專利名稱：人核酸外切酶因子基因編碼蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于人類基因組技術(shù)領(lǐng)域。
本發(fā)明所述人核酸外切酶因子(Novel exonuclease factor gene,NEF)基因是發(fā)明人在南京醫(yī)科大學(xué)生殖醫(yī)學(xué)江蘇省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室用基因芯片方法篩選獲得，首先制備人睪丸功能基因表達(dá)芯片，通過(guò)比較胚胎和成年人睪丸功能基因的表達(dá)，獲得差異表達(dá)克隆，經(jīng)序列測(cè)定證明為全長(zhǎng)cDNA，為2716bp；其開(kāi)放閱讀框架為2325bp，其編碼774個(gè)氨基酸。查閱基因庫(kù)，該基因?yàn)樾禄?，與小鼠核酸外切酶因子同源。由于該基因是成人睪丸高表達(dá)，而胚胎與成人睪丸的主要差別是后者有精子發(fā)生，因此發(fā)現(xiàn)的人核酸外切酶因子基因可能與精子發(fā)生有關(guān)，用該基因克隆可制備成融合蛋白，用該蛋白免疫家兔，可獲得單克隆和多克隆抗體，該基因也可用于制備睪丸功能基因表達(dá)芯片。融合蛋白也可能成為治療相關(guān)疾病的基因藥物。
由于人核酸外切酶因子基因在Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)中尚無(wú)人的同源基因，本發(fā)明人對(duì)于該基因的結(jié)構(gòu)和功能研究成果全都是開(kāi)創(chuàng)性的。美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)情報(bào)中心(National Center for BiotechnologyInformation,NCBI)已正式接受該基因?yàn)镚enbank的新成員，接受號(hào)為AF332193。1 aggctgaggg gcggttgttg ttggcagctg tggctaagga ggggagaacc tctgctcccc61 gcccgtcttc tcttctgcgt ttcccgggct agggggcgtg gggagtggtt ttaggcggcg121 aagccgctcg gcagcacctt ccttctttgc caggcagacg cccgttgtag ccgttgggga181 accgttgaga atccgccatg gagccagaga gggaagggac cgagagacac cccaggaagg241 tcagggaagg caggcaggcc ccaaataagc tggtcggggc agctgaggcg atgaaagccg301 gttgggatct cgaggagagt cagcccgagg ccaagaaagc ccgcttatct accattttat361 ttactgacaa ctgtgaagta acccatgacc agctgtgtga attgctgaag tatgcagttc421 tgggcaaatc caatgttcca aaacccagct ggtgccagct ttttcatcaa aaccacctaa481 acaacgtagt ggtttttgtt ctgcagggaa tgagtcagct acacttttac aggttctatt541 tggagtttgg atgtcttcga aaagcattca gacataaatt ccgcttgcct ccaccatcat601 ctgattttct agctgatgtt gttgggctac aaactgaaca aagagctgga gatctgccca661 agacaatgga agggccttta ccttctaatg caaaagccgc catcaacctt caggatgatc721 ccatcattca aaagtatggc tctaagaaag tgggcttgac cagatgcctt ctgacaaagg781 aggaaatgag aacgtttcac tttccattac aaggttttcc tgattgtgaa aactttttac841 ttaccaaatg taatggttct atagcagaca atagtcctct ctttggactt gactgtgaaa901 tgtgcctcac atccaagggg agagagctaa cacgcatctc actggttgct gaaggaggct961 gctgtgttat ggatgaactg gtcaaacctg aaaacaagat tctggactac ctcaccagct1021 tttcgggaat cacgaagaag attcttaacc cagtgacgac caaactcaaa gatgtacaga1081 ggcagttaaa agcactgctt cctcctgatg ctgtgttagt gggccactcc ttagatttgg1141 atctcagagc actgaaaatg atacatccat atgttattga tacatcgttg ctttatgtca1201 gagagcaggg cagaagattt aagctcaagt tcttagccaa agttattttg gggaaggata1261 tacagtgtcc agacagactt ggtcatgatg ccacagaaga tgctagaaca atccttgaat1321 tggctcggta tttccttaag catggcccaa aaaagattgc agaactaaat ctagaagcac1381 tagctaatca ccaagaaata caagcagcag gccaagagcc taaaaacaca gcagaagtac1441 ttcagcaccc aaacacaagt gttttagaat gcttggattc agtgggtcag aagcttcttt1501 ttttgacccg ggagacagat gctggtgaac ttccatcttc cagaaattgt caaactatta1561 agtgtctttc aaataaagag gttcttgagc aggccagagt ggaaatcccc ctgtttccct1621 tcagcattgt tcagttctct tttaaggcct tttcacctgt cctcactgag gagatgaaca1681 aaaggatgag gatcaagtgg acagagatat caactgtcta tgctgggcca tttagcaaaa1741 attgcaatct cagggctctg aagaggctgt ttaaaagctt tggcccagtc cagtcaatga1801 cttttgttct tgaaacccgt cagcctcatc tctgtataca gtatgaagtc ctagaagctg1861 cccagctggc catagagtcc ttggatggta ttctggtaga tggtatctgc atcaaggtgc1921 agaggcctgt gacagagctc acgcttgatt gtgacaccct cgtgaatgag ctggaaggag1981 attctgaaaa ccaaggctct atatatctgt ctggagtgag tgaaaccttc aaagaacagc2041 tattgcagga gccccgcctc tttcttggcc tggaagctgt gatcttgcct aaagatctta2101 aaagtggaaa gcagaaaaaa tactgtttcc tgaaattcaa aagttttggc agtgcccagc2161 aggccctcaa cattctcaca ggcaaggact ggaagctgaa aggcaggcat gccctaaccc2221 ccaggcacct ccatgcctgg ctcagaggct taccacctga atcaacaagg ctcccagggc2281 ttcgtgttgt acctcccccc tttgaacagg aggccttgca gactctgaaa ctggaccacc2341 cgaagatagc agcctggcgc tggagccgga agattggaaa gctctacaac agcttgtgcc2401 cgggcactct ctgcctcatc ctgctgccag gaaccaagag cactcatggt tcactctctg2461 gtctaggact gatgggaata aaagaggaag aagaaagcgc tggcccaggc ctgtgttcgt2521 gagtcggcct gccatgtttc catgtgccat ttcttacccc ttgtaggcaa tggcaaagaa2581 tgtggtcagg ctgtagcctc cccaaccagc agacagtttt atggaaactt ggtatagcag2641 ctaaaagagt ttagtttgtt tatatggcat gtataagttt tcaataaatg cctaaagttc2701 aagcataaaa aaaaaa人核酸外切酶因子基因cDNA序列MEPEREGTERHPRKVREGRQAPNKLVGAAEAMKAGWDLEESQPEAKKARLSTILFTDNCEVTHDQLCELLKYAVLGKSNVPKPSWCQLFHQNHLNNVVVFVLQGMSQLHFYRFYLEFGCLRKAFRHKFRLPPPSSDFLADVVGLQTEQRAGDLPKTMEGPLPSNAKAAINLQDDPIIQKYGSKKVGLTRCLLTKEEMRTFHFPLQGFPDCENFLLTKCNGSIADNSPLFGLDCEMCLTSKGRELTRISLVAEGGCCVMDELVKPENKILDYLTSFSGITKKILNPVTTKLKDVQRQLKALLPPDAVLVGHSLDLDLRALKMIHPYVIDTSLLYVREQGRRFKLKFLAKVILGKDIQCPDRLGHDATEDARTILELARYFLKHGPKKIAELNLEALANHQEIQAAGQEPKNTAEVLQHPNTSVLECLDSVGQKLLFLTRETDAGELPSSRNCQTIKCLSNKEVLEQARVEIPLFPFSIVQFSFKAFSPVLTEEMNKRMRIKWTEISTVYAGPFSKNCNLRALKRLFKSFGPVQSMTFVLETRQPHLCIQYEVLEAAQLAIESLDGILVDGICIKVQRPVTELTLDCDTLVNELEGDSENQGSIYLSGVSETFKEQLLQEPRLFLGLEAVILPKDLKSGKQKKYCFLKFKSFGSAQQALNILTGKDWKLKGRHALTPRHLHAWLRGLPPESTRLPGLRVVPPPFEQEALQTLKLDHPKIAAWRWSRKIGKLYNSLCPGTLCLILLPGTKSTHGSLSGLGLMGIKEEEESAGPGLCS
人核酸外切酶因子基因開(kāi)放閱讀框架氨基酸序列本發(fā)明的目的是鑒于人核酸外切酶因子基因是本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)的全新基因，目前人類對(duì)此基因的認(rèn)識(shí)和了解僅限于本發(fā)明人所做的科學(xué)研究工作。由于該基因是與睪丸特異功能相關(guān)的基因，而且是胚胎低表達(dá)，成人高表達(dá)，因此該基因很可能與睪丸內(nèi)的精子發(fā)生有關(guān)，其異常表達(dá)可能影響男性的生殖功能，因此該基因的研究可用于①通過(guò)制備該基因的融合蛋白，用于研究該基因與睪丸功能的關(guān)系，還可能成為一種治療男性睪丸相關(guān)疾病的生物藥品。
②制備特異性抗體基因編碼蛋白的特異性抗體是研究基因結(jié)構(gòu)和功能的不可缺少的重要工具，人核酸外切酶因子基因編碼蛋白的多克隆和單克隆抗體，可用作免疫組織化學(xué)染色、ELISA、免疫電鏡、免疫共沉淀等多種根據(jù)免疫學(xué)原理設(shè)計(jì)的檢測(cè)方法，可用于該基因編碼蛋白在組織細(xì)胞中的定位和定量研究，也可用于各種生物樣本(如血液、精液、尿液等)中的含量變化研究以及蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用研究等。因此，該抗體有可能用于制備與人核酸外切酶因子基因表達(dá)異常相關(guān)疾病診斷試劑盒，并有可能用于制備抗生育藥物。
③制備基因診斷芯片將功能基因用于制備基因診斷芯片是基因開(kāi)發(fā)研究的一個(gè)重要方面，在疾病診斷(如男性不育、性功能低下)和藥物篩選等方面均具有重要意義。本發(fā)明技術(shù)方案1．人核酸外切酶因子基因融合蛋白的制備以人核酸外切酶因子基因開(kāi)放閱讀框的核苷酸序列與質(zhì)粒pDESTTMl5制備成GST-SP2-pDESTl5表達(dá)質(zhì)粒，在無(wú)NaCl的LB中30℃培養(yǎng)到0.5OD600，經(jīng)0.3M NaCl誘導(dǎo)后，超聲粉碎后經(jīng)GST親和層析柱純化，得到純化的融合蛋白。2．人核酸外切酶因子基因編碼蛋白特異性多克隆抗體取融合蛋白與載體蛋白KLH(Keyhole Limpet Hymocyanin)結(jié)合，經(jīng)透析后再與完全/不完全佐劑(Complete/Incomplete Freund’sAdjuvant)等量混合，免疫新西蘭兔(背部皮下注射)，每隔3～4周激發(fā)注射一次，共三次，于三個(gè)月后取血分離血清。以免疫前動(dòng)物血清作為對(duì)照做ELISA，測(cè)定各免疫兔血清中抗體滴度。篩選高滴度血清，進(jìn)一步用抗原作競(jìng)爭(zhēng)抑制免疫試驗(yàn)確定抗體的特異性。根據(jù)ELISA結(jié)果確定其用于免疫組織化學(xué)染色的稀釋倍增數(shù)為1∶200～500。3．人核酸外切酶因子基因編碼蛋白特異性單克隆抗體取融合蛋白與載體蛋白KLH(Keyhole Limpet Hymocyanin)結(jié)合，經(jīng)透析后再與完全/不完全佐劑(Complete/Incomplete Freund’sAdjuvant)混合，免疫Balb/C小鼠(腹腔內(nèi)注射)，隔周一次，連續(xù)2-3次，融合前靜脈加強(qiáng)一次，用ELISA方法證實(shí)抗體的產(chǎn)生后，取脾臟分離脾細(xì)胞，然后與骨髓瘤細(xì)胞融合產(chǎn)生雜交瘤細(xì)胞。陽(yáng)性克隆經(jīng)多次亞克隆，直至獲得分泌抗人核酸外切酶因子抗體的單克隆雜交瘤細(xì)胞株。4．人核酸外切酶因子基因用于制備睪丸功能基因表達(dá)芯片(1)以獲取的人核酸外切酶因子基因的核苷酸序列設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增全長(zhǎng)的人核酸外切酶因子基因序列，用作點(diǎn)膜的樣品。
(2)用英國(guó)BioRobotics自動(dòng)點(diǎn)膜儀將標(biāo)本點(diǎn)在8×12cm尼龍膜上，每一標(biāo)本點(diǎn)2個(gè)點(diǎn)，每點(diǎn)的DNA量約幾ng。；陽(yáng)性對(duì)照8個(gè)housekeeping genes (a．ribosomal protein S9；b．Actin gamma；c．glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase；d．hypoxanthinephosphoribosyltransferase l；e．H.sapiens mRNA for 23KD highly basicprotein；f．ubiqnitin C；g．Phospholipase A2；h．ubiquitin carboxy I-ferminal esterase L I)。陰性對(duì)照加λ噬菌體DNA和P-blue質(zhì)粒。(3)將含有該基因的芯片用于人核酸外切酶因子基因缺失的診斷和藥物篩選33P標(biāo)記抽提待檢標(biāo)本mRNA或DNA，用Random Primer標(biāo)記法標(biāo)記待檢標(biāo)本mRNA或DNA，作為雜交的探針。雜交將點(diǎn)制好的尼龍膜標(biāo)記探針雜交后，雜交爐(68℃)內(nèi)烘干，用磷屏壓片。信號(hào)掃描和分析用記錄儀分析雜交信號(hào)。根據(jù)雜交信號(hào)的強(qiáng)弱分析影響人核酸外切酶因子基因蛋白表達(dá)水平或人核酸外切酶因子基因的缺失。
權(quán)利要求
1．一種睪丸功能特異基因(NEF)克隆制備的融合蛋白，其特征是NEF基因全部開(kāi)放閱讀框氨基酸，序列為MEPEREGTERHPRKVREGRQAPNKLVGAAEAMKAGWDLEESQPEAKKARLSTILFTDNCEVTHDQLCELLKYAVLGKSNVPKPSWCQLFHQNHLNNVVVFVLQGMSQLHFYRFYLEFGCLRKAFRHKFRLPPPSSDFLADVVGLQTEQRAGDLPKTMEGPLPSNAKAAINLQDDPIIQKYGSKKVGLTRCLLTKEEMRTFHFPLQGFPDCENFLLTKCNGSIADNSPLFGLDCEMCLTSKGRELTRISLVAEGGCCVMDELVKPENKILDYLTSFSGITKKILNPVTTKLKDVQRQLKALLPPDAVLVGHSLDLDLRALKMIHPYVIDTSLLYVREQGRRFKLKFLAKVILGKDIQCPDRLGHDATEDARTILELARYFLKHGPKKIAELNLEALANHQEIQAAGQEPKNTAEVLQHPNTSVLECLDSVGQKLLFLTRETDAGELPSSRNCQTIKCLSNKEVLEQARVEIPLFPFSIVQFSFKAFSPVLTEEMNKRMRIKWTEISTVYAGPFSKNCNLRALKRLFKSFGPVQSMTFVLETRQPHLCIQYEVLEAAQLAIESLDGILVDGICIKVQRPVTELTLDCDTLVNELEGDSENQGSIYLSGVSETFKEQLLQEPRLFLGLEAVILPKDLKSGKQKKYCFLKFKSFGSAQQALNILTGKDWKLKGRHALTPRHLHAWLRGLPPESTRLPGLRVVPPPFEQEALQTLKLDHPKIAAWRWSRKIGKLYNSLCPGTLCLILLPGTKSTHGSLSGLGLMGIKEEEESAGPGLCS
2．根據(jù)權(quán)利要求1所述針對(duì)NEF基因開(kāi)放閱讀框氨基酸序列制備的多克隆抗體，其特征是融合蛋白與完全和不完全佐劑混合后，免疫新西蘭兔制備多克隆抗體。
3．根據(jù)權(quán)利要求1所述針對(duì)NEF基因開(kāi)放讀框氨基酸序列制備的單克隆抗體，其特征是融合蛋白與完全和不完全佐劑混合，免疫Balb/C小鼠，分離脾臟B淋巴細(xì)胞并和骨髓瘤細(xì)胞融合產(chǎn)生雜交瘤細(xì)胞，進(jìn)一步用亞克隆方法、ELISA和抗體分型方法篩選分泌IgG抗體的單克隆，制備單克隆抗體。
4．根據(jù)權(quán)利要求1所述針對(duì)將NEF基因開(kāi)放讀框氨基酸序列用于制備睪丸功能基因表達(dá)芯片，其特征是PCR擴(kuò)增NEF基因cDNA，點(diǎn)于芯片用于芯片制備。
5．根據(jù)權(quán)利要求1所述，針對(duì)NEF基因開(kāi)放讀框氨基酸序列制備融合蛋白，其特征是融合蛋白可作為制備治療相關(guān)疾病的藥物。
全文摘要
本發(fā)明屬于人類基因組技術(shù)領(lǐng)域，所述的人睪丸核酸外切酶因子(Novel exonuclease factor gene,NEF)基因全長(zhǎng)cDNA序列為2716bp，其開(kāi)放閱讀框序列為2325bp，其編碼774個(gè)氨基酸，該基因在基因庫(kù)(Genbank)中的編號(hào)為AF332193。本發(fā)明利用NEF基因克隆制備融合蛋白，并可用該蛋白免疫動(dòng)物制備單克隆和多克隆抗體，同時(shí)可將基因克隆用于睪丸特異功能基因表達(dá)芯片的制備，表達(dá)蛋白也可能成為治療相關(guān)疾病的基因藥物。
文檔編號(hào)C07K16/18GK1316433SQ01108200
公開(kāi)日2001年10月10日 申請(qǐng)日期2001年4月11日 優(yōu)先權(quán)日2001年4月11日
發(fā)明者沙家豪, 周作民, 李建民 申請(qǐng)人:南京醫(yī)科大學(xué)