專利名稱：一種高產(chǎn)量大規(guī)模質(zhì)粒制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供一種高產(chǎn)量大規(guī)模質(zhì)粒制備方法，涉及對(duì)堿變性-PEG沉淀法的改進(jìn)，屬于分子生物學(xué)，基因治療，基因免疫技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
質(zhì)粒大規(guī)模制備的經(jīng)典方法是堿變性-CsCl密度梯度超速離心法和堿變性-PEG沉淀法。堿變性-CsCl密度梯度超速離心法能夠制備得到高質(zhì)量的質(zhì)粒，但對(duì)設(shè)備條件要求高，成本高，產(chǎn)量少，已很少有人使用。應(yīng)用堿變性-PEG沉淀法制備質(zhì)粒的產(chǎn)量較大，每1000ml菌的產(chǎn)量約為4-10mg，大大高于堿變性-CsCl密度梯度超速離心法和柱層析試劑盒制備質(zhì)粒的產(chǎn)量，其質(zhì)量也較好，能滿足多數(shù)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的要求，如酶切、連接，DNA序列測(cè)定等。但其質(zhì)量和純度不如堿變性-CsCl密度梯度超速離心法和柱層析試劑盒制備的質(zhì)粒，所含細(xì)菌內(nèi)毒素(LPS)量過高，不太合適用于人體或動(dòng)物機(jī)體的基因治療和基因免疫。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種高產(chǎn)量大規(guī)模質(zhì)粒制備方法，是對(duì)堿變性-PEG沉淀法進(jìn)行了改進(jìn)，使其產(chǎn)量大大提高，最高可達(dá)到23mg/1000ml細(xì)菌培養(yǎng)物。
本發(fā)明的技術(shù)解決方案包括以下步驟1、重組菌的培養(yǎng)與收集挑目的單菌落接種至LB培養(yǎng)基，加入相應(yīng)量抗生素，至細(xì)菌生長至密度為OD600≈0.6，將其再接種至20倍體積的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)12-16小時(shí)左右，5000rpm，10分鐘離心，棄盡上清，收集菌體；2、原生質(zhì)體的制備用溶菌酶將上述收集細(xì)菌的細(xì)胞壁水解，制成原生質(zhì)體；3、質(zhì)粒的抽提純化①用SDS-堿變性法將質(zhì)粒從細(xì)菌中釋放出來至溶液中，在該步驟中，溶液I先使用標(biāo)準(zhǔn)溶液I的4～6倍濃度，在原生體分散均勻后，用蒸餾水調(diào)整至標(biāo)準(zhǔn)溶液I的濃度(50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl，10mM EDTA pH 8.0)；并向溶液I中加入高濃度的RNA酶A。質(zhì)粒從細(xì)菌中釋放出來至溶液后，離心取上清暫保存；②向以往棄丟的沉淀物中加入3～4體積的TE懸浮，加入終濃度為50-80ug/ml的蛋白酶K，置37℃，搖床震搖(210～230rpm)，再次懸浮消化至適當(dāng)；8000rpm，離心10分鐘，取上清；將①和②的上清合并，加入1/2體積20％的PEG8000(溶于2.4M的NaCl溶液)，冰浴30-60分鐘或放4℃冰箱過夜；12000g，離心5分鐘或8000g，15分鐘；棄上清，沉淀加入18ml TE溶解；加入終濃度為50-100ug/ml的蛋白酶K，56℃，消化直至清亮；加入等體積的酚、酚/氯仿/異戊醇、氯仿抽提，直至無蛋白帶出現(xiàn)；取上清，加入0.1體積3M NaAC(pH 5.2)，2倍體積預(yù)冷的無水乙醇，輕輕吹吸或搖晃后，4℃，30分鐘以上；12000rpm，離心10分鐘，棄上清；加入少量70％的乙醇，輕輕洗刷管底沉淀物及管壁上粘附的鹽類，然后置室溫涼干；4、適量雙蒸水或PBS溶解質(zhì)粒沉淀，用DNA檢測(cè)儀測(cè)定質(zhì)粒含量并用適當(dāng)?shù)拿缸髅盖需b定；
5、鑒定后分裝，-20℃保存。
本發(fā)明的積極效果在于本工藝與堿變性-CsCl密度梯度超速離心法所制備質(zhì)粒的純度相當(dāng)，而產(chǎn)量卻大幅度提高，每1000ml大腸桿菌培養(yǎng)物的質(zhì)粒產(chǎn)量達(dá)到15-23mg。第一次對(duì)上清中沉淀質(zhì)粒使用20％的PEG8000而不使用異丙醇，并將沉淀加入18 TE溶液溶解，加入終濃度為50-100ug/ml的蛋白酶K消化。其內(nèi)毒素含量極低，與堿變性-CsCl密度梯度超速離心法的相當(dāng)。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例11、重組菌的培養(yǎng)與收集挑目的單菌落接種55ml LB培養(yǎng)基(加入相應(yīng)量抗性藥物，以下相同)至OD600≈0.6，→取50ml(另5ml作小提鑒定)倒入1000ml LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)12-16小時(shí)左右；→5000rpm，10分鐘離心，棄盡上清，收集菌體。
2、原生質(zhì)體制備細(xì)菌沉淀中加入50ml含20％蔗糖、50mMTris-HCl(pH 8.0)，吹打懸??；→冰浴3-5分鐘；→加入10ml用預(yù)冷的0.25M Tris-HCl(pH 8.0)配制的新鮮溶菌酶液(5mg/ml)，冰浴5分鐘；→加入20ml預(yù)冷的0.25M EDTA(pH 8.0)，冰浴5分鐘；→加入20ml預(yù)冷的0.25M Tris-HCl(pH 8.0)，37℃水浴5分鐘；→立即4℃，6000rpm，10分鐘，棄上清。(冰浴條件和作用時(shí)間很關(guān)鍵)3、質(zhì)粒的抽提純化于原生質(zhì)體沉淀中加入6ml 5倍的溶液I(0.25M葡萄糖，75mM Tris-HCl，50mM EDTA pH 8.0)，吹打懸浮后，加入23ml蒸餾水，再加入0.6mg RNA酶A(溶于1ml 10mMpH 7.5的Tris-HCl，15mM NaCl)；→37℃作用15分鐘；→加入蛋白酶K至終濃度為80ug/ml，37℃，再作用15分鐘；→加入30ml溶液II(0.2M NaOH，1％SDS)，輕輕地上下顛倒離心瓶以便混勻充分，冰上放置5分鐘；→加入30ml冰預(yù)冷的溶液III(60％5M KAC，11.5％冰醋酸)，震搖混勻，冰浴5分鐘；→7500rpm，15分鐘。
①取上清暫保存；②對(duì)沉淀物加入25ml TE懸浮，加入終濃度為50-80μg/ml的蛋白酶K，置37℃搖床劇烈振搖(210-230rpm)，再次懸浮消化1～2小時(shí)；8000rpm，離心10分鐘，取上清。
將①和②的上清，加入1/2體積20％的PEG8000(溶于2.4M的NaCl溶液)，冰浴30-60分鐘或放4℃冰箱過夜；→12000g，離心10分鐘或8000g，15分鐘；→棄上清，沉淀加入18ml TE溶解；→加入終濃度為50-100ug/ml的蛋白酶K，56℃，消化直至清亮；→加入等體積的酚、酚/氯仿/異戊醇、氯仿抽提，直至無蛋白帶出現(xiàn)；→取上清，加入0.1體積3M NaAC(pH 5.2)，2倍體積預(yù)冷的無水乙醇，輕輕吹吸或搖晃后，4℃，30分鐘以上；→12000g，離心5分鐘，棄上清；→加入少量70％的乙醇，輕輕洗刷管底沉淀物及管壁上粘附的鹽類，然后置室溫涼干。
用適量PBS溶解質(zhì)粒沉淀，用DNA檢測(cè)儀測(cè)定質(zhì)粒含量。結(jié)果共得到pIRESNeol質(zhì)粒15mg，實(shí)施例2從BL21(DE3)轉(zhuǎn)化重組菌中純化pcDNA3質(zhì)粒，2000LB培養(yǎng)基，46mg質(zhì)粒。
1.菌落培養(yǎng)與收集挑取pcDNA3轉(zhuǎn)化的單菌落接種110ml LB培養(yǎng)基(加氨芐青霉素至60μg/ml)至OD600≈0.6，→取100ml倒入2000ml LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)12-16小時(shí)左右；
→5000rpm，10分鐘離心，棄盡上清，收集菌體。
2.原生質(zhì)體制備細(xì)菌沉淀中加入100ml含20％蔗糖、50mMTris-HCl(pH 8.0)，吹打懸??；→冰浴5分鐘；→加入20ml用預(yù)冷的0.25M Tris-HCl(pH 8.0)配制的新鮮溶菌酶液(5mg/ml)，冰浴5分鐘；→加入40ml預(yù)冷的0.25M EDTA(pH 8.0)，冰浴5分鐘；→加入40ml預(yù)冷的0.25M Tris-HCl(pH 8.0)，37℃水浴5分鐘；→立即4℃，6000rpm，10分鐘，棄上清。
(冰浴條件和作用時(shí)間很關(guān)鍵)3.質(zhì)粒的抽提純化將獲得的原生質(zhì)體沉淀，及時(shí)加入15ml 4倍的溶液I(0.20M葡萄糖，60mM Tris-HCl，40mM EDTA pH 8.0)，吹打懸浮后，加入43ml蒸餾水，再加入1.2mg RNA酶A(溶于2ml 10mM pH7.5的Tris-HCl，15mM NaCl)；→37℃作用15分鐘；→加入蛋白酶K至終濃度為80ug/ml，37℃，再作用15分鐘；→加入60ml溶液II(0.2M NaOH，1％SDS)，輕輕地上下顛倒離心瓶以便混勻充分，冰上放置5分鐘；→加入60ml冰預(yù)冷的溶液III(60％ 5M Kac，11.5％冰醋酸)，震搖混勻，冰浴5分鐘；→7500rpm，15分鐘①取上清暫保存；②對(duì)沉淀物加入50ml TE懸浮，加入終濃度為80ug/ml的蛋白酶K，置37℃，搖床震搖(230rpm)2小時(shí)；8000rpm，離心10分鐘，取上清。
將①和②的上清，加入1/2體積20％的PEG8000(溶于2.4M的NaCl溶液)，放置4℃冰箱過夜；→12000rpm，離心10分鐘或8000rpm，15分鐘；→棄上清，沉淀加入36ml TE溶解；→加入終濃度為100ug/ml的蛋白酶K，56℃，消化直至清亮；→加入等體積的酚、酚/氯仿/異戊醇、氯仿抽提，直至無蛋白帶出現(xiàn)；→取上清，加入0.1體積3M NaAc(pH 5.2)，2倍體積預(yù)冷的無水乙醇，輕輕吹吸或搖晃混勻；→12000rpm，離心10分鐘，棄上清；→加入少量70％的乙醇，輕輕洗刷管底沉淀物及管壁上粘附的鹽類，然后置室溫涼干。
4.用20ml PBS溶解質(zhì)粒沉淀，用DNA檢測(cè)儀測(cè)定質(zhì)粒含量，結(jié)果共得到pcDNA3質(zhì)粒46mg。即23mg/1000ml。
實(shí)施例3從JM109轉(zhuǎn)化重組菌中純化pVAX1質(zhì)粒，1000LB培養(yǎng)基，21mg質(zhì)粒1.菌落培養(yǎng)與收集挑pVAX1轉(zhuǎn)化的JM109單菌落接種55ml LB培養(yǎng)基(卡那霉素至30μg/ml)至OD600≈0.6，→取50ml(另5ml作小提鑒定)倒入1000ml LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)14小時(shí)左右；→5000rpm，10分鐘離心，棄盡上清，收集菌體。2. 原生質(zhì)體制備細(xì)菌沉淀中加入50ml含20％蔗糖、50mMTris-HCl(pH 8.0)，吹打懸??；
→冰浴5分鐘；→加入10ml用預(yù)冷的0.25M Tris-HCl(pH 8.0)配制的新鮮溶菌酶液(5mg/ml)，冰浴5分鐘；→加入20ml預(yù)冷的0.25M EDTA(pH 8.0)，冰浴5分鐘；→加入20ml預(yù)冷的0.25M Tris-HCl(pH 8.0)，37℃水浴5分鐘；→立即4℃，6000rpm，10分鐘，棄上清。
(冰浴條件和作用時(shí)間很關(guān)鍵)3.質(zhì)粒的抽提純化將獲得的原生質(zhì)體沉淀，及時(shí)加入5ml 6倍的溶液I(0.30M葡萄糖，90mM Tris-HCl，60mM EDTA pH 8.0)，吹打懸浮后，加入23ml蒸餾水，再加入0.6mg RNA酶A(溶于1ml 10mM pH7.5的Tris-HCl，15mM NaCl)；→37℃作用15分鐘；→加入蛋白酶K至終濃度為80ug/ml，37℃，再作用15分鐘；→加入30ml溶液II(0.2M NaOH，1％SDS)，輕輕地上下顛倒離心瓶以便混勻充分，冰上放置5分鐘；→加入30ml冰預(yù)冷的溶液III(60％ 5M Kac，11.5％冰醋酸)，震搖混勻，冰浴5分鐘；→7500rpm，15分鐘①取上清暫保存；②對(duì)沉淀物加入25ml TE懸浮，加入終濃度為50-80ug/ml的蛋白酶K，置37℃，搖床震搖(210-230rpm)1.5小時(shí)；8000rpm，離心10分鐘，取上清。
將①和②的上清，加入1/2體積20％的PEG8000(溶于2.4M的NaCl溶液)，冰浴60分鐘；
→12000rpm，離心10分鐘或8000rpm，15分鐘；→棄上清，沉淀加入18ml TE溶解；→加入終濃度為50uG/ml的蛋白酶K，56℃，消化直至清亮；→加入等體積的酚、酚/氯仿/異戊醇、氯仿抽提，直至無蛋白帶出現(xiàn)；→取上清，加入0.1體積3M NaAc(pH 5.2)，2倍體積預(yù)冷的無水乙醇，輕輕吹吸或搖晃混勻；→12000rpm，離心10分鐘，棄上清；→加入少量70％的乙醇，輕輕洗刷管底沉淀物及管壁上粘附的鹽類，然后置室溫涼干。
4.用10ml PBS溶解質(zhì)粒沉淀，用DNA檢測(cè)儀測(cè)定質(zhì)粒含量。結(jié)果pVAX1的濃度為2.1mg/ml，共得到質(zhì)粒21mg。
權(quán)利要求
1.一種高產(chǎn)量大規(guī)模質(zhì)粒制備方法，包括以下步驟1)菌落培養(yǎng)與收集挑目的單菌落接種至LB培養(yǎng)基，加入相應(yīng)量抗生素，至細(xì)菌生長至密度為OD600≈0.6，將其再接種至20倍體積的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)12-16小時(shí)左右，5000rpm，10分鐘離心，棄盡上清，收集菌體；2)原生質(zhì)體制備用溶菌酶將上述收集細(xì)菌的細(xì)胞壁水解，制成原生質(zhì)體。3)質(zhì)粒的抽提純化用SDS-堿變性法將質(zhì)粒從細(xì)菌中釋放出來至溶液中，在該步驟中，溶液I先使用標(biāo)準(zhǔn)溶液I的4～6倍濃度，在原生體分散均勻后，用蒸餾水調(diào)整至標(biāo)準(zhǔn)溶液I的濃度并向溶液I中加入高濃度的RNA酶A；質(zhì)粒從細(xì)菌中釋放出來至溶液后，離心取上清加入1/2體積20％的PEG8000溶于2.4M的NaCl溶液，冰浴30-60分鐘或放4℃冰箱過夜；12000g，離心5分鐘或8000g，15分鐘；棄上清，沉淀加入18ml TE溶解；加入終濃度為50-100ug/ml的蛋白酶K，56℃，消化直至清亮；加入等體積的酚、酚/氯仿/異戊醇、氯仿抽提，直至無蛋白帶出現(xiàn)；取上清，加入0.1體積3M NaAC(pH 5.2)，2倍體積預(yù)冷的無水乙醇，輕輕吹吸或搖晃后，4℃，30分鐘以上；12000rpm，離心10分鐘，棄上清；加入少量70％的乙醇，輕輕洗刷管底沉淀物及管壁上粘附的鹽類，然后置室溫涼干；4)適量雙蒸水或PBS溶解質(zhì)粒沉淀，用DNA檢測(cè)儀測(cè)定質(zhì)粒含量并用適當(dāng)?shù)拿缸髅盖需b定；5)鑒定后分裝，-20℃保存。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的質(zhì)粒制備方法，其特征在于可將質(zhì)粒抽提純化步驟中離心后的沉淀物利用，加入3～4體積的TE懸浮，加入終濃度為50-80ug/ml的蛋白酶K，置37℃，搖床震搖(210～230rpm)，再次懸浮消化至適當(dāng)；8000rpm，離心10分鐘，取上清與抽提純化離心的上清混合進(jìn)一步抽提純化。
全文摘要
本發(fā)明一種高產(chǎn)量大規(guī)模質(zhì)粒制備方法,包括菌落培養(yǎng)與收集:原生質(zhì)體制備:質(zhì)粒的抽提純化:用DNA檢測(cè)儀測(cè)定質(zhì)粒含量并用適當(dāng)?shù)拿缸髅盖需b定;本工藝與堿變性－CsCl密度梯度超速離心法所制備質(zhì)粒的純度相當(dāng),而產(chǎn)量卻大幅度提高,每1000ml大腸桿菌培養(yǎng)物的質(zhì)粒產(chǎn)量達(dá)到15－23mg。第一次在上清中沉淀質(zhì)粒使用20%的PEG
文檔編號(hào)C07H21/00GK1373214SQ0210935
公開日2002年10月9日 申請(qǐng)日期2002年3月25日 優(yōu)先權(quán)日2002年3月25日
發(fā)明者涂長春, 余興龍, 張茂林 申請(qǐng)人:中國人民解放軍軍需大學(xué)軍事獸醫(yī)研究所