專利名稱：來自橄欖植物液的富含羥基酪醇的組合物及其使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及橄欖果實(shí)和樹葉中所含的一組化合物的酚類餾分，稱之為多酚。具體說來，本發(fā)明提供了一種含羥基酪醇(hydroxytyrosol)(3，4-二羥苯基乙醇)和少量油橄欖苦甙(oleuropein)和酪醇或幾乎不含油橄欖苦甙和酪醇的橄欖提取物，其制備方法和該化合物的應(yīng)用方法。
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背景技術(shù)：
許多疾病的發(fā)展都牽涉到大量的飲食脂肪(Owen等，2000c)。動脈粥樣硬化癥(Kuller，1997)和冠心病(Gerber，1994)以及乳腺癌(La Vecchia等，1998)、前列腺癌(Chan等，1998)、卵巢癌(Risch等，1994)和結(jié)腸癌(Armstrong和Doll，1975)各自都與升高的飲食脂肪有關(guān)。然而，證據(jù)表明在某些癌癥的病原學(xué)中重要的不僅是飲食脂肪的數(shù)量，還包括飲食脂肪的類型。
橄欖油是地中海飲食的主要油脂成分，與冠心病(Owen等，2000b；Parthasarathy等，1990；Mattson和Grundy，1985)和某些癌癥(d’Amicis和Farchi，1999；Braga等，1998；Martin-Moreno等，1994)較低的發(fā)病率有關(guān)。一些實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)指出橄欖油酚類油橄欖苦甙和其它同族物質(zhì)的水解產(chǎn)生具有強(qiáng)抗癌活性的小酚類組分(Owen等，2000a；Manna等，2000)。特別地，橄欖油酚類羥基酪醇能防止低密度脂蛋白(LDL)氧化(Visioli和Galli，1998)、血小板凝集(Petroni等，1995)并抑制5-和12-脂肪氧合酶(de la Puerta等，1999；Kohyama等，1997)。此外，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)羥基酪醇對過亞硝酸鹽決定的DNA堿基修飾和酪氨酸硝化反應(yīng)產(chǎn)生抑制作用(Deiana等，1999)，而且它能在各種人類細(xì)胞系統(tǒng)中解除由活性氧類引起的細(xì)胞毒性(Manna等，2000)。最后，研究顯示，羥基酪醇消化后在人體內(nèi)劑量依賴性地吸收，顯示出其生物利用率(Visioli等，2000)。
通常，橄欖油制造包括碾碎含核的橄欖以制造稠漿。在此工序中，不斷地用水沖洗碾碎的橄欖，將該過程稱為“揉拌”(malaxation)。然后將該漿料進(jìn)行機(jī)械擠壓以榨出油分。除了提供油分，該擠壓過程還榨出漿料的水分。這些沖洗和擠壓步驟產(chǎn)生相當(dāng)多的水，稱之為“植物液”(vegetation water)。
橄欖核和果肉都富含水溶性酚類化合物。這些化合物在揉拌過程中按照其分配系數(shù)從橄欖中提取出，并最終進(jìn)入植物液中。這解釋了為什么在植物液中可以發(fā)現(xiàn)大量的橄欖果肉中生成的各種酚類化合物，例如油橄欖苦甙及其衍生物。同樣地，在植物液中也富含大量的橄欖核中生成的單酚化合物，例如酪醇及其衍生物。
由于酪醇的強(qiáng)抗癌活性，希望開發(fā)一種能制備含有高百分比的羥基酪醇的水性橄欖提取物的方法。
發(fā)明概述一方面，本發(fā)明包括一種制備富含羥基酪醇的組合物的方法。該方法包括下列步驟(a)用橄欖，優(yōu)選用去核橄欖的果肉(或果漿)制備植物液，(b)在植物液中加入酸，酸的用量優(yōu)選為使pH為1至5的量，更優(yōu)選為使pH為2至4的量，(c)培養(yǎng)酸化的植物液，直至植物液中原先存在的油橄欖苦甙有至少50％，優(yōu)選至少75％，更優(yōu)選至少90％轉(zhuǎn)化成羥基酪醇。在優(yōu)選的實(shí)施例中，將酸化植物液培養(yǎng)至少兩個(gè)月，更優(yōu)選地，將酸化植物液培養(yǎng)大約6-12個(gè)月。
在一個(gè)實(shí)施方案中，培養(yǎng)植物液直至植物液中羥基酪醇對油橄欖苦甙的重量比為1∶1至200∶1，優(yōu)選為4∶1至200∶1，更優(yōu)選為l0∶1至100∶1。在相關(guān)實(shí)施例中，培養(yǎng)植物液直至植物液中羥基酪醇對酪醇的重量比為3∶1至50∶1，通常為5∶1至30∶1。
該方法進(jìn)一步包括將培養(yǎng)后的植物液分餾，從而將羥基酪醇與其它組分分離，和/或?qū)⒏缓u基酪醇的植物液干燥來制備干燥的提取物。在一個(gè)實(shí)施例中，用有機(jī)溶劑萃取培養(yǎng)后的植物液，來制備含20％，或優(yōu)選95％或更高羥基酪醇的餾分。
本發(fā)明還提供了一種可注射組合物，其含有由一種或多種上述實(shí)施例制備的富含羥基酪醇的組合物。
另一方面，本發(fā)明包括一種制備富含羥基酪醇的組合物的方法，包括下列步驟(a)用橄欖制備植物液；(b)加入酸使油橄欖苦甙和其它酚類大分子水解；(c)任選地，將植物液干燥；(d)將任選干燥的植物液與超臨界流體接觸；和(e)從接觸后的植物液中回收富含羥基酪醇的組合物。在一個(gè)實(shí)施例中，富含羥基酪醇的組合物含有至少大約95wt％的羥基酪醇。在另一個(gè)實(shí)施例中，富含羥基酪醇的組合物含有至少大約97wt％的羥基酪醇。在又一個(gè)實(shí)施例中，富含羥基酪醇的組合物含有至少大約99wt％的羥基酪醇。
另一方面，一種制備富含羥基酪醇的組合物的方法，包括下列步驟(a)用橄欖制造植物液；(b)加入酸使油橄欖苦甙和其它酚類大分子水解；(c)任選地，將植物液干燥；(d)用合適的有機(jī)溶劑，例如乙酸乙酯(EtAc)萃取植物液；和(e)回收羥基酪醇含量為酚類餾分總量的95wt％或更高的餾分。在一個(gè)實(shí)施例中，富含羥基酪醇的組合物包括至少20％含大約95wt％羥基酪醇的酚類餾分。在一個(gè)實(shí)施例中，通過硅膠色譜法或其它凝膠色譜法提純EtAc餾分，以獲得含有95wt％或更高羥基酪醇的羥基酪醇餾分。
在一個(gè)實(shí)施例中，上述回收步驟包括下列步驟(a)回收超臨界流體，其中超臨界流體含有羥基酪醇；和(b)將超臨界流體蒸發(fā)以提取富含羥基酪醇的組合物。在另一個(gè)實(shí)施例中，上述接觸步驟包括下列步驟(a)提供在受壓組件中的具有兩個(gè)側(cè)面的多孔膜，該膜作為流體和高密度氣體之間的阻隔界面，該膜對所述羥基酪醇是非選擇性的；(b)超臨界流體在膜的一側(cè)上流入組件，而植物液在膜的另一側(cè)；(c)植物液和超臨界流體之間的羥基酪醇濃度梯度驅(qū)使羥基酪醇穿過該膜提取出來。在一個(gè)實(shí)施例中，多孔膜是中空纖維膜。在另一個(gè)實(shí)施例中，超臨界流體是二氧化碳。
在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明包括一種制備富含羥基酪醇的組合物的方法，其包括下列步驟(a)用橄欖制造植物液；(b)加入酸使油橄欖苦甙和其它酚類大分子水解；(c)將酸化植物液進(jìn)行噴霧干燥，即蒸發(fā)，由此制成含羥基酪醇的粉末。在另一個(gè)實(shí)施例中，通過在酸化植物液中加入麥芽糖糊精進(jìn)行上述蒸發(fā)步驟，優(yōu)選制成含大約1至5％羥基酪醇的粉末，更優(yōu)選制成含大約2％羥基酪醇的粉末。
另一方面，本發(fā)明包括一種含橄欖水性提取物的膳食補(bǔ)充劑，該橄欖水性提取物中羥基酪醇對油橄欖苦甙的重量比為4∶1至200∶1，通常為10∶1至100∶1。
在相關(guān)方面，本發(fā)明包括一種含橄欖水性提取物的膳食補(bǔ)充劑，該橄欖水性提取物中羥基酪醇對酪醇的重量比為3∶1至50∶1，通常為5∶1至30∶1。
可以將上述補(bǔ)充劑干燥，優(yōu)選通過噴霧干燥法干燥，來獲得一種粉狀提取物，該粉狀提取物可以配制成片狀、膠囊狀、丸狀或糖膏劑食品添加劑?；蛘?，可以將上述補(bǔ)充機(jī)加入藥用制劑中，例如加入富含羥基酪醇的可注射制劑。
本發(fā)明還提供保護(hù)皮膚抵御紫外線輻射(UVR)照射造成的不利效果的方法，包括對需要這種保護(hù)的對象施用治療有效量的治療劑，該治療劑中羥基酪醇對油橄欖苦甙的重量比為大約1∶1至大約200∶1，優(yōu)選為大約4∶1至大約100∶1，更優(yōu)選為大約10∶1至大約50∶1。該試劑在局部敷用時(shí)還可以含有遮光劑。在一個(gè)實(shí)施例中，局部敷用該試劑。優(yōu)選地，口服該試劑。
結(jié)合附圖和表來閱讀本發(fā)明的下列詳細(xì)說明，可以更充分地理解本發(fā)明的這些和其它方面和特征。
附圖簡要說明

圖1表示在橄欖油中測出的酚類化合物及其前體的結(jié)構(gòu)ligstroside(I)；油橄欖苦甙葡糖苷(II)；ligstroside的糖苷配基(III)；油橄欖苦甙葡糖苷的糖苷配基(IV)；缺少羧甲基的ligstroside糖苷配基的二醛形態(tài)(V)；缺少羧甲基的油橄欖苦甙葡糖苷糖苷配基的二醛形態(tài)(VI)；酪醇(VII)；羥基酪醇(VIII)。
圖2表示本發(fā)明的富含羥基酪醇的組合物在從由去核橄欖果肉制成的植物液中用超臨界二氧化碳提取出來后進(jìn)行的HPLC分析。
圖3表示超臨界二氧化碳提取后，加入合成的羥基酪醇的本發(fā)明的富含羥基酪醇的組合物的HPLC分析。
圖4表示本發(fā)明的富含羥基酪醇的組合物在由去核橄欖果肉制成的植物液酸性水解后的HPLC分析。
圖5表示本發(fā)明的富含羥基酪醇的組合物在用乙酸乙酯從由去核橄欖果肉制成并經(jīng)過加酸水解的植物液中萃取出羥基酪醇后的HPLC分析。
圖6表示通過在硅膠上進(jìn)行凝膠色譜法提純后制得的純凈(95％或更高)羥基酪醇的HPLC分析。
圖7表示本發(fā)明的富含羥基酪醇的組合物的質(zhì)譜圖。
圖8表示羥基酪醇的碎裂途徑。
發(fā)明詳述本申請引用的所有出版物、專利、專利申請文件或其它參考文獻(xiàn)全部經(jīng)此引用并入本文，如同每篇出版物、專利、專利申請文件或參考文獻(xiàn)各自明確并單獨(dú)地經(jīng)此引用并入本文。
I.定義除非另行說明，本文使用的所有術(shù)語具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員所理解的意思。可以理解的是，本發(fā)明并不限于所述的特定方法、方案和試劑，因?yàn)檫@些是可以改變的。
“油橄欖苦甙”是指裂環(huán)烯醚萜類葡糖苷油橄欖苦甙(secoiridoidglucoside oleuropein)(圖1中的結(jié)構(gòu)II)。
“酪醇”是指4-羥苯基乙醇(圖1中的結(jié)構(gòu)VII)。
“羥基酪醇”是指3，4-二羥苯基乙醇(圖1中的結(jié)構(gòu)VIII)。
II.本發(fā)明的方法本發(fā)明一方面提供了取自橄欖植物液的富含羥基酪醇的組合物。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在下文所述的特定條件下，可以從橄欖的植物液中制得羥基酪醇。下文描述的是實(shí)施本發(fā)明的步驟。
A.制備植物液本發(fā)明的方法使用來自例如種植商的常規(guī)和商業(yè)來源的橄欖。優(yōu)選地，植物液是由去核橄欖制成的。按照本文公開的方法處理的橄欖可以通過任何適當(dāng)?shù)姆椒ㄟM(jìn)行去核。橄欖核中含有的酪醇是植物液中不希望有的組分，而且基本上不能被下述酸處理分解?？梢匀缦滤鐾ㄟ^手工或自動化方式將果核與果肉分離。優(yōu)選地，這些方式應(yīng)該能夠完整地分離出果核，否則會使植物液中酪醇的濃度變高。在另一個(gè)實(shí)施例中，從用沒有去核的橄欖制成的植物液中提取羥基酪醇。
為了制備植物液，首先將橄欖果肉擠壓來獲得含橄欖油、植物液和固體副產(chǎn)物的液相混合物。隨后，將植物液與其余液相混合物分離并收集。在同屬于R.Crea的美國專利申請?zhí)?,165,475和6,197,308中描述了植物液制備方法的范例，這兩個(gè)申請各自明確完整地經(jīng)此引用并入本文。
為了進(jìn)行工業(yè)生成，最好使本發(fā)明的各個(gè)方面都自動化。為此，一個(gè)實(shí)施例考慮使用美國專利4,452,744，4,522,119和4,370,274中公開的裝置，這些專利都屬于Finch等人，而且各自明確地經(jīng)此引用并入本文。簡要地說，F(xiàn)inch等人描述了從橄欖中獲得橄欖油的裝置。首先，將橄欖裝入果肉采集器，將橄欖核與橄欖分離，制成無核橄欖肉。然后用壓榨螺桿處理果肉，對果肉施加足以榨出含油、水和少量橄欖果漿的的液體相的壓榨壓力。將液相收集在一個(gè)料斗中，然后送入凈化離心機(jī)，將果漿與液相分離以制成含橄欖油和植物液的混合物。凈化離心機(jī)然后將植物液和少量固體物質(zhì)從混合物中分離出來，制成幾乎不含植物液的橄欖油，將其收集在油罐中。按照Finch等人所說，將植物液排入下水道之類的排污裝置中。本發(fā)明則完全相反，是將植物液收集、保留并用來提取羥基酪醇。
在意大利專利1276576和1278025中公開了用于實(shí)施本發(fā)明的其它設(shè)備，這兩個(gè)專利各自明確的經(jīng)此引用并入本文。如上所述，可以在將碾碎的橄欖果肉加工成油、水和固體殘?jiān)?，使用這些設(shè)備來分離果肉和果核。
B.油橄欖苦甙轉(zhuǎn)化成羥基酪醇在本發(fā)明的一個(gè)方面，將植物液中所含的油橄欖苦甙轉(zhuǎn)化成羥基酪醇?？梢约尤胨峤档椭参镆旱膒H值，并將植物液在按照本發(fā)明的發(fā)現(xiàn)能夠促進(jìn)油橄欖苦甙酸性水解成羥基酪醇的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。然后將試樣分餾或萃取，從而將羥基酪醇與其它化合物分離。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，加入的酸是檸檬酸。在植物液中加入酸，優(yōu)選將pH值調(diào)節(jié)至1-5，更優(yōu)選調(diào)節(jié)至2-4?？梢约尤牍腆w檸檬酸，同時(shí)不斷攪拌，加入量優(yōu)選為大約每1000加侖植物液中加入大約25-50磅的酸。監(jiān)測所得溶液的pH值，可能需要再加入酸以獲得所需的pH值。實(shí)施例1和2給出了加入檸檬酸后將油橄欖苦甙轉(zhuǎn)化成羥基酪醇的示范方法。
酸也可以是檸檬酸以外的其他有機(jī)酸或無機(jī)酸。可用于本發(fā)明的典型的酸包括稱作礦物酸的無機(jī)物-硫酸、硝酸、鹽酸和磷酸和屬于羧酸、磺酸和苯酚(芐基)類的有機(jī)化合物。向植物液中加入酸有幾個(gè)目的(i)使植物液穩(wěn)定，以免酚分子發(fā)生空氣(氧氣)聚合；(ii)防止植物液被內(nèi)生的和/或外生的細(xì)菌和酵母發(fā)酵；和(iii)如實(shí)施例1和2所示，使含羥基酪醇的油橄欖苦甙和其它酚類大分子水解，從而將它們轉(zhuǎn)化成羥基酪醇。實(shí)施例1中的表1和實(shí)施例2中的表2包含來自兩個(gè)植物液樣品的數(shù)據(jù)和加入檸檬酸后經(jīng)過一定時(shí)間樣品中各種組分各自的百分比組成。在一個(gè)實(shí)施例中，培養(yǎng)該混合物直至其中的羥基酪醇占油橄欖苦甙和羥基酪醇總量的75-90％。在另一個(gè)實(shí)施例中，原始混合物中的油橄欖苦甙幾乎都沒有留下。
C.羥基酪醇的提純油橄欖苦甙轉(zhuǎn)化成羥基酪醇(優(yōu)選加入酸使其轉(zhuǎn)化)后，可以通過本領(lǐng)域已知的許多方法將培養(yǎng)后的植物液分餾。示例性的分餾方法包括用例如乙酸乙酯的有機(jī)溶劑分相、包括凝膠色譜法和高效液相色譜法(HPLC)在內(nèi)的色譜法或超臨界流體。
或者，如上所述制得的植物液酸化后，產(chǎn)生一種富含低分子量多酚，特別是羥基酪醇，和少量酪醇和油橄欖苦甙的溶液。加工液中羥基酪醇的濃度為每升4-5克至每升10-15克，這取決于橄欖油提取過程中加水稀釋的程度。在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明提供了一種提取或提純方法，該方法在沒有添加污染物的前提下選擇性地提高羥基酪醇含量。因此，主要的多酚組分，即羥基酪醇，與多酚類中的其它物質(zhì)、雜質(zhì)、懸浮固體、丹寧酸和植物液所含的其它分子分離。因此可以以目前的合成或天然提取方法不容易實(shí)現(xiàn)的純度和量來制備羥基酪醇。
超臨界流體是在臨界溫度和壓力之上變得非常稠密的氣體。其性質(zhì)介于氣體和液體之間，因此具有更高的溶解化合物的能力。其相對較高的密度、高擴(kuò)散率和低粘性使其提取化合物的速度快于常規(guī)的液體溶劑。二氧化碳是最廣泛用于食品和食品成分的超臨界流體處理的氣體，因?yàn)樗烊?、無毒、不可燃、相對惰性而且不會殘留在提取產(chǎn)物中。典型的用超臨界二氧化碳進(jìn)行的液體提取通常如下在大接觸柱或塔中使一種相分散在另一種相中，其中含溶質(zhì)的流體，例如果汁，由于重力作用向下流動，而超臨界二氧化碳向上流動。在兩種相之間的界面上發(fā)生質(zhì)量傳遞。
或者，可以使用例如二氧化碳的超臨界流體和多孔膜而非接觸塔來實(shí)現(xiàn)液體和懸浮液的連續(xù)提取。將液體連續(xù)加料通過中空纖維束或螺旋纏繞片造型的多孔聚丙烯膜，而不是使相分散。液體通過受壓組件內(nèi)的多孔膜，同時(shí)超臨界二氧化碳在膜的另一面上逆向流動。組件內(nèi)的壓力基本相同，因此提取由流體和超臨界二氧化碳之間的濃度梯度驅(qū)動進(jìn)行?？梢酝ㄟ^蒸發(fā)再利用二氧化碳來回收提取物。在美國專利號5,490,884中描述了使用超臨界二氧化碳和多孔膜進(jìn)行提取的示例性方法，該專利明確完整地經(jīng)此引用并入本文。
可以用其它超臨界流體來代替二氧化碳或與二氧化碳聯(lián)用。這些流體包括甲烷、乙烷、丙烷、丁烷、異丁烷、乙烯、丙稀、氫氟碳、四氟甲烷、氯二氟甲烷、二氧化碳、一氧化二氮、六氟化硫、氨和甲基氯。
實(shí)施例3描述了一個(gè)支持本發(fā)明的小規(guī)模實(shí)驗(yàn)，其中使用超臨界二氧化碳和多孔膜從植物液中離析出羥基酪醇。離析出的羥基酪醇的HPLC和質(zhì)譜分析表明樣品是純度為97-99％的羥基酪醇。因此，本發(fā)明提供了含至少大約80％羥基酪醇，優(yōu)選至少大約90％羥基酪醇，更優(yōu)選至少大約95％羥基酪醇，再優(yōu)選至少大約97％羥基酪醇，還優(yōu)選至少大約99％羥基酪醇的富含羥基酪醇的組合物。
用超臨界流體提取之前，可以在植物液中加入本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的載體，例如麥芽糖糊精(maltodextran)和/或聚丙稀珠；和/或可以將溶液干燥。干燥步驟優(yōu)選從植物液中去除至少大約90％，更優(yōu)選至少大約95％，再優(yōu)選至少大約98％的水分。
膜反應(yīng)器的一個(gè)重要特征在于可以獨(dú)立于流體速率增加接觸表面界面面積的事實(shí)。相應(yīng)地，本發(fā)明考慮使用一組大規(guī)模裝置，其中提取用的膜的膜表面積為至少大約100平方碼，優(yōu)選為至少大約300平方碼，更優(yōu)選為至少大約600平方碼，這樣就可以從大量的植物液中來分離羥基酪醇。因此，一方面，本發(fā)明的膜系統(tǒng)可以接受每分鐘1-20升，優(yōu)選每分鐘5-10升的流速。
按照上述本發(fā)明也可以使用其它提純方法。在Ficarra等，1991；Romani等，1999；和Tsimidou，1992中描述了羥基酪醇的HPLC離析法，這些文獻(xiàn)各自明確地經(jīng)此引用并入本文。
III.富含羥基酪醇的膳食補(bǔ)充劑應(yīng)該意識到由上述方法制備的羥基酪醇可用于多種用途。例如，由本發(fā)明的方法制得的羥基酪醇可以用于(i)可作為天然抗菌、抗病毒和/或殺真菌產(chǎn)品用于農(nóng)業(yè)和/或蟲害控制用途，和(ii)作為治療劑和/或抗氧化劑用于多種保健用途。在一個(gè)具體實(shí)施例中，將羥基酪醇施用于哺乳動物對象，例如期望獲得一種或多種與羥基酪醇有關(guān)的益處的人。
因此，本發(fā)明提供了抵御紫外線輻射(UVR)照射引起的皮膚損傷的組合物和方法。由本發(fā)明的方法制得的羥基酪醇可以口服或腸道外施用?？诜┬涂梢允枪腆w或液體形式。該劑型可以由純化的羥基酪醇配制而成，或者可以由水或水-醇提取物配制而成。對于后者，可以將水或水-醇(例如水或水-乙醇)提取物噴霧干燥來獲得干燥粉末，該粉末與其它藥學(xué)上可以接受的載體一起配制成口服劑型。配制水或水-醇提取物，使其含有的羥基酪醇對油橄欖苦甙的重量比介于4∶1至200∶1之間，優(yōu)選大約10∶1至大約100∶1之間。也可以配制該提取物，使其所含羥基酪醇對酪醇的重量比介于大約2∶1至大約50∶1之間，優(yōu)選大約5∶1至大約30∶1之間。
優(yōu)選地，將該組合物口服給藥需要抵御UVR照射引起的皮膚損傷的患者。以制藥領(lǐng)域公知的方式制備本發(fā)明的固體口服劑型組合物，其含有羥基酪醇和至少一種藥學(xué)上可以接受的載體。在制造這類組合物時(shí)，通常將富含羥基酪醇的組合物，無論其是以幾乎純凈的形態(tài)還是作為粗餾物或提取物的組分之一，與載體混合、稀釋或封裝。載體可以是作為活性成分的賦形劑、載體或介質(zhì)的固體、半固體或液體材料。或者，載體可以是利于口服的膠囊形式或其它包裝。因此，按照本發(fā)明施用的固體口服劑型可以是片狀、丸狀、粉狀、軟或硬膠囊狀。
或者，按照本發(fā)明制得的口服羥基酪醇可以是液態(tài)，其中藥學(xué)上可以接受的載體是水或水-醇介質(zhì)。
在本發(fā)明中施用的組合物也可以與其它常用的藥學(xué)上可以接受的賦形劑一起配制，包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉、樹膠、硅酸鈣、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纖維素、水、醇等。制劑還可以包括例如滑石、硬脂酸鎂和礦物油的潤滑劑、潤濕劑、乳化劑、懸浮劑、例如羥基苯甲酸甲酯和羥基苯甲酸丙酯之類的防腐劑、甜味劑或增味劑。此外，可以配制本發(fā)明的組合物使其施用于對象后活性成分快速、持續(xù)或延緩釋放。
使用本領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)工藝來制備按照本發(fā)明施用的腸道外制劑。本文使用的術(shù)語腸道外包括皮下注射、靜脈注射、肌肉注射、膜(intrasternal)注射或輸液技術(shù)。這類制劑通常使用例如等滲壓鹽水溶液的腸道外注射用載體制成無菌注射溶液，或制成無菌成包粉末，在施用于對象之前用無菌緩沖劑或等滲壓鹽水使之復(fù)原。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，腸道外制劑是含有1至500mg/ml本發(fā)明的富含羥基酪醇的組合物的可注射制劑。更優(yōu)選地，該可注射制劑含有1至100mg/ml富含羥基酪醇的組合物，再優(yōu)選地，含有10至100mg/ml富含羥基酪醇的組合物，最優(yōu)選含有大約10mg/ml富含羥基酪醇的組合物。
從前文可以看出本發(fā)明的各種目的和特征是如何實(shí)現(xiàn)的。根據(jù)前文的描述，本領(lǐng)域技術(shù)人員現(xiàn)在可以看出，能夠通過多種方式實(shí)踐本發(fā)明的廣義原理。因此，盡管用具體實(shí)施方案及其實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行了描述，但本發(fā)明的實(shí)際范圍并不限于此?？梢栽诓幻撾x所附權(quán)利要求所界定的本發(fā)明范圍的前提下對其進(jìn)行各種改變和修正。
下列實(shí)施例闡明了制備本發(fā)明的富含羥基酪醇的組合物的方法。這些實(shí)施例旨在舉例說明而決不是限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例實(shí)施例1每1000加侖加入大約25磅檸檬酸后，油橄欖苦甙轉(zhuǎn)化成羥基酪醇表1表示在每1000加侖植物液加入大約25磅檸檬酸后，經(jīng)過一定時(shí)間油橄欖苦甙轉(zhuǎn)化成羥基酪醇的情況。表1中的百分比是占溶液中酚類化合物總量的重量百分比。如表1所示，羥基酪醇在12個(gè)月后構(gòu)成溶液內(nèi)酚類化合物的80％以上。
表1每1000加侖加入大約25磅檸檬酸后，油橄欖苦甙轉(zhuǎn)化成羥基酪醇
實(shí)施例2每1000加侖加入大約50磅檸檬酸后，油橄欖苦甙轉(zhuǎn)化成羥基酪醇表2表示在每1000加侖植物液加入大約50磅檸檬酸后，經(jīng)過一定時(shí)間油橄欖苦甙轉(zhuǎn)化成羥基酪醇的情況。表2中的百分比是占溶液中酚類化合物總量的重量百分比。明顯地，如表2所示，羥基酪醇在2個(gè)月后構(gòu)成溶液內(nèi)酚類化合物的45％以上。
表2每1000加侖加入大約50磅檸檬酸后，油橄欖苦甙轉(zhuǎn)化成羥基酪醇
實(shí)施例3從植物液中提取羥基酪醇將含大約40毫克干燥固體(麥芽糖糊精)的植物液等分試樣(0.5毫升)與聚丙烯多孔珠混合并干燥。該干燥混合物用超臨界二氧化碳來提取(PoroCrit，LLC，Berkeley，CA)。通過HPLC分析收集到的樣品(大約2.0毫克)。圖2表示樣品分布圖，表3表明主峰下的面積達(dá)到97％。在樣品中加入合成羥基酪醇并通過HPLC分析時(shí)，如圖3所示呈現(xiàn)一個(gè)主峰，表明樣品的主要產(chǎn)物是羥基酪醇(表4)。
表3圖2HPLC結(jié)果的峰值分析
表4圖3HPLC結(jié)果的峰信分析
實(shí)施例4從酸化的植物液中提取羥基酪醇將酸性水解后的植物液等分試樣(0.5毫升)在搖動燒瓶中與乙酸乙酯一起劇烈搖動。將有機(jī)溶劑從水溶液中分離出來并用旋轉(zhuǎn)式汽化器蒸發(fā)掉。收集制得的稠油(大約20克)并通過HPLC分析。圖5表示該樣品分布圖，表5顯示主峰下的面積達(dá)到97.457％，表明羥基酪醇構(gòu)成植物液中多酚總餾分的大約95％或更高。通過標(biāo)準(zhǔn)比色分析進(jìn)行的總酚類測定表明油中羥基酪醇的含量約為20wt％。
表5圖5HPLC結(jié)果的峰值分析
該餾分用凝膠色譜法來進(jìn)一步提純羥基酪醇。將干燥硅石(150克)懸浮在乙酸乙酯(300毫升)中，制得粘稠漿料。將該漿料導(dǎo)入玻璃柱中并使硅石放置15分鐘直至沉積。將含大約20％(4克)羥基酪醇的稠油溶于25毫升乙酸乙酯并倒入硅膠中。通過產(chǎn)物的重力洗脫和加入作為溶劑的乙酸乙酯將羥基酪醇提純。收集含純羥基酪醇的餾分并匯集在一起。蒸發(fā)溶劑直到制得黃色油。如圖6和表6所示，經(jīng)HPLC和質(zhì)譜法證實(shí)，該油是基本純凈的羥基酪醇(97-99％)。提純的產(chǎn)量約為2.8-3.0克羥基酪醇或ca.65％。
表6圖6HPLC結(jié)果的峰值分析
如圖7所示，按照實(shí)施例3和4中兩個(gè)步驟所述制得的樣品的質(zhì)譜分析證實(shí)主要產(chǎn)物是羥基酪醇。用甲醇將樣品稀釋至最終濃度為每毫升26微克，并在安裝有ESI探針的Finnigan LCQ上以負(fù)電荷電離模式進(jìn)行分析。使用一體式注射泵以每分鐘3微升的速度進(jìn)行輸液。溫度是270℃，指針電壓+4.2V，夾套氣(sheath gas)45單位，輔助氣體10單位。羥基酪醇的碎裂途徑表示在圖8中。從圖7中可以看出，羥基酪醇(質(zhì)量/電荷153.1)及其碎裂產(chǎn)物(123.1和105.1質(zhì)量/電荷)占據(jù)了多級譜中富含的產(chǎn)品的大部分。
實(shí)施例5抵御紫外線輻射造成的皮膚損傷Olivenol組合物測試物是Olivenol(Lot#1A-1B)。Olivenol是通過旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)器將植物液的酸性水解液(500毫升)蒸發(fā)至干燥、隨后再冷凍干燥制得的粗制水制品。測試物賦形劑是0.5％w/v甲基纖維素水溶液(口服)和甲醇，99.9％A.C.S.分光光度等級(局部敷用)。在研究過程中一次性制備制劑，為了進(jìn)行劑量計(jì)算，將測試物視作75％活性。
小鼠將一百只雄性CrlSKH1-hrBR無毛小鼠(來源Charles RiverLaboratories，Inc.，Portage，Michigan USA)隨機(jī)分配到十個(gè)劑量組(組1至組10)，每組十只小鼠，如表1所示。雄鼠的體重為17至28克。
表5實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
*組1-5劑量＝10毫升/千克組6-10劑量和濃度假設(shè)小鼠體重為25克并對每只鼠施用0.1毫升的量(即100mcL/鼠)。
施用Olivenol組合物及UVR照射每天一次將制劑口服施用給合適的小鼠(通過管飼法)，持續(xù)31天(組1至4)或10天(組5)。每天一次將制劑局部敷用給合適的小鼠(100mcL/小鼠)，持續(xù)31天(組6至9)或10天(組10)。
在施用制劑的第28天(組1至4和組6至9)或第7天(組5和10)，將組1至組10的小鼠暴露在UVR(即電磁波譜的UVB和UVA部分的波長)下。輻射源是帶有連到Orlel光導(dǎo)管上的WG320 Schott玻璃濾光鏡(1mm)的Berger Compact Arc高強(qiáng)度太陽能模擬器(SolarLight Company，Philadelphia，PA)。用PMA 2100儀表(Solar LightCompany，Philadelphia，PA)或類似設(shè)備連續(xù)監(jiān)測輻射源的輻射強(qiáng)度。在第28或第7天，施用制劑與開始暴露在UVR下之間的間隔對多數(shù)小鼠低于15分鐘，而對少數(shù)小鼠略高于15分鐘。
每天檢測兩次成活力。至少每周記錄臨床觀察結(jié)果，包括在第一次施用制劑之前記錄一次，在馬上要暴露在UVR下之前記錄一次。還在輻射后大約24、48和72小時(shí)記錄臨床觀察結(jié)果。在給藥周期內(nèi)每周記錄一次體重并在最終死亡后記錄體重。
小鼠的死亡所有小鼠都存活到計(jì)劃的死亡時(shí)間。在最終檢測之后，即完成UVR照射大約72小時(shí)之后，執(zhí)行預(yù)定的滅亡(CO2窒息)。移去包括UVR照射部位的背部皮膚，并保存在中性緩沖10％福爾馬林中以待可能進(jìn)行的組織病理學(xué)檢測。
如下測定各組的UVR劑量平均計(jì)算值(MED)和標(biāo)準(zhǔn)偏差。對每只小鼠測定在照射部位造成任何皮膚反應(yīng)的最低作用劑量。測定每個(gè)觀察時(shí)間點(diǎn)時(shí)每組小鼠的UVR劑量平均計(jì)算值。如果施用測試物對根據(jù)此計(jì)算方法得出的引起皮膚反應(yīng)所需的UVR劑量沒有任何影響，預(yù)計(jì)在照射48小時(shí)后得到相當(dāng)于1.0MED的UVR劑量平均計(jì)算值。高于1.0的UVR劑量平均計(jì)算值表示測試物具有保護(hù)效應(yīng)。對于在六個(gè)UVR照射部位的任何部位都沒有皮膚反應(yīng)的小鼠，為了進(jìn)行計(jì)算，賦予其2.8的估算值，將＞號作為這組UVR劑量平均計(jì)算值的前綴。此外，計(jì)算帶有標(biāo)準(zhǔn)偏差(體重)的比率(臨床觀察結(jié)果)和平均值。
測量體重和體重變化的組平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差并制成表格。
結(jié)果在UVR照射部位產(chǎn)生的皮膚反應(yīng)包括紅斑、水腫和剝落，皮膚反應(yīng)的嚴(yán)重程度取決于UVR照射劑量。
在口服Olivenol達(dá)31天的無毛小鼠身上，有對UVR引起的皮膚炎癥具有輕微的劑量依賴保護(hù)效應(yīng)的跡象，而在局部敷用Olivenol達(dá)31天的小鼠身上，有適度的劑量依賴保護(hù)效應(yīng)的跡象。在這種研究中，預(yù)計(jì)在對未試驗(yàn)過的小鼠進(jìn)行UVR照射48小時(shí)后，UVR劑量平均計(jì)算值接近1.0。
在口服Olivenol達(dá)31天的小鼠(組1至組4)身上，在0(賦形劑)、1、10和100毫克/千克/天的劑量組中，UVR照射48小時(shí)后的UVR劑量平均計(jì)算值分別為1.2、1.3、1.4和1.5。在局部敷用Olivenol達(dá)31天的小鼠(組6至組9)身上，在0(賦形劑)、1、10和100毫克/千克/天的劑量組中，UVR照射48小時(shí)后的UVR劑量平均計(jì)算值分別為1.5、1.5、＞1.9和＞2.2。在組8和9的UVR劑量平均計(jì)算值前有前綴＞號，這是因?yàn)檫@兩組各有兩只小鼠的任何UVR照射部位都沒有產(chǎn)生皮膚反應(yīng)。對于這四只小鼠，為了進(jìn)行計(jì)算，賦予其2.8的估算值。
在UVR照射72小時(shí)后，對測試物的保護(hù)效應(yīng)不那么明確。然而，在局部敷用100毫克/千克/天Olivenol達(dá)31天的小鼠(組9)身上，UVR照射后72小時(shí)的UVR劑量平均計(jì)算值為1.6，而在適當(dāng)?shù)膶φ战M(組6)，該值為1.2。
UVR照射48小時(shí)后，組6
中1.5的UVR劑量平均計(jì)算值是未曾預(yù)料到的。由于該值明顯高于大約1.0的預(yù)計(jì)值，賦形劑可能對UVR照射的皮膚感應(yīng)性具有一定的影響，然而，與局部敷用0(賦形劑)毫克/千克/天Olivenol的小鼠相比，在局部敷用10和100毫克/千克/天Olivenol劑量達(dá)31天的小鼠身上的UVR劑量平均計(jì)算值有明顯提高。
與適當(dāng)?shù)膶φ战M相比，在通過口服(組5)或局部(組10)敷用途徑施用100毫克/千克/天Olivenol劑量達(dá)10天的無毛小鼠身上，沒有對UVR引起的皮膚炎癥的保護(hù)效應(yīng)的跡象。在口服或局部敷用100毫克/千克/天Olivenol劑量達(dá)10天的小鼠身上，UVR照射48小時(shí)后的UVR劑量平均計(jì)算值分別為1.0和1.3。這些值相當(dāng)于在專門的0(賦形劑)毫克/千克/天劑量組(即分別為組1和6)中形成的值。
認(rèn)為UVR照射24小時(shí)后產(chǎn)生的皮膚反應(yīng)在確定測試物的保護(hù)潛力方面無用，因?yàn)檫@些反應(yīng)往往在可再生性上不如隨后產(chǎn)生的反應(yīng)。
組1和組3每組各有兩只小鼠產(chǎn)生了泌尿系統(tǒng)潰瘍。組6和組7各有一只小鼠產(chǎn)生腫塊。這些是雄性無毛小鼠中常見的疾病，并不認(rèn)為其與測試物有關(guān)。尸檢顯示所有組織看上去都很正常。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)規(guī)程中觀察到的體重和體重變化都很尋常。
在口服Olivenol達(dá)31天的雄性無毛小鼠身上，有對UVR引起的皮膚炎癥具有輕微的劑量依賴保護(hù)效應(yīng)的跡象，而在口服Olivenol達(dá)31天的小鼠身上，有適度的劑量依賴保護(hù)效應(yīng)的跡象。高Olivenol劑量，100毫克/千克/天，通過口服和局部敷用途徑提供皮膚保護(hù)。
在通過口服或局部敷用途徑施用100毫克/千克/天Olivenol劑量達(dá)10天的無毛小鼠身上，沒有對UVR引起的皮膚炎癥具有保護(hù)效應(yīng)的跡象。
根據(jù)發(fā)明詳述和上述實(shí)施例，可以看出實(shí)現(xiàn)了本發(fā)明的幾個(gè)方面。
可以理解的是，已經(jīng)通過圖解和實(shí)施例具體描述了本發(fā)明，以使本領(lǐng)域的技術(shù)人員了解本發(fā)明、其原理及其實(shí)際應(yīng)用。此外，本發(fā)明的上述具體實(shí)施方案并不是窮盡的，也不是為了限制本發(fā)明，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，參照上述實(shí)施例和詳細(xì)描述，許多替換方案、修改和變動是顯而易見的。相應(yīng)地，本發(fā)明旨在包括所有落在下列權(quán)利要求的實(shí)質(zhì)和范圍內(nèi)的替換方案、修改和變動。盡管上述一些實(shí)施例和描述包括了一些關(guān)于本發(fā)明作用方式的結(jié)論，本發(fā)明的發(fā)明人并不想受縛于那些結(jié)論和作用，它們的提出僅僅是作為可能的解釋。
權(quán)利要求
1.一種制備富含羥基酪醇的組合物的方法，包括(a)用橄欖制備植物液；(b)將酸加入植物液中，由此制得酸化的植物液；(c)將酸化的植物液培養(yǎng)一段時(shí)間直至植物液中原先存在的油橄欖苦甙有至少50％轉(zhuǎn)化成羥基酪醇。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中進(jìn)行所述培養(yǎng)直至植物液中原先存在的油橄欖苦甙有至少75％轉(zhuǎn)化成羥基酪醇。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中進(jìn)行所述培養(yǎng)至少2個(gè)月，直至植物液中原先存在的油橄欖苦甙有至少90％轉(zhuǎn)化成羥基酪醇。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中用去核橄欖的果肉或果漿來制備植物液。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中進(jìn)行所述培養(yǎng)直至植物液中羥基酪醇對油橄欖苦甙的重量比為大約1∶1至大約200∶1。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中進(jìn)行所述培養(yǎng)直至植物液中羥基酪醇對油橄欖苦甙的重量比為大約4∶1至大約200∶1。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中進(jìn)行所述培養(yǎng)直至植物液中羥基酪醇對油橄欖苦甙的重量比為大約10∶1至大約100∶1。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中進(jìn)行所述培養(yǎng)直至植物液中羥基酪醇與酪醇的重量比為大約3∶1至大約50∶1。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中進(jìn)行所述培養(yǎng)直至植物液中羥基酪醇與酪醇的重量比為大約5∶1至大約30∶1。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其進(jìn)一步包括將培養(yǎng)后的植物液分餾，將羥基酪醇與其它組分分離。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其進(jìn)一步包括用有機(jī)溶劑萃取培養(yǎng)后的植物液，以制備20％或更多富含羥基酪醇的餾分。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其進(jìn)一步包括通過色譜法進(jìn)行羥基酪醇的提純。
13.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中有機(jī)溶劑是乙酸乙酯。
14.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述酸的加入量為使pH值為大約1至大約5的有效量。
15.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述酸的加入量為使pH值為大約2至大約4的有效量。
16.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述酸是檸檬酸。
17.一種可注射制劑，其含有根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法制備的富含羥基酪醇的組合物。
18.一種保護(hù)皮膚免受暴露在紫外線輻射(UVR)下引起的不利效果的方法，包括對需要這種保護(hù)的對象口服施用治療有效量的治療劑，該治療劑中羥基酪醇對油橄欖苦甙的重量比為大約1∶1至大約200∶1。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述重量比為大約4∶1至大約100∶1。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述重量比為大約10∶1至大約50∶1。
21.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述對象是人。
22.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述試劑是由包含下列步驟的方法制備的(a)用橄欖制備植物液；(b)在植物液中加入足以產(chǎn)生大約1至大約5的pH值的酸；(c)培養(yǎng)該酸化的植物液直至植物液中原先存在的油橄欖苦甙有至少75％轉(zhuǎn)化成羥基酪醇。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中將所述試劑干燥以獲得粉狀提取物。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中所述試劑是片狀、膠囊狀或丸狀。
25.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中所述試劑是液態(tài)。
26.一種保護(hù)皮膚免受紫外線輻射(UVR)不利效果的方法，包括對需要這種保護(hù)的對象施用治療有效量的治療劑，該治療劑中羥基酪醇對油橄欖苦甙的重量比為大約1∶1至大約200∶1，其中所述治療劑進(jìn)一步含有用于局部敷用的遮光劑。
27.一種保護(hù)皮膚免受紫外線輻射(UVR)不利效果的方法，包括對需要這種保護(hù)的對象口服治療有效量的基本純凈的羥基酪醇或基本純凈的羥基酪醇和油橄欖苦甙混合物。
28.一種含有橄欖多酚的口服組合物，其中橄欖多酚的量足以清除自由基，而且所述橄欖多酚中羥基酪醇對油橄欖苦甙的重量比為大約1∶1至大約200∶1。
29.根據(jù)權(quán)利要求28所述的口服組合物，其中所述重量比為大約4∶1至大約100∶1。
30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的口服組合物，其中所述重量比為大約10∶1至大約50∶1。
全文摘要
本發(fā)明提供了來自橄欖的羥基酪醇。按照本發(fā)明的一個(gè)方面，從橄欖中收集植物液。加入酸來穩(wěn)定植物液并防止其發(fā)酵。培養(yǎng)該混合物以使油橄欖苫甙轉(zhuǎn)化成羥基酪醇，然后進(jìn)行分餾，從而將羥基酪醇與其它組分分離。羥基酪醇可作為治療劑和抗氧化劑用于多種保健用途，包括用于皮膚損傷的治療。此外，羥基酪醇可作為天然的抗菌、抗病毒和殺真菌產(chǎn)品用于農(nóng)業(yè)和蟲害控制用途。
文檔編號C07H17/04GK1665764SQ03815986
公開日2005年9月7日 申請日期2003年7月3日 優(yōu)先權(quán)日2002年7月5日
發(fā)明者R·克雷 申請人:克雷農(nóng)業(yè)公司