專利名稱：一種高產(chǎn)量的結(jié)冷膠發(fā)酵制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物發(fā)酵領(lǐng)域，特別是一種微生物多糖--結(jié)冷膠的高產(chǎn)發(fā)酵制 備方法。
背景技術(shù)：
結(jié)冷膠是一種從水百合上分離所得的格蘭氏陰性菌-少動鞘氨醇單胞菌
(5^/w>2gomcwas/7m/c^o6//&)-所產(chǎn)生的胞外多糖，有著用量低，透明度高， 香氣釋放能力強，耐酸，耐堿等優(yōu)點。結(jié)冷膠可在各類食品中廣泛使用，可以 說是目前性能最為優(yōu)異的增稠劑、穩(wěn)定劑之一，并具有優(yōu)良的凝膠特性。它在 食品、日化、醫(yī)藥等行業(yè)有廣泛的用途。結(jié)冷膠在1988年于日本被批準(zhǔn)在食品 中的應(yīng)用，1992年美國FDA批準(zhǔn)其在食品中的運用，歐共體于1994年將其正 式列入食用安全代碼(E-418)表中，我國則于1996年把結(jié)冷膠列入GB2760 — 1996中，批準(zhǔn)其作為食品增稠劑、穩(wěn)定劑，可在各類食品中按正常生產(chǎn)需要適 量使用。
結(jié)冷膠的單糖分子組成是葡萄糖，鼠李糖，葡萄糖酸，乙酸脂，L-甘油酸 脂基團，主鏈?zhǔn)且粋€線性四糖重復(fù)單位，由1，3-和1,4-連接的葡萄糖單位，1,3-連接的葡萄糖酸單位和1,4-連接的鼠李糖單位組成。分子量為0.5X1()S道爾頓。
目前國內(nèi)有不少企業(yè)和科研機構(gòu)在進行結(jié)冷膠產(chǎn)品的發(fā)酵研究，但效果不 是很理想，主要表現(xiàn)在發(fā)酵時間長、產(chǎn)品得率低、生產(chǎn)成本高等問題
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明在現(xiàn)行發(fā)酵生產(chǎn)工藝基礎(chǔ)上，選用好氧格蘭氏陰性菌-少動鞘氨醇單
胞菌(^/^gomomw; "w"'m(^Zto)，進行發(fā)酵工藝控制的方法。主要過程包括結(jié) 冷膠種子液的pH， OD值控制，并在發(fā)酵過程中補入無菌水，控制發(fā)酵培養(yǎng)過 程攪拌轉(zhuǎn)速及進空氣的溫度，達(dá)到發(fā)酵周期由原來的50 60h縮短至40 45h，粗 多糖含量由1.5 1.6g/100ml提高至2.0 2.5g/100ml，真正實現(xiàn)了結(jié)冷膠低能高產(chǎn) 的目的，并且大大提高了設(shè)備的有效利用率。
本發(fā)明易于實現(xiàn)，耗能低，通過發(fā)酵后期補入無菌水的方法，解決了發(fā)酵 后期溶解氧低的矛盾，增大了放罐體積，提高了單罐產(chǎn)量；通過對發(fā)酵整個過 程進氣溫度的有效控制，三級發(fā)酵罐溫控制在30-34。C培養(yǎng)，縮短了發(fā)酵周期。 使放罐粗多糖濃度達(dá)到2.0 2.5g/100ml。
本發(fā)酵工藝在實行過程中操作簡單，耗用成本低，較傳統(tǒng)的發(fā)酵方法可以 節(jié)約20%的發(fā)酵和動力電能，提高15%以上的單罐產(chǎn)量。
本發(fā)明的高產(chǎn)量結(jié)冷膠發(fā)酵制備方法分為三級發(fā)酵，具體工藝流程如下
斜面 一搖瓶-^一級種子罐-^二級種子罐- 三級發(fā)酵罐
該制備方法包括以下步驟
1) 斜面菌種經(jīng)擴大培養(yǎng)成搖瓶種子液；
2) 將搖瓶種子液接入一級種子罐無菌培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)；
3) 將一級種子罐中的種子液接入二級種子罐無菌培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)；
4) 將二級種子罐中的種子液接入三級發(fā)酵罐無菌培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)；
5) 收集結(jié)冷膠發(fā)酵液；
其中所述菌種為少動鞘氨醇單胞菌，并且在三級發(fā)酵罐中的培養(yǎng)過程中添加 無菌水。
本發(fā)明所用的少動鞘氨醇單胞菌購自江南大學(xué)。 更具體地，該方法包括
l)斜面菌種經(jīng)擴大培養(yǎng)成搖瓶種子液，搖瓶培養(yǎng)基組成為蛋白胨0.3 0.6，牛肉膏0.2-0.4，酵母膏0.05 0.15，其余為水。
搖瓶擴大培養(yǎng)的條件為溫度28-34"，周期18 30h，搖床轉(zhuǎn)速150r/min;
2) 將上述制備的搖瓶種子液按一級種子培養(yǎng)基體積的0.01 0.03%比例接入 一級種子罐中培養(yǎng)， 一級種子罐的培養(yǎng)基組成為；
酵母浸出汁0.2 0.5，牛肉膏0.3，魚蛋白胨0.5， DDFS-303 (食品級 消泡劑)0.0003，其余為水；
一級種子罐中擴大培養(yǎng)的條件為培養(yǎng)溫度28~34°C，通風(fēng)比1: 0.5，
運行壓力0.05 0.08Mpa;
一級種子罐擴大培養(yǎng)的終點為周期13 16h， PH值在8.2以上，氨基氮
在350mg/Kg以上，OD值0.1 ±0.02。 OD值檢測為紫外可見分光光度計 H0605019，波長520nm。
3) 將上述制備的一級種子罐中的種子液按二級種子培養(yǎng)基體積的8~12%比 例接入二級種子罐中培養(yǎng)，二級種子罐中的培養(yǎng)基組成為；
白糖2.0~3.0，酵母浸出汁0.1~0.3，大豆蛋白粉0.2 0.4， KH2P04: 0.05， K2PH04: 0.05， MgS04: 0.06， DDFS-303: 0.0003，其余為水；
二級種子罐中的條件為培養(yǎng)溫度28 34°C，通風(fēng)比1: 0.5，運行壓力
0.05 0.08Mpa;
二級種子罐擴大培養(yǎng)的終點為周期6 8h， pH值在6.0 6.6，氨基氮在 40 80mg/Kg之間，OD值0.4±0.02。 OD值檢測為紫外可見分光光度計 H0605019,波長520nm。
4) 將上述制備的二級種子罐中的種子液按三級發(fā)酵培養(yǎng)基體積的5~9%比 例接入三級發(fā)酵罐中培養(yǎng)，三級發(fā)酵罐的培養(yǎng)基組成為；
白糖2.5~3.5，大豆蛋白粉0.5 0.8， KH2P04: 0.1， MnS04.H20: 0.025， K2HP04: 0.15， MgS04: 0.06， DDFS-303: 0.0003， H3B03: 0.003，其余為水；
三級發(fā)酵罐中的培養(yǎng)條件為發(fā)酵培養(yǎng)溫度:30 34。C,運行壓力0.05 0.08Mpa;
發(fā)酵攪拌使用變頻調(diào)速攪拌，風(fēng)量根據(jù)發(fā)酵時間分段控制進氣量來控制；
發(fā)酵攪拌使用變頻調(diào)速攪拌，具體控制的變頻轉(zhuǎn)速如下
Oh 160r(min 10h 18Qr/min 20h 2g0r/min 放罐
風(fēng)量根據(jù)發(fā)酵時間分段控制進氣量來控制，具體控制參數(shù)如下；
Oh 1000n^3/h 12h 150Qm3/h 3Oh IgOO m3/h 放罐
發(fā)酵黏度達(dá)4000cp以上時，按發(fā)酵液體積比例補入10%的無菌水，分3次
補入，頻率每兩小時一次。
三級發(fā)酵罐培養(yǎng)的終點為放罐黏度在7000~9000cp，殘?zhí)潜壤刂圃?br> 0.2~0.4。
從一級種子罐至發(fā)酵罐的整個發(fā)酵過程中，進氣空氣溫度控制在25 30°C， 使發(fā)酵罐內(nèi)培養(yǎng)發(fā)酵液的溫度更精確地控制在工藝要求范圍內(nèi)，利于微生物多 糖的生長合成。
除非另外指出，本發(fā)明的培養(yǎng)基以重量(g) /體積(L)百分比計。例如，以 搖瓶培養(yǎng)基組成為例稱取蛋白胨0.3 0.6g，牛肉膏0.2 0.4g，酵母膏0.05 0.15g，
溶解于適量水中后，用水補足體積至l升。
具體實施例方式
提出以下實施例來具體說明，以更好地理解本發(fā)明，但該實施例為非限制 性的。
以5L搖瓶，500L—級種子罐，5T二級種子罐，50T三級發(fā)酵罐為例。實 用體積為一級種子罐300L， 二級種子罐3T，三級發(fā)酵罐35T，即罐中添加的培 養(yǎng)基體積。
具體制備方法包括以下步驟
1)接種針在潔凈操作臺上劃取少量斜面種子，接入搖瓶培養(yǎng)基培養(yǎng)。
7搖瓶培養(yǎng)基組成為
蛋白胨0.5，牛肉膏0.3，酵母膏0.1，其余為水。
搖瓶培養(yǎng)的條件為溫度30。C，周期24h，搖床轉(zhuǎn)速150r/min。
2) 將上述制備的搖瓶種子液按一級種子培養(yǎng)基體積的0.017%比例接入一級
種子罐中培養(yǎng)
一級種子罐的培養(yǎng)基組成為；
酵母浸出汁0.4，牛肉膏0.3，魚蛋白胨0.5， DDFS-303: 0.0003，
其余為水；
一級種子罐中的培養(yǎng)條件為培養(yǎng)溫度30°C，通風(fēng)比1: 0.5，運行壓力
0.06Mpa;
一級種子罐的培養(yǎng)終點為周期15h， pH值在8.32，氨基氮365mg/Kg， OD值0.086。 OD值檢測為紫外可見分光光度計H0605019，波長520nm。
3) 將上述制備的一級種子罐中的種子液按二級種子培養(yǎng)基體積的10%比例 接入二級種子罐中培養(yǎng)
二級種子罐的培養(yǎng)基組成為；
白糖2.5，酵母浸出汁0.2，大豆蛋白粉0.3， KH2P04: 0.05， K2PH04: 0.05， MgS04: 0.06， DDFS國303: 0.0003，其余為水；
二級種子罐中的培養(yǎng)條件為培養(yǎng)溫度30°C，通風(fēng)比1: 0.5，運行壓力
0.06Mpa;
二級種子罐的培養(yǎng)終點為周期7h， pH值在6.56，氨基氮在56mg/Kg， OD值0.410。 OD值檢測為紫外可見分光光度計H0605019，波長520nm。
4)將上述制備的二級種子罐中的種子液按發(fā)酵培養(yǎng)基體積的8%比例接入三 級發(fā)酵罐中培養(yǎng)
發(fā)酵罐的培養(yǎng)基組成為
白糖3.0，大豆蛋白粉0.7， KH2P04: 0.1， MnS04.H20: 0.025，K2HP04: 0.15， MgS04: 0.06， DDFS-303: 0.0003， H3B03: 0.003，其余 為水；
三級發(fā)酵罐中的培養(yǎng)條件為
發(fā)酵培養(yǎng)溫度32.5°C，運行壓力0.06Mpa; 發(fā)酵攪拌使用變頻調(diào)速攪拌，具體控制的變頻轉(zhuǎn)速如下 Oh 160r/min 10h 180r/min 20h 220r/min 放罐 風(fēng)量根據(jù)k酵時間分段i制進氣量來控fej，具體控制參數(shù)如下； Oh 1000m3/h 12h 1500 m3/h 30h 1800 m3/h 放罐 發(fā)酵黏度達(dá)4000cp以上，按罐中發(fā)酵液體積按10%的比例補入無菌水，即 3.5T。分3次補入，頻率每兩小時一次。
三級發(fā)酵罐中的培養(yǎng)終點為放罐黏度在8500cp，殘?zhí)潜壤刂圃?.29。 從一級種子罐到發(fā)酵罐的整個發(fā)酵過程中，進氣空氣溫度控制在25 30°C, 使發(fā)酵罐內(nèi)培養(yǎng)發(fā)酵液的溫度更精確地控制在工藝要求范圍內(nèi)，利于微生物多 糖的生長合成。
發(fā)酵結(jié)束后，收集發(fā)酵液，取定量的發(fā)酵液用水溶解搖勻，再離心，使用 離心后的上層溶液加入酒精浸泡，抽濾后烘干，得粗多糖濃度在2.05g/100ml。 較文獻(xiàn)記載的單罐粗多糖濃度最高1.6g/100ml提高了 28%。
權(quán)利要求
1.一種高產(chǎn)量的結(jié)冷膠發(fā)酵制備方法，其包括以下步驟1)斜面菌種經(jīng)擴大培養(yǎng)成搖瓶種子液；2)將搖瓶種子液接入一級種子罐無菌培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)；3)將一級種子罐中的種子液接入二級種子罐無菌培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)；4)將二級種子罐中的種子液接入三級發(fā)酵罐無菌培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)；5)收集結(jié)冷膠發(fā)酵液；其中所述菌種為少動鞘氨醇單胞菌，并且在三級發(fā)酵罐中的培養(yǎng)過程中添加無菌水。
2. 權(quán)利要求1的制備方法，其特征在于，搖瓶培養(yǎng)基的組成為蛋白胨0.3 0.6，牛肉膏0.2 0.4，酵母膏0.05~0.15，其余為水。
3. 權(quán)利要求1的制備方法，其特征在于，搖瓶擴大培養(yǎng)的條件為溫度28-34 °C，周期18 30h，搖床轉(zhuǎn)速150r/min。
4. 權(quán)利要求l的制備方法，其特征在于， 一級種子罐中的培養(yǎng)基組成為 酵母浸出汁0.2 0.5，牛肉膏0.3，魚蛋白胨0.5， DDFS-303: 0.0003，其余為水；以重量/體積百分比計。
5. 權(quán)利要求l的制備方法，其特征在于， 一級種子罐中擴大培養(yǎng)的條件為培養(yǎng)溫度28~34°C，通風(fēng)比1: 0.5，運行壓力0.05 0.08Mpa。
6. 權(quán)利要求l的制備方法，其特征在于， 一級種子罐擴大培養(yǎng)的終點為周期:13 16h， pH值在8.2以上，氨基氮在350mg/Kg以上，OD520nm值0.1 ± 0.02。
7. 權(quán)利要求l的制備方法，其特征在于，二級種子罐中的培養(yǎng)基組成為白糖2.0 3.0，酵母浸出汁0.1 0.3，大豆蛋白粉0.2 0.4, KH2P04: 0.05， K2PH04: 0.05， MgS04: 0.06， DDFS-303: 0.0003，其余為水。
8. 權(quán)利要求1的制備方法，其特征在于，二級種子罐的培養(yǎng)條件為培養(yǎng)溫度:28 34。C，通風(fēng)比h 0.5，運行壓力0.05 0.08Mpa。
9. 權(quán)利要求l的制備方法，其特征在于，二級種子罐擴大培養(yǎng)的終點為周期:`6 8h， pH值在6.0 6.6，氨基氮在40 80mg/Kg之間，OD520nm值0.4±0.02。
10. 權(quán)利要求l的制備方法，其特征在于三級發(fā)酵罐中的培養(yǎng)基組成為白糖:`2.5~3.5，大豆蛋白粉0.5~0.8， KH2P04: 0.1， MnS04'H20: 0.025， K2HP04: 0.15， MgS04: 0.06， DDFS-303: 0.0003, H3B03: 0.003，其余為水。
全文摘要
一種高產(chǎn)量的結(jié)冷膠發(fā)酵制備方法，其包括以下步驟1)斜面菌種經(jīng)擴大培養(yǎng)成搖瓶種子液；2)將搖瓶種子液接入一級種子罐無菌培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)；3)將一級種子罐中的種子液接入二級種子罐無菌培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)；4)將二級種子罐中的種子液接入三級發(fā)酵罐無菌培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)；5)收集結(jié)冷膠發(fā)酵液；其中所述菌種為少動鞘氨醇單胞菌，并且在三級發(fā)酵罐中的培養(yǎng)過程中添加無菌水。使用本發(fā)明的方法，可以將發(fā)酵周期由原來的50～60h縮短至40～45h，粗多糖含量由1.5～1.6g/100ml提高至2.0～2.5g/100ml，真正實現(xiàn)低能高產(chǎn)的目的。
文檔編號C12R1/01GK101586135SQ20091014390
公開日2009年11月25日 申請日期2009年6月3日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月3日
發(fā)明者倪井廣, 吳榮明, 楊寶毅, 潘小玉, 梅 陳 申請人:浙江中肯生物科技有限公司