專(zhuān)利名稱(chēng)：轉(zhuǎn)基因奶牛早期胚胎性別鑒定的分子生物學(xué)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于動(dòng)物繁殖技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及牛早期胚胎性別鑒定領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
為了充分發(fā)揮轉(zhuǎn)基因奶牛的潛力，擴(kuò)大轉(zhuǎn)基因奶牛的規(guī)模，可以通過(guò)胚胎移植技術(shù)來(lái)提高轉(zhuǎn)基因奶牛的繁殖速度，并且通過(guò)胚胎移植技術(shù)可以大大降低生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因奶牛的成本。對(duì)轉(zhuǎn)基因奶牛早期胚胎進(jìn)行性別鑒定，再進(jìn)行移植，可以便外源基因有效的遺傳給下一代，在生產(chǎn)中具有重要的科學(xué)研究?jī)r(jià)值和商業(yè)價(jià)值。到目前為止，性別控制的方法主要分為兩個(gè)方面一是X、Y精子的分離技術(shù)，結(jié)合人工受精，來(lái)控制后代性別，但目前分離速度太慢(1. 8 X 107個(gè)/h)，精液價(jià)格昂貴，且分離后精液不耐冷凍，后代有一定的畸形率，因而應(yīng)用受到限制。一是通過(guò)胚胎性別鑒定，結(jié)合胚胎移植來(lái)進(jìn)行性別控制。家畜胚胎的性別鑒定已成為家畜胚胎移植技術(shù)的一項(xiàng)重要內(nèi)容。用分子生物學(xué)方法鑒定家畜胚胎性別是20世紀(jì)80年代后期才開(kāi)始的。目前，已被國(guó)內(nèi)外研究人員廣泛應(yīng)用于家畜，尤其是牛胚胎的性別鑒定。其主要方法有雄性特異性DNA 探針檢測(cè)法、PCR擴(kuò)增DNA片段檢測(cè)法、PCR擴(kuò)增SRY法等。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，研究出一種可在牛生產(chǎn)實(shí)踐中推廣應(yīng)用的快速、簡(jiǎn)便的鑒別方法，并通過(guò)該發(fā)明加快轉(zhuǎn)基因奶牛生產(chǎn)。實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)方案是1、試樣的制備與保存從待檢牛胚胎中分離4 6個(gè)細(xì)胞，用無(wú)菌超純水沖洗3次后，放入0. 5mL PCR管中，加入IOuL無(wú)菌超純水，100°C煮沸IOmin 15min，立即置于碎冰中，冷卻后在4°C下離心5min，取上清液保存于4°C冰箱中備用。2、引物設(shè)計(jì)根據(jù)牛Y染色體和常染色體基因序列設(shè)計(jì)引物，利用生物學(xué)引物設(shè)計(jì)軟件I^rimer 5，設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物。引物序列如下Y-染色體特異性引物正向5' -TGATAGTTGATCCCACAGAAGG-3 ‘反向5' -TGAACTTACAAGCAGCTGAGG-3‘常染色體特異性引物正向5' -TGAGGCATGGAACTCCGCTTG-3‘反向5' -GGTGGTTCCACATTCCGTAGG-3‘3、PCR 反應(yīng)以Y-染色體特異性引物和常染色體內(nèi)標(biāo)引物擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系總體積為 20uL，其中 IOXPCRBuffer 2uL，4dDNTP 的濃度均為 200pmol/L，引物濃度為 5 20pmol/L， Tap酶2. 5U，模板DNAlO 100ng/uL。反應(yīng)程序?yàn)?4°C預(yù)變性5min ；94°C變性30s ；53°C退火25s ；72°C延伸30s，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；最后在72°C延伸5min。4、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)取5uL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，1 % 5%瓊脂糖凝膠電泳，所述的條件是3V/cm 5V/cm， 電泳20min 50min，用溴化乙錠染色，凝膠成像系統(tǒng)檢查，電泳圖參見(jiàn)附圖1。5、結(jié)果判定檢測(cè)電泳圖譜中是否出現(xiàn)131bp和250bp兩條帶；如果電泳圖譜中出現(xiàn)131bp和 250bp兩條帶，即判定為雄性胚胎；如果只出現(xiàn)250bp條帶，即可判定為雌性胚胎。


圖1為DNA樣鑒定性別的電泳圖
具體實(shí)施例方式1、試樣的制備與保存從待檢牛胚胎中分離4 6個(gè)細(xì)胞，用無(wú)菌超純水沖洗3次后，放入0. 5mL PCR管中，加入IOuL無(wú)菌超純水，100°C煮沸IOmin 15min，立即置于碎冰中，冷卻后在4°C下離心5min，取上清液保存于4°C冰箱中備用。2、引物設(shè)計(jì)Y-染色體特異性引物正向5' -TGATAGTTGATCCCACAGAAGG-3 ‘反向5' -TGAACTTACAAGCAGCTGAGG-3‘常染色體特異性引物正向5' -TGAGGCATGGAACTCCGCTTG-3‘反向5' -GGTGGTTCCACATTCCGTAGG-3‘3、PCR 反應(yīng)以Y-染色體特異性引物和常染色體內(nèi)標(biāo)引物擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系總體積為 20uL，其中 IOXPCRBuffer 2uL，4dDNTP 的濃度均為 200pmol/L，引物濃度為 5 20pmol/L， Tap酶2. 5U，模板DNAlO 100ng/uL。反應(yīng)程序?yàn)?4°C預(yù)變性5min ；94°C變性30s ；53°C退火25s ；72°C延伸30s，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；最后在72°C延伸5min。4、結(jié)果判定取5uL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，1 % 5%瓊脂糖凝膠電泳，所述的條件是3V/cm 5V/cm， 電泳20min 50min，用溴化乙錠染色，凝膠成像系統(tǒng)檢查，電泳圖參見(jiàn)附圖1。檢測(cè)電泳圖譜中是否出現(xiàn)131bp和250bp兩條帶；如果電泳圖譜中出現(xiàn)131bp和 250bp兩條帶，即判定為雄性胚胎；如果只出現(xiàn)250bp條帶，即可判定為雌性胚胎。
權(quán)利要求
1. 一種用于轉(zhuǎn)基因奶牛早期胚胎性別鑒定的分子生物學(xué)方法，其特征在于下列步驟(1)試樣的制備與保存從待檢牛胚胎中切取4 6個(gè)細(xì)胞，用無(wú)菌超純水沖洗3次后，放入0. 5mLPCR管中， 加入IOuL無(wú)菌超純水，100°C煮沸IOmin 15min，立即置于碎冰中，冷卻后在4°C下離心 5min,取上清液保存于4°C冰箱中，備用。(2)PCR反應(yīng)以Y-染色體特異性引物和常染色體內(nèi)標(biāo)引物擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系總體積為 20uL，其中 IOXPCRBuffer 2uL，4dDNTP 的濃度均為 200pmol/L，引物濃度為 5 20pmol/L， Tap酶2. 5U，模板DNAlO 100ng/uL。反應(yīng)程序?yàn)?4°C預(yù)變性5min ；94°C變性30s ；53°C退火25s ；72°C延伸30s，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；最后在72°C延伸5min。(3)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)取5uL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，1 % 5%瓊脂糖凝膠電泳，所述的條件是3V/cm 5V/cm，電泳 20min 50min，用溴化乙錠染色，凝膠成像系統(tǒng)檢查，得到電泳圖。其中，步驟(2)所用引物如下
全文摘要
本發(fā)明屬于動(dòng)物繁殖技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種轉(zhuǎn)基因奶牛早期胚胎的性別鑒定領(lǐng)域。其步驟是應(yīng)用顯微操作技術(shù)從待檢胚胎中切取4～6個(gè)細(xì)胞，用無(wú)菌超純水沖洗后放入PCR管中，加入適量無(wú)菌超純水，煮沸，置于碎冰中，冷卻后在低溫下離心，取上清夜進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，得到電泳圖，觀(guān)察電泳圖中同時(shí)出現(xiàn)131bp和250bp兩條帶的為公牛，只出現(xiàn)250bp條帶的為母牛。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102477459SQ20101055572
公開(kāi)日2012年5月30日 申請(qǐng)日期2010年11月23日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月23日
發(fā)明者張俊瑜, 王巍, 王洋, 董鈞, 許靜, 馬毅 申請(qǐng)人:天津夢(mèng)得集團(tuán)有限公司