFA inH2O，工作緩沖液B80％ CAN，0.1％ TFA)。利用這些色譜圖，WW結(jié)構(gòu)域和自由的、未鍵合的肽可以相互分開(洗脫時間肽是12分鐘，WW結(jié)構(gòu)域是25-27分鐘)，而形成二硫鍵的肽和WW結(jié)構(gòu)域幾乎是共洗脫(28分鐘)。通過肽的熒光標記法，與WW結(jié)構(gòu)域在一起的肽可被檢測出現(xiàn)。圖9(a)顯示這種情況發(fā)生在WW結(jié)構(gòu)域變體K19C中，而不是D8C中。這可能是因為變體D8C的半胱氨酸存在空間不相容性。為了證明WW結(jié)構(gòu)域鍵合的特異性，在一個平行的實驗中分析了不含有半胱氨酸的WW結(jié)構(gòu)域變體，同樣地它沒有發(fā)生鍵合。圖9(b)顯示出WW結(jié)構(gòu)域變體K19C與富含脯氨酸肽之間的共價作用可以通過添加還原劑(50mM二硫蘇糖醇)遭到破壞。這樣熒光標記的蛋白質(zhì)又會以完全自由的形式存在。
實施例1、將WW結(jié)構(gòu)域插入到一種體外裝配的、病毒樣蛋白衣殼(PyVP1-WW150)的外部片段中在第一個實施例中一個氨基酸序列為Gly-Ser-Gly-Trp-Thr-Glu-His-Lys-Ser-Pro-Asp-Gly-Arg-Thr-Tyr-Tyr-Tyr-Asn-Thr-Glu-Thr-Lys-Gln-Ser-Thr-Trp-Glu-Prs-Pro-Asp-Asp的WW結(jié)構(gòu)域插入病毒外殼蛋白的一個特定環(huán)中。同時，在WW結(jié)構(gòu)域之前和之后再插入一個氨基酸Gly-Ser交互出現(xiàn)構(gòu)成的接頭。在給出的實施例中，所用的病毒核心蛋白質(zhì)是溶液中以五聚體形式存在的多瘤病毒VP1核心蛋白質(zhì)，根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)，這種蛋白可以在體外裝配成病毒樣衣殼。根據(jù)蛋白質(zhì)的晶體結(jié)構(gòu)，辨認出150位氨基酸附近結(jié)構(gòu)中的環(huán)形區(qū)域可能適合WW結(jié)構(gòu)域的插入，因為在五聚體蛋白質(zhì)裝配成病毒樣衣殼時，發(fā)現(xiàn)這個環(huán)形區(qū)域位于衣殼的外部。
PyVP1-WW150的表達和純化是以融合蛋白形式進行的，該融合蛋白羧基端融合有內(nèi)含肽結(jié)構(gòu)域，其上連接一個幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CBD)。為了這個目的，首先，用源于IMPACT-系統(tǒng)(New England Biolabs)的載體pCYB2，構(gòu)建了一個質(zhì)粒。通過pCYB2的多克隆位點，利用限制性位點NdeI-XmaI(New England Biolabs)，用PCR和標準方法擴增和克隆了一個編碼小鼠多瘤病毒VP1基因變體的DNA片段。
作為上述工作的基礎，用到了一種無論怎樣其序列中也不展示半胱氨酸的多瘤病毒變體；通過傳統(tǒng)的突變技術(shù)，野生型蛋白質(zhì)的六個半胱氨酸分別被提前替換為絲氨酸。這個PyVP1變體的優(yōu)點是溶液的氧化還原條件對蛋白質(zhì)的狀態(tài)沒有影響；所以在很多應用中很容易操作。另外，通過后來在插入的WW結(jié)構(gòu)域內(nèi)引入半胱氨酸，使WW結(jié)構(gòu)域與富含脯氨酸序列之間可以形成特異的二硫鍵。進一步突變是在第249位，天然蛋白質(zhì)中此處的蘇氨酸被替換為半胱氨酸。通過現(xiàn)有技術(shù)，蛋白的這個位點被帶上熒光染料標記，進一步增加了它的應用優(yōu)勢。五聚體中受保護的定位，使這一位點的標記不產(chǎn)生副作用。這里使用的多瘤病毒VP1變體被正確命名為PyVP1-CallS-T249C，以后縮寫為PyVP1。
PCR中使用了以下的寡核苷酸序列作為引物vp1N I mp(5’-TAT ACA TATGGC CCC CAA AAG AAA AAG C-3’)，和vp1 CImp(5’-ATA TCC CGG GAGGAA ATA CAG TCT TTG TTT TTC C-3’)。通過這個PCR，天然VP1蛋白質(zhì)的C-端氨基酸Gly383-Asn384被同時轉(zhuǎn)變?yōu)镻ro383-Gly384，因為位于C-端的天冬氨酸不利于內(nèi)含肽剪切系統(tǒng)的剪切性質(zhì)。指定的點突變對PyVP1蛋白質(zhì)的性質(zhì)沒有本質(zhì)的影響。pCYB2載體的tac啟動子只能表達少量的融合蛋白質(zhì)，所以，通過再一次PCR過程將融合結(jié)構(gòu)PyVP1-內(nèi)含肽-CBD從pCYB2載體中分離出來，克隆到帶有T7lac啟動子的高效表達pET載體的Nde I-EcoR I位點中(質(zhì)粒pET21a，Novagen)。寡核苷酸vp1-NImp(5’-TAT ACA TAT GGC CCC CAA AAG AAAAAG C-3’)和5’-ATA TGA ATT CCA GTC ATT GAA GCT GCC ACA AGG-3’。
作為在PyVP1蛋白質(zhì)第148與149位氨基酸之間的外部環(huán)形區(qū)域的插入物的WW結(jié)構(gòu)域的克隆分幾步完成。利用寡核苷酸FBP11-WWaN(5’-ATA CTC TTCAGG CAG CGG CTG GAC AGA ACA TAA ATC ACC TGA TGG-3’)和FBP11-WWaC(5’-ATA CTC TTC TAC CAC TAC CAT CAT CCG GCT TTT CCCAGG TAG ACT G-3’)，用包含來自生物體mus musculus(鼠)的形成素結(jié)合蛋白質(zhì)11(FBP11)的DNA片段，進行PCR。除了別的以外，WW結(jié)構(gòu)域在本基因序列中得以編碼。每個寡核苷酸同時被插入了一個由5個氨基酸組成的短接頭，這個序列中包含交互的甘氨酸與絲氨酸。利用寡核苷酸vp1NImp(見上)和vp1-150-WWaC(5’-ATA CTC TTC AGG TAG CGG CGT AAA CAC AAA AGGAAT TTC CAC TCC AG-3’)，在上述提到的載體上做的第二個PCR，擴增了PyVP1的1-148位氨基酸之間的N-端片段。最后，利用寡核苷酸vp1-150-WWaN(5’-ATACTC TTC AGC CGC TGC CTG TAT CTG TCG GTT TGT TGA ACC CAT G-3’)和vp1CImp(見上)，第三個PCR也擴增出PyVP1的149位氨基酸與該蛋白C-端之間的C-端片段。
隨后，三次PCR產(chǎn)物全部用IIS型限制性內(nèi)切酶Earm I 104 I(Stratagene公司產(chǎn)品)進行消化。PyVP1的N-端與C-端片段(PCR產(chǎn)物2和3，見上)用堿性磷酸酶(CIP，New England Biolabs公司產(chǎn)品)去磷酸化，以便從三次制備性PCR片段按照下述連接步驟產(chǎn)生基因序列，即，(PyVP1-N-端)-WW結(jié)構(gòu)域片段-(PyVP1-C-端)。然后利用寡核苷酸vp1NImp和vp1CImp(見上)進行的PCR擴增出三個片段的連接反應產(chǎn)物，以后簡寫為PyVP1-WW150。然后，利用標準方法將PCR產(chǎn)物克隆進入載體pCR-blunt(Invitrogen公司產(chǎn)品)。用限制性內(nèi)切酶NdeI-Sma將克隆片段PyVP1-WW150切下，最后，將其克隆進入前面提到的質(zhì)粒pET21中。
最后產(chǎn)生的載體使在E.coli BL21(DE3)細胞(mfr.Novagen)中，借助高表達性啟動子T7lac的幫助下，融合蛋白質(zhì)(PyVP1-WW150)-內(nèi)含肽-CBD的表達成為可能。為了表達蛋白質(zhì)，將轉(zhuǎn)化細胞接入含有2升LB培養(yǎng)基的5升三角錐瓶中，37℃培養(yǎng)至培養(yǎng)物的OD600達到2.0-2.5。向培養(yǎng)基中加入1mM IPTG來誘導蛋白質(zhì)的表達。隨后，將培養(yǎng)物放于15℃繼續(xù)培養(yǎng)20小時；，低溫可以降低體內(nèi)條件下融合蛋白質(zhì)的內(nèi)含肽部分的裂解。離心收集細胞，用70ml重懸緩沖液(20mM HEPES，1mM EDTA，100mM NaCl，5％(w/v)甘油，pH8.0)懸浮，通過高壓勻漿化裂解細胞。將粗提物在48,000G離心60分鐘之后，得到清澈的細胞提取物。提取物在10℃下、以0.5ml/分鐘的流速通過一個10ml的幾丁質(zhì)親和柱(NewEngland Biolabs公司產(chǎn)品)。接著，分別用3倍柱體積的重懸緩沖液，高離子強度的、15倍柱體積的洗滌液(20mM HEPES，1mM EDTA，2M NaCl，5％(w/v)甘油，pH8.0)，3倍柱體積的重懸緩沖液清洗柱子；從而所有不需要的E.coli宿主的蛋白質(zhì)被從幾丁質(zhì)基質(zhì)上洗去。
通過內(nèi)含肽自身剪切活性，將PyVP1-WW150單體從融和蛋白質(zhì)上剪切下來的過程，是在重懸緩沖液中，通過一個分別由50mM二硫蘇糖醇(DTT)、50mM羥胺或同時含有30mM DTT與30mM羥胺組成的沖擊液(3倍柱體積)誘導的。為了達到這一目的，加樣的幾丁質(zhì)基質(zhì)置于其中一種指示的溶液中在10℃溫育14小時。這樣，通過柱層析的標準方法，PyVP1-WW150蛋白質(zhì)可以從幾丁質(zhì)基質(zhì)完全釋放并被分離，而融合蛋白質(zhì)的其余部分則吸附在基質(zhì)上。為了達到這一目的，適當使用了濃度在0.1-2.0M NaCl的線性鹽梯度。根據(jù)生產(chǎn)者提供的使用說明，幾丁質(zhì)的再生可以通過用3倍柱體積的、含有SDS的緩沖液(含有1％SDS(w/v)的重懸緩沖液)清洗基質(zhì)而實現(xiàn)。
在上述方法中，PyVP1-WW150蛋白質(zhì)是以可溶解的五聚體形式表達，并且是天然形態(tài)。圖2a為野生型PyVP1(或其變體PyVP1-CallS-T249C)與由于插入了外源氨基酸而具有較大的分子量的PyVP1-WW150變體的純化組分的SDS凝膠電泳結(jié)果。圖2b為生成的蛋白質(zhì)在10mM HEPES、150mM NaCl、pH7.2條件下的比較圓二色譜，其顯示出蛋白質(zhì)的正確折疊。根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)，兩種圓二色譜的去卷積計算表明，與PyVP1蛋白質(zhì)相比，PyVP1-WW150結(jié)構(gòu)域中存在明顯的β-片層結(jié)構(gòu)增加現(xiàn)象。這表明插入的WW結(jié)構(gòu)域保持了它的天然結(jié)構(gòu)，即β-片層。
另人驚奇的是，本實施例表明，在合適的條件下，WW結(jié)構(gòu)域可以以正確折疊方式被插入蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的環(huán)形區(qū)域，并不嚴重破壞其天然結(jié)構(gòu)。在溶液中以五聚體形式存在的PyVP1-WW150蛋白質(zhì)，含有插入其多肽鏈的天然WW結(jié)構(gòu)域，并在裝配后將它們呈現(xiàn)于病毒樣衣殼的外部(見實施例2)。實施例2、PyVP1-WW150性質(zhì)描述通過實施例1所述方法，生成了一種含有人為插入的WW結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)(PyVP1-WW150)。PyVP1-WW150與富含脯氨酸配體的結(jié)合性，可以通過多種方法來描述。比較好的方法是表面胞質(zhì)團共振；本給定實施例中，使用的儀器是Biacore X(Biacore AB)。根據(jù)生產(chǎn)者提供的使用說明，一個合成的、序列為Cys-Ser-Gly-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-Leu-Pro的肽，通過巰基或氨基偶合，與CM5型傳感芯片相連。在本方法中，先將量度為80共振單位的一種指示蛋白質(zhì)(RU)被固定在表面上。隨后的測量一直在25℃、流速20ul/分鐘的條件下進行。
對PyVP1-WW150在傳感芯片上的連接研究是在多種溶劑條件下，使用固定化富含脯氨酸肽來進行。第一次測量是在標準的溶劑條件下進行的，即，10mMHEPES、1mM EDTA、150mM NaCl、pH7.2。PyVP1-WW150的蛋白質(zhì)濃度變化范圍為5-50nM。在圖3a中，PyVP1-WW150與傳感芯片的結(jié)合有明顯的高親和性。與預想的一樣，結(jié)合量與使用的蛋白質(zhì)濃度成比例。因而PyVP1-WW150蛋白質(zhì)的結(jié)合常數(shù)KD被確定為5nM(圖3a)。圖中還可以明顯看出，結(jié)合并不是持久的，但在加到傳感芯片表面后，另一方面而言，蛋白質(zhì)解離處于很緩慢的過程中。這表明，作用組份間的作用是可逆的。
為了檢驗在生理性強離子條件下的結(jié)合，第二次測量使用Dulbecco磷酸緩沖鹽溶液(Gibco)作為溶劑，其它的實驗條件與前面的第一次實驗相似。圖3b顯示出，在Dulbecco磷酸緩沖鹽溶液條件下，PyVP1-WW150的結(jié)合與在標準條件下的結(jié)合(圖3a)沒有顯著差異。在這個實驗中，可以得到結(jié)合的參數(shù)，其中結(jié)合常數(shù)(Kon＝2×105M-1s-1)和解離常數(shù)(Koff＝1.8×10-3s-1)的。本實施例表明，溶劑條件的改變對PyVP1-WW150與富含脯氨酸肽的結(jié)合沒有嚴重的影響，同時表明兩種組份之間的作用也可以在生理條件下穩(wěn)定發(fā)生。所以，這個系統(tǒng)也可以在臨床條件下，在診斷與治療領域基本應用。
為了確定結(jié)合的專一性，在第三次測量中使用含有10％FCS(小牛胎兒血清，Gibco)的Dulbecco’s MEM培養(yǎng)基作為工作緩沖液。這里的FCS是一種系統(tǒng)模型，代表生物系統(tǒng)中相關(guān)的不同蛋白質(zhì)和其它物質(zhì)的混合物。圖3c表明，在這樣的條件下，PyVP1-WW150蛋白質(zhì)在傳感芯片表面的重要和專一性結(jié)合也很顯著。如同前面所述的兩次測量中一樣，傳感芯片的表面的響應信號在這里也與加入的PyVP1-WW150蛋白質(zhì)的濃度成比例。于是，表明PyVP1-WW150與固定化富含脯氨酸肽的相互作用不依賴于其他物質(zhì)的混合物的存在，如血清中存在其它物質(zhì)混合物。
總之，借助Biacore技術(shù)及帶有固定化富含脯氨酸肽的傳感表面，這三種分析表明，帶有WW結(jié)構(gòu)域和富含脯氨酸配體的分子物質(zhì)之間的結(jié)合具有很高的親和性及專一性。由此產(chǎn)生的相互作用作用是可逆的，而且不十分依賴所選擇的溶劑條件。與結(jié)合相比，解離是很慢的，解離常數(shù)是20nM。實施例3、基質(zhì)上的固定化進一步確定結(jié)合特性的一種方法是WW結(jié)構(gòu)域在一種惰性基質(zhì)上的可逆性的固定。為了達到這一目的，根據(jù)生產(chǎn)者提供的使用說明，一個合成的富含脯氨酸肽(序列為Cys-Ser-Gly-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-Leu-Pro)，通過巰基與SulfoLink柱基質(zhì)(Pierce)偶合。用這種方法修飾的基質(zhì)來填充一個層析柱。這樣，樣品就可以加載到基質(zhì)上，且可以在不同條件下洗脫結(jié)合的蛋白質(zhì)。按照實施例1所述純化的PyVP1-WW150蛋白質(zhì)加到這種柱子上(溶劑10mM HEPES、1mM EDTA、150mM NaCl、5％甘油、pH7.2)。圖4表明，蛋白質(zhì)與基質(zhì)發(fā)生結(jié)合，在洗滌組分中只出現(xiàn)微量蛋白。接著，通過在工作緩沖液中添加1％SDS或300mM精氨酸，將蛋白質(zhì)從基質(zhì)上洗脫下來。
這個實驗表明，PyVP1-WW150蛋白質(zhì)可以與帶有富含脯氨酸肽的基質(zhì)可逆結(jié)合。所以，可以發(fā)生暫時固定化。蛋白質(zhì)與基質(zhì)的分離可以通過在工作緩沖液中使用添加劑來實現(xiàn)。實施例4、富含脯氨酸肽與衣殼的結(jié)合在另一個實驗中，研究了一種帶有富含脯氨酸序列的、熒光標記的蛋白質(zhì)結(jié)合在病毒樣衣殼的表面(外部)。以現(xiàn)有技術(shù)為基礎，蛋白質(zhì)的裝配條件與以上提到條件相似(參見Salunke，Caspar & Garcea，多瘤病毒衣殼蛋白質(zhì)PyVP1裝配的多態(tài)性，Biophys.J.56，887-900，1989)。將蛋白質(zhì)在10mM HEPES、50mM NaCl、0.5mMCaCl2、5％甘油、pH7.2條件下進行透析，得到病毒樣衣殼。根據(jù)生產(chǎn)者提供的使用說明，對富含脯氨酸肽Cys-Ser-Gly-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-Leu-Pro，用熒光劑-馬來酰亞胺衍生物(分子探針)在其N-端半胱氨酸位點進行特定標記。在病毒蛋白質(zhì)變體裝配進入衣殼后，加入10倍摩爾過量熒光標記肽。通過凝膠過濾(TSKGel G5000PWXL柱，TosoHaas)，病毒樣衣殼外膜可以被明顯發(fā)現(xiàn)，且與自由的、未結(jié)合的衣殼元件、多余肽和熒光染料分開。與位于衣殼表面的WW結(jié)構(gòu)域結(jié)合的肽洗脫在衣殼組分中，可以通過熒光染料的特異性吸收來證實(圖5)。
這個實施例表明，在合適條件下，PyVP1-WW150變體可以形成衣殼結(jié)構(gòu)(病毒樣衣殼)。這些衣殼可以和富含脯氨酸肽結(jié)合。這樣，通過WW結(jié)構(gòu)域和富含脯氨酸序列之間特異而強烈的相互作用，分子物質(zhì)可以以定向方式被帶到病毒樣結(jié)構(gòu)的表面(外部)。實施例5、GFP在病毒樣蛋白質(zhì)衣殼內(nèi)部的包裝在這個實施例中，通過對銜接頭片段的合適定位，分子物質(zhì)定位于病毒衣殼或病毒樣衣殼(衣殼)的內(nèi)部可以發(fā)生。利用現(xiàn)有技術(shù)，根據(jù)多瘤病毒VP1的三級空間結(jié)構(gòu)，可知蛋白質(zhì)的N-端在裝配進入殼粒后，位于衣殼的內(nèi)部。因此，蛋白質(zhì)的前14個氨基酸可能沒有用處，因為在衣殼的×-射線結(jié)構(gòu)中不能發(fā)現(xiàn)它們。這樣，產(chǎn)生了PyVP1蛋白質(zhì)的兩個不同變體，它們可以是在天然蛋白質(zhì)的氨基端含有WW結(jié)構(gòu)域(變體PyVP1-3C-WW1)或在被切掉14個氨基酸的N-端含有WW結(jié)構(gòu)域(變體PyVP1-3C-WW[N-14])，也可以是在N-端含有富含脯氨酸序列的PyVP1蛋白質(zhì)變體(PyVP1-3C-[N-14]-PLP)。這些變體的基礎是一個包含半胱氨酸C19和C114的PyVP1變體，它帶有一個外部引入的新的特定半胱氨酸(與變體PyVP1-CallS-T249C相似)。這個變體以后簡稱為PyVP1-3C。
首先，通過PCR方法擴增了WW結(jié)構(gòu)域；因此，與實施例1相似，以鼠的FBP11基因作為模板。PCR中應用的寡核苷酸因而為5’-AAT ATA TCA TAT GTCCAT CAT CCG GCT TTT CCC AGG TAG ACT-3’(帶有NdeI位點)，和5’-TATTAA TCA TAT GAG CGG CTG GAC AGA ACA TAA ATC ACC TGA TGG-3’。通過寡核苷酸引入的NdeI-NdeI切割位點，所得PCR產(chǎn)物隨后被克隆進來自實施例1的表達載體pET21a，它帶有融合蛋白PyVP1-內(nèi)含肽-CBD的基因；在這個基因的5’末端，發(fā)現(xiàn)了單個的NdeI限制性位點。這個載體的基因表達產(chǎn)物就是目的蛋白質(zhì)PyVP1-3C-WW1。與其相似，基于實施例1所述標準方法，進行了被截掉14個氨基酸的PyVP1-3C片段(PyVP1-3C-WW[N-14])的克隆。為了達到這個目的，在PyVP1基因片段上進行PCR，使用的是5’-GCG CGC GCA TAT GAG CACCAA GGC TAG CCC AAG ACC CG-3’和寡核苷酸vp1CImp(見實施例1)。所得PCR產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶NdeI-Sma I進行消化，再用標準方法將所得片段克隆進來自實施例1的載體pET21a中。根據(jù)實施例1進行兩種蛋白質(zhì)的表達與純化。純化蛋白質(zhì)與圖6a中的PyVP1和PyVP1-WW150變體進行比較。這表明所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)是可溶的并可天然產(chǎn)生。通過引入WW結(jié)構(gòu)域引起的N-端改變對蛋白質(zhì)形成病毒樣殼狀結(jié)構(gòu)所需的裝配能力沒有顯著的負面影響。
通過類似方法，進行了GFP變體的制備和純化。GFP是一種在天然條件下顯示綠色熒光(最大吸收在490nm)的蛋白質(zhì)。它極利于標記復合體與裝配體。為了制備帶有富含脯氨酸末端序列的GFP變體，首先以質(zhì)粒pEGFP-N1(Clontech公司產(chǎn)品)為模板，用PCR方法擴增GFP基因。同時，PCR產(chǎn)物中引入了合適的限制性酶切位點。利用寡核苷酸5’-TTA TTT ACA TAT GGT GAG CAA GGG CGAGGA G-3’(帶有Nde I切點)，和5’-ATA TCT TAA GTA CAG CTC GTC CAT GCCG-3’(帶有Afl II切點)進行PCR。然后，所得PCR產(chǎn)物被克隆在pTIP載體的酶切位點中，進行表達。pTIP載體是實施例1所記錄的內(nèi)含肽純化載體的一種衍生物，以pET21a為基礎，含有附加插入的富含脯氨酸序列。這樣構(gòu)建的載體，可以使富含脯氨酸序列選擇性地與在整合進多克隆位點的基因的5’或3’端融合。這里使用的富含脯氨酸序列主要包括Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-Leu-Pro。按照實施例1中的方法，GFP-PLP蛋白的制備和純化采用了幾丁質(zhì)親和層析。GFP-PLP的成功制備和純化用圖6b予以證明。其C-端帶有富含脯氨酸序列Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-Leu-Pro的GFP-PLP蛋白，可以在溶液中大量生產(chǎn)。蛋白質(zhì)溶液的綠色熒光同時表明蛋白質(zhì)可以折疊成它的天然結(jié)構(gòu)。
Py-VP1-3C-PLP變體的制備過程相似。為了制備這個PyVP1變體，PyVP1-3C-[N-14]被克隆進入載體pTIP，這樣，載體中的富含脯氨酸序列與Py-VP1-3C-[N-14]的N-端融合。
為了考察在各自的N-端帶有WW結(jié)構(gòu)域的所有兩種PyVP1變體的功能特性，將所有兩種變體與帶有富含脯氨酸序列的蛋白質(zhì)溫育。PyVP1-3C-WW1蛋白質(zhì)與已制備的GFP-PLP蛋白質(zhì)(摩爾比1∶6)溫育10分鐘(10mM HEPES、1mM EDTA、150mM NaCl、5％甘油、pH7.2)；使用含有0.5mMCaCl2的緩沖液進行透析(見實施例4)，誘導PyVP1變體的衣殼形成。衣殼的成功檢測到衣殼的結(jié)果(圖7a)表明PyVP1-3C-WW1變體能夠在合適條件下裝配。通過凝膠過濾分析(TSKGelG6000PWXL柱，TosoHaas)，發(fā)現(xiàn)衣殼組分(洗脫體積在9-10ml之間)中含有一小部分天然GFP-PLP蛋白質(zhì)(可由490nm的特異吸收來確定)(圖7a)。這意味著，在GFP-PLP蛋白質(zhì)與PyVP1-3C-WW[N-14]變體溫育過程中，發(fā)生了兩種蛋白質(zhì)之間的相互結(jié)合，從而GFP在隨后的衣殼裝配過程中被導入病毒樣顆粒的內(nèi)部。實施例6、將肽包裝于病毒樣蛋白質(zhì)外殼的內(nèi)部在與實施例5相似的另一個實驗中，PyVP1-3C-WW-[N-14]以摩爾比1∶10與一個已用熒光標記的富含脯氨酸肽共同溫育。根據(jù)生產(chǎn)者提供的使用說明書，在這里，肽(Cys-Ser-Gly-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-Leu-Pro)的標記是利用熒光素馬來酰亞胺(分子探針)的馬來酰亞胺偶合將染料與N-端的半胱氨酸結(jié)合。又如實施例5中一樣，發(fā)現(xiàn)在PyVP1-3C-WW[N-14]變體裝配后，PyVP1-3C-WW[N-14]能在合適條件下進行裝配。另外，這個蛋白質(zhì)可以和富含脯氨酸肽結(jié)合；同時，在裝配進入蛋白質(zhì)外殼的過程中，可以把富含脯氨酸肽帶入衣殼內(nèi)部。這個過程用圖7b中的凝膠過濾予以說明，通過與蛋白質(zhì)共價結(jié)合的熒光染料在490nm處的特異吸收，發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)主要出現(xiàn)在衣殼的洗脫區(qū)(9-10ml)。
而且，利用變體PyVP1-3C-[N-14]-PLP(其N-端富含脯氨酸序列)和GFP-WW1(其N-端存在WW結(jié)構(gòu)域)，可以進行相似的裝配。這表明WW結(jié)構(gòu)域和富含脯氨酸配體在被連接物質(zhì)上的位置顛倒，即，將富含脯氨酸序列置于多瘤病毒核心蛋白質(zhì)(衣殼)上而WW結(jié)構(gòu)域置于被包裝蛋白質(zhì)上，也可以使GFP成功定位于病毒樣衣殼的內(nèi)部。
總之，實施例5和實施例6中的實驗表明N-端融合WW結(jié)構(gòu)域的PyVP1變體，在合適條件下，可以與富含脯氨酸序列以及其上具有富含脯氨酸序列的任何分子物質(zhì)結(jié)合并在衣殼裝配過程中引導它們進入病毒樣衣殼的內(nèi)部。因此，所述過程適于將分子物質(zhì)定向包裝于病毒或病毒樣衣殼內(nèi)。同時表明N-端融合富含脯氨酸序列的PyVP1變體可以與WW結(jié)構(gòu)域和其上具有WW結(jié)構(gòu)域的分子物質(zhì)結(jié)合。實施例7、用于以修飾后的WW結(jié)構(gòu)域和富含脯氨酸肽為基礎的共價連接的二硫鍵實施例1到6所述研究表明通過WW結(jié)構(gòu)域與富含脯氨酸序列之間的相互作用，可以出現(xiàn)兩種銜接頭片段的暫時聚集。相互作用組份之間的持久橋接的形成可以通過在所有兩種銜接頭片段上配備特定引入的半胱氨酸來實現(xiàn)，借助合適的位置布置，這些半胱氨酸可能在結(jié)合組分締合后形成二硫鍵。
通過按照現(xiàn)有技術(shù)的常規(guī)方法進行的點突變，可以使WW結(jié)構(gòu)域與配體中的富含脯氨酸序列中對兩種銜接頭片段締合不重要的單個氨基酸變成半胱氨酸。在合適的氧化還原(氧化過程)條件下，含有一個或多個半胱氨酸的結(jié)合在一起的WW結(jié)構(gòu)域與富含脯氨酸配體可以形成特定二硫鍵。由于WW結(jié)構(gòu)域與配體之間的相互作用，所以形成的這個鍵肯定是有益的。未連在一起的WW結(jié)構(gòu)域與富含脯氨酸配體間的暫時相互作用持續(xù)足夠長的時間，以便可以通過二硫鍵形成共價連接。通過這種方法，所有兩種銜接頭片段之間的相互作用變得不受時間限制，因為二硫鍵在生理條件下是穩(wěn)定的，舉例而言，正如它們在細胞外部空間時一樣穩(wěn)定。如果需要，在還原條件下(如50Mm DTT、DTE或β-巰基乙醇)，WW結(jié)構(gòu)域與富含脯氨酸配體之間的二硫鍵可以在體外再次消除；去除還原試劑，還可以再連接。
以鼠多瘤病毒核心蛋白質(zhì)VP1的PyVP1-WW150變體為基礎，通過突變，一個天冬氨酸(WW結(jié)構(gòu)域的第8位點)被轉(zhuǎn)變?yōu)榘腚装彼帷．a(chǎn)生的含有半胱氨酸的變體隨后被命名為PyVP1-WW150-D8C。通過基于表面胞質(zhì)團共振的結(jié)合情況研究，發(fā)現(xiàn)即使沒有二硫鍵的形成，這種WW結(jié)構(gòu)域變體也可結(jié)合富含脯氨酸配體Cys-Ser-Gly-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-Leu-Pro。然而，這個相互作用的程度有點輕于使用PyVP1-WW150的情況。這明顯可歸于新引入的半胱氨酸?？梢园l(fā)現(xiàn)，通過加入500mM硫酸銨，可以加強這種累積作用。因而，富含脯氨酸配體與WW結(jié)構(gòu)域之間的疏水作用大概加強了。所以，可以通過溶劑中的硫酸胺濃度來調(diào)節(jié)作用強度。
富含脯氨酸配體與WW結(jié)構(gòu)域之間的二硫鍵可以隨后在微弱的氧化條件下形成。為了這個目的，使用了一種既含有硫酸胺并且保持氧化還原條件不變的緩沖液。后一條件是通過在氧化還原緩沖液(50mM Tris、pH8.5、1mM EDTA、500mM硫酸胺)中使用1mM GSSG和5mM GSH來獲得的；氧化型(GSSG)或還原型谷胱甘肽(GSH)在這里作為二硫鍵形成的氧化還原變換系統(tǒng)發(fā)揮作用(參見R.Rudolph，包含體蛋白質(zhì)的體外折疊，F(xiàn)ASEB J.10，49-56，1996)。二硫鍵形成的條件是15℃、24小時，然后在條件50mM Tris、1mM EDTA、pH7下透析，完成建的形成。在上面最后提到的條件下，不會發(fā)生二硫鍵交換；所形成的二硫鍵是穩(wěn)定的。
總之，可以說，半胱氨酸殘基引入WW結(jié)構(gòu)域使與至少含有一個半胱氨酸的富含脯氨酸配體與WW結(jié)構(gòu)域的共價結(jié)合成為可能，因而導致WW結(jié)構(gòu)域與配體間形成穩(wěn)定的共價連接(見圖9)。實施例8、通過銜接頭片段純化蛋白質(zhì)(多聚脯氨酸/WW親和層析)本發(fā)明的另一應用領域是分子物質(zhì)從混合物中的分離，其典型應用于從粗提物(細胞提取物)中純化蛋白質(zhì)。在這一過程中，應用了WW結(jié)構(gòu)域與富含脯氨酸配體的親和性將含有WW結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)從復雜的蛋白質(zhì)混合物(粗提取物)中分離出來(親和層析原理)。為了這個目的，使用了與實施例3一樣的柱子；根據(jù)生產(chǎn)者提供的使用說明，通過一個巰基，使SulfoLink材料(Pierce，具有巰基的基質(zhì)活性基于位于含有10個CH2基團的接頭的末端的碘乙酰胺基團)與多肽Cys-Ser-Gly-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-Leu-Pro偶合，用于裝柱。
相似地，多肽也可與其它基質(zhì)偶合，例如通過肽的N-端連接的AffiGel10(Biorad，具有NH2基團的基質(zhì)活性基于含有10個CH2基團的接頭的末端的N-羥基琥珀酰亞氨基團)。同樣地，對以CH-sepharose 4B為基礎的基質(zhì)(Sigma，基質(zhì)的活性基團也是N-羥基琥珀酰亞氨酯)，肽的偶合可發(fā)生在其N-端。與在這里，也會發(fā)生富含脯氨酸配體共價偶合到載體材料上這種偶合因而使含WW結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)純化成為可能。
與實施例1的詳述相似，來自實施例5的PyVP1變體，PyVP1-3C-WW1(在PyVP1蛋白質(zhì)的N-端存在WW結(jié)構(gòu)域)可以作為與內(nèi)含肽和幾丁質(zhì)結(jié)構(gòu)域形成的融合蛋白而產(chǎn)生([PyVP1-3C-WW1]-內(nèi)含肽-CBD)。然而，它不以所述的標準方法純化，而是用幾丁質(zhì)親和層析法。在細胞裂解和離心之后，細胞提取物上于前面提到的柱子上。于是將10mM HEPES、150mM NaCl、1mM EDTA、5％甘油、pH8.0用作工作緩沖液。將提取物加入后，用10倍柱體積的添加有2M NaCl的含有10mM HEPES(pH8.0)、1mM EDTA、5％甘油的緩沖液清洗柱子。通過這個清洗過程，所有非特異吸附的蛋白質(zhì)和細胞成分被從SulfoLink基質(zhì)上沖洗下來。然后，用含有2％SDS的緩沖液將結(jié)合的融合蛋白質(zhì)[PyVP1-3C-WW1]-內(nèi)含肽-CBD洗脫下來。從圖8中可以看出，融合蛋白質(zhì)[PyVP1-3C-WW1]-內(nèi)含肽-CBD的結(jié)合是通過WW結(jié)構(gòu)域和固定在SulfoLink基質(zhì)上的富含脯氨酸肽之間的相互作用實現(xiàn)的。這樣，融合蛋白質(zhì)與基質(zhì)結(jié)合，細胞提取物中的大多數(shù)其它蛋白質(zhì)在流通池或洗滌過程中被除去。接下來，SDS洗脫幾乎只洗下所有含有WW結(jié)構(gòu)域的融合蛋白質(zhì)，及其蛋白水解所產(chǎn)生的降解產(chǎn)物(對PyVP1來說，出現(xiàn)在以現(xiàn)有技術(shù)為基礎所有可比較的制備方法中)和陪伴分子。人所公知，陪伴分子可直接與PyVP1結(jié)合且一般不易被分開。除了通過SDS洗脫方法洗脫結(jié)合的含有WW結(jié)構(gòu)域的融合蛋白質(zhì)，還可以通過在工作緩沖液中加入300mM精氨酸來洗脫天然蛋白質(zhì)。隨后通過對洗出液進行透析除去精氨酸，就可以獲得純化的天然蛋白質(zhì)。
總之，這個實施例表明，對于所述系統(tǒng)，可以從混合物質(zhì)(粗提物)中分離純化特異的分子。實施例9、通過銜接頭片段實現(xiàn)分子的特異性二聚化通過銜接頭片段(WW結(jié)構(gòu)域和富含脯氨酸肽)的相互作用，在體外可以制備雙功能或雙價雜交分子。為了這個目的，產(chǎn)生了兩種分子物質(zhì)，根據(jù)其用途它們可以具有相同或不同的性質(zhì)，而且每個都通常帶有共價結(jié)合的銜接頭片段之一。在所選擇的實施例中，進行了易于被被檢測的GFP蛋白質(zhì)二聚體的制備。
為了這個目的，與PyVP1的制備相似，借助來自實施例1中的以內(nèi)含肽為基礎的表達系統(tǒng)的幫助，制備了一種在GFP的N-端帶有WW結(jié)構(gòu)域的GFP變體(GFP-WW1)。首先，在載體pEGFP-N1(Clontech，見實施例5)上，利用寡核苷酸5’-TAT AGC TAG CGT GAG CAA GGG CGA GGA GCT GTT C-3’和5’-GGGAAT TAA GTA CAG CTC GTC CAT GCC G-3’作PCR。通過切割位點NheI-SmaI，將PCR產(chǎn)物連接進入來自實施例5的載體pET21a中，其中在該載體的插入位點的3’端，包含實施例1所述的由內(nèi)含肽和幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CBD)組成的融合蛋白質(zhì)。在插入位點的5’端，存在實施例5所述的WW結(jié)構(gòu)域。這樣，制備了序列為WW結(jié)構(gòu)域-GFP-內(nèi)含肽-CBD的融合蛋白質(zhì)。編碼融合蛋白質(zhì)的質(zhì)?？梢员晦D(zhuǎn)化進入E.coli菌株BL21(DE3)。與實施例1和3相似，可以進行融合蛋白質(zhì)的制備與純化。用所述方法，可以產(chǎn)生純化形式的GFP-WW1蛋白質(zhì)。
與之相似，制備了其C-端帶有富含脯氨酸片段(Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-Leu-Pro)的第二種GFP變體，。這里，GFP-PLP蛋白質(zhì)的制備與純化與實施例5中有關(guān)蛋白的描述相同。
然后，將所有兩種GFP變體一起溫育。因而，通過銜接頭片段所有兩種蛋白質(zhì)產(chǎn)生互相連接，結(jié)果產(chǎn)生了GFP二聚體。使用TSK-PW2000XL凝膠過濾柱(TosoHaas)，通過凝膠過濾方法，可以區(qū)分GFP二聚體和GFP單體。本實施例證明，通過使用本發(fā)明的方法，可以進行任意分子物質(zhì)的連接，這些物質(zhì)帶有以WW結(jié)構(gòu)域或富含脯氨酸肽為基礎的合適銜接頭片段。因而，可以形成同功能或異功能的裝配體。
P12604序列序列列表<110>ACGT前基因組公司(ACGT ProGenomics AG)<120>一種將分子物質(zhì)連接的方法<130>P12604<140>PCT/EP00/10873<141>2000-11-03<150>PCT/EP00/10873<151>2000-11-03<150>DE 199 52 956.6<151>1999-11-03<160>21<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1266<212>DNA<213>人工序列<220><223>在WW結(jié)構(gòu)域的第8位點具有氨基酸交換D8C的VP1-WW150的半胱氨酸變體(PyVP1-WW150-D8C)<220><221>CDS<222>(1)..(1266)<223><220><221>misc_feature<222>(445)..(558)<223>插入的WW結(jié)構(gòu)域(WW150)<220><221>misc_feature<222>(481)..(483)<223>在WW結(jié)構(gòu)域插入半胱氨酸(WW150)<400>1atg gcc ccc aaa aga aaa agc ggc gtc tct aaa agc gag aca aaa agc48Met Ala Pro Lys Arg Lys Ser Gly Val Ser Lys Set Glu Thr Lys Ser1 5 10 15aca aag gct agc cca aga ccc gca ccc gtt ccc aaa ctg ctt att aaa96Thr Lys Ala Ser Pro Arg Pro Ala Pro Val Pro Lys Leu Leu Ile Lys20 25 30ggg ggt atg gag gtg ctg gac ctt gtg aca ggg cca gac agt gtg aca144Gly Gly Met Glu Val Leu Asp Leu Val Thr Gly Pro Asp Ser Val Thr35 40 45gaa ata gaa gct ttt ctg aac ccc aga atg ggg cag cca ccc acc cct192Glu Ile Glu Ala Phe Leu Asn Pro Arg Met Gly Gln Pro Pro Thr Pro50 55 60gaa agc cta aca gag gga ggg caa tac tat ggt tgg agc aga ggg att240Glu Ser Leu Thr Glu Gly Gly Gln Tyr Tyr Gly Trp Ser Arg Gly Ile65 70 75 80aat ttg gct aca tca gat aca gag gat tcc cca gga aat aat aca ctt288Asn Leu Ala Thr Ser Asp Thr Glu Asp Ser Pro Gly Asn Asn Thr Leu85 90 95ccc aca tgg agt atg gca aag ctc cag ctt ccc atg ctc aat gag gac336Pro Thr Trp Ser Met Ala Lys Leu Gln Leu Pro Met Leu Asn Glu Asp100 105 110ctc acg tct gac acc cta caa atg tgg gag gca gtc tca gtg aaa acc384Leu Thr Ser Asp Thr Leu Gln Met Trp Glu Ala Val Ser Val Lys Thr115 120 125gag gtg gtg ggc tct ggc tca ctg tta gat gtg cat ggg ttc aac aaa432Glu Val Val Gly Ser Gly Ser Leu Leu Asp Val His Gly Phe Asn Lys130 135 140ccc aca gat aca ggc agc ggc agc ggc tgg aca gaa cat aaa tca cct480Pro Thr Asp Thr Gly Ser Gly Ser Gly Trp Thr Glu His Lys Ser Pro145 150 155160tgt gga agg act tat tat tac aat act gaa aca aaa cag tct acc tgg528Cys Gly Arg Thr Tyr Tyr Tyr Asn Thr Glu Thr Lys Gln Ser Thr Trp165 170 175gaa aag cca gat gat ggt agt ggt agc ggc gta aac aca aaa gga att576Glu Lys Pro Asp Asp Gly Ser Gly Ser Gly Val Asn Thr Lys Gly Ile
180 185 190tcc act cca gtg gaa ggc agc caa tat cat gtg ttt gct gtg ggc ggg624Ser Thr Pro Val Glu Gly Ser Gln Tyr His Val Phe Ala Val Gly Gly195 200 205gaa ccg ctt gac ctc cag gga ctt gtg aca gat gcc aga aca aaa tac672Glu Pro Leu Asp Leu Gln Gly Leu Val Thr Asp Ala Arg Thr Lys Tyr210 215 220aag gaa gaa ggg gta gta aca atc aaa aca atc aca aag aag gac atg720Lys Glu Glu Gly Val Val Thr Ile Lys Thr Ile Thr Lys Lys Asp Met225 230 235 240gtc aac aaa gac caa gtc ctg aat cca att agc aag gcc aag ctg gat768Val Asn Lys Asp Gln Val Leu Asn Pro Ile Ser Lys Ala Lys Leu Asp245 250 255aag gac gga atg tat cca gtt gaa atc tgg cat cca gat cca gca aaa816Lys Asp Gly Met Tyr Pro Val Glu Ile Trp His Pro Asp Pro Ala Lys260 265 270aat gag aac aca agg tac ttt ggc aat tac act gga ggc acg tgc acc864Asn Glu Asn Thr Arg Tyr Phe Gly Asn Tyr Thr Gly Gly Thr Cys Thr275 280 285cca ccc gtc ctg cag ttc aca aac acc ctg aca act gtg ctc cta gat912Pro Pro Val Leu Gln Phe Thr Asn Thr Leu Thr Thr Val Leu Leu Asp290 295 300gaa aat gga gtt ggg ccc ctc agc aaa ggagaa ggt cta tac ctc tcg960Glu Asn Gly Val Gly Pro Leu Ser Lys Gly Glu Gly Leu Tyr Leu Ser305 310 315 320agc gta gat ata atg ggc tgg aga gtt aca aga aac tat gat gtc cat1008Ser Val Asp Ile Met Gly Trp Arg Val Thr Arg Asn Tyr Asp Val His325 330 335cac tgg aga ggg ctt ccc aga tat ttc aaa atc acc ctg aga aaa aga1056His Trp Arg Gly Leu Pro Arg Tyr Phe Lys Ile Thr Leu Arg Lys Arg340 345 350tgg gtc aaa aat ccc tat ccc atg gcc tcc ctc ata agt tcc ctt ttc1104Trp Val Lys Asn Pro Tyr Pro Met Ala Ser Leu Ile Ser Ser Leu Phe355 360 365aac aac atg ctc ccc caa gtg cag ggc caa ccc atg gaa ggg gag aac1152Asn Asn Met Leu Pro Gln Val Gln Gly Gln Pro Met Glu Gly Glu Asn370 375 380acc cag gta gag gag gtt aga gtg tat gat ggg act gaa cct gta ccg1200Thr Gln Val Glu Glu Val Arg Val Tyr Asp Gly Thr Glu Pro Val Pro385 390 395 400ggg gac cct gat atg acg cgc tat gtt gac cgc ttt gga aaa aca aag1248Gly Asp Pro Asp Met Thr Arg Tyr Val Asp Arg Phe Gly Lys Thr Lys405 410 415act gta ttt cct ccc ggg1266Thr Val Phe Pro Pro Gly420<210>2<211>422<212>PRT<213>人工序列<220><223>在WW結(jié)構(gòu)域的第8位點具有氨基酸交換D8C的VP1-WW150的半胱氨酸變體(PyVP1-WW150-D8C)<220><22 1>misc_feature<222>(445)..(558)<223>插入的WW結(jié)構(gòu)域(WW150)<220><22 1>misc_feature<222>(481)..(483)<223>在WW結(jié)構(gòu)域中插入半胱氨酸(WW150)<400>2Met Ala Pro Lys Arg Lys Ser Gly Val Ser Lys Ser Glu Thr Lys Ser1 5 10 15Thr Lys Ala Ser Pro Arg Pro Ala Pro Val Pro Lys Leu Leu Ile Lys20 25 30Gly Gly Met Glu Val Leu Asp Leu Val Thr Gly Pro Asp Ser Val Thr
35 40 45Glu Ile Glu Ala Phe Leu Asn Pro Arg Met Gly Gln Pro Pro Thr Pro50 55 60Glu Ser Leu Thr Glu Gly Gly Gln Tyr Tyr Gly Trp Ser Arg Gly Ile65 70 75 80Asn Leu Ala Thr Ser Asp Thr Glu Asp Ser Pro Gly Asn Asn Thr Leu85 90 95Pro Thr Trp Ser Met Ala Lys Leu Gln Leu Pro Met Leu Asn Glu Asp100 105 110Leu Thr Ser Asp Thr Leu Gln Met Trp Glu Ala Val Ser Val Lys Thr115 120 125Glu Val Val Gly Ser Gly Ser Leu Leu Asp Val His Gly Phe Asn Lys130 135 140Pro Thr Asp Thr Gly Ser Gly Ser Gly Trp Thr Glu His Lys Ser Pro145 150 155 160Cys Gly Arg Thr Tyr Tyr Tyr Asn Thr Glu Thr Lys Gln Ser Thr Trp165 170 175Glu Lys Pro Asp Asp Gly Ser Gly Ser Gly Val Asn Thr Lys Gly Ile180 185 190Ser Thr Pro Val Glu Gly Ser Gln Tyr His Val Phe Ala Val Gly Gly195 200 205Glu Pro Leu Asp Leu Gln Gly Leu Val Thr Asp Ala Arg Thr Lys Tyr210 215 220Lys Glu Glu Gly Val Val Thr Ile Lys Thr Ile Thr Lys Lys Asp Met225 230 235 240Val Asn Lys Asp Gln Val Leu Asn Pro Ile Ser Lys Ala Lys Leu Asp245 250 255Lys Asp Gly Met Tyr Pro Val Glu Ile Trp His Pro Asp Pro Ala Lys260 265 270Asn Glu Asn Thr Arg Tyr Phe Gly Asn Tyr Thr Gly Gly Thr Cys Thr275 280 285Pro Pro Val Leu Gln Phe Thr Asn Thr Leu Thr Thr Val Leu Leu Asp290 295 300Glu Asn Gly Val Gly Pro Leu Ser Lys Gly Glu Gly Leu Tyr Leu Ser305 310 315 320Ser Val Asp Ile Met Gly Trp Arg Val Thr Arg Asn Tyr Asp Val His325 330 335His Trp Arg Gly Leu Pro Arg Tyr Phe Lys Ile Thr Leu Arg Lys Arg340 345 350Trp Val Lys Asn Pro Tyr Pro Met Ala Ser Leu Ile Ser Ser Leu Phe355 360 365Asn Asn Met Leu Pro Gln Val Gln Gly Gln Pro Met Glu Gly Glu Asn370 375 380Thr Gln Val Glu Glu Val Arg Val Tyr Asp Gly Thr Glu Pro Val Pro385 390 395 400Gly Asp Pro Asp Met Thr Arg Tyr Val Asp Arg Phe Gly Lys Thr Lys405 410 415Thr ValPhe Pro Pro Gly420<210>3<211>1266<212>DNA<213>人工序列<220><223>VP1-WW150，已插入來自形成素結(jié)合蛋白11(FBP11)的WW結(jié)構(gòu)域<220><221>CDS<222>(1)..(1266)<223><220><221>misc_feature<222>(445)..(558)<223>WW結(jié)構(gòu)域<400>3atg gcc ccc aaa aga aaa agc ggc gtc tct aaa agc gag aca aaa agc48Met Ala Pro Lys Arg Lys Ser Gly Val Ser Lys Ser Glu Thr Lys Ser1 5 10 15aca aag gct agc cca aga ccc gca ccc gtt ccc aaa ctg ctt att aaa96Thr Lys Ala Ser Pro Arg Pro Ala Pro Val Pro Lys Leu Leu Ile Lys20 25 30ggg ggt atg gag gtg ctg gac ctt gtg aca ggg cca gac agt gtg aca144Gly Gly Met Glu Val Leu Asp Leu Val Thr Gly Pro Asp Ser Val Thr35 40 45gaa ata gaa gct ttt ctg aac ccc aga atg ggg cag cca ccc acc cct192Glu Ile Glu Ala Phe Leu Asn Pro Arg Met Gly Gln Pro Pro Thr Pro50 55 60gaa agc cta aca gag gga ggg caa tac tat ggt tgg agc aga ggg att240Glu Ser Leu Thr Glu Gly Gly Gln Tyr Tyr Gly Trp Ser Arg Gly Ile65 70 75 80aat ttg gct aca tca gat aca gag gat tcc cca gga aat aat aca ctt288Asn Leu Ala Thr Ser Asp Thr Glu Asp Ser Pro Gly Asn Asn Thr Leu85 90 95ccc aca tgg agt atg gca aag ctc cag ctt ccc atgctc aat gag gac336Pro Thr Trp Ser Met Ala Lys Leu Gln Leu Pro Met Leu Asn Glu Asp100 105 110ctc acg tct gac acc cta caa atg tgg gag gca gtc tca gtg aaa acc384Leu Thr Ser Asp Thr Leu Gln Met Trp Glu Ala Val Ser Val Lys Thr115 120 125gag gtg gtg ggc tct ggc tca ctg tta gat gtg cat ggg ttc aac aaa432Glu Val Val Gly Ser Gly Ser Leu Leu Asp Val His Gly Phe Asn Lys130 135 140ccc aca gat aca ggc agc ggc agc ggc tgg aca gaa cat aaa tca cct480Pro Thr Asp Thr Gly Ser Gly Ser Gly Trp Thr Glu His Lys Ser Pro145 150 155 160gat gga agg act tat tat tac aat act gaa aca aaa cag tct acc tgg528Asp Gly Arg Thr Tyr Tyr Tyr Asn Thr Glu Thr Lys Gln Ser Thr Trp165 170 175gaa aag cca gat gat ggt agt ggt agc ggc gta aac aca aaa gga att576Glu Lys Pro Asp Asp Gly Ser Gly Ser Gly Val Asn Thr Lys Gly Ile180 185 190tcc act cca gtg gaa ggc agc caa tat cat gtg ttt gct gtg ggc ggg624Ser Thr Pro Val Glu Gly Ser Gln Tyr His Val Phe Ala Val Gly Gly195 200 205gaa ccg ctt gac ctc cag gga ctt gtg aca gat gcc aga aca aaa tac672Glu Pro Leu Asp Leu Gln Gly Leu Val Thr Asp Ala Arg Thr Lys Tyr210 215 220aag gaa gaa ggg gta gta aca atc aaa aca atc aca aag aag gac atg720Lys Glu Glu Gly Val Val Thr Ile Lys Thr Ile Thr Lys Lys Asp Met225 230 235 240gtc aac aaa gac caa gtc ctg aat cca att agc aag gcc aag ctg gat768Val Asn Lys Asp Gln Val Leu Asn Pro Ile Ser Lys Ala Lys Leu Asp245 250 255aag gac gga atg tat cca gtt gaa atc tgg cat cca gat cca gca aaa816Lys Asp Gly Met Tyr Pro Val Glu Ile Trp His Pro Asp Pro Ala Lys260265 270aat gag aac aca agg tac ttt ggc aat tac act gga ggc acg tgc acc864Asn Glu Asn Thr Arg Tyr Phe Gly Asn Tyr Thr Gly Gly Thr Cys Thr275 280 285cca ccc gtc ctg cag ttc aca aac acc ctg aca act gtg ctc cta gat912Pro Pro Val Leu Gln Phe Thr Asn Thr Leu Thr Thr Val Leu Leu Asp290 295 300gaa aat gga gtt ggg ccc ctc agc aaa gga gaa ggt cta tac ctc tcg960Glu Asn Gly Val Gly Pro Leu Ser Lys Gly Glu Gly Leu Tyr Leu Ser305 310 315 320agc gta gat ata atg ggc tgg aga gtt aca aga aac tat gat gtc cat1008Ser Val Asp Ile Met Gly Trp Arg Val Thr Arg Asn Tyr Asp Val His325 330 335cac tgg aga ggg ctt ccc aga tat ttc aaa atc acc ctg aga aaa aga1056His Trp Arg Gly Leu Pro Arg Tyr Phe Lys Ile Thr Leu Arg Lys Arg340 345 350tgg gtc aaa aat ccc tat ccc atg gcc tcc ctc ata agt tcc ctt ttc1104Trp Val Lys Asn Pro Tyr Pro Met Ala Ser Leu Ile Ser Ser Leu Phe355 360 365aac aac atg ctc ccc caa gtg cag ggc caa ccc atg gaa ggg gag aac1152Asn Asn Met Leu Pro Gln Val Gln Gly Gln Pro Met Glu Gly Glu Asn370 375 380acc cag gta gag gag gtt aga gtg tat gat ggg act gaa cct gta ccg1200Thr Gln Val Glu Glu Val Arg Val Tyr Asp Gly Thr Glu Pro Val Pro385 390 395 400ggg gac cct gat atg acg cgc tat gtt gac cgc ttt gga aaa aca aag1248Gly Asp Pro Asp Met Thr Arg Tyr Val Asp Arg Phe Gly Lys Thr Lys405 410 415act gta ttt cct ccc ggg1266Thr Val Phe Pro Pro Gly420<210>4<211>422<212>PRT<213>人工序列<220><223>VP1-WW150，已插入來自形成素結(jié)合蛋白11(FBP11)的WW結(jié)構(gòu)域<220><221>misc_feature<222>(445)..(558)<223>WW結(jié)構(gòu)域<400>4Met Ala Pro Lys Arg Lys Ser Gly Val Ser Lys Ser Glu Thr Lys Ser1 5 10 15Thr Lys Ala Ser Pro Arg Pro Ala Pro Val Pro Lys Leu Leu Ile Lys20 25 30Gly Gly Met Glu Val Leu Asp Leu Val Thr Gly Pro Asp Ser Val Thr35 40 45Glu Ile Glu Ala Phe Leu Asn Pro Arg Met Gly Gln Pro Pro Thr Pro50 55 60Glu Ser Leu Thr Glu Gly Gly Gln Tyr Tyr Gly Trp Ser Arg Gly Ile65 70 75 80Asn Leu Ala Thr Ser Asp Thr Glu Asp Ser Pro Gly Asn Asn Thr Leu85 90 95Pro Thr Trp Ser Met Ala Lys Leu Gln Leu Pro Met Leu Asn Glu Asp100 105 110Leu Thr Ser Asp Thr Leu Gln Met Trp Glu Ala Val Ser Val Lys Thr115 120 125Glu Val Val Gly Ser Gly Ser Leu Leu Asp Val His Gly Phe Asn Lys130 135 140Pro Thr Asp Thr Gly Ser Gly Ser Gly Trp Thr Glu His Lys Ser Pro145 150 155 160Asp Gly Arg Thr Tyr Tyr Tyr Asn Thr Glu Thr Lys Gln Ser Thr Trp165 170 175Glu Lys Pro Asp Asp Gly Ser Gly Ser Gly Val Asn Thr Lys Gly Ile180 185 190Ser Thr Pro Val Glu Gly Ser Gln Tyr His Val Phe Ala Val Gly Gly195 200 205Glu Pro Leu Asp Leu Gln Gly Leu Val Thr Asp Ala Arg Thr Lys Tyr
210 215 220Lys Glu Glu Gly Val Val Thr Ile Lys Thr Ile Thr Lys Lys Asp Met225 230 235 240Val Asn Lys Asp Gln Val Leu Asn Pro Ile Ser Lys Ala Lys Leu Asp245 250 255Lys Asp Gly Met Tyr Pro Val Glu Ile Trp His Pro Asp Pro Ala Lys260 265 270Asn Glu Asn Thr Arg Tyr Phe Gly Asn Tyr Thr Gly Gly Thr Cys Thr275 280 285Pro Pro Val Leu Gln Phe Thr Asn Thr Leu Thr Thr Val Leu Leu Asp290 295 300Glu Asn Gly Val Gly Pro Leu Ser Lys Gly Glu Gly Leu Tyr Leu Ser305 310 315 320Ser Val Asp Ile Met Gly Trp Arg Val Thr Arg Asn Tyr Asp Val His325 330 335His Trp Arg Gly Leu Pro Arg Tyr Phe Lys Ile Thr Leu Arg Lys Arg340 345 350Trp Val Lys Asn Pro Tyr Pro Met Ala Ser Leu Ile Ser Ser Leu Phe355 360 365Asn Asn Met Leu Pro Gln Val Gln Gly Gln Pro Met Glu Gly Glu Asn370 375 380Thr Gln Val Glu Glu Val Arg Val Tyr Asp Gly Thr Glu Pro Val Pro385 390 395 400Gly Asp Pro Asp Met Thr Arg Tyr Val Asp Arg Phe Gly Lys Thr Lys405 410 415Thr Val Phe Pro Pro Gly420<210>5<211>1251<212>DNA<213>人工序列<220><223>PyVP1-3C-WW1，氨基端具有WW結(jié)構(gòu)域<220><221>CDS<222>(1)..(1251)<223><220><221>misc_feature<222>(9)..(93)<223>WW結(jié)構(gòu)域<400> 5atg agc ggc tgg aca gaa cat aaa tca cct gat gga agg act tat tat48Met Ser Gly Trp Thr Glu His Lys Ser Pro Asp Gly Arg Thr Tyr Tyr1 5 10 15tac aat act gaa aca aaa cag tct acc tgg gaa aag cca gat gat gga96Tyr Asn Thr Glu Thr Lys Gln Ser Thr Trp Glu Lys Pro Asp Asp Gly20 25 30cat atg gcc ccc aaa aga aaa agc ggc gtc tct aaa tct gag aca aaa144His Met Ala Pro Lys Arg Lys Ser Gly Val Ser Lys Ser Glu Thr Lys35 40 45agc aca aag gcc tgt cca aga ccc gca ccc gtt ccc aaa ctg ctt att192Ser Thr Lys Ala Cys Pro Arg Pro Ala Pro Val Pro Lys Leu Leu Ile50 55 60aaa ggg ggt atg gag gtg ctg gac ctt gtg aca ggg cca gac agt gtg240Lys Gly Gly Met Glu Val Leu Asp Leu Val Thr Gly Pro Asp Ser Val65 70 75 80aca gaa ata gaa gct ttt ctg aac ccc aga atg ggg cag cca ccc acc288Thr Glu Ile Glu Ala Phe Leu Asn Pro Arg Met Gly Gln Pro Pro Thr85 90 95cct gaa agc cta aca gag gga ggg caa tac tat ggt tgg agc aga ggg336Pro Glu Ser Leu Thr Glu Gly Gly Gln Tyr Tyr Gly Trp Ser Arg Gly100 105 110att aat ttg gct aca tca gat aca gag gat tcc cca gga aat aat aca384Ile Asn Leu Ala Thr Ser Asp Thr Glu Asp Ser Pro Gly Asn Asn Thr115 120 125ctt ccc aca tgg agt atg gca aag ctc cag ctt ccc atg ctc aat gag432Leu Pro Thr Trp Ser Met Ala Lys Leu Gln Leu Pro Met Leu Asn Glu130 135 140gac ctc acc tgt gac acc cta caa atg tgg gag gca gtc tca gtg aaa480Asp Leu Thr Cys Asp Thr Leu Gln Met Trp Glu Ala Val Ser Val Lys145 150 155 160acc gag gtg gtg ggc tct ggc tca ctg tta gat gtg cat ggg ttc aac528Thr Glu Val Val Gly Ser Gly Ser Leu Leu Asp Val His Gly Phe Asn165 170 175aaa ccc aca gat aca gta aac aca aaa gga att tcc act cca gtg gaa576Lys Pro Thr Asp Thr Val Asn Thr Lys Gly Ile Ser Thr Pro Val Glu180 185 190ggc agc caa tat cat gtg ttt gct gtg ggc ggg gaa ccg ctt gac ctc624Gly Ser Gln Tyr His Val Phe Ala Val Gly Gly Glu Pro Leu Asp Leu195 200 205cag gga ctt gtg aca gat gcc aga aca aaa tac aag gaa gaa ggg gta672Gln Gly Leu Val Thr Asp Ala Arg Thr Lys Tyr Lys Glu Glu Gly Val210 215 220gta aca atc aaa aca atc aca aag aag gac atg gtc aac aaa gac caa720Val Thr Ile Lys Thr Ile Thr Lys Lys Asp Met Val Asn Lys Asp Gln225 230 235 240gtc ctg aat cca att agc aag gcc aag ctg gat aag gac gga atg tat768Val Leu Asn Pro Ile Ser Lys Ala Lys Leu Asp Lys Asp Gly Met Tyr245 250 255cca gtt gaa atc tgg cat cca gat cca gca aaa aat gag aac aca agg816Pro Val Glu Ile Trp His Pro Asp Pro Ala Lys Asn Glu Asn Thr Arg260 265 270tac ttt ggc aat tac act gga ggc acg tgc act cca ccc gtc ctg cag864Tyr Phe Gly Asn Tyr Thr Gly Gly Thr Cys Thr Pro Pro Val Leu Gln275 280 285ttc aca aac acc ctg aca act gtg ctc cta gat gaa aat gga gtt ggg912Phe Thr Asn Thr Leu Thr Thr Val Leu Leu Asp Glu Asn Gly Val Gly290 295 300ccc ctc agc aaa gga gag ggc cta tac ctc tcg agc gta gat ata atg960Pro Leu Ser Lys Gly Glu Gly Leu Tyr Leu Ser Ser Val Asp Ile Met305 310 315 320ggc tgg aga gtt aca aga aac tat gat gtc cat cac tgg aga ggg ctt1008Gly Trp Arg Val Thr Arg Asn Tyr Asp Val His His Trp Arg Gly Leu325 330 335ccc aga tat ttc aaa atc acc ctg aga aaa aga tgg gtc aaa aat ccc1056Pro Arg Tyr Phe Lys Ile Thr Leu Arg Lys Arg Trp Val Lys Asn Pro340 345 350tat ccc atg gcc tcc ctc ata agt tcc ctt ttc aac aac atg ctc ccc1104Tyr Pro Met Ala Ser Leu Ile Ser Ser Leu Phe Asn Asn Met Leu Pro355 360 365caa gtg cag ggc caa ccc atg gaa ggg gag aac acc cag gta gag gag1152Gln Val Gln Gly Gln Pro Met Glu Gly Glu Asn Thr Gln Val Glu Glu370 375 380gtt aga gtg tat gat ggg act gaa cct gta ccg ggg gac cct gat atg1200Val Arg Val Tyr Asp Gly Thr Glu Pro Val Pro Gly Asp Pro Asp Met385 390 395 400acg cgc tat gtt gac cgc ttt gga aaa aca aag act gta ttt cct ccc1248Thr Arg Tyr Val Asp Arg Phe Gly Lys Thr Lys Thr Val Phe Pro Pro405 410 415ggg1251Gly<210>6<211>417<212>PRT<213>人工序列<220><223>PyVP1-3C-WW1，氨基端具有WW結(jié)構(gòu)域<220><221>misc_feature<222>(9)..(93)<223>WW結(jié)構(gòu)域<400>6Met Ser Gly Trp Thr Glu His Lys Ser Pro Asp Gly Arg Thr Tyr Tyr1 5 10 15Tyr Asn Thr Glu Thr Lys Gln Ser Thr Trp Glu Lys Pro Asp Asp Gly20 25 30His Met Ala Pro Lys Arg Lys Ser Gly Val Ser Lys Ser Glu Thr Lys35 40 45Ser Thr Lys Ala Cys Pro Arg Pro Ala Pro Val Pro Lys Leu Leu Ile50 55 60Lys Gly Gly Met Glu Val Leu Asp Leu Val Thr Gly Pro Asp Ser Val65 70 75 80Thr Glu Ile Glu Ala Phe Leu Asn Pro Arg Met Gly Gln Pro Pro Thr85 90 95Pro Glu Ser Leu Thr Glu Gly Gly Gln Tyr Tyr Gly Trp Ser Arg Gly100 105 110Ile Asn Leu Ala Thr Ser Asp Thr Glu Asp Ser Pro Gly Asn Asn Thr115 120 125Leu Pro Thr Trp Ser Met Ala Lys Leu Gln Leu Pro Met Leu Asn Glu130 135 140Asp Leu Thr Cys Asp Thr Leu Gln Met Trp Glu Ala Val Ser Val Lys145 150 155 160Thr Glu Val Val Gly Ser Gly Ser Leu Leu Asp Val His Gly Phe Asn165 170 175Lys Pro Thr Asp Thr Val Asn Thr Lys Gly Ile Ser Thr Pro Val Glu180 185 190Gly Ser Gln Tyr His Val Phe Ala Val Gly Gly Glu Pro Leu Asp Leu195 200 205Gln Gly Leu Val Thr Asp Ala Arg Thr Lys Tyr Lys Glu Glu Gly Val210 215 220Val Thr Ile Lys Thr Ile Thr Lys Lys Asp Met Val Asn Lys Asp Gln225 230 235 240Val Leu Asn Pro Ile Ser Lys Ala Lys Leu Asp Lys Asp Gly Met Tyr245 250 255Pro Val Glu Ile Trp His Pro Asp Pro Ala Lys Asn Glu Asn Thr Arg260 265 270Tyr Phe Gly Asn Tyr Thr Gly Gly Thr Cys Thr Pro Pro Val Leu Gln275 280 285Phe Thr Asn Thr Leu Thr Thr Val Leu Leu Asp Glu Asn Gly Val Gly290 295 300Pro Leu Ser Lys Gly Glu Gly Leu Tyr Leu Ser Ser Val Asp Ile Met305 310 315 320Gly Trp Arg Val Thr Arg Asn Tyr Asp Val His His Trp Arg Gly Leu325 330 335Pro Arg Tyr Phe Lys Ile Thr Leu Arg Lys Arg Trp Val Lys Asn Pro340 345 350Tyr Pro Met Ala Ser Leu Ile Ser Ser Leu Phe Asn Asn Met Leu Pro355 360 365Gln Val Gln Gly Gln Pro Met Glu Gly Glu Asn Thr Gln Val Glu Glu370 375 380Val Arg Val Tyr Asp Gly Thr Glu Pro Val Pro Gly Asp Pro Asp Met385 390 395 400Thr Arg Tyr Val Asp Arg Phe Gly Lys Thr Lys Thr Val Phe Pro Pro405 410 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180 185190Thr Ile Lys Thr Ile Thr Lys Lys Asp Met Val Asn Lys Asp Gln Val195 200 205Leu Asn Pro Ile Ser Lys Ala Lys Leu Asp Lys Asp Gly Met Tyr Pro210 215 220Val Glu Ile Trp His Pro Asp Pro Ala Lys Asn Glu Asn Thr Arg Tyr225 230 235 240Phe Gly Asn Tyr Thr Gly Gly Thr Cys Thr Pro Pro Val Leu Gln Phe245 250 255Thr Asn Thr Leu Thr Thr Val Leu Leu Asp Glu Asn Gly Val Gly Pro260 265 270Leu Ser Lys Gly Glu Gly Leu Tyr Leu Ser Ser Val Asp Ile Met Gly275 280 285Trp Arg Val Thr Arg Asn Tyr Asp Val His His Trp Arg Gly Leu Pro290 295 300Arg Tyr Phe Lys Ile Thr Leu Arg Lys Arg Trp Val Lys Asn Pro Tyr305 310 315 320Pro Met Ala Ser Leu Ile Ser Ser Leu Phe Asn Asn Met Leu Pro Gln325 330 335Val Gln Gly Gln Pro Met Glu Gly Glu Asn Thr Gln Val Glu Glu Val340 345 350Arg Val Tyr Asp Gly Thr Glu Pro Val Pro Gly Asp Pro Asp Met Thr355 360 365Arg Tyr Val Asp Arg Phe Gly Lys Thr Lys Thr Val Phe Pro Pro Gly370 375 380
權(quán)利要求
1.通過銜接頭片段將兩種或更多種分子物質(zhì)互相連接起來的方法，其特征在于分子物質(zhì)之一以這樣一種方式被修飾，以致其至少在其一個區(qū)域作為銜接頭片段，展示一個WW結(jié)構(gòu)域或其衍生結(jié)構(gòu)，另一種分子物質(zhì)以這樣一種方式被修飾，以致其至少在其一個區(qū)域作為銜接頭片段，展示一個能夠與WW結(jié)構(gòu)域或其衍生結(jié)構(gòu)結(jié)合的富含脯氨酸序列，以及，通過WW結(jié)構(gòu)域或其衍生結(jié)構(gòu)與富含脯氨酸序列的連接，使分子物質(zhì)建立相互作用，以便達到彼此結(jié)合。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于用于連接的分子物質(zhì)選自蛋白質(zhì)或肽，結(jié)合了糖、核酸或脂類成分的肽或蛋白質(zhì)，DNA，RNA，核酶，合成核酸如肽核酸，或者它們的雜種，也選自由肽和蛋白質(zhì)或它們的結(jié)合物衍生而來物質(zhì)或分子形成的雜種，在這些分子內(nèi)部或表面，用于裝配的一個WW結(jié)構(gòu)域與一個富含脯氨酸序列可以整合。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于用于連接的分子物質(zhì)選自抗體、抗體類似物、酶、結(jié)構(gòu)蛋白、病毒和噬菌體的衣殼蛋白亞單位、肽類抗生素、形成結(jié)構(gòu)的分離物、催化功能或調(diào)節(jié)蛋白的結(jié)構(gòu)域、蛋白片段、肽、肽類似物、抗原承受物、糖蛋白、脂蛋白、蛋白聚糖、或上述物質(zhì)的組合物，在這些分子內(nèi)部或表面，用于裝配的一個WW結(jié)構(gòu)域與一個富含脯氨酸序列可以整合。
4.根據(jù)前述權(quán)利要求中的一項或幾項所述的方法，其特征在于分子物質(zhì)之一為固定相基質(zhì)分子。
5.根據(jù)前述權(quán)利要求中的一項或幾項所述的方法，其特征在于WW結(jié)構(gòu)域出現(xiàn)在蛋白結(jié)構(gòu)的環(huán)狀區(qū)或者蛋白或肽結(jié)構(gòu)的N或C末端。
6.根據(jù)前述權(quán)利要求中的一項或幾項所述的方法，其特征在于富含脯氨酸序列出現(xiàn)在蛋白結(jié)構(gòu)的環(huán)狀區(qū)或者蛋白或肽結(jié)構(gòu)的N或C末端。
7.根據(jù)前述權(quán)利要求中的一項或幾項所述的方法，其特征在于作為分子物質(zhì)之一，使用的病毒或噬菌體衣殼蛋白亞單位，其在衣殼蛋白亞單位的那樣一個位置展示出WW結(jié)構(gòu)域或富含脯氨酸序列，以致，其他分子物質(zhì)，在與第一種分子物質(zhì)發(fā)生結(jié)合或締合并與更多的衣殼蛋白亞單位裝配成病毒或噬菌體衣殼之后，可在病毒或噬菌體衣殼內(nèi)部找到。
8.根據(jù)前述權(quán)利要求中的一項或幾項所述的方法，其特征在于作為分子物質(zhì)之一，使用的病毒或噬菌體衣殼蛋白亞單位，其在衣殼蛋白亞單位的那樣一個位置展示出WW結(jié)構(gòu)域或富含脯氨酸序列，以致與更多的衣殼蛋白亞單位裝配成病毒或噬菌體衣殼之后，可在衣殼的外部找到它。
9.根據(jù)前述權(quán)利要求中的一項或幾項所述的方法，其特征在于除了銜接頭片段之間的結(jié)合以外，通過WW結(jié)構(gòu)域和富含脯氨酸序列間的相互作用，分子物質(zhì)間形成共價鍵。
10.根據(jù)前述權(quán)利要求中的一項或幾項所述的方法，其特征在于通過在WW結(jié)構(gòu)域及其衍生結(jié)構(gòu)區(qū)域特異引入一個或幾個半胱氨酸，同時在富含脯氨酸序列的區(qū)域特異引入一個或幾個半胱氨酸，導致分子物間形成共價連接。
11.根據(jù)前述權(quán)利要求中的一項或幾項所述的方法，其特征在于分子物質(zhì)間形成可逆或不可逆的連接。
12.根據(jù)前述權(quán)利要求中的一項或幾項所述的方法，其特征在于WW結(jié)構(gòu)域和富含脯氨酸序列與分子物質(zhì)間形成共價或非共價的結(jié)合。
13.根據(jù)前述權(quán)利要求中的一項或幾項所述的方法，其特征在于至少一種分子物質(zhì)和(或)結(jié)合區(qū)為合成生產(chǎn)。
14.根據(jù)前述權(quán)利要求中的一項或幾項所述的方法，其特征在于使用了從WW結(jié)構(gòu)域衍生而來的結(jié)構(gòu)，即，變體，與天然WW結(jié)構(gòu)域相比，其被縮短、延長或經(jīng)過個別氨基酸位點的改變，或者其在空間適合位置包含半胱氨酸，或者其包含一前一后幾個WW結(jié)構(gòu)域。
15.根據(jù)前述權(quán)利要求中的一項或幾項所述的方法，其特征在于來自病毒或噬菌體衣殼的修飾或未修飾的單體、雙體、寡聚體成分被作為重組產(chǎn)生的病毒衣殼蛋白亞單位或噬菌體衣殼蛋白亞單位予以使用。
16.通過銜接頭片段而結(jié)合的分子物質(zhì)，其特征在于分子物質(zhì)之一是以那樣一種方式修飾，以致其至少在其一個區(qū)域作為銜接頭片段，展示一個WW結(jié)構(gòu)域或其一個衍生結(jié)構(gòu)，另一種分子物質(zhì)以這樣一種方式被修飾，以致其至少展示一個作為銜接頭片段，能夠與WW結(jié)構(gòu)域或其衍生結(jié)構(gòu)結(jié)合的富含脯氨酸序列，以及，通過WW結(jié)構(gòu)域和富含脯氨酸區(qū)或其衍生結(jié)構(gòu)的締合作用，使分子物質(zhì)相互間建立相互作用，以便達到彼此結(jié)合。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種將兩種或更多種分子物質(zhì)連接起來的方法。借助銜接頭片段,基于富含脯氨酸的氨基酸序列與WW型蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域之間的親合性,該方法產(chǎn)生了靶向相互作用。
文檔編號C07K19/00GK1390140SQ00815316
公開日2003年1月8日 申請日期2000年11月3日 優(yōu)先權(quán)日1999年11月3日
發(fā)明者G·伯姆, U·施密特, C·帕蒂爾, C·京特 申請人:Acgt前基因組公司