專(zhuān)利名稱(chēng)：一種羥基酪醇的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種羥基酪醇的制備方法。
(二)
背景技術(shù)：
許多疾病的發(fā)展都牽涉到大量的飲食脂肪。動(dòng)脈粥樣硬化、冠心 病、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌以及結(jié)腸癌等疾病各自都與飲食脂肪 有關(guān)，然而，證據(jù)表明某些癌癥的病原學(xué)中重要的不僅是飲食脂肪的 數(shù)量，還包括飲食脂肪的類(lèi)型。
橄欖油是地中海飲食的主要油脂成分，與冠心病和某些癌癥的較 低發(fā)病率有關(guān)， 一些實(shí)驗(yàn)顯示，橄欖油酚類(lèi)油橄欖苦苷和其它同族物 質(zhì)的水解能夠產(chǎn)生具有強(qiáng)抗癌活性的小酚類(lèi)組分，特別地油橄欖酚類(lèi)
羥基酪醇能防止低密度脂蛋白(LDL)氧化、血小板凝集并抑制5-和 12-脂肪氧合酶；此外，我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)羥基酪醇對(duì)過(guò)亞硝酸鹽決定的 DNA堿基修飾和酪氨酸硝化反應(yīng)產(chǎn)生抑制作用，而且它能夠在各種人 類(lèi)細(xì)胞系統(tǒng)中解除自由活性氧類(lèi)引起的細(xì)胞毒性；最后，研究顯示， 羥基酪醇消化后在人體內(nèi)劑量依賴性的吸收，顯示出其生物利用率。
羥基酪醇具有消炎作用，擴(kuò)張血管和抗菌作用，能夠防止動(dòng)脈粥 樣硬化，能降低某些癌癥(如乳腺、前列腺、子宮內(nèi)膜、消化道)的 發(fā)病率；由于羥基酪醇具有很強(qiáng)的抗氧化活性和降低癌癥發(fā)病率的作 用，因此具有巨大的醫(yī)療作用前景。
(三)

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明為了彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種以對(duì)羥基苯乙醇為 原料，生物合成羥基酪醇的制備方法。 本發(fā)明是通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的
一種結(jié)構(gòu)如式(I )所示的羥基酪醇的制備方法，其特征在于 包括如下步驟(1) 以溶解在pH值為2 7.5的緩沖液中結(jié)構(gòu)如式(II)所示的 對(duì)羥基苯乙醇為原料，加入結(jié)構(gòu)如式(III)所示的抗壞血酸，在多酚 氧化酶的催化下與氧反應(yīng)，得到含有羥基酪醇(I )的反應(yīng)液；
(2) 將反應(yīng)液通過(guò)截留分子量為200Da 1000Da的納濾膜，分離 反應(yīng)物中大分子成分；
(3) 將反應(yīng)液通過(guò)苯乙烯類(lèi)樹(shù)脂或聚酰胺層析柱，用純化水洗 脫，收集含羥基酪醇的洗脫液；
(4) 將洗脫液濃縮，用乙酸乙酯萃取，將萃取的乙酸乙酯相脫 水，濃縮回收乙酸乙酯，得到淡黃色膏狀的羥基酪醇粗品；
(5) 使羥基酪醇粗品經(jīng)柱層析，采用洗脫劑洗脫，收集含羥基 酪醇部分，回收溶劑后得高純度羥基酪醇(I )產(chǎn)品。
OH
OH HO
0 J
I II
本發(fā)明的反應(yīng)原理如下所示
OH
對(duì)羥基苯Z0
HO OH ，諷血酸
本發(fā)明所述的制備方法，步驟(1)中，所述多酚氧化酶為非固 定酶或固定化酶。非固定酶是指通過(guò)向反應(yīng)原料內(nèi)添加的方式進(jìn)行催化劑的加入；固定化酶是指用物理的或化學(xué)的方法使酶與水不溶性 大分子載體結(jié)合或把酶包埋在水不溶性凝膠或半透膜的微囊體中 制成的，如表面擔(dān)載、交聯(lián)、包埋等；酶固定化后一般穩(wěn)定性增 加，易從反應(yīng)系統(tǒng)中分離，且易于控制，能反復(fù)多次使用。在本 發(fā)明中優(yōu)選使用固定化酶。
多酚氧化酶是一種蛋白體，在物質(zhì)的加工過(guò)程中參與一系列 由酶促活動(dòng)而引起的化學(xué)變化，故又被稱(chēng)為生物催化劑；多酚氧 化酶主要來(lái)源于土壤微生物、植物根系分泌物及動(dòng)植物殘?bào)w分解 釋放的酶，它是一種復(fù)合性酶；多酚氧化酶主要來(lái)源于土豆、蘋(píng) 果、香蕉、菌菇等。
步驟(1)中，對(duì)羥基苯乙醇的濃度為10mg/L~1000mg/L，優(yōu)選 50 200mg/L ; 抗壞血酸的濃度為 10mg/L 1000mg/L ， 優(yōu)選 100mg/L 500mg/L;緩沖液的pH優(yōu)選4 7;步驟(2)中，納濾膜的 截留分子量?jī)?yōu)選200Da 500Da。
步驟(3)中層析柱采用的洗脫液為純化水， 一般是采用蒸餾法、 離子交換法、反滲透法或其他適宜的方法制得的水，不含任何附加劑。
步驟(4)中，將洗脫液濃縮10倍，用等體積的乙酸乙酯萃取3 5 次，濃縮回收乙酸乙酯得到羥基酪醇粗品。
步驟(5)中，柱層析所用的吸附劑為硅膠或中性氧化鋁；洗脫 劑為水、甲醇、乙醇、丙醇、乙酸乙酯、醋酸丁酯、氯仿、二氯甲烷、 石油醚、汽油中的一種或幾種的混合液；最終羥基酪醇產(chǎn)品為無(wú)色透 明粘稠狀物質(zhì)。
本發(fā)明中采用的柱層析方法為吸附柱層析，它以固體吸附劑為固 定相，以有機(jī)溶劑或緩沖液為流動(dòng)相構(gòu)成柱，用于吸附反應(yīng)液中的雜 質(zhì)，對(duì)反應(yīng)液進(jìn)行洗脫；本發(fā)明中還涉及一種聚酰胺層析柱，聚酰胺 對(duì)極性物質(zhì)的吸附作用在于它能和被分離物之間形成氫鍵，這種氫鍵 的強(qiáng)弱就決定了被分離物與聚酰胺薄膜之間吸附能力的大小。
本發(fā)明以對(duì)羥基苯乙醇為原料，以多酚氧化酶為催化劑，在氧的 參與下，發(fā)生氧化反應(yīng)，并通過(guò)抗壞血酸抑制多酚氧化酶雙酚活性，控制反應(yīng)進(jìn)程，得到富含羥基酪醇的反應(yīng)液，然后再經(jīng)過(guò)膜分離、大 孔吸附樹(shù)脂吸附分離、萃取、柱層析，得到高純度的羥基酪醇產(chǎn)品。
本發(fā)明具有原料易得、操作連續(xù)化、環(huán)境友好、產(chǎn)物易純化、收 率高等優(yōu)點(diǎn)，適用于工業(yè)化生產(chǎn)。 具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1:
稱(chēng)取2. 5kg對(duì)羥基苯乙醇，溶于100kg 0. 1M pH二6. 5磷酸鹽緩沖 液中，加入5kg抗壞血酸，加入酶液1L (比活500U/mg)，于5(TC攪 拌反應(yīng)60分鐘，反應(yīng)液通過(guò)納濾膜，透析液通過(guò)苯乙烯類(lèi)樹(shù)脂柱(約 100kg樹(shù)脂)，用水洗至流出液用TLC檢測(cè)無(wú)羥基酪醇斑點(diǎn)，此水洗液 濃縮至50kg，用100kg乙酸乙酯萃取5次，乙酸乙酯液濃縮回收溶劑， 得2.5kg淡黃色粘稠物，羥基酪醇含量88. 3%。
實(shí)施例2:
取純化的多酚氧化酶液包埋在殼聚糖中用戊二醛交聯(lián)成形，測(cè)定其 活力50U/mg;取5kg對(duì)羥基苯乙醇溶于2000L 0. 05mol/L磷酸鹽緩沖 液(pH值6.5)，加入10kg抗環(huán)酸，攪拌溶解，加入lkg固定化酶， 于5(TC攪拌反應(yīng)60分鐘，得到的反應(yīng)也用離心法回收固定化多酚氧 化酶，將反應(yīng)液通過(guò)納濾膜，透析液通過(guò)苯乙烯類(lèi)樹(shù)脂柱(約200kg 樹(shù)脂)，用水洗至流出液用TLC檢測(cè)無(wú)羥基酪醇斑點(diǎn)，此水洗液濃縮 至100kg，用100kg乙酸乙酯萃取5次，乙酸乙酯液濃縮回收溶劑， 得4kg淡黃色粘稠物，羥基酪醇含量91.2%。
實(shí)施例3:
取純化的多酚氧化酶液包埋在海藻酸鹽中用無(wú)水丁稀二酸-乙烯交 聯(lián)成形，測(cè)定其活力35U/mg;取5kg對(duì)羥基苯乙醇溶于2000L 0. 05mol/L磷酸鹽緩沖液(pH值6.5)，加入10kg抗環(huán)酸，攪拌溶解， 加入1.5kg固定化酶，于50。C攪拌反應(yīng)60分鐘，得到的反應(yīng)也用離 心法回收固定化多酚氧化酶，將反應(yīng)液通過(guò)納濾膜，透析液通過(guò)苯乙 烯類(lèi)樹(shù)脂柱(約200kg樹(shù)脂)，用水洗至流出液用TLC檢測(cè)無(wú)羥基酪 醇斑點(diǎn)，此水洗液濃縮至100kg，用100kg乙酸乙酯萃取5次，乙酸乙酯液濃縮回收溶劑，得4.2kg淡黃色粘稠物，羥基酪醇含量87.6%。 實(shí)施例4:
取純化的多酚氧化酶液包埋在殼聚糖中用戊二醛交聯(lián)成形，測(cè)定 其活力50U/mg;取2kg固定化酶珠于裝入夾套玻璃柱中(① 20*2000cm)，夾套用50。C熱水循環(huán)；取10kg對(duì)羥基苯乙醇溶于3000L 0. 05mol/L磷酸鹽緩沖液(pH值6. 5)，加入20kg抗環(huán)酸，該反應(yīng)液 以10L/min的流速通過(guò)酶柱，并連續(xù)通過(guò)苯乙烯類(lèi)樹(shù)脂柱(約400kg 樹(shù)脂)，反應(yīng)液流完后加入100L0.05mol/L磷酸鹽緩沖液(pH值6.5) 沖洗酶柱，完成后將酶柱接口與樹(shù)脂柱接口分離，樹(shù)脂柱繼續(xù)用純化 水沖洗至流出液用TLC檢測(cè)無(wú)羥基酪醇斑點(diǎn)，此水洗液濃縮至200kg， 用200kg乙酸乙酯萃取5次，乙酸乙酯液濃縮回收溶劑，得8. 5kg淡 黃色粘稠物，羥基酪醇含量92.4%。
實(shí)施例5:
取實(shí)施例4中羥基酪醇粗品lkg，硅膠吸附后，用乙酸乙酯石 油醚(1 : 1)洗脫，收集含羥基酪醇部分，回收溶劑，得950g粉色 透明粘稠物，羥基酪醇95.7%。
實(shí)施例6:
取實(shí)施例4中羥基酪醇粗品lkg，硅膠吸附后，用氯仿甲醇(8 : 2)洗脫，收集含羥基酪醇部分，回收溶劑，得908g無(wú)色透明粘稠物， 羥基酪醇含量98. 6%。
實(shí)施例7:
取實(shí)施例4中羥基酪醇粗品lkg，氧化鋁吸附后，甲醇洗脫，收 集含羥基酪醇部分，回收溶劑，得920g無(wú)色透明粘稠物，羥基酪醇 含量98. 2%。
權(quán)利要求
1.一種結(jié)構(gòu)如式(I)所示的羥基酪醇的制備方法，其特征在于包括如下步驟(1)以溶解在pH值為2～7.5的緩沖液中結(jié)構(gòu)如式(II)所示的對(duì)羥基苯乙醇為原料，加入結(jié)構(gòu)如式(III)所示的抗壞血酸，在多酚氧化酶的催化下與氧反應(yīng)，得到含有羥基酪醇(I)的反應(yīng)液；(2)將反應(yīng)液通過(guò)截留分子量為200Da～1000Da的納濾膜，分離反應(yīng)物中大分子成分；(3)將反應(yīng)液通過(guò)苯乙烯類(lèi)樹(shù)脂或聚酰胺層析柱，用純化水洗脫，收集含羥基酪醇的洗脫液；(4)將洗脫液濃縮，用乙酸乙酯萃取，將萃取的乙酸乙酯相脫水，濃縮回收乙酸乙酯，得到淡黃色膏狀的羥基酪醇粗品；(5)使羥基酪醇粗品經(jīng)柱層析，采用洗脫劑洗脫，收集含羥基酪醇部分，回收溶劑后得高純度羥基酪醇(I)產(chǎn)品。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的羥基酪醇的制備方法，其特征在于步驟(l) 中，所述多酚氧化酶為非固定酶或固定化酶。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的羥基酪醇的制備方法，其特征在于步驟(1) 中，所述對(duì)羥基苯乙醇的濃度為10mg/L 1000mg/L ，優(yōu)選 50~200mg/L。
4. 根據(jù)權(quán)利要求l、 2或3所述的羥基酪醇的制備方法，其特征在于 步驟(1)中，所述抗壞血酸的濃度為10mg/L 1000mg/L，優(yōu)選 100mg/L~500mg/L。
5. 根據(jù)權(quán)利要求l、 2或3所述的羥基酪醇的制備方法，其特征在于 步驟(1)中，所述緩沖液的pH為4 7。
6. 根據(jù)權(quán)利要求l、 2或3所述的羥基酪醇的制備方法，其特征在于 步驟(2)中，所述納濾膜的截留分子量為200Da 500Da。
7. 根據(jù)權(quán)利要求l、 2或3所述的羥基酪醇的制備方法，其特征在于 步驟(4)中，將洗脫液濃縮10倍，用等體積的乙酸乙酯萃取3 5 次，濃縮回收乙酸乙酯得到羥基酪醇粗品。
8. 根據(jù)權(quán)利要求l、 2或3所述的羥基酪醇的制備方法，其特征在于 步驟(5)中，所述柱層析所用的吸附劑為硅膠或中性氧化鋁。
9. 根據(jù)權(quán)利要求l、 2或3所述的羥基酪醇的制備方法，其特征在于 步驟(5)中，所述的洗脫劑為水、甲醇、乙醇、丙醇、乙酸乙酯、 醋酸丁酯、氯仿、二氯甲烷、石油醚、汽油中的一種或幾種的混合 液。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1、 2或3所述的羥基酪醇的制備方法，其特征在于 所述羥基酪醇產(chǎn)品為無(wú)色透明粘稠狀物質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，特別公開(kāi)了一種羥基酪醇的制備方法。該方法特征是以對(duì)羥基苯乙醇為原料，以多酚氧化酶為催化劑，在氧的參與下，發(fā)生氧化反應(yīng)，并通過(guò)抗壞血酸抑制多酚氧化酶雙酚活性，控制反應(yīng)進(jìn)程，得到富含羥基酪醇的反應(yīng)液，然后再經(jīng)過(guò)膜分離、大孔吸附樹(shù)脂吸附分離、萃取、柱層析，得到高純度的羥基酪醇產(chǎn)品。本發(fā)明具有原料易得、操作連續(xù)化、環(huán)境友好、產(chǎn)物易純化、收率高等優(yōu)點(diǎn)，適用于工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C12P7/22GK101624607SQ20091001736
公開(kāi)日2010年1月13日 申請(qǐng)日期2009年8月3日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月3日
發(fā)明者劉福錦 申請(qǐng)人:山東省巨野晨農(nóng)天然產(chǎn)物有限公司;劉福錦