專利名稱：檢測性別分化阻斷劑的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種快速評估化學物質(zhì)的內(nèi)分泌阻斷活性的方法，以及醫(yī)學、藥理學、環(huán)境研究和營養(yǎng)學領(lǐng)域的一系列與之相關(guān)的技術(shù)。
在環(huán)境署的過度期報導(dǎo)(1997年7月)“Exogenous EndocrineDisrupting Chemical Task Force”中報導(dǎo)了能導(dǎo)致內(nèi)分泌阻斷的物質(zhì)(或各種類型的物質(zhì))。不過，相信所述物質(zhì)的類型在將來的研究過程中會進一步增加。
測定內(nèi)分泌阻斷活性的已知方法被分成兩類，即體外方法和體內(nèi)方法。體外方法的例子包括測定結(jié)合雌激素受體、雄激素受體或甲狀腺激素受體的活性的方法，以及測定抑制激素合成酶活性的方法。體內(nèi)方法的例子包括在產(chǎn)后的不同日期測定各種激素的產(chǎn)生和異常組織形成的方法，測定蛙的異常變態(tài)的方法，以及測定魚的異常成熟的方法(分析化學，70，15528A-532A，1998)。
優(yōu)選體外方法，因為該方法是靈敏的，并且，該方法可用于在短時間內(nèi)分析多個檢測樣品。不過，采用體外方法不能確定內(nèi)分泌是否確實被阻斷，因為該方法只能確定結(jié)合受體或類似物的活性。另一方面，采用體內(nèi)方法可以直接檢驗對內(nèi)分泌的實際影響，在該方法中，使用諸如大鼠、蛙、或魚之類的動物。因此，為了測定對活體或環(huán)境的影響，這樣的方法是必需的。不過，體內(nèi)方法也有缺陷，因為，例如其靈敏度低，需要復(fù)雜的操作，并且，如果要檢查多個樣品的話，需要很長時間。
例如，業(yè)已建立了一個系統(tǒng)，通過該系統(tǒng)可以監(jiān)測雄性向雌性的轉(zhuǎn)化，以便評估內(nèi)分泌阻斷活性。所述監(jiān)測是利用抗卵黃原蛋白抗體測定雌性體內(nèi)魚雌性專一性卵黃前體蛋白卵黃原蛋白的表達而實現(xiàn)的。不過，要用該系統(tǒng)一次處理大量樣品是困難的。估計用該系統(tǒng)評估成魚時的靈敏度，低于使用魚苗的評估系統(tǒng)，因為魚苗更容易受破壞活性的影響。該系統(tǒng)還具有其它問題，因為它需要大的飼養(yǎng)空間和長的飼養(yǎng)時間。另外，該系統(tǒng)需要針對要評估的相應(yīng)魚的抗卵黃原蛋白抗體。
業(yè)已提出了利用成魚所產(chǎn)的卵的數(shù)量或卵的可孵化性作指數(shù)的評估方法，以及監(jiān)測求偶行為等的評估方法(Lisa，D.等，環(huán)境毒理學和化學，1749-57，1998)。不過，用上述方法不能確定性別分化是否確實被阻斷。
性別分化的阻斷可以通過確定個體的基因型性別和表現(xiàn)型性別并對其進行相互比較而檢驗。例如，業(yè)已提出了一種用于分析阻斷活性的系統(tǒng)，其中，用性別顛倒作指數(shù)。在該系統(tǒng)中，在培育魚苗或卵時對其使用環(huán)境激素，然后測定與第二性別特征相關(guān)的表現(xiàn)型性別。例如，對于青鳉來說，可以用PCR確定基因型性別(Shinoyama，A.等，魚類生物學雜志青鳉，1031-31，1999)，或基因型性別與色素表達連鎖的青鳉系d-rR(Yamamoto，T.，實驗動物學雜志，123571-594，1958)或Qurt(Wada，H.等，動物學科學，15123-126，1998)。為了對生殖腺進行顯微鏡檢查，需要制備組織切片，以便確定魚苗的表型型性別。因此，要處理大量的檢測樣品是困難的。為了根據(jù)與第二性別特征相關(guān)的鰭的形狀確定表現(xiàn)型性別，需要飼養(yǎng)至少一個月。另外，測定也需要技巧。同樣，用該方法處理大量檢測樣品也是困難的。如上文所述，體內(nèi)分析需要從評估開始算起的很長的時間，并且難于一次分析大量的檢測樣品。不過，這樣一種體內(nèi)分析方法，是評估化學物質(zhì)或水環(huán)境或監(jiān)測水污染所必需的。另外，還需要建立快速而又精確的分析系統(tǒng)。
檢查內(nèi)分泌阻斷活性，可以提供一種用于評估化學物質(zhì)對人體的影響，用于測定當其釋放到環(huán)境中時對活體的影響或?qū)ι鷳B(tài)系統(tǒng)的影響，或用于監(jiān)測水污染的指數(shù)。不過，現(xiàn)有技術(shù)具有上述缺陷。因此，需要一種用于測定內(nèi)分泌阻斷活性的靈敏而又快速的方法。
本發(fā)明大體上如下文所述。本發(fā)明的第一方面涉及根據(jù)其表現(xiàn)型性別以雌性專一性形式表達的基因，該基因具有選自由SEQ ID NO1-21的核苷酸序列所構(gòu)成的一組的核苷酸序列。本發(fā)明還涉及能在嚴格條件下與所述序列雜交的基因，以及具有所述序列并具有被插入的一個內(nèi)含子或幾個內(nèi)含子的基因。
本發(fā)明的第二方面涉及一種評估樣品的性別分化阻斷活性的方法，該方法包括(1)給青鳉服用要評估其性別分化阻斷活性的樣品；(2)確定青鳉的基因型性別；(3)根據(jù)雌性專一性基因的表達確定青鳉的表現(xiàn)型性別；和(4)根據(jù)步驟(2)和(3)的結(jié)果確定性別分化是否被阻斷。
本發(fā)明的第三方面涉及一種檢測內(nèi)分泌阻斷劑的方法，包括用所述第二方面的方法評估性別分化阻斷活性。
本發(fā)明的第四方面涉及用于檢測所述第一方面的基因的寡核苷酸。
本發(fā)明的第五方面涉及利用所述第二方面的方法評估性別分化阻斷活性的試劑盒。
本發(fā)明的第六方面涉及用于通過所述第三方面的方法檢測內(nèi)分泌阻斷劑的試劑盒。發(fā)明詳述下面詳細說明本發(fā)明。
本發(fā)明可應(yīng)用于不受限制的任何樣品，包括天然存在的或人工合成的化合物。所述物質(zhì)能以分離形式或混合物形式用于本發(fā)明的方法。本發(fā)明的方法還可用于取自環(huán)境的樣品，如河水或土壤等。
將青鳉用作本發(fā)明方法的生物。這是一種被廣泛用作研究基因的材料，因為它較小并且容易操作，它在產(chǎn)卵時能釋放大量的卵子，其世代周期短(大約3個月)，并且，通過近交可以獲得遺傳學上純合的系。青鳉在孵化之后，可以在96孔微量平板上用蒸餾水飼養(yǎng)大約1周。由于不需要飼料，在評估時可以排除由餌料所產(chǎn)生的諸如阻斷活性的二級因素。
青鳉的飼養(yǎng)可以在包括淡水和海水在內(nèi)的、含有各種濃度的鹽的水中進行，飼養(yǎng)溫度為大約0-大約30℃的很寬的溫度范圍。因此，可將其用于評估各種環(huán)境。
用于本發(fā)明的青鳉不受具體限制?？梢允褂靡吧颓圜毣蚱浠蛐托詣e與色素表達連鎖的青鳉系，如d-rR或Qurt。
Qurt是leucophore free(lf)基因座雜合的青鳉系，該基因座與性別緊密連鎖。Qurt的雌性(Xlt/Xlf)個體是無色的，而雄性(Xlf/Y+)個體由于色素表達的結(jié)果是黃色的。黃色可以出現(xiàn)在卵上。因此，本發(fā)明優(yōu)選使用Qurt，因為不需要提取DNA，通過對卵進行顯微鏡檢查就可以方便地確定其基因型性別(動物學科學，15123-126，1998)。
根據(jù)本發(fā)明，用于確定基因型性別的方法不受特別限制。例如，通過對性別染色體進行遺傳學分析可以確定基因型性別。
青鳉的基因型性別是根據(jù)受精時性別染色體的以下組合決定的X/X為雌性；而X/Y為雄性。因此，基因型性別可以通過性別染色體的遺傳學分析確定。遺傳學分析的方法沒有特別限制。例如，該分析可以通過用能與性別染色體上的一個基因雜交的探針進行雜交而實現(xiàn)，或者通過使用能用于擴增性別染色體上的一個基因的引物進行PCR而實現(xiàn)。如果所述方法被用于確定基因型性別，還必須制備來自個體的DNA和RNA。這是因為必須利用RNA分析雌性專一性基因的表達，以便按下文所述方法確定表現(xiàn)型性別。在這種情況下，將魚苗的頭部切掉。將含有生殖腺等的剩余的身體部分用于測定基因的表達，該基因是根據(jù)表現(xiàn)型性別進行專一性表達的，如下文所述。將從頭部提取的DNA用于確定基因型性別?；蛘?，可以用QIAGEN RNA/DNA系統(tǒng)(QIAGEN)同時制備DNA和RNA。另外，可以用DNeasy96組織試劑盒(QIAGEN)同時制備來自96孔微量平板的多個檢測樣品的DNA。
如果使用青鳉系Qurt，可以在受精后次日識別基因型性別所特有的色素表達的差別。因此，不需要制備DNA，通過檢測色素就可以確定卵的基因型性別。
根據(jù)本發(fā)明的方法，將青鳉的以表現(xiàn)型性別專一性方式表達的基因用于確定表現(xiàn)型性別。使用以表現(xiàn)型雌性專一性方式表達的青鳉基因。在孵化之后5天內(nèi)專一性表達的基因可優(yōu)選用于早期的評估。
所述基因的例子包括以下基因(1)FIGα，含有一個堿性螺旋-環(huán)-螺旋基序的轉(zhuǎn)錄因子；(2)eIF-4，延長起始因子的帽結(jié)合亞基；(3)編碼含有ZP結(jié)構(gòu)域的蛋白的基因；(4)42Sp50和42Sp43，編碼卵細胞專一性RNA儲存蛋白的基因；(5)醌還原酶基因；和(6)編碼分泌蛋白的未知基因。
所述基因的例子是這樣的基因，該基因具有SEQ ID NO1-21的序列或能在嚴格條件下與所述序列雜交的序列。例如，嚴格雜交條件包括披露于以下文獻中的條件T.Maniatis等(著)，分子克隆實驗室手冊，第2版，冷泉港實驗室，1989。所述條件的例子如下在65℃下，在含有6×SSC(1×SSC0.15M氯化鈉，0.015M檸檬酸鈉，pH7.0)、0.5％SDS、5×denhardt’s和100毫克/毫升鯡魚精DNA的溶液中與探針一起培養(yǎng)過夜。
所述基因可存在于插入了一個內(nèi)含子或幾個內(nèi)含子的染色體上。本發(fā)明還包括具有插入了一個或幾個內(nèi)含子的所述基因。所述基因的例子包括具有SEQ ID NO22的核苷酸序列的基因(插入了內(nèi)含子的SEQ IDNO1的序列)或具有SEQ ID NO23的核苷酸序列的基因(插入了內(nèi)含子的SEQ ID NO8的序列)。
例如，上述基因可以按下文所述方法分離。
青鳉的性別分化最初表現(xiàn)為這樣一種現(xiàn)象，在孵化時(即受精后大約第10天)，雌性體內(nèi)生殖細胞的數(shù)量大約為雄性的兩倍(Satoh，N.，Egami，N.，胚胎學實驗形態(tài)學雜志，28385-395，1972)。這是因為雌性體內(nèi)的一部分生殖細胞在孵化之后馬上開始有絲分裂，而雄性體內(nèi)的生殖細胞直到孵化之后2個月才開始分裂。用生殖細胞系的性別分化差別作指標，可以在早期發(fā)育階段鑒定以雌性專一性形式表達的基因。通過扣除雜交可以檢查青鳉雄性和雌性之間的基因表達差別。在孵化之前，基因型雄性和雌性是彼此分離的。在孵化之后從基因型雄性和雌性中提取RNA。然后，可以通過扣除雜交分離以雌性專一性形式表達的基因。如果使用青鳉系Qurt，利用色素基因的表達作指標，在孵化之前或受精后次日可以方便地區(qū)分基因型雄性和雌性。
通過用由此獲得的基因作探針根據(jù)已知方法篩選基因組文庫，可以分離相應(yīng)于每一個基因的基因組基因。
所述基因可以用根據(jù)該基因的核苷酸序列設(shè)計的寡核苷酸檢測。用于檢測本發(fā)明基因的寡核苷酸包括，但不限于可用于根據(jù)基因擴增方法擴增所述基因或該基因的一部分的引物，以及能夠在嚴格條件下與該基因雜交的探針。
可以使用的基因擴增方法的例子包括，但不限于PCR、SDA、NASBA和ICAN(WO 00/56877)。
引物或探針可以視需要根據(jù)該基因的核苷酸序列設(shè)計。當然，在設(shè)計時選擇一種序列，以便引物或探針不會在分子內(nèi)部形成二級結(jié)構(gòu)，并且要注意的是，使得引物或探針以及相應(yīng)模板的解鏈溫度(Tm值)設(shè)定為合適的溫度。
例如，引物或探針的Tm值可以按以下公式確定Tm＝81.5-16.6(log10[Na+])+0.41(％G+C)-(600/N)其中，N是引物或探針的鏈長；％G+C是引物或探針中鳥嘌呤或胞嘧啶殘基的含量。
如果引物或探針的鏈長短于18個堿基，例如，Tm值可以計算為腺苷和胸苷(A+T)殘基的數(shù)量乘以2(℃)的乘積和G+C的殘基的數(shù)量乘以4(℃)的乘積的總和，即[(A+T)X2+(G+C)X4]。
盡管不是要限定本發(fā)明，但探針的鏈長優(yōu)選為15個堿基或更多，更優(yōu)選18個堿基或更多，以避免非專一性雜交。
盡管不是要限定本發(fā)明，例如，可以使用鏈長為15-40個堿基的引物。特別是，可以優(yōu)選使用鏈長為17-30個堿基的引物。
另外，需要對引物進行設(shè)計，以使3’末端周圍的胞嘧啶(C)和鳥嘌呤(G)的比例變高。用于引物設(shè)計的商業(yè)化軟件，如OLIGOTM引物分析軟件(Takara Shuzo)可用于設(shè)計引物。
在所述引物或探針的一部分序列上可以具有突變，如一個核苷酸(或幾個核苷酸)的缺失、取代、插入或添加，只要它能用于檢測該基因即可。對于引物來說，最好沒有突變，或者如果有的話，要減少該引物3’末端周圍的突變，因為這種突變會大大影響引物延伸反應(yīng)的效率。在引物的5’末端可以添加與該基因的核苷酸序列無關(guān)的合適序列(例如，可以由RNA聚合酶識別的啟動子序列)。
可以對所述引物或探針選擇性地進行合適的修飾。在引物或探針上添加諸如生物素或洋地黃毒苷或熒光物質(zhì)的配體，有利于擴增反應(yīng)產(chǎn)物的檢測。
用所述引物進行的基因擴增反應(yīng)的產(chǎn)物，可以用以下方法檢測擴增反應(yīng)之后，對一部分反應(yīng)混合物進行電泳，然后用溴化乙錠對DNA進行染色。可以通過雜交不進行電泳來檢測擴增產(chǎn)物。如果使用修飾過的引物，可以使用適合修飾的檢測方法。
可以構(gòu)建包括所述引物或探針的試劑盒，并用于檢測本發(fā)明的基因。所述試劑盒可以包括用于擴增反應(yīng)或雜交的緩沖液或酶。該試劑盒還可以包括一種用于從細胞制備核酸樣品或用于檢測擴增產(chǎn)物的試劑，以便使得該檢測更方便。
檢測基因表達的方法沒有特殊限制。例如，可以通過Northern雜交、RT-PCR等檢測用孵化后第1-第5天青鳉制備的RNA中由所述基因轉(zhuǎn)錄的mRNA來檢測所述表達。
可以用青鳉制備RNA，例如，通過用TRIzol試劑(Gibco-BRL)等直接處理青鳉個體。或者，可以用QIAGEN RNA/DNA系統(tǒng)(QIAGEN)同時制備RNA和DNA。在這種情況下，DNA可直接用于確定基因型性別。另外，可以用RNeasy96試劑盒(QIAGEN)由96孔微量平板上的多個測試樣品同時制備DNA。
為了排除由于基因組DNA擴增產(chǎn)物所導(dǎo)致的假陽性結(jié)果，需要使用一對引物進行RT-PCR，該引物可用于擴增由感興趣的基因轉(zhuǎn)錄的mRNA的一部分，并將其設(shè)計成使得該基因的相應(yīng)部分含有被插入的一個內(nèi)含子或幾個內(nèi)含子。例如，可以用引物F1(SEQ ID NO30)和引物R1(SEQ ID NO31)的組合、引物F2(SEQ ID NO32)和引物R2(SEQID NO33)的組合等檢測基因5。引物F1、R1、F2和R2分別具有外顯子2、8、2和7的序列。
如果使用引物F1和R1，由mRNA擴增的產(chǎn)物的大小大約為730bp，而由基因組DNA擴增的產(chǎn)物的大小大約為1.1kbp。如果使用引物F2和R2，由mRNA擴增的產(chǎn)物的大小大約為590bp，而由基因組DNA擴增的產(chǎn)物的大小大約為0.9kbp。因此，由mRNA擴增的產(chǎn)物與作為背景的由基因組DNA擴增的產(chǎn)物明顯不同。
利用上述引物對可以實現(xiàn)更靈敏的檢測，用引物對F1和R1進行第一輪PCR，然后用引物對F2和R2進行嵌套PCR。
可以用引物863.3(SEQ ID NO24)和引物863.1(SEQ ID NO25)的組合，引物863.3(SEQ ID NO24)和引物1/15(SEQ ID NO26)的組合等檢測基因1。引物863.3、863.1和1/15分別具有外顯子1、3和4的序列。如果使用引物863.1和863.3，由mRNA擴增的產(chǎn)物的大小大約為300bp，而由基因組DNA擴增的產(chǎn)物的大小大約為1kbp。如果使用引物863.3和1/15，由mRNA擴增的產(chǎn)物的大小大約為400bp，而由基因組DNA擴增的產(chǎn)物的大小大約為4kbp。因此，由mRNA擴增的產(chǎn)物與作為背景的由基因組DNA擴增的產(chǎn)物明顯不同。
可以用引物6a(SEQ ID NO27)和引物6b(SEQ ID NO28)的組合、引物6a(SEQ ID NO27)和引物8.3(SEQ ID NO29)的組合等檢測基因8。引物6a、6b和8.3分別具有外顯子3、7和8的序列。如果使用引物6a、6b，由mRNA擴增的產(chǎn)物的大小大約為530bp，而由基因組DNA擴增的產(chǎn)物的大小大約為1.3kbp，如果使用引物6a和8.3，由mRNA擴增的產(chǎn)物的大小大約為880bp，而由基因組DNA擴增的產(chǎn)物的大小大約為2.2kbp。因此，由mRNA擴增的產(chǎn)物與作為背景的由基因組DNA擴增的產(chǎn)物明顯不同。
為了排除由基因組DNA所產(chǎn)生的假陽性結(jié)果，需要使用這樣一種Northern雜交探針，該探針能與由感興趣的基因轉(zhuǎn)錄的mRNA的一部分雜交，并且，該探針被設(shè)計成使得該基因上的相應(yīng)部分含有插入的一個或幾個內(nèi)含子。
所述基因的表達可以用DNA微陣列檢測。DNA微陣列是在它上面固定了核酸的材料，其中，將多種不同的基因或DNA片段排列并固定在諸如載玻片的固相基質(zhì)。通過讓DNA與由用于雜交的樣品制備的核酸樣品(優(yōu)選標記過的核酸樣品)接觸，可以用該DNA微陣列檢查一種核酸樣品中具有互補于固定在微陣列上的DNA的序列的核酸的存在。使用該微陣列，可以同時監(jiān)測取決于表現(xiàn)型性別的專一性表達的若干基因的表達。
另外，可以用由所述基因翻譯的蛋白的抗體檢測該基因的表達。對使用的抗體沒有特別限制，只要它能識別由所述基因表達的蛋白即可。用已知方法制備的多克隆抗體、或單克隆抗體等。
可以通過比較按上述方法確定的表現(xiàn)型性別和基因型性別評估一種樣品的性別分化阻斷活性。用該方法可以評估一種樣品的內(nèi)分泌阻斷活性。盡管不是要限定本發(fā)明，性別分化的阻斷可以體現(xiàn)為在基因型雄性個體中表現(xiàn)型雌性專一性基因的表達，或在基因型雌性個體中表現(xiàn)型雌性專一性基因表達的喪失。
例如，可以按以下方法評估一種樣品的性別分化阻斷活性。在受精之后，馬上在試驗水樣品中培養(yǎng)青鳉卵。按上述方法確定每一個個體的基因型性別和表現(xiàn)型性別。如果一個個體的基因型性別不同于該個體的表現(xiàn)型性別，就認定該個體受性別分化阻斷活性的影響。通過統(tǒng)計所述個體的數(shù)量，可以評估該樣品的性別分化阻斷活性。如果使用基因型性別與色素表達連鎖的青鳉系Qurt的話，基因型性別與色素表達之間的關(guān)系，可能會因為染色體轉(zhuǎn)位而顛倒，發(fā)生轉(zhuǎn)位的可能性通常為百分之幾或更低。通過增加測試樣品的數(shù)量可以解決這一問題。對于基因型性別同樣與色素表達連鎖的青鳉系t-rR來說，很少出現(xiàn)染色體轉(zhuǎn)位。因此，如果使用該青鳉系的話，幾乎不會出現(xiàn)基因型性別和色素表達之間關(guān)系的顛倒。
用于評估性別分化阻斷活性的試劑盒是用本發(fā)明方法評估所述活性的試劑盒。盡管不是要限定本發(fā)明，可以用可用于檢測上述本發(fā)明基因的含有寡核苷酸的試劑盒作為例子。所述試劑盒可以含有用于擴增反應(yīng)的緩沖液或酶。該試劑盒還可以包括一種由細胞核酸樣品或檢測擴增產(chǎn)物存在的試劑，以便用于檢測。
本發(fā)明的用于檢測內(nèi)分泌阻斷劑的試劑盒是利用本發(fā)明方法檢測內(nèi)分泌阻斷劑的試劑盒。盡管不是要限定本發(fā)明，可以用可用于檢測上述本發(fā)明基因的含有寡核苷酸的試劑盒作為例子。所述試劑盒可以含有用于擴增反應(yīng)的緩沖液或酶。該試劑盒還可以包括一種由細胞核酸樣品或檢測擴增產(chǎn)物存在的試劑，以便用于檢測。
用本發(fā)明的方法可以在孵化后第5天的早期階段確定表現(xiàn)型性別。通常，只能在孵化后一個月或一個月以上，根據(jù)與第二性別特別相關(guān)的鰭的形狀的改變等來確定表現(xiàn)型性別。另外，對于本發(fā)明來說，不需要特殊技能。因此，利用本發(fā)明的方法還可以處理多個檢測樣品。該方法可有效地快速并方便地評估天然存在的或人工合成的化合物以及來自環(huán)境的樣品，如河水或土壤的內(nèi)分泌阻斷活性。
例1通過扣除雜交鑒定雌性專一性基因在25℃下，在14小時的光照周期和10小時的黑暗周期的條件下，在3升綠色水(含有綠藻的小球藻的純化水)中，飼養(yǎng)由一個雄性和一個雌性組成的一對成熟Qurt青鳉(動物學科學，15123-126，1998)。每天用TetraMin喂食3-5次，設(shè)定TetraMin的量，使得在3-5分鐘內(nèi)被吃光，然后排卵。在排卵之后第4天，在熒光顯微鏡下，通過根據(jù)自發(fā)熒光檢查黃色色素基因的表達，將胚胎從基因型上分類成雄性和雌性。用4個時期的樣品制備mRNA(37/39時期(孵化前2-3天)，或孵化后1、5或30天)，所述時期是按照Iwamatsu分類表分類的(Iwamatsu，T.動物學科學，11825-839，1994)。用寡聚(dT)引物和Copy試劑盒(Invitrogen)制備cDNA。用限制酶AluI裂解cDNA，與接頭連接(Wang，Z.和Brown，D.，美國科學院院報，8811505-11509，1991)，并通過PCR擴增。用來自每一時期的雄性和雌性的cDNA進行扣除雜交。其余的cDNA通過PCR擴增。將所述扣除/PCR擴增過程重復(fù)3次。將相應(yīng)時期的雄性和雌性的擴增的cDNA克隆到質(zhì)粒中，以便獲得8個cDNA文庫。分離從相應(yīng)文庫中隨機挑選的插入克隆中的片段，并進行Southern雜交，以便篩選在每一時期以性別專一性形式表達的基因。將原始cDNA和經(jīng)過3輪扣除/PCR擴增之后所獲得的cDNA用作Southern雜交的探針。沒有出現(xiàn)雄性專一性陽性反應(yīng)。因此，不能分離到以雄性專一性形式表達的基因。分別從第5天和第30天的雌性文庫中獲得了3個和47個以雌性專一性形式表現(xiàn)陽性反應(yīng)的克隆。用插入這些克隆中的片段作探針，與來自第1天、第5天或第30天雄性或雌性的cDNA雜交(原始cDNA和在經(jīng)過3輪扣除/PCR擴增之后獲得的cDNA)。根據(jù)上述雜交結(jié)果，將基因分成3類，即在第1天、第5天或第30天在雌性體內(nèi)表達的基因類型。測定了屬于在第1天在雌性體內(nèi)表達的類型的2個基因(基因1和2)以及屬于在第5天在雌性體內(nèi)表達的類型的19個基因(基因3-21)的核苷酸序列。所測定的基因1-21的核苷酸序列如SEQID NO1-21所示。
對所測定的基因序列所作的數(shù)據(jù)庫同源性檢索發(fā)現(xiàn)，所述基因與已知基因具有如下同源性基因1(SEQ ID NO1)-編碼FIGα的基因，具有堿性螺旋-環(huán)-螺旋基序的小鼠轉(zhuǎn)錄因子；基因2(SEQ ID NO2)-編碼eIF-4的基因，人的延伸起始因子的帽結(jié)合亞基；基因3(SEQ IDNO3)-編碼兔ZPA結(jié)構(gòu)域的基因；基因4(SEQ ID NO4)-編碼金魚GPB結(jié)構(gòu)域的基因；基因5(SEQ ID NO5)-編碼鯉魚ZPC結(jié)構(gòu)域的基因；基因6(SEQ ID NO6)-編碼斑馬魚ZPC結(jié)構(gòu)域的基因；基因7(SEQ ID NO7)-編碼鯉魚ZPC結(jié)構(gòu)域的基因；基因8(SEQ ID NO8)-編碼斑馬魚ZPC結(jié)構(gòu)域的基因；基因9(SEQ ID NO9)-編碼斑馬魚ZPC結(jié)構(gòu)域的基因；基因10(SEQ ID NO10)-非洲爪蟾屬42Sp42基因，它編碼卵細胞專一性RNA儲存蛋白；基因11(SEQ ID NO11)-非洲爪蟾屬42Sp50基因；和基因12(SEQ ID NO12)-大鼠醌還原酶基因?；?3-21(SEQ ID NO13-21)與已知基因沒有同源性。據(jù)推測，這些未知基因根據(jù)其序列特征編碼分泌蛋白。
然后，用按照已知方法由青鳉制備的染色體DNA構(gòu)建基因組文庫。用基因1或8作探針進行篩選。分離相應(yīng)的基因組基因，并測定其核苷酸序列。基因組基因22(相當于基因1)的核苷酸序列和基因組基因23(相當于基因8)的核苷酸序列如SEQ ID NO22和23所示。
例2檢測17β-雌二醇的性別分化阻斷活性在25℃下，在14小時的光照周期和10小時的黑暗周期的條件下，在3升綠色水(含有綠藻的小球藻的純化水)中，飼養(yǎng)由一個雄性和一個雌性組成的一對成熟Qurt青鳉(動物學科學，15123-126，1998)。每天用TetraMin喂食3-5次，設(shè)定TetraMin的量，使得在3-5分鐘內(nèi)被吃光，然后排卵。在排卵之后，將來自5對的卵放在培養(yǎng)皿中，在除去了氯的自來水中用鑷子將每一個卵分離，并洗滌。用含有0.1％二甲基亞砜的1-ppb 17β-雌二醇(E2)水溶液取代上述水。將該混合物分配到用超純凈水徹底洗凈的96孔圓底微量平板(#3797，Corning)的孔中，使每一個孔含有一個卵。用蓋子覆蓋，然后將該微量平板放在培養(yǎng)箱中在25℃下培養(yǎng)。在開始培養(yǎng)之后的第3天，通過用熒光顯微鏡(尼康)檢查表現(xiàn)為自發(fā)熒光的以雄性專一性形式表達的黃色色素區(qū)分雄性和雌性。繼續(xù)進行上述培養(yǎng)，并在排卵之后第7天-第9天孵化魚苗。在排卵后第12天(孵化后第3-第5天)收集魚苗，然后浸泡在RNAlater(#7021，Ambion)中，并在-80℃下保存。用StrataPrep總RNA小量制備試劑盒(#400711，Stratagene)從魚苗體內(nèi)提取RNA。將試驗樣品浸泡在所述試劑盒所帶的裂解溶液中，并在1.5毫升試管中用顆粒攪拌器(UrinSeisakusho)勻漿，然后，按照該試劑盒所帶的手冊的說明進行提取。所提取的RNA用TaKaRa一步RNA PCR試劑盒(AMV)(Takara Shuzo)進行處理。第1輪PCR是用引物對引物F1(SEQ ID NO30)和R1(SEQID NO31)進行的，該引物被用于擴增基因5上的一個729bp的片段(SEQID NO5)，該基因以雌性專一性形式表達。然后，用引物對F2(SEQID NO32)和R2(SEQ ID NO33)進行嵌套PCR。該引物被用于擴增所述729bp片段上的一個593bp的片段，用第1輪PCR的每一種產(chǎn)物的0.5微升作為模板。所得到的擴增產(chǎn)物在2％瓊脂糖凝膠上進行電泳。結(jié)果如表1所示。在表1中，基因型性別表示顯微鏡檢查的結(jié)果，而表現(xiàn)型性別表示用RT-PCR區(qū)分雌性和雄性的結(jié)果。
表1對照組(用溶劑(含有0.1％DMSO的水)處理)樣品編號 1 2 3 4 5 6 7 8基因型性別 ♂ ♂ ♂ ♂ ♀ ♀ ♀ ♀基因5的表達- - - - + + + +用1ppb17β-雌二醇處理樣品編號 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10基因型性別 ♂ ♂ ♂ ♂ ♂ ♀ ♀ ♀ ♀ ♀基因5的表達- - - + + - - + + +對于由對照組中用溶劑(含有0.1％DMSO的水)處理過的卵孵化的魚苗來說，僅在基因型雌性上觀察到雌性專一性基因基因5的表達，而在基因型雄性上沒有觀察到。因此，基因型性別與表現(xiàn)型性別一致。另一方面，對于用由1ppb17β-雌二醇處理過的卵孵化過的魚苗來說，在5個基因型雄性中的2個上觀察到了基因5的表達。另外，在5個基因型雌性中的2個上沒有觀察到基因6的表達。上述結(jié)果表明，性別分化被阻斷了。
工業(yè)應(yīng)用性本發(fā)明首次提供了根據(jù)表現(xiàn)型性別以雌性專一性形式表達的青鳉基因。本發(fā)明提供了利用所述基因的表達作指標確定表現(xiàn)型性別的快速而又方便的方法。按照本發(fā)明的方法，在孵化5天之后可以確定其表現(xiàn)型性別。通常表現(xiàn)型性別只有到孵化之后一個月才能確定。另外，按照本發(fā)明的方法，可以在短時間內(nèi)對多個測試樣品進行確定。
通過以下方法可以快速而又方便地確定一種樣品的性別分化阻斷活性給青鳉服用被懷疑具有性別分化阻斷活性的樣品，按照本發(fā)明的方法確定青鳉的表現(xiàn)型性別，并將所確定的結(jié)果與基因型性別加以比較。
序列表純文本SEQ ID NO1基因1的cDNASEQ ID NO2基因2的cDNASEQ ID NO3基因3的cDNASEQ ID NO4基因4的cDNASEQ ID NO5基因5的cDNASEQ ID NO6基因6的cDNASEQ ID NO7基因7的cDNASEQ ID NO8基因8的cDNASEQ ID NO9基因9的cDNASEQ ID NO10基因10的cDNASEQ ID NO11基因11的cDNASEQ ID NO12基因12的cDNASEQ ID NO13基因13的cDNASEQ ID NO14基因14的cDNASEQ ID NO15基因15的cDNASEQ ID NO16基因16的cDNA
SEQ ID NO17基因17的cDNASEQ ID NO18基因18的cDNASEQ ID NO19基因19的cDNASEQ ID NO20基因20的cDNASEQ ID NO21基因21的cDNASEQ ID NO22基因1的基因組DNASEQ ID NO23基因8的基因組DNASEQ ID NO24PCR引物863.3SEQ ID NO25PCR引物863.1SEQ ID NO26PCR引物1/15SEQ ID NO27PCR引物6aSEQ ID NO28PCR引物6bSEQ ID NO29PCR引物8.3SEQ ID NO30PCR引物F1SEQ ID NO31PCR引物R1SEQ ID NO32PCR引物F2SEQ ID NO33PCR引物R2
序列表<110>寶酒造株式會社(Takara Shuzo Co.，Ltd.)<120>檢測性別分化阻斷劑的方法<130>662292<150>JP 11-372602<151>1999-12-28<160>33<210>1<211>1099<212>DNA<213>青鳉(Oryzias latipes)<220><223>基因1 cDNA<400>1gtaaacggac agctagagtt cagctgaaaa gaagtgtaat tctattcgga cgtagtcttt 60aaaaaaaaaa tgaaggtgcc agaggcggaa ttaatgagcg acattctgaa gaggctgacg 120ggagagtctg ctctgccgct gtactgctgc atcgagaagt acaagcgcga gaggaacggc 180ctctactttg tcgccgagga tttcactgaa accgtcaaaa aaagagaaat ggtcaacgcc 240aaggaaagac tgagaataag gaacttgaac acaatgttct cccgactgaa gcgcatgctg 300cctctaatgc aaccagacaa aaagccgagt aaagttgata cactcaaagc agccactgaa 360tacattcgac ttcttcttgc tgttttgcgg gacactgaaa ataacaacac tgggacggat 420tttctaaaga atgcaatcac ttatggtcag caggatggct tcgccaatga cctctggaga 480atggacgatt tcttgaacct gtcagatgat cacatggagg atgggttcac catgccagca 540gaacctgcag cagaggatgg agacatgact agactggtgt tgcagcattg tgtgatgcct 600gcataccagt tcatcatcca agtagcgccc gatcaagctt cgagggatta attagccacc 660gcctcccgac tgcacatccc aaccactgac ccgatgtcct tgctatcttg gacattgatg 720acttgcactc tttttccttg acacttatta taaaatggct tgatttaaaa cctaaccctt 780aatttttttt tcattattta gttgtacata cattggaagt tgatgcatct agtaaacata 840cctaaaaaga actgctgctc taagagttct cattttgctt tcagctgtac tctatttgag 900gaaatgactt aatttatgta tttttcttgt aattgtaatc ataaagcccc aatgaaaaag 960atgcaaattt gtgacaattt gttgaggtca atgtgatcta agttgtcaat atgaattatc 1020tgtttgaaaa cttgaatcta atttaaattc agaaatgtct aaatgtgttt agttaatgat 1080caaataaaca agctttaag 1099<210>2<211>938<212>DNA<213>青鱂(Oryzias latipes)<220><223>基因2 cDNA<400>2gaccgccgta gtggtgtcca cttcgattcc tggaaacctc gaggaaaaaa gtgaaataag 60caacggaaag atcgggaatc ctgaggcttg catcaaacat cccttacaga acaggtggac 120tctttggttt ttcaagaatg acaaaagcaa aacctggcag gccaaccttc gtctcatctc 180tacgtttgac acagttgagg atttctgggc gttatacaat catattcaac tgtcaagtaa 240cttgatgtct ggctgtgact actctctgtt taaggatggg attgaaccca tgtgggagga 300tgaaaggaat cggcgtgggg gccgctggct catcaccctg tccaaacatc aacggaaaat 360ggatctggac cggttctggt tggagacgct tttgtgtctc gtgggcgaag cctttgatga 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tcaatggcac 300acaacgtatt ttggtgacac ccagtctggc tgcccagtgt ggatacagca tggagtctga 360cccatgggga aacaccagga tctacatgtc tctgttgggt tgctttatgg ttagcaagga 420tgagtccacc ttcagcacca gcttgaaact gcacatgtac aagcacagtc cctctgatgt 480ggtcagccat gatgtgactc agacctgcag ctattctcgc tgggccttca gagatgtcct 540ctgtgacagg aactacatgg aagtgtcagc tcacatcgct cccagtcaac aaacaaaagg 600acaagttcag aacaaggaca actctcaaac aaataagctt cctggtgact ccaatgacgc 660ccctggaatc tggaagatga ccttttacac tcctgaacct gttgcgatgg tcctgaaaga 720agccgaacaa gctggttatg gtgcaacaat gagacaaact cgcctggcaa tcagaagccc 780ctatcatact tcagagactt attctgaaga tgttgctgga gtccccatgg aaatcctcaa 840agtgagcgtt taccacaaaa ctcaagaggg actgaatgtt gtcaacttgg cagctgcttg 900ccccacaggt ggcattctct tcactgacga gttcatctcc tggcacatcc ctcgccgcgt 960aactcctcta actgagggca aggtcaagat tgtagagctg tacatgggaa tcaatggaca 1020gaggctggaa aaggctcaaa tagctgcaag aggttactcc ctctcaacca cagagttcca 1080cattgttgtt gacatcccag tgggatcacc tgacggctac tacaagagcc atgctccaga 1140cttcctgtac 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1.一種根據(jù)其表現(xiàn)型性別以雌性專一性形式表達的青鳉基因，該基因具有選自由SEQ ID NO1-21的核苷酸序列所構(gòu)成的一組的核苷酸序列。
2.一種根據(jù)其表現(xiàn)型性別以雌性專一性形式表達的基因，該基因能在嚴格條件下與權(quán)利要求所限定的基因雜交。
3.一種根據(jù)其表現(xiàn)型性別以雌性專一性形式表達的基因，該基因具有選自由SEQ ID NO1-21的核苷酸序列所構(gòu)成的一組的核苷酸序列，以及被插入的一個內(nèi)含子或幾個內(nèi)含子。
4.如權(quán)利要求3的基因，該基因具有SEQ ID NO22或23的核苷酸序列。
5.一種用于評估樣品的性別分化阻斷活性的方法，該方法包括(1)給青鳉服用要評估其性別分化阻斷活性的樣品；(2)確定青鳉的基因型性別；(3)根據(jù)雌性專一性基因的表達確定青鳉的表現(xiàn)型性別；和(4)根據(jù)步驟(2)和(3)的結(jié)果確定性別分化是否被阻斷。
6.如權(quán)利要求5的方法，其中，所述基因型性別是用孵化之前的青鳉卵或孵化之后5天之內(nèi)的青鳉魚苗確定的。
7.如權(quán)利要求5或6的方法，其中，所述表現(xiàn)型性別是用孵化之后5天之內(nèi)的青鳉魚苗確定的。
8.如權(quán)利要求5-7中任一項的方法，其中，將所述樣品用于孵化之前的青鳉卵或孵化之后5天之內(nèi)的青鳉魚苗。
9.如權(quán)利要求5-8中任一項的方法，其中，使用其基因型性別與色素表達連鎖的青鳉系。
10.如權(quán)利要求5-9中任一項的方法，其中，通過檢查權(quán)利要求1-4中任一項所限定的基因的表達確定青鳉表現(xiàn)型性別。
11.如權(quán)利要求10的方法，其中，所述基因的表達是用該基因的mRNA的產(chǎn)生作指標檢查的。
12.一種檢測內(nèi)分泌阻斷劑的方法，包括通過權(quán)利要求5-11中任一項所限定的方法評估性別分化阻斷活性。
13.一種用于檢測權(quán)利要求1-4中任一項所限定的基因的寡核苷酸。
14.一種用權(quán)利要求5-11中任一項所限定的方法評估性別分化阻斷活性的試劑盒，該試劑盒包括權(quán)利要求13所限定的寡核苷酸。
15.一種用權(quán)利要求12所限定的方法檢測內(nèi)分泌阻斷劑的試劑盒，該試劑盒包括權(quán)利要求13所限定的寡核苷酸。
全文摘要
根據(jù)表現(xiàn)型性別由雌性專一性表達的淡水魚基因，其特征是它具有選自序列表中SEQ ID NO1－21所示堿基序列的堿基序列。
文檔編號C07K14/46GK1411507SQ00817434
公開日2003年4月16日 申請日期2000年12月25日 優(yōu)先權(quán)日1999年12月28日
發(fā)明者金森章, 木下政人, 高嶋良吉, 蝶野英人, 水谷滋利, 近藤昭宏, 加藤郁之進 申請人:寶生物工程株式會社