專利名稱：胃癌相關(guān)的基因家族的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般涉及胃癌患者的胃組織中的基因表達(dá)相對(duì)于正常胃組織中的基因表達(dá)所發(fā)生的變化。本發(fā)明具體涉及與正常組織相比在晚期胃癌以及其它惡性腫瘤中進(jìn)行差異表達(dá)的人類基因家族。

背景技術(shù)：
胃癌
在美國(guó)，每年診斷出大約24000個(gè)胃癌新病例。盡管近60年來(lái)，胃癌的發(fā)病率顯著降低，但是胃癌仍然是一種起因不明的嚴(yán)重疾病。在相似的境況下，某些人就患上了胃癌而其它人則沒(méi)有患上胃癌。
胃癌通常發(fā)生在年齡大于55歲的人群中并且男人的發(fā)病率是婦女發(fā)病率的兩倍。這類癌癥在美國(guó)并不普遍，但是在日本、韓國(guó)、拉丁美洲和東歐部分地區(qū)卻很普遍，這些地區(qū)的人食用了較多的經(jīng)干燥、酸漬、煙熏或鹽漬保存的食物。相反，食用新鮮水果和蔬菜可以預(yù)防這種疾病。
胃癌可以發(fā)生在胃的任何部位并且會(huì)擴(kuò)散到整個(gè)胃和/或其它器官。這種癌癥還可以沿著胃壁生長(zhǎng)從而擴(kuò)散到食管或小腸中。如果這種癌透過(guò)胃壁生長(zhǎng)則會(huì)蔓延到附近的淋巴結(jié)、肝臟、胰腺和結(jié)腸。胃癌甚至能夠擴(kuò)散得更遠(yuǎn)，甚至到卵巢、肺和遠(yuǎn)距離的淋巴結(jié)。當(dāng)胃癌轉(zhuǎn)移到身體的另一個(gè)部位時(shí)，這些腫瘤細(xì)胞與原發(fā)腫瘤中的那些腫瘤細(xì)胞屬于同一類型。換句話說(shuō)，肝臟中的轉(zhuǎn)移性細(xì)胞仍然是胃癌細(xì)胞。擴(kuò)散到卵巢并生長(zhǎng)成一個(gè)或多個(gè)卵巢腫瘤的這種腫瘤細(xì)胞被稱作Krukenberg腫瘤而且是由被轉(zhuǎn)化的胃細(xì)胞而不是卵巢細(xì)胞組成。
由于胃癌的癥狀是非特異性的，因此在胃癌早期很難檢測(cè)出這種癌癥。癥狀包括消化不良、胃灼熱、腹痛、惡心和嘔吐，腹瀉或便秘、食欲減退、虛弱和疲勞，以及便血或吐血。診斷通常借助X-光檢測(cè)胃腸道上部和食道來(lái)進(jìn)行，當(dāng)患者喝下液體鋇示蹤劑后進(jìn)行X-光片的拍攝。利用胃鏡還可以對(duì)胃和食道進(jìn)行內(nèi)窺鏡檢測(cè)。如果發(fā)現(xiàn)異常組織，還可以通過(guò)胃鏡進(jìn)行活組織檢查。如果結(jié)果表明活組織樣品具有癌細(xì)胞，則對(duì)周圍淋巴結(jié)進(jìn)行活組織檢查，通過(guò)CT掃描檢測(cè)周圍的器官如肝臟和胰腺來(lái)確定疾病的程度或階段。胃癌的治療方法與那些用于其它類型癌的方法相似切除受影響的器官(部分或整體胃切除術(shù))，還可以清除附近淋巴結(jié)、化療、放射療法和免疫療法(刺激襲擊癌細(xì)胞的免疫系統(tǒng)組分)(http//cancernet.nci.nih.gov/canceertype s.html)。由于早期胃癌基本沒(méi)有癥狀，所以在該疾病沒(méi)有發(fā)展到晚期前通常不作診斷，而晚期的治療卻沒(méi)有效果。
胃癌中的分子變化
對(duì)與胃癌的發(fā)生和發(fā)展相關(guān)的胃細(xì)胞中的分子變化基本沒(méi)有了解。因此，存在著對(duì)在基因表達(dá)水平發(fā)生的變化進(jìn)行研究的需求，以及存在著對(duì)與胃癌發(fā)生和發(fā)展相關(guān)的新分子標(biāo)記物進(jìn)行鑒定的需求。而且，如果期望阻止或減緩胃癌發(fā)展的干預(yù)能夠成功，需要建立準(zhǔn)確評(píng)估這種疾病早期癥狀的方法。一種準(zhǔn)確評(píng)估胃癌早期癥狀的方法是識(shí)別與疾病進(jìn)展相關(guān)的獨(dú)特標(biāo)記(參見(jiàn)例如Kim等(2001)，癌基因204568-4575)。同樣，預(yù)防或終止胃癌發(fā)展的治療方法的建立取決于對(duì)在胃內(nèi)部引起癌變和癌生長(zhǎng)的基因進(jìn)行的識(shí)別。
本發(fā)明的公開
本發(fā)明基于對(duì)在晚期胃癌(AGC)和其它惡性腫瘤中的表達(dá)與在正常組織中的表達(dá)具有差異性的新基因家族的發(fā)現(xiàn)。本發(fā)明包括含有SEQ ID NO3，5，7，9，11，13，17或19的分離核酸分子；編碼SEQ ID NO4，14或18的氨基酸序列的分離核酸分子；編碼在胃癌中被表達(dá)的蛋白并與SEQ ID NO3或17的全長(zhǎng)序列具有至少約92％核苷酸序列相同性的分離核酸分子；編碼在胃癌中被表達(dá)的蛋白并與SEQ ID NO13的全長(zhǎng)序列具有至少約95％核苷酸序列相同性的分離核酸分子；和含有上述任一核酸分子的互補(bǔ)鏈的分離核酸分子。
本發(fā)明還包括與包括含所述分離核酸分子的載體在內(nèi)的一種或多種表達(dá)控制元件可操作性連接的核酸分子。本發(fā)明還包括被轉(zhuǎn)化而含有本發(fā)明的核酸分子的宿主細(xì)胞和用于生產(chǎn)蛋白的方法，該方法包括在該蛋白被表達(dá)的條件下培養(yǎng)經(jīng)本發(fā)明核酸分子轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的步驟。
本發(fā)明還提供了一種分離多肽，該多肽選自含SEQ ID NO4，6，8，10，12，14或18的氨基酸序列的分離多肽、含SEQ ID NO6，8，10或12的至少10個(gè)氨基酸的片段的分離多肽、含SEQ ID NO6，8，10或12的保守氨基酸取代物的分離多肽和含SEQ ID NO6，8，10或12的自然存在的氨基酸序列變異體的分離多肽。本發(fā)明的多肽還包括其氨基酸序列與SEQ ID NO4所示序列具有至少約90％、優(yōu)選地至少約92-95％以及更優(yōu)選地至少約95-98％氨基酸序列相同性的多肽。本發(fā)明的多肽還包括其氨基酸序列與SEQ ID NO6，8，10或12所示序列具有至少約50％、60％、70％或75％，優(yōu)選地至少約80％，更優(yōu)選地至少約90-95％以及最優(yōu)選地至少約95-98％氨基酸序列相同性的多肽。本發(fā)明的多肽還包括其氨基酸序列分別與SEQ ID NO14和SEQ ID NO18所示序列具有至少約95％和至少約92％氨基酸序列相同性的多肽。
本發(fā)明還提供了一種與本發(fā)明的多肽發(fā)生特異性結(jié)合的分離抗體或抗原-結(jié)合型抗體片段，包括單克隆或多克隆抗體。
本發(fā)明還提供了鑒定調(diào)控編碼本發(fā)明蛋白的核酸分子表達(dá)的介質(zhì)(agent)的方法，該方法包括使表達(dá)所述核酸分子的細(xì)胞與所述介質(zhì)接觸；和確定所述介質(zhì)是否調(diào)控所述核酸分子的表達(dá)，從而鑒定出調(diào)控編碼所述蛋白的核酸分子的表達(dá)的介質(zhì)。
本發(fā)明還提供了鑒定調(diào)控本發(fā)明蛋白的水平或至少一種活性的介質(zhì)的方法，該方法包括使表達(dá)所述蛋白的細(xì)胞與所述介質(zhì)接觸；和確定所述介質(zhì)是否調(diào)控所述蛋白的水平或至少一種活性，從而鑒定出調(diào)控所述蛋白的水平或至少一種活性的介質(zhì)。
本發(fā)明還提供了鑒定本發(fā)明蛋白的結(jié)合配偶體的方法，該方法包括以下步驟使所述蛋白與可能的結(jié)合配偶體接觸；和確定所述可能的配偶體是否與所述蛋白結(jié)合，從而鑒定出所述蛋白的結(jié)合配偶體。
本發(fā)明還提供了對(duì)編碼本發(fā)明蛋白的核酸分子的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控的方法，該方法包括以下步驟施用有效量的調(diào)控編碼所述蛋白的核酸分子的表達(dá)的介質(zhì)。本發(fā)明還提供了調(diào)控本發(fā)明蛋白的至少一種活性的方法，該方法包括以下步驟施用有效量的調(diào)控本發(fā)明蛋白的至少一種活性的介質(zhì)。
本發(fā)明還包括被改造而含有本發(fā)明的核酸分子的非-人類轉(zhuǎn)基因動(dòng)物或被改造而含有突變的核酸分子從而不能表達(dá)本發(fā)明的被編碼的多肽的非-人類轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。
本發(fā)明還包括非-人類轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，其中含有SEQ ID NO3，5，7，9，11，13或17的全長(zhǎng)或部分序列的完整或部分基因被從該動(dòng)物的基因組中敲除或刪除。
本發(fā)明還提供了診斷胃癌或惡性腫瘤的方法，該方法包括以下步驟從受試者身上獲取組織、血液、尿液或其它樣品，并確定本發(fā)明的核酸分子或本發(fā)明的多肽的表達(dá)水平。
本發(fā)明還包括含有稀釋劑和多肽或蛋白的組合物，該多肽或蛋白選自含SEQ ID NO4，6，8，10，12，14或18的氨基酸序列的分離多肽、其氨基酸序列與SEQ ID NO4所示序列具有至少約90％、優(yōu)選地至少約92-95％以及更優(yōu)選地至少約95-98％氨基酸序列相同性的分離多肽、含SEQ ID NO6，8，10或12的至少10個(gè)氨基酸的片段的分離多肽、含SEQ ID NO6，8，10或12的保守氨基酸取代物的分離多肽、SEQ ID NO6，8，10或12的自然存在的氨基酸序列變異體、其氨基酸序列與SEQ ID NO6，8，10或12所示序列具有至少約50％、60％、70％或75％，優(yōu)選地至少約80％，更優(yōu)選地至少約90-95％以及最優(yōu)選地至少約95-98％氨基酸序列相同性的分離多肽、其氨基酸序列與SEQ ID NO14所示序列具有至少約95％的分離多肽或其氨基酸序列與SEQ ID NO18所示序列具有至少約92％氨基酸序列相同性的分離多肽。
附圖的簡(jiǎn)要描述


圖1是顯示SEQ ID NO1(克隆AD12)與SEQ ID NO3(克隆CH4)的序列差異的圖表，其中SEQ ID NO1(克隆AD12)和SEQ ID NO3(克隆CH4)是被命名為L(zhǎng)BFL301的基因的剪接變體。
圖2是由LBFL301變體AD12的可讀框編碼的蛋白(SEQ ID NO2)的疏水性圖。按照Kyte-Doolittle和Goldman等的方法進(jìn)行分析。
圖3是由LBFL301變體CH4的可讀框編碼的蛋白(SEQ ID NO4)的疏水性圖。按照Kyte-Doolittle和Goldman等的方法進(jìn)行分析。
圖4是由LBFL304的可讀框中的最長(zhǎng)可讀框編碼的蛋白(SEQ IDNO6)的疏水性圖。按照Kyte-Doolittle和Goldman等的方法進(jìn)行分析。
圖5是由LBFL305的可讀框編碼的蛋白(SEQ ID NO14)的疏水性圖。按照Kyte-Doolittle和Goldman等的方法進(jìn)行分析。
圖6表示三個(gè)LBFL306克隆的相對(duì)比對(duì)位置。
圖7是由克隆序號(hào)為L(zhǎng)BFL306-EF3的可讀框編碼的蛋白(SEQ IDNO18)的疏水性圖。按照Kyte-Doolittle和Goldman等的方法進(jìn)行分析。
圖8是由克隆序號(hào)為L(zhǎng)BFL306-GC7的可讀框編碼的蛋白(SEQ IDNO20)的疏水性圖。按照Kyte-Doolittle和Goldman等的方法進(jìn)行分析。
圖9是由克隆序號(hào)為L(zhǎng)BFL306-GE2的可讀框編碼的蛋白(SEQ IDNO22)的疏水性圖。按照Kyte-Doolittle和Goldman等的方法進(jìn)行分析。
實(shí)施本發(fā)明的最好方式
I.總述
本發(fā)明部分基于對(duì)新基因家族的鑒定，所述新基因家族在人的癌性胃組織和其它惡性腫瘤中的表達(dá)不同于在人正常組織中的表達(dá)。這些基因家族包括SEQ ID NOS1，3，5，7，9，11，1 3，17，19和21的人cDNA。
本發(fā)明的基因和蛋白可被用作檢測(cè)樣品中的胃癌或監(jiān)視樣品中的胃癌的發(fā)展的診斷試劑或標(biāo)記物。它們還可以作為調(diào)控基因表達(dá)或活性的試劑的靶標(biāo)。例如，可以鑒定調(diào)控與包括胃癌增生過(guò)程在內(nèi)的腫瘤生長(zhǎng)有關(guān)的生物學(xué)過(guò)程的介質(zhì)。
II.具體的技術(shù)方案
A.與胃癌相關(guān)的蛋白質(zhì)
本發(fā)明提供了分離的蛋白質(zhì)、所述蛋白質(zhì)的等位基因變體和所述蛋白質(zhì)的保守氨基酸取代物。本文中所使用的“蛋白質(zhì)”或“多肽”部分是指具有SEQ ID NO2，4，6，8，10，12，14或18所示的人氨基酸序列的蛋白質(zhì)。該術(shù)語(yǔ)還指其氨基酸序列與以上具體列舉的氨基酸序列略有差異的自然存在的等位基因變體和蛋白質(zhì)。盡管等位基因變體具有的氨基酸序列與以上列舉的氨基酸序列略有差異，但等位基因變體卻仍然具有與這些蛋白質(zhì)相同或相似的生物學(xué)功能。
本文中的與SEQ ID N02，4，6，8，10，12，14或18所示的人氨基酸序列相關(guān)的蛋白質(zhì)家族包括從除人以外的生物體中分離的蛋白質(zhì)。被用于鑒定和分離與這些蛋白質(zhì)相關(guān)的蛋白質(zhì)家族的其它成員的方法如以下所述。
本發(fā)明的蛋白質(zhì)優(yōu)選地是分離形式的。當(dāng)采用物理、機(jī)械或化學(xué)方法從通常與蛋白質(zhì)結(jié)合的細(xì)胞組分中移出所述蛋白質(zhì)時(shí)該蛋白質(zhì)就被認(rèn)為是分離的。一個(gè)技術(shù)人員可以輕而易舉地采用標(biāo)準(zhǔn)的純化方法來(lái)獲得一種分離蛋白。
本發(fā)明的蛋白質(zhì)還包括SEQ ID NO2，4，6，8，10，12，14或18的剪接變體和插入、缺失或保守氨基酸取代變異體。本文中的保守變異體是指對(duì)蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能不產(chǎn)生負(fù)作用的氨基酸序列的改變。當(dāng)改變的序列阻礙或破壞蛋白質(zhì)的相關(guān)生物學(xué)功能時(shí)，取代、插入或缺失被認(rèn)為對(duì)蛋白質(zhì)具有副作用。例如，蛋白質(zhì)的整體帶電性、結(jié)構(gòu)或疏水性/親水性在某些情況下是可以被改變的，而對(duì)生物學(xué)活性則不產(chǎn)生副作用。因此，可以改變氨基酸的序列從而提供疏水性或親水性更強(qiáng)的肽而對(duì)蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性不產(chǎn)生副作用。
通常，等位變體、保守取代變異體和由LBFL301編碼的蛋白質(zhì)家族的成員具有的氨基酸序列與SEQ ID NO2或4所示的序列具有至少約50％，60％，70％或75％的氨基酸序列相同性，更優(yōu)選地至少約80-90％，甚至更優(yōu)選地至少約92-95％以及最優(yōu)選地至少約95-98％的序列相同性。等位變體、保守取代變異體和由LBFL304編碼的蛋白質(zhì)家族的成員具有的氨基酸序列與SEQ ID NO6，8，10或12所示的序列具有至少約50％，60％，70％或75％的氨基酸序列相同性，更優(yōu)選地至少約80％，甚至更優(yōu)選地至少約92-95％以及最優(yōu)選地至少約99％或99.5％的序列相同性。等位變體、保守取代變異體和由LBFL305或LBFL306編碼的蛋白質(zhì)家族的成員具有的氨基酸序列與SEQ ID NO14或18所示的序列具有至少約50％，60％，70％或75％的氨基酸序列相同性，更優(yōu)選地至少約80-90％，甚至更優(yōu)選地至少約92-94％以及最優(yōu)選地至少約95％，98％或99％的序列相同性。關(guān)于這種序列的相同性或同源性在本文中被定義為當(dāng)進(jìn)行序列比對(duì)和引入缺口(如果必要)以獲得最大百分比的同源性后，候選序列中的與SEQ ID NO2，4，6，8，10，12，14或18相同的氨基酸殘基的百分比，其中不考慮將任何保守取代作為序列相同性的一部分(參見(jiàn)B部分中的相關(guān)參數(shù))。認(rèn)為融合蛋白或肽序列中的N-端、C-端或內(nèi)部延長(zhǎng)、缺失或插入并不影響同源性。
因此，本發(fā)明的蛋白質(zhì)包括具有SEQ ID NO2，4，6，8，10，12，14或18所示的氨基酸序列的分子；其具有這些蛋白質(zhì)的至少約3，4，5，6，10，15，20，25，30，35或更多個(gè)氨基酸殘基的連續(xù)序列的片段；所公開的編碼序列的N-或C-端或內(nèi)部已被插入一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基而生成的氨基酸序列變異體；和被公開的序列的氨基酸序列變異體或其如上定義已被至少一個(gè)殘基取代的片段。也被稱作肽或多肽的這種片段可含有蛋白質(zhì)的抗原區(qū)域、功能區(qū)域，這些區(qū)域被確認(rèn)為是對(duì)應(yīng)于已知蛋白結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列區(qū)域，其還可含有強(qiáng)親水性區(qū)域。利用常規(guī)獲得的蛋白序列分析軟件如MacVector(OxfordMolecular)可以輕而易舉地鑒定出所述的所有區(qū)域。
所預(yù)期的變異體還包括那些含有通過(guò)例如同源性重組、定點(diǎn)或PCR誘變所進(jìn)行的預(yù)定突變的變異體，和包括但不限于兔子、小鼠、大鼠、豬、牛、羊、馬和非人類靈長(zhǎng)目動(dòng)物品種在內(nèi)的其它動(dòng)物品種的相應(yīng)蛋白質(zhì)，和等位基因或蛋白家族的其它自然存在的變異體(例如，一種與對(duì)應(yīng)于GenBank序列號(hào)為XM_128002，XM_129365，NM_021420，NM_133971(DNA序列)的小鼠蛋白和NP_598732(蛋白質(zhì)序列)具有相似性的小鼠類似物，所有這些內(nèi)容被引入本文作為參考)。其它變異體包括其中蛋白質(zhì)已經(jīng)通過(guò)取代的、化學(xué)的、酶的或其它適當(dāng)?shù)姆椒ㄓ贸匀淮嬖诘陌被嵋酝獾钠渌糠?例如一種可測(cè)部分如酶或放射性同位素)進(jìn)行了共價(jià)修飾的衍生物。
本發(fā)明還提供了含有本發(fā)明的蛋白或多肽和稀釋劑的組合物。合適的稀釋劑可以是水性或非水性溶劑或其組合物，并且可含有其它增加所述蛋白質(zhì)或多肽的穩(wěn)定性、溶解性、活性和/或貯存期的組分，例如水溶性鹽或甘油。
如下所述，可以使用蛋白質(zhì)家族中的成員(1)來(lái)識(shí)別調(diào)控該蛋白質(zhì)的水平或至少一種活性的介質(zhì)，(2)來(lái)識(shí)別蛋白質(zhì)的結(jié)合配偶體，(3)作為抗原以產(chǎn)生多克隆或單克隆抗體，(4)作為一種治療劑或靶標(biāo)和(5)作為胃癌和其它增生疾病的診斷試劑或標(biāo)記物。
B.核酸分子
本發(fā)明還提供了編碼如SEQ ID NO2，4，6，8，10，12，14或18所示的蛋白質(zhì)及本文記載的相關(guān)蛋白質(zhì)的核酸分子，優(yōu)選地是以分離的形式存在。本文中使用的“核酸”被定義為如下列的RNA或DNA編碼上述蛋白或肽；與編碼這種肽的核酸序列互補(bǔ)；與SEQ ID NO1，3，5，7，9，11，13或17所示的核酸雜交并且在合適的嚴(yán)緊條件下仍然與其穩(wěn)定結(jié)合；編碼與SEQ ID NO2或4的肽序列具有至少約50％，60％，70％或75％，優(yōu)選地至少約80-90％，更優(yōu)選地至少約92-95％以及最優(yōu)選地至少約95-98％或更高相同性的多肽；與SEQ ID NO1或3的可讀框具有至少50％，60％，70％或75％，優(yōu)選地至少約80-90％，更優(yōu)選地至少約92-95％以及甚至更優(yōu)選的至少約95-98％或更高的核苷酸序列相同性；編碼與SEQ ID NO6，8，10或12的肽序列具有至少約50％，60％，70％或75％，優(yōu)選地至少約80％，更優(yōu)選地至少約85％以及最優(yōu)選地至少約90％，95％，98％，99％，99.5％或更高相同性的多肽；與SEQ ID NO5，7，9或11的可讀框具有至少50％，60％，70％或75％，優(yōu)選地至少約80％，更優(yōu)選地至少約85％和甚至更優(yōu)選地至少約90％，95％，98％，99％，99.5％或更高的核苷酸序列相同性；編碼與SEQID NO14或18的肽序列具有至少約50％，60％，70％或75％，優(yōu)選的至少約80-90％，更優(yōu)選地至少約92-94％以及最優(yōu)選地至少約95％，98％，99％或更高相同性的多肽；或者與SEQ ID NO13或17的可讀框具有至少50％，60％，70％或75％，優(yōu)選地至少約80-90％，更優(yōu)選地至少約92-94％，和甚至更優(yōu)選的至少約95％，98％，99％或更高的核苷酸序列相同性。
本發(fā)明還包括與SEQ ID NO1，3，5，7，9，11，13或17的互補(bǔ)鏈進(jìn)行特異性雜交的分離的核酸分子，具體地是與可讀框進(jìn)行特異性雜交的分子。與SEQ ID NO1，3，5，7，9，11，13或17的互補(bǔ)鏈進(jìn)行特異性雜交的這種分子一般是在嚴(yán)緊的雜交條件下進(jìn)行雜交的。
具體預(yù)期的是基因組DNA，cDNA，mRNA和反義分子以及基于自然界來(lái)源或合成的可替代性主鏈或包含替代性堿基的核酸。然而，這種雜交或互補(bǔ)核酸被進(jìn)一步定義為相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)中的核酸是新的和非顯而易見(jiàn)性的，所述核酸包括編碼本發(fā)明的蛋白質(zhì)、在適當(dāng)嚴(yán)緊條件下與編碼本發(fā)明的蛋白質(zhì)的核酸雜交或與編碼本發(fā)明的蛋白質(zhì)的核酸互補(bǔ)的核酸。
核苷酸或氨基酸序列水平的同源性或相同性通過(guò)BLAST(BasicLocal Alignment Search Tool)分析法來(lái)測(cè)定，所述分析法利用特意為序列相似性檢索而改進(jìn)的程序blastp，blastn，blastx，tblastn和tblastx(Altschul等，(1997)Nucleic Acids Res253389-3402，和Karlin等，(1990)Proc Natl Acad SciUSA 872264-2268，兩者被全部引入作為參考)所使用的算法。BLAST程序所采用的方法首先考慮了查詢序列與數(shù)據(jù)庫(kù)序列之間的具有或不具有缺口的相似片段，然后評(píng)價(jià)所有被識(shí)別的匹配物的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性并且最終僅僅加和那些滿足顯著性預(yù)選閾值的匹配物。為了討論序列數(shù)據(jù)庫(kù)相似性檢索的基本問(wèn)題，參見(jiàn)Altschul等，(1994)Nature Genetics 6119-129，其內(nèi)容被全部引入作參考。將直方圖(histogram)、描述項(xiàng)(descriptions)、序列比對(duì)(alignments)、期待值(expect)(即用于反映相對(duì)于數(shù)據(jù)序列的匹配物的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性閾值)、截止(cutoff)、矩陣和過(guò)濾器(低復(fù)雜性)的檢索參數(shù)設(shè)置在默認(rèn)值。blastp，blastx，tblastn和tblastx所采用的默認(rèn)評(píng)分矩陣是BLOSUM62矩陣(Henikoff等，(1992)Proc Natl Acad Sci USA8910915-10919，被全部引入作為參考)，被推薦用于長(zhǎng)度超過(guò)85個(gè)核苷酸或氨基酸的查詢序列。
對(duì)于blastn，所述評(píng)分矩陣被設(shè)置成M(即匹配殘基的獎(jiǎng)勵(lì)評(píng)分)與N(即錯(cuò)配殘基的罰分)的比例，其中M和N的默認(rèn)值分別為5和-4。四個(gè)blastn參數(shù)按照以下方式進(jìn)行調(diào)節(jié)Q＝10(缺口產(chǎn)生罰分)；R＝10(缺口延伸罰分)；wink＝1(查詢序列的每個(gè)winkth位置產(chǎn)生字串命中值)；和gapw＝16(設(shè)定其中產(chǎn)生缺口比對(duì)的窗口寬度)。Blastp的相應(yīng)參數(shù)設(shè)定值是Q＝9；R＝2；wink＝1；和gapw＝32。10.0版本的GCG軟件包中用于序列比較的Bestfit采用了DNA參數(shù)GAP＝50(缺口產(chǎn)生罰分)和LEN＝3(缺口延伸罰分)以及蛋白質(zhì)比較過(guò)程中相應(yīng)的設(shè)定值是GAP-8和LEN＝2。
“嚴(yán)緊條件”是如下(1)采用了低離子強(qiáng)度和高溫進(jìn)行沖洗，例如在50℃下利用0.015M NaCl/0.0015M檸檬酸鈉/0.1％SDS進(jìn)行沖洗，或(2)在雜交過(guò)程中采用了變性劑如甲酰胺，例如在42℃下50％(vol/vol)的甲酰胺與0.1％牛血清白蛋白/0.1％Ficoll/0.1％聚乙烯吡咯烷酮/50mM pH 6.5的磷酸鈉緩沖液與750mM NaCl，75mM檸檬酸鈉。另一個(gè)例子是于42℃下在50％甲酰胺，5×SSC(0.75M NaCl，0.075M檸檬酸鈉)，50mM的磷酸鈉(pH 6.8)，0.1％的焦磷酸鈉，5×Denhardt溶液，超聲處理的鮭精DNA(50μg/ml)，0.1％SDS，和10％的葡聚糖硫酸酯中進(jìn)行的雜交，并在42℃用0.2×SSC和0.1％SDS進(jìn)行沖洗。技術(shù)人員能夠輕而易舉地適當(dāng)確定和改變嚴(yán)緊條件從而獲得清晰的和可檢測(cè)的雜交信號(hào)。優(yōu)選的分子是那些在上述條件下與SEQ ID NO1，3，5，7，9，11，13或17的互補(bǔ)鏈雜交并且編碼具有功能的或全長(zhǎng)蛋白質(zhì)的分子。更優(yōu)選的雜交分子是那些在上述條件下與SEQ ID NO1，3，5，7，9，11，13或17的可讀框的互補(bǔ)鏈雜交的分子。
如本文中使用的，當(dāng)核酸分子基本上從編碼其它多肽的雜質(zhì)核酸分子中分離時(shí)，所述核酸分子被認(rèn)為是“分離的”。
本發(fā)明還提供了被公開的核酸分子的片段。本文中使用的核酸分子片段是指編碼或非-編碼序列的小的部分。片段的大小由使用目的來(lái)決定。例如，如果所述片段被選擇用來(lái)編碼所述蛋白質(zhì)的活性部分，那么該片段則需要足夠大以便編碼所述蛋白的功能域。例如可以制備編碼對(duì)應(yīng)于預(yù)測(cè)抗原區(qū)域的肽的片段。如果所述片段被用作核酸探針或PCR引物，那么則需要對(duì)所述片段的長(zhǎng)度進(jìn)行選擇從而使得探測(cè)/引發(fā)過(guò)程中出現(xiàn)的假陽(yáng)性的數(shù)目較小(參見(jiàn)H部分的討論)。
本發(fā)明被用作聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)的探針或特定引物或用來(lái)合成編碼本發(fā)明的蛋白質(zhì)的基因序列的核酸分子片段(即合成的寡核苷酸)可以通過(guò)化學(xué)技術(shù)，例如Matteucci等的亞磷酰胺技術(shù)((1981)J AmChem Soc 1033185-3191)或利用自動(dòng)合成法來(lái)輕而易舉地得到。另外，大的DNA片段可以通過(guò)已經(jīng)通曉的方法來(lái)制備，諸如合成一組限定該基因各個(gè)模塊片段的寡核苷酸，接著連接這些寡核苷酸從而構(gòu)建出完整的修飾基因。
本發(fā)明的核酸分子還可以被修飾成含有用于診斷和探針目的的可測(cè)標(biāo)記物。許多這種標(biāo)記物在本技術(shù)領(lǐng)域中是已知的并且可以輕易用于本文記載的編碼分子。合適的標(biāo)記物包括但不限于生物素、放射性或熒光標(biāo)記的核苷酸等。技術(shù)人員可以輕而易舉地采用任何這種標(biāo)記物來(lái)獲得本發(fā)明的核酸分子的標(biāo)記變異體。
C.其它相關(guān)核酸分子的分離
如上所述，具有SEQ ID NO1，3，5，7，9，11，13或17所示序列的核酸分子的鑒定和表征允許技術(shù)人員分離除本文記載的序列以外的編碼該蛋白質(zhì)家族中的其它成員的核酸分子。而且，本文公開的核酸分子允許技術(shù)人員分離除具有SEQ ID NO2，4，6，8，10，12，14或18所示序列的蛋白質(zhì)以外的編碼蛋白質(zhì)家族的其它成員的核酸分子。
例如，技術(shù)人員可以輕易地利用SEQ ID NO2，4，6，8，10，12，14或18的氨基酸序列來(lái)制備抗體探針以便篩選從合適的細(xì)胞中制備的表達(dá)文庫(kù)。典型地，得自哺乳動(dòng)物如經(jīng)純化蛋白免疫的兔子(如下所述)的多克隆抗血清或單克隆抗體可以被用來(lái)探測(cè)哺乳動(dòng)物的cDNA或基因組表達(dá)文庫(kù)，諸如λgt11文庫(kù)，從而獲得編碼蛋白質(zhì)家族其它成員的合適序列。被克隆的cDNA序列可以以融合蛋白的形式進(jìn)行表達(dá)，直接利用其自身的調(diào)控序列進(jìn)行表達(dá)或通過(guò)利用適于用于表達(dá)酶的特定宿主的調(diào)控序列經(jīng)構(gòu)建體來(lái)進(jìn)行表達(dá)。
或者，可以合成本文記載的編碼序列的一部分片段并將其用作檢測(cè)DNA的探針，該DNA編碼源自哺乳動(dòng)物的蛋白質(zhì)家族的成員。制備含約18-20個(gè)核苷酸的低聚物(編碼約6-7個(gè)氨基酸的片段)并將其用來(lái)篩選基因組DNA或cDNA文庫(kù)從而實(shí)現(xiàn)在能夠消除過(guò)高水平的假陽(yáng)性的嚴(yán)緊條件或充分嚴(yán)緊的條件下的雜交。
另外，可以制備用于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的寡苷酸引物對(duì)以便選擇性地克隆一種編碼核酸分子。利用這種PCR引物的PCR變性/退火/延伸循環(huán)在本技術(shù)領(lǐng)域中是熟知的并且非常適用于分離其它編碼核酸分子。
利用任何可獲得的算法，包括但不限于PSI-BLAST(Altschul等，(1997)Nucleic Acids Res 253389-3402)；PHI-BLAST(Zhang等，(1998)Nucleic Acids Res 263986-3990)，3D-PSSM(Kelly等，(2000)J Mol Biol 299(2)499-520)和其它計(jì)算分析方法(Shi等，(1999)Biochem Biophys Res Commun 262(1)132-138和Matsunami等，(2000)Nature 404(6778)601-604)，還可以在已有基因組或其它序列中鑒定出編碼蛋白質(zhì)家族其它成員的核酸分子。
D.含核酸分子的rDNA分子
本發(fā)明還提供了含有編碼序列的重組DNA分子(rDNAs)。本文中使用的rDNA分子是一種已經(jīng)進(jìn)行了原位分子操縱的DNA分子，用于產(chǎn)生rDNA分子的方法在本技術(shù)領(lǐng)域中是已知的，例如參見(jiàn)Sambrook等，Molecular Cloning-A Laboratory Manual，第三版，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，2001。在優(yōu)選的rDNA分子中，DNA編碼序列與表達(dá)控制序列和/或載體序列進(jìn)行了可操作性的連接。
正如本技術(shù)領(lǐng)域所熟知的，可操作性地連接于本發(fā)明的蛋白家族編碼序列的載體和/或表達(dá)控制序列的選擇直接依賴于所需要的功能特性，例如蛋白質(zhì)的表達(dá)，和待轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。本發(fā)明所預(yù)期的載體至少能夠指導(dǎo)rDNA分子中所含的結(jié)構(gòu)基因在宿主染色體中的復(fù)制和插入，而且優(yōu)選地還能指導(dǎo)rDNA分子中所含結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)。
被用于調(diào)節(jié)可操作連接的蛋白編碼序列的表達(dá)的表達(dá)控制元件在本技術(shù)領(lǐng)域中是已知的，并且包括但不限于誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、組成型啟動(dòng)子、分泌信號(hào)和其它調(diào)節(jié)元件。優(yōu)選地，所述誘導(dǎo)型啟動(dòng)子容易得到控制，諸如響應(yīng)于宿主細(xì)胞培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分。
在一個(gè)實(shí)施方案中，含有編碼核酸分子的載體包括原核復(fù)制子，即一種能夠指導(dǎo)自主復(fù)制和將重組DNA分子保持在經(jīng)其轉(zhuǎn)化的原核宿主細(xì)胞如細(xì)菌宿主細(xì)胞的染色體外的DNA序列。這種復(fù)制子在本技術(shù)領(lǐng)域中是已知的。另外，含有原核復(fù)制子的載體還可包括其表達(dá)產(chǎn)生一個(gè)可檢測(cè)標(biāo)記物如抗藥性的基因。典型的細(xì)菌抗藥性基因是那些對(duì)氨芐青霉素、卡那霉素、氯霉素或四環(huán)素具有抗性的基因。
含有原核復(fù)制子的載體可包含能夠指導(dǎo)編碼基因序列在細(xì)菌宿主細(xì)胞如大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)(轉(zhuǎn)錄和翻譯)的原核或噬菌體啟動(dòng)子。啟動(dòng)子是由允許RNA聚合酶的結(jié)合和轉(zhuǎn)錄進(jìn)行的DNA序列形成的一種表達(dá)控制元件。適用于細(xì)菌宿主的啟動(dòng)子序列通常以質(zhì)粒載體的形式來(lái)提供，所述質(zhì)粒載體含有方便的限制性位點(diǎn)用于插入本發(fā)明的DNA片段。這種載體質(zhì)粒的典型實(shí)例是從BioRad實(shí)驗(yàn)室(Richmond，CA)得到的pUC8，pUC9，pBR322和pBR329，從Pharmacia(Piscataway，NJ)得到的pPL和pKK223。
適用于真核細(xì)胞的表達(dá)載體，優(yōu)選地是那些適用于脊椎動(dòng)物細(xì)胞諸如胃細(xì)胞的表達(dá)載體，還可被用來(lái)制備含編碼序列的rDNA分子。包括病毒載體在內(nèi)的真核細(xì)胞表達(dá)載體在本技術(shù)領(lǐng)域中是已知的并且購(gòu)自幾個(gè)商業(yè)途徑。通常，這種載體是以含有適于插入所需DNA片段的限制位點(diǎn)的形式提供。這種載體的典型實(shí)例是pSVL和pKSV-10(Pharmacia)，pBPV-1/pML2d(Interna tionational Biotechnologies，Inc.)，pTDT1(ATCC，#31255)，本文記載的載體pCDM8以及類似真核表達(dá)載體。如果需要，載體可以被修飾以含有胃細(xì)胞特異性啟動(dòng)子。
被用于構(gòu)建本發(fā)明rDNA分子的真核細(xì)胞表達(dá)載體還可含有在真核細(xì)胞中有效的選擇性標(biāo)記物，優(yōu)選地是一種藥物抗性選擇標(biāo)記物。一種優(yōu)選的藥物抗性標(biāo)記物是其表達(dá)產(chǎn)生新霉素抗性的基因，即新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(neo)基因(Southern等，(1982)J Mol Anal Genet1327-341)?；蛘?，選擇性標(biāo)記物可以存在于分開的質(zhì)粒上，而且，兩個(gè)載體通過(guò)共-轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞而被引進(jìn)，并且通過(guò)在適于該選擇性標(biāo)記物的合適藥物中進(jìn)行培養(yǎng)來(lái)進(jìn)行選擇。
E.含外源編碼核酸分子的宿主細(xì)胞
本發(fā)明還提供了被編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的核酸分子轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。所述宿主細(xì)胞既可以是原核細(xì)胞也可以是真核細(xì)胞。用于表達(dá)本發(fā)明蛋白質(zhì)的真核細(xì)胞不受什么限制，只要所述細(xì)胞系適于細(xì)胞培養(yǎng)方法并適于表達(dá)載體的增殖和基因產(chǎn)物的表達(dá)就行。優(yōu)選的真核宿主細(xì)胞包括但不限于酵母、昆蟲和哺乳動(dòng)物細(xì)胞，優(yōu)選脊椎動(dòng)物細(xì)胞，如那些源自小鼠、大鼠、猴子或人細(xì)胞系的細(xì)胞。優(yōu)選的真核宿主細(xì)胞包括得自ATCC的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞CCL61，得自ATCC的NIH瑞士小鼠胚胎細(xì)胞(NIH/3T3)CRL 1658，幼小倉(cāng)鼠腎細(xì)胞(BHK)和類似真核組織培養(yǎng)細(xì)胞系。
任何原核宿主可以被用來(lái)表達(dá)編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的rDNA分子。優(yōu)選的原核宿主是大腸桿菌。
利用本發(fā)明的rDNA分子對(duì)適當(dāng)宿主細(xì)胞進(jìn)行的轉(zhuǎn)化可以通過(guò)取決于所用載體和宿主系統(tǒng)類型的已知方法來(lái)實(shí)現(xiàn)。針對(duì)原核宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，通常采用電穿孔和鹽處理方法(參見(jiàn)，例如Cohen等，(1972)Proc Natl Acad Sci USA 692110；和Sambrook等，上文)。針對(duì)利用含rDNA分子的載體對(duì)脊椎動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行的轉(zhuǎn)化，通常采用電穿孔、陽(yáng)離子脂質(zhì)或鹽處理方法，參見(jiàn)例如Graham等，(1973)Virol 52456；Wigler等，(1979)Proc Natl Acad Sci USA 76；1373-1376。
被成功轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，即含本發(fā)明rDNA分子的細(xì)胞，可以通過(guò)包括篩選選擇性標(biāo)記物的方法在內(nèi)的已知技術(shù)進(jìn)行鑒定。例如，可以克隆出引入本發(fā)明的rDNA的細(xì)胞以便制備單個(gè)菌落。得自這些菌落的細(xì)胞被收集和溶胞后，利用諸如由Southern，(1975)J Mol Bio l98503或Berent等，(1985)Biotech 3208記載的方法進(jìn)行DNA含量檢測(cè)以便確定rDNA的存在，或通過(guò)免疫學(xué)方法測(cè)定產(chǎn)自所述細(xì)胞的蛋白質(zhì)。
F.利用rDNA分子生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)
本發(fā)明還提供了利用本文記載的核酸分子生產(chǎn)本發(fā)明蛋白質(zhì)的方法?？傊亟M形式的蛋白質(zhì)的生產(chǎn)通常包括下列步驟
首先，得到編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的核酸分子，諸如下列、基本由下列組成或由下列組成的核酸分子SEQ ID NO1，SEQ ID NO3，SEQID NO5，SEQ ID NO7，SEQ ID NO9，SEQ ID NO11，SEQ ID NO13，SEQ ID NO17，SEQ ID NO1的131-862位或131-859位核苷酸，SEQ ID NO3的174-587位或174-584位核苷酸，SEQ ID NO5的38-892位或38-895位核苷酸，SEQ ID NO7的53-892位或53-895位核苷酸，SEQ ID NO9的65-892位或65-895位核苷酸，或SEQ IDNO11的92-892位或92-895位核苷酸，或SEQ ID NO13的49-1437位或49-1434位核苷酸，或SEQ ID NO17的75-575位或75-572位核苷酸。如果編碼序列不被內(nèi)含子所打斷，如這些可讀框，那么所述編碼序列直接適用于在任何宿主中進(jìn)行表達(dá)。
其次，如上所述，所述核酸分子優(yōu)選地與合適的控制序列可操作性地連接從而形成一種含有蛋白可讀框的表達(dá)單位。該表達(dá)單位被用于轉(zhuǎn)化合適的宿主以及在能使重組蛋白產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)該轉(zhuǎn)化宿主。所述重組蛋白質(zhì)可選擇性地分離自培養(yǎng)基或細(xì)胞；在可以容忍某些雜質(zhì)的情況下，所述蛋白的回收和純化不是必需的。
上述每一個(gè)步驟能以各種方式進(jìn)行。例如，所需的編碼序列可以從基因組片段中獲得并被直接用于合適的宿主中。如上所述，可以在各種宿主中操作的表達(dá)載體的構(gòu)建是通過(guò)利用合適的復(fù)制子和控制序列完成的?？刂菩蛄小⒈磉_(dá)載體和轉(zhuǎn)化方法取決于被用于表達(dá)基因的宿主細(xì)胞的類型并且已在以前進(jìn)行過(guò)詳細(xì)討論。如果不能正常得到，可以將合適的限制位點(diǎn)加到編碼序列的末端從而提供一種可剪切基因以便插入到這些載體中。一個(gè)技術(shù)人員可以輕而易舉地對(duì)本技術(shù)領(lǐng)域中已知的宿主/表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行改造以便適用于本發(fā)明的核酸分子來(lái)產(chǎn)生重組蛋白。
G.鑒定結(jié)合配偶體的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的另一個(gè)技術(shù)方案提供了用于分離和鑒定本發(fā)明的結(jié)合配偶體的方法?？傊谀苁?jié)撛诘慕Y(jié)合配偶體與本發(fā)明的蛋白質(zhì)結(jié)合的條件下將本發(fā)明的蛋白質(zhì)與所述的潛在配偶體或細(xì)胞的提取物或級(jí)分相混合。混合后，從所述混合物中分離出結(jié)合了本發(fā)明蛋白質(zhì)的肽、多肽、蛋白質(zhì)或其它分子。然后除去與本發(fā)明蛋白質(zhì)結(jié)合的結(jié)合配偶體并進(jìn)一步進(jìn)行分析。為了鑒定和分離結(jié)合配偶體，可以利用完整蛋白，例如含有SEQ ID NO2，4，6，8，10，12，14或18的全長(zhǎng)氨基酸序列的蛋白?；蛘撸梢岳盟龅鞍椎钠?。
本文中使用的細(xì)胞提取物是指由溶胞的或裂解的細(xì)胞制得的制品或級(jí)分。優(yōu)選的細(xì)胞提取物的來(lái)源是得自人胃腫瘤或被轉(zhuǎn)化的胃細(xì)胞的細(xì)胞，例如來(lái)源于胃癌的活檢組織或組織培養(yǎng)細(xì)胞。或者，可以由正常組織或可得到的細(xì)胞系，尤其是得自胃的細(xì)胞系，來(lái)制備細(xì)胞提取物。
可以使用多種方法來(lái)獲得細(xì)胞提取物。利用物理或化學(xué)裂解方法可以將細(xì)胞裂解。物理裂解方法的實(shí)例包括但不限于超聲處理和機(jī)械剪切，化學(xué)溶胞方法的實(shí)例包括但不限于去污劑溶胞和酶溶胞。一名技術(shù)人員可以輕而易舉地對(duì)制備細(xì)胞提取物的方法進(jìn)行改變以便獲得用于本發(fā)明的提取物。
一旦制備出細(xì)胞提取物，就在能使本發(fā)明的蛋白與結(jié)合配偶體進(jìn)行結(jié)合的條件下將該提取物與本發(fā)明的蛋白質(zhì)相混合?？梢圆捎枚喾N條件，最優(yōu)選的是與人類細(xì)胞的胞質(zhì)中的條件極其相似的條件?？梢愿淖冎T如摩爾滲透壓濃度、pH、溫度和所用細(xì)胞提取物的濃度的特性以便使所述蛋白質(zhì)與結(jié)合配偶體的結(jié)合達(dá)到最佳狀態(tài)。
在適當(dāng)條件下混合后，從所述混合物中分離出結(jié)合的復(fù)合體?？梢岳枚喾N技術(shù)來(lái)對(duì)所述混合物進(jìn)行分離。例如，特異于本發(fā)明蛋白質(zhì)的抗體可以被用來(lái)免疫沉淀所述結(jié)合配偶體復(fù)合物?；蛘撸梢圆捎脴?biāo)準(zhǔn)化學(xué)分離技術(shù)如色譜法和密度/沉淀離心。
當(dāng)除去所述提取物中的未結(jié)合細(xì)胞成分后，利用常規(guī)的方法就可以使結(jié)合配偶體從復(fù)合體中解離。例如，通過(guò)改變所述混合物的鹽濃度或pH可以實(shí)現(xiàn)解離的目的。
為了有助于從所述混合提取物中分離出結(jié)合的結(jié)合配偶體對(duì)子，可以將本發(fā)明的蛋白質(zhì)固定在固相載體上。例如，可以將蛋白質(zhì)連接在硝化纖維素基質(zhì)或丙烯酸珠子上。所述蛋白與固相載體的連接有助于從所述提取物中的其它組分中分離出肽/結(jié)合配偶體對(duì)子。被鑒定出來(lái)的結(jié)合配偶體可以是單一蛋白或由兩種或多種蛋白組成的復(fù)合體。或者，可以利用在Takayama等，(1997)Methods Mol Biol 69171-184或Sauder等，(1996)J Gen Virol 77991-996中記載的方法用Far-Western測(cè)定法來(lái)鑒定結(jié)合配偶體，或者通過(guò)利用表位標(biāo)記的蛋白或GST融合蛋白來(lái)鑒定結(jié)合配偶體。
或者，本發(fā)明的核酸分子可被用于酵母雙雜交系統(tǒng)中或其它體內(nèi)蛋白-蛋白檢測(cè)系統(tǒng)。酵母雙雜交系統(tǒng)已被用來(lái)鑒定其它蛋白質(zhì)配偶體對(duì)子，并可以被適當(dāng)?shù)馗淖儚亩m用于本文所記載的核酸分子。
H. 鑒定調(diào)控編碼胃癌相關(guān)基因的核酸的表達(dá)的介質(zhì)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例提供了用于鑒定調(diào)控編碼本發(fā)明蛋白的核酸的表達(dá)的介質(zhì)的方法，所述本發(fā)明蛋白諸如是具有SEQ ID NO2，4，6，8，10，12或18所示氨基酸序列的蛋白或Mst1蛋白或本發(fā)明的剪接變體，如具有SEQ ID NO14所示氨基酸序列的蛋白。調(diào)控編碼Mst1蛋白或剪接變體的核酸的表達(dá)的介質(zhì)在治療胃癌中具有特定的用途。這種測(cè)定法可以利用任何有效檢測(cè)手段來(lái)檢測(cè)本發(fā)明核酸的表達(dá)水平。只要本文中的介質(zhì)能夠上調(diào)或下調(diào)所述核酸在細(xì)胞中的表達(dá)，那么就認(rèn)為其能調(diào)控本發(fā)明核酸的表達(dá)。
在一種測(cè)定形式中，可制備出在下列核苷酸和任何可檢測(cè)的融合配偶體之間的報(bào)道基因融合體由SEQ ID NO1的131-862位核苷酸、SEQ ID NO3的174-587位核苷酸、SEQ ID NO5的38-895位核苷酸、SEQ ID NO7的53-895位核苷酸、SEQ ID NO9的65-895位核苷酸、SEQ ID NO11的92-895位核苷酸、SEQ ID NO13的49-1437位或49-1434位核苷酸、SEQ ID NO17的75-575位核苷酸所定義的可讀框和/或5’和/或3’調(diào)節(jié)元件。包括螢火蟲熒光素酶基因和編碼氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶在內(nèi)的大量可測(cè)定融合配偶體是已知的并且容易得到(Alam等，(1990)Anal Biochem 188245-254)。然后在適當(dāng)條件和時(shí)間下使含報(bào)道基因融合體的細(xì)胞系與待測(cè)的介質(zhì)進(jìn)行接觸。接觸所述介質(zhì)的樣品與對(duì)照樣品之間的報(bào)道基因的差異表達(dá)能夠鑒定調(diào)控本發(fā)明核酸表達(dá)的介質(zhì)。
可以采用其它測(cè)定形式來(lái)監(jiān)測(cè)介質(zhì)調(diào)控核酸表達(dá)的能力，所述核酸編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)，諸如具有SEQ ID NO2，4，6，8，10，12，14或18所示序列的蛋白質(zhì)。例如，mRNA表達(dá)可以直接通過(guò)與本發(fā)明的核酸進(jìn)行雜交來(lái)監(jiān)測(cè)。在適當(dāng)條件和時(shí)間下細(xì)胞系與待測(cè)介質(zhì)進(jìn)行接觸并且總RNA或mRNA通過(guò)常規(guī)方法如那些被公開于Sambrook等，Molecular Cloning-A Laboratory Manual，Third Ed.，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，2001中的方法而得到分離。
優(yōu)選的細(xì)胞是那些得自人胃組織，例如，胃活檢組織的細(xì)胞或源自胃癌患者的培養(yǎng)細(xì)胞?？梢允褂眉?xì)胞系如目錄號(hào)為NCI-SNU-16，CRL-1863，HTB-103，CRL-1739和CRL-1864的ATCC胃癌細(xì)胞系。或者，可以使用其它可得到的細(xì)胞或細(xì)胞系。
用于檢測(cè)接觸了所述介質(zhì)的細(xì)胞與對(duì)照細(xì)胞之間的RNA表達(dá)水平差異的探針可以由本發(fā)明的核酸來(lái)制備。更好地是，但不是必需的，設(shè)計(jì)僅與靶核酸在高嚴(yán)緊條件下進(jìn)行雜交的探針。在高嚴(yán)緊條件下僅僅形成高度互補(bǔ)的核酸雜交體。因此，測(cè)定條件的嚴(yán)緊性決定兩條核酸鏈之間為了形成雜交體應(yīng)該存在的互補(bǔ)量。應(yīng)當(dāng)對(duì)嚴(yán)緊性進(jìn)行選擇從而使探針靶標(biāo)雜交體與探針?lè)前袠?biāo)雜交體之間的穩(wěn)定性差異最大化。
可以通過(guò)本領(lǐng)域中的已知方法由本發(fā)明的核酸設(shè)計(jì)探針。例如，探針的G+C含量和探針的長(zhǎng)度能夠影響探針與其靶序列的結(jié)合。使探針特異性最佳化的方法通常被記載在Sambrook等，上文，或Ausubel等，Short Protocols in Molecular Biology，第四版，John Wiley& Sons，Inc.，New York，1999中。
根據(jù)每一探針的需要，雜交條件利用已知方法來(lái)改變，所述已知方法諸如是由Sambrook等和Ausubel等記載的方法?？偧?xì)胞RNA或富集了聚腺苷酸RNA的RNA的雜交能以任何可用形式得到實(shí)現(xiàn)。例如，在探針進(jìn)行特異性雜交的條件下，總細(xì)胞RNA或富集了聚腺苷酸RNA的RNA可以被附著于固相載體，固相載體暴露于至少一種含有本發(fā)明的至少一種序列或本發(fā)明的一種序列的部分序列的探針?；蛘?，含本發(fā)明的至少一種序列或本發(fā)明的一種序列的部分序列的核酸片段可以被附著于固相載體上，所述固相載體例如是硅片、多孔玻璃膠片或膜。然后在被附著的序列進(jìn)行特異性雜交的條件下使所述固相載體與得自樣品的總細(xì)胞RNA或聚腺苷酸RNA接觸。這種固相載體和雜交方法是廣泛可用的，例如由Beattie，(1995)WO 95/11755公開的方法。通過(guò)檢測(cè)給定探針與源自未處理細(xì)胞群和與所述介質(zhì)接觸的細(xì)胞群的RNA樣品進(jìn)行特異性雜交的能力，可以鑒定出上調(diào)或下調(diào)核酸表達(dá)的介質(zhì)，該核酸編碼具有SEQ ID NO2，4，6，8，10，12，14或18所示序列的蛋白質(zhì)。
通過(guò)利用RNase Protection Assay(即RPA，參見(jiàn)Ma等，(1996)Methods 10273-238)也可以實(shí)施適用于對(duì)mRNA進(jìn)行定性和定量分析的雜交。簡(jiǎn)要地說(shuō)，含編碼基因產(chǎn)物的cDNA和噬菌體特定DNA依賴性RNA聚合酶啟動(dòng)子(例如T7，T3或SP6 RNA聚合酶)的表達(dá)載體在cDNA分子的3’端，噬菌體啟動(dòng)子的下游，被線性化，其中這種線性化分子被隨后用作合成cDNA的被標(biāo)記的反義轉(zhuǎn)錄物的模板，所述反義轉(zhuǎn)錄物是通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄得到的。然后通過(guò)在含80％甲酰胺、40mM Pipes，0.4M NaCl和1mM EDTA的pH為6.4的緩沖液中進(jìn)行45℃的過(guò)夜孵育來(lái)使被標(biāo)記的轉(zhuǎn)錄物與被分離的RNA混合物(即總mRNA或分級(jí)的mRNA)進(jìn)行雜交。然后在含40μg/ml核糖核酸酶A和2μg/ml核糖核酸酶的緩沖液中對(duì)所得到的雜交體進(jìn)行消化。在使外來(lái)蛋白質(zhì)失活并提取外來(lái)蛋白質(zhì)后，將樣品加載到分析用的尿素/聚丙烯酰胺凝膠上。
在另一個(gè)分析方法中，為了鑒定影響本發(fā)明基因產(chǎn)物表達(dá)的介質(zhì)，首先鑒定生理表達(dá)本發(fā)明基因產(chǎn)物的細(xì)胞或細(xì)胞系。如此鑒定的細(xì)胞和/或細(xì)胞系可望含有必需的細(xì)胞結(jié)構(gòu)以便當(dāng)介質(zhì)進(jìn)行體外接觸時(shí)轉(zhuǎn)錄結(jié)構(gòu)的調(diào)控保真度被維持，所述介質(zhì)具有適當(dāng)?shù)谋砻孓D(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制和/或胞質(zhì)級(jí)聯(lián)傳導(dǎo)。而且，這種細(xì)胞或細(xì)胞系被表達(dá)載體(例如質(zhì)?；虿《据d體)構(gòu)建物轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)染，所述表達(dá)載體構(gòu)建物含有融合于一個(gè)或多個(gè)抗原性片段上的編碼本發(fā)明基因產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)基因的可操作的非翻譯5′末端(該末端含有啟動(dòng)子)，所述抗原性片段對(duì)于本發(fā)明基因產(chǎn)物來(lái)說(shuō)是獨(dú)特的，其中所述片段處于所述啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄控制下并以其分子量不同于天然多肽的多肽形式進(jìn)行表達(dá)或進(jìn)一步含有免疫上不同的標(biāo)簽或其它可檢測(cè)標(biāo)記物。這種方法在本技術(shù)領(lǐng)域中是已知的(參見(jiàn)Sambrook等，見(jiàn)上文)。
然后在適當(dāng)?shù)臈l件下使上述被轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)染的細(xì)胞或細(xì)胞系與介質(zhì)接觸。例如，藥學(xué)可接受賦形劑中的介質(zhì)與含水生理緩沖液如生理pH的磷酸鹽緩沖液(PBS)、生理pH的Eagles平衡鹽溶液(BSS)、含血清的PBS或BSS或者37℃下溫育的含PBS或BSS和/或血清的條件培養(yǎng)基中的細(xì)胞接觸。所述條件可以由本技術(shù)領(lǐng)域中的技術(shù)人員根據(jù)需要進(jìn)行調(diào)節(jié)。細(xì)胞與所述介質(zhì)接觸后，將所述細(xì)胞進(jìn)行裂解并且對(duì)溶胞產(chǎn)物的多肽進(jìn)行分部分離，從而將多肽級(jí)分合并起來(lái)并且與抗體接觸以通過(guò)免疫學(xué)測(cè)定方法進(jìn)一步加工(例如，ELISA，免疫沉淀或蛋白質(zhì)印跡)。將從“介質(zhì)-接觸的”樣品中分離的蛋白的合并物與其中只有賦形劑與細(xì)胞接觸的對(duì)照樣品進(jìn)行比較，并且由“介質(zhì)-接觸的”樣品所產(chǎn)生的免疫學(xué)信號(hào)相對(duì)于對(duì)照物的增強(qiáng)或減弱來(lái)識(shí)別所述介質(zhì)的有效性。
I.調(diào)控胃癌相關(guān)蛋白的水平或至少一種活性的介質(zhì)的識(shí)別方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案提供了用于鑒定調(diào)控本發(fā)明蛋白或本發(fā)明的Mst1蛋白或剪接變體的水平或至少一種活性的介質(zhì)的方法，所述本發(fā)明蛋白例如是具有SEQ ID NO2，4，6，8，10，12或18的氨基酸序列的蛋白，所述本發(fā)明的Mst1蛋白或剪接變體例如是具有SEQID NO14的氨基酸序列的蛋白。這種方法或測(cè)定方法可以利用任何監(jiān)控或檢測(cè)所需活性的手段。
在一種情況下，可以檢測(cè)與待測(cè)介質(zhì)接觸過(guò)的細(xì)胞群相對(duì)于未接觸的對(duì)照細(xì)胞群的本發(fā)明蛋白的相對(duì)含量。在這種情況下，探針諸如特定抗體被用來(lái)監(jiān)控所述蛋白在不同細(xì)胞群中的差異表達(dá)。在適當(dāng)條件下和時(shí)間內(nèi)使細(xì)胞系或細(xì)胞群與所述介質(zhì)接觸?？梢詮慕佑|過(guò)的細(xì)胞系或細(xì)胞群和未接觸過(guò)的對(duì)照細(xì)胞系或細(xì)胞群中制備細(xì)胞溶胞產(chǎn)物。然后利用探針對(duì)該細(xì)胞溶胞產(chǎn)物進(jìn)行分析。
如果本發(fā)明的肽、多肽或蛋白質(zhì)足夠長(zhǎng)，或如果需要，或如果需要加強(qiáng)免疫原性，則將所述肽、多肽或蛋白質(zhì)結(jié)合到適當(dāng)?shù)妮d體上，就在適當(dāng)?shù)拿庖叻桨钢型ㄟ^(guò)利用本發(fā)明的所述肽、多肽或蛋白質(zhì)免疫合適的哺乳動(dòng)物宿主來(lái)制備抗體探針。用于制備結(jié)合在載體如BSA，KLH或其它載體蛋白上的免疫原性綴合物的方法在本技術(shù)領(lǐng)域中是已知的。在某些情況下，利用例如碳二亞胺試劑直接進(jìn)行綴合可能是有效的；在其它情況下，可能需要連接試劑如那些由Pierce ChemicalCo.(Rockford，IL)提供的連接試劑來(lái)提供對(duì)半抗原的可接近性。例如為了便于與載體進(jìn)行連接，所述半抗原肽可以用半胱氨酸殘基在氨基或羧基端進(jìn)行延伸，或用半胱氨酸殘基進(jìn)行點(diǎn)綴。如本技術(shù)領(lǐng)域中所知曉的，通常通過(guò)適當(dāng)長(zhǎng)時(shí)間的注射和利用合適的佐劑來(lái)施用免疫原。在免疫程序中，測(cè)定抗體滴度以確定足夠抗體的形成。
盡管以這種方式產(chǎn)生的多克隆抗血清可以滿足某些用途，但對(duì)于藥物組合物，單克隆制備物的利用是優(yōu)選的。眾所周知，可以利用Kohler和Milstein((1975)Nature 256495-497)的標(biāo)準(zhǔn)方法或引起淋巴細(xì)胞或脾細(xì)胞的無(wú)限增殖的改進(jìn)方法來(lái)制備分泌所需單克隆抗體的永生化細(xì)胞系。分泌所需抗體的無(wú)限增殖細(xì)胞系通過(guò)其中抗原是肽半抗原、多肽或蛋白質(zhì)的免疫分析法來(lái)篩選。當(dāng)鑒定了分泌所需抗體的適當(dāng)?shù)臒o(wú)限增殖細(xì)胞培養(yǎng)物后，可以體外培養(yǎng)所述細(xì)胞或通過(guò)利用腹水來(lái)制備所述細(xì)胞。
然后從培養(yǎng)上清中或從腹水上清中回收所需單克隆抗體。含有免疫學(xué)顯性(抗原-結(jié)合)部分的單克隆抗體片段或多克隆抗血清以及完整抗體可被用作拮抗劑。利用免疫反應(yīng)(抗原-結(jié)合)性抗體片段，諸如Fab，F(xiàn)ab’或F(ab’)2片段通常是優(yōu)選的，尤其是在治療方面，因?yàn)檫@些片段的免疫原性通常比完整免疫球蛋白的免疫源性小。
抗體或抗原-結(jié)合型片段還可以利用現(xiàn)有技術(shù)，通過(guò)重組手段來(lái)生產(chǎn)。與所述蛋白的所需區(qū)域特異結(jié)合的抗體區(qū)域可以產(chǎn)生于多個(gè)物種來(lái)源的嵌合體中，諸如人源化抗體中。
可以對(duì)以上述方法測(cè)定的介質(zhì)進(jìn)行隨機(jī)選擇或理性選擇或設(shè)計(jì)。本文中的介質(zhì)是隨機(jī)選擇的，這里指這樣的介質(zhì)是隨機(jī)選擇的而沒(méi)有考慮參與與本發(fā)明蛋白單獨(dú)結(jié)合或聯(lián)合相關(guān)的底物、結(jié)合配偶體等與本發(fā)明蛋白結(jié)合的特定序列。隨機(jī)選擇的介質(zhì)的實(shí)例是利用化學(xué)文庫(kù)或肽組合文庫(kù)或微生物培養(yǎng)肉湯。
當(dāng)在考慮了靶位點(diǎn)的序列和/或與所述介質(zhì)的作用有關(guān)的構(gòu)象的非隨機(jī)基礎(chǔ)上選擇本文使用的介質(zhì)時(shí)，所述介質(zhì)被認(rèn)為是理性選擇或設(shè)計(jì)的。可以利用組成這些位點(diǎn)的肽序列對(duì)介質(zhì)進(jìn)行理性的選擇或設(shè)計(jì)。例如，理性選擇的肽介質(zhì)可以是其氨基酸序列與任何功能性共有序列位點(diǎn)相同的肽或其氨基酸序列是任何功能性共有序列位點(diǎn)的衍生物的肽。
本發(fā)明的介質(zhì)可以是，例如肽、小分子、維生素衍生物以及碳水化合物?？梢詫@性失活蛋白，編碼這些蛋白的DNA、針對(duì)這些蛋白的抗體、這些蛋白的肽片段或這些蛋白的模擬物引進(jìn)細(xì)胞來(lái)實(shí)現(xiàn)功能。本文使用的“模擬物”是指對(duì)肽分子的一個(gè)區(qū)域或幾個(gè)區(qū)域進(jìn)行修飾從而使其化學(xué)結(jié)構(gòu)有別于母本肽而拓?fù)鋵W(xué)和功能卻類似于母本肽(參見(jiàn)GrantMolecular Biology and Biotechno logy，Meyers編輯，659-664頁(yè)，VCH Publishers，Inc.，紐約，1995)。技術(shù)人員可以輕而易舉地得知本發(fā)明介質(zhì)的結(jié)構(gòu)特性不受限定。
本發(fā)明的肽介質(zhì)可以利用在本技術(shù)領(lǐng)域中已知的標(biāo)準(zhǔn)固相(或液相)肽合成法來(lái)制備。另外，編碼這些肽的DNA可以利用商購(gòu)寡核苷酸合成儀來(lái)合成并且利用常規(guī)重組生產(chǎn)體系來(lái)進(jìn)行重組制備。如果包含非基因編碼氨基酸，那么利用固相肽合成法的生產(chǎn)則成為必需。
本發(fā)明的另一種介質(zhì)是與本發(fā)明蛋白的關(guān)鍵位點(diǎn)發(fā)生免疫反應(yīng)的抗體?？贵w介質(zhì)通過(guò)用肽對(duì)合適哺乳動(dòng)物主體進(jìn)行免疫而獲得，所述肽含有要作為所述抗體的靶標(biāo)的那些蛋白部分作為免疫原性區(qū)域。
J.調(diào)控胃癌相關(guān)蛋白的表達(dá)或至少一種活性的介質(zhì)的用途
如實(shí)施例所提供的，本發(fā)明的蛋白和核酸，諸如具有SEQ ID NO2，4，6，8，10，12或18所示氨基酸序列的蛋白，和本發(fā)明的Mst1或Mst1剪接變體蛋白和核酸，諸如具有SEQ ID NO14所示氨基酸序列的蛋白，在胃癌組織進(jìn)行差異性表達(dá)。上調(diào)或下調(diào)或調(diào)控蛋白質(zhì)表達(dá)或蛋白質(zhì)至少一種活性的介質(zhì)，諸如激動(dòng)劑或拮抗劑，可以被用來(lái)調(diào)控與蛋白質(zhì)功能和活性有關(guān)的生物和病理的過(guò)程。
例如，兩種類型的藥物已經(jīng)被證明通過(guò)Mst1(例如，GenBank序號(hào)為NM_006282，核酸序列和蛋白序列分別如SEQ ID NO15和16所示)，一種與SEQ ID NOS13和14相關(guān)的基因，起作用。首先，已經(jīng)證明二膦酸鹽，即被用來(lái)治療骨質(zhì)疏松和其它骨病的藥物，直接作用于破骨細(xì)胞從而在編程性細(xì)胞死亡的過(guò)程中誘導(dǎo)Mst1的caspase裂解。其次，cytotrienin A是一種被用來(lái)治療白血病、乳腺癌和肺癌的抗腫瘤藥物(美國(guó)專利US 6,251,885)。Cytotrienin A已經(jīng)被證明在cytotrienin A-誘導(dǎo)的編程性細(xì)胞死亡過(guò)程中能夠激活Mst1(Watabe等，(2000)J Biol Chem 2758766-8771)。
在本文中，主體可以是任何哺乳動(dòng)物，只要所述哺乳動(dòng)物需要調(diào)控由本發(fā)明的蛋白介導(dǎo)的病理學(xué)或生物學(xué)過(guò)程就行。術(shù)語(yǔ)“哺乳動(dòng)物”被定義為是一種屬于哺乳動(dòng)物綱的個(gè)體。本發(fā)明被特別用于人體的治療。
病理學(xué)過(guò)程是指一類產(chǎn)生有害作用的生物過(guò)程。例如，本發(fā)明的蛋白表達(dá)可能與胃細(xì)胞的生長(zhǎng)或增生有關(guān)。在本文中，介質(zhì)被認(rèn)為能夠調(diào)控病理學(xué)過(guò)程，就是指所述介質(zhì)降低了所述過(guò)程的程度或嚴(yán)重性。例如，可以通過(guò)施用以某種方式上調(diào)或下調(diào)或調(diào)控本發(fā)明蛋白的表達(dá)或至少一種活性的介質(zhì)來(lái)預(yù)防胃癌或調(diào)控疾病進(jìn)展。
本發(fā)明的介質(zhì)能以單獨(dú)的形式進(jìn)行提供，或者以與其它調(diào)控特定病理學(xué)過(guò)程的介質(zhì)組合的形式來(lái)提供。例如，本發(fā)明的介質(zhì)可以與其它已知藥物聯(lián)合進(jìn)行施用。在本文中，當(dāng)兩種介質(zhì)同時(shí)施用或以所述介質(zhì)同時(shí)發(fā)揮作用的方式分別獨(dú)立地施用時(shí)，所述兩種介質(zhì)就被認(rèn)為是進(jìn)行聯(lián)合施用的。
本發(fā)明的介質(zhì)可以通過(guò)非腸道、皮下、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、透皮或口腔途徑進(jìn)行用藥。替代性地，或同時(shí)地，可以通過(guò)口服進(jìn)行用藥。用藥劑量將取決于受試者的年齡、健康和重量，共同治療的類型(如果有的話)，還取決于治療的頻率和所需作用的特性。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了含有一種或多種調(diào)控本發(fā)明蛋白的表達(dá)或至少一種活性的介質(zhì)的組合物。盡管個(gè)體需要會(huì)變化，確定每個(gè)組分的有效量的優(yōu)化范圍是本技術(shù)領(lǐng)域中的技術(shù)人員所能控制的。典型的劑量含有0.1至100μg/kg體重。優(yōu)選的劑量含有0.1至10μg/kg體重。最優(yōu)選的劑量含有0.1至1μg/kg體重。
除了藥理學(xué)活性介質(zhì)外，本發(fā)明的組合物可以含有適當(dāng)?shù)乃帉W(xué)可接受載體以遞送至作用位點(diǎn)，該載體含有有利于將所述活性化合物加工成可被藥學(xué)利用的制劑的賦形劑和輔劑。適用于非腸道用藥的制劑包括水溶形式的活性化合物的水溶液，例如水溶性鹽。另外，可以施用活性化合物的懸液例如合適的含油注射懸液。合適的親脂性溶劑或載體包括脂肪油，例如芝麻油，或合成脂肪酸酯，例如乙基油酸酯或甘油三酯。注射用水懸液可以含有增加懸液粘度的物質(zhì)，這種物質(zhì)包括，例如，羧甲基纖維素鈉、山梨醇和/或葡聚糖。任選地，所述懸液還可以含有穩(wěn)定劑。脂質(zhì)體也能被用來(lái)將所述介質(zhì)包囊化以便輸入到細(xì)胞內(nèi)。
本發(fā)明的全身用藥的藥物制劑可以被配制成適于腸內(nèi)、非腸道或局部用藥。實(shí)際上，所有三種類型的制劑都可以被用來(lái)實(shí)現(xiàn)活性成分的全身用藥。
合適的口服制劑包括硬明膠膠囊劑或軟明膠膠囊劑、丸劑、片劑包括有包衣的片劑、酏劑、懸液、糖漿或吸入劑及其控釋劑型。
為了實(shí)施本發(fā)明的方法，本發(fā)明的化合物可以進(jìn)行單獨(dú)使用，或以與其它治療劑或診斷試劑聯(lián)合的形式使用。在某些優(yōu)選的實(shí)施例中，根據(jù)通常接受的醫(yī)學(xué)實(shí)踐，本發(fā)明的化合物可以與其它化合物一起共同施用，所述化合物被通常指定用于這些病癥。本發(fā)明的化合物可以進(jìn)行體內(nèi)用藥或體外用藥，通常在哺乳動(dòng)物體內(nèi)用藥，所述哺乳動(dòng)物諸如是人、綿羊、馬、牛、豬、狗、貓、大鼠和小鼠。
K.轉(zhuǎn)基因動(dòng)物
本發(fā)明也包括含有突變、敲除或修飾基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，所述基因?qū)?yīng)于SEQ ID NO1，3，5，7，9，11，13或17所示的cDNA序列或編碼SEQ ID NO2，4，6，8，10，12，14或18所示多肽序列或其具有至少約3，4，5，6，10，15，20，25，30，35或更多個(gè)氨基酸殘基的連續(xù)序列的片段的可讀框。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是其體內(nèi)已通過(guò)實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)入了重組的、外源的或克隆的遺傳物質(zhì)的被遺傳修飾的動(dòng)物。這種遺傳物質(zhì)通常被稱作“轉(zhuǎn)基因”。在本案中，可以將SEQ ID NO1，3，5，7，9，11，13或17形式的轉(zhuǎn)基因核酸序列整合到其中該特定核酸通常不存在的基因組的基因座上或整合到該轉(zhuǎn)基因的正?；蜃?。所述轉(zhuǎn)基因可由得自相同物種或不同于靶動(dòng)物物種的其它物種的基因組的核酸序列組成。
在某些實(shí)施方案中，可以構(gòu)建其中缺失了含SEQ ID NO1，3，5，7，9，11，13或17所示基因的全部或部分片段的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。當(dāng)對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO1，3，5，7，9，11，13或17的基因含有一個(gè)或多個(gè)內(nèi)含子時(shí)，可以刪除全長(zhǎng)基因，即所有外顯子、內(nèi)含子和調(diào)控序列?；蛘撸梢詣h除全長(zhǎng)基因的一部分序列。例如，可以刪除單個(gè)外顯子和/或內(nèi)含子，以便創(chuàng)建一種表達(dá)經(jīng)修飾的本發(fā)明蛋白的動(dòng)物。
術(shù)語(yǔ)“生殖細(xì)胞系轉(zhuǎn)基因動(dòng)物”是指其中生殖細(xì)胞進(jìn)行了遺傳改構(gòu)或引入了遺傳信息從而賦予了轉(zhuǎn)基因動(dòng)物將遺傳信息傳給后代的能力的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。如果這種后代事實(shí)上擁有了一部分或全部的遺傳改構(gòu)或遺傳信息，那么它們也是轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。
所述改構(gòu)或遺傳信息相對(duì)受體所屬動(dòng)物品種來(lái)說(shuō)可以是外源的，僅相對(duì)該特定個(gè)體受體是外源的或者可以是已經(jīng)被受體擁有的遺傳信息。在最后一種情況下，被改構(gòu)或引進(jìn)的基因與天然基因的表達(dá)可能有差異。
轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可以通過(guò)多種不同的方法來(lái)生產(chǎn)，所述方法包括轉(zhuǎn)染、電穿孔、顯微注射、基因在胚胎干細(xì)胞中的定位以及重組病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒傳染(參見(jiàn)例如US專利號(hào)4736866；US專利號(hào)5602307；Mullins等，(1993)Hypertension 22630-633；Brenin等，(1997)Surg Oncol 699-110；Recombinant Gene Expression Protocols(Methods in Molecular Biology，Vol.62)，Tuan編輯，Humana出版社，Totowa，NJ，1997)。
已經(jīng)制備出許多重組或轉(zhuǎn)基因小鼠，包括那些表達(dá)活化的致癌基因序列(US專利號(hào)4,736,866)；表達(dá)猿SV40 T-抗原(US專利號(hào)5,728,915)；不進(jìn)行干擾素調(diào)控因子1(IRF-1)表達(dá)(US專利號(hào)5,731,490)；表現(xiàn)出多巴胺能機(jī)能障礙(US專利號(hào)5,723,719)；表達(dá)至少一種參與血壓調(diào)控的人類基因(US專利號(hào)5,731,489)；表現(xiàn)出與自然發(fā)生的阿爾茨海墨氏病中存在的癥狀更相似的癥狀(US專利號(hào)5,720,936)；介導(dǎo)細(xì)胞粘附的能力降低(US專利號(hào)5,602,307)；具有牛生長(zhǎng)激素基因(Clutter等，(1996)Genetics 1431753-1760)；或能夠產(chǎn)生完全人體抗體應(yīng)答(McCarthy(1997)Lancet 349405)的重組或轉(zhuǎn)基因小鼠。
盡管小鼠和大鼠仍然是大多數(shù)轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)所選擇的動(dòng)物，但是，在某些情況下，優(yōu)選地或必要地是利用其它動(dòng)物品種。轉(zhuǎn)基因方法已被成功用于多種非-鼠科動(dòng)物，這些動(dòng)物包括綿羊、山羊、豬、狗、貓、猴子、黑猩猩、倉(cāng)鼠、兔子、牛和豚鼠(參見(jiàn)例如Kim等，(1997)MolReprod Dev 46515-526；Houdebine，(1995)Reprod Nutr Dev35609-617；Petters(1994)Reprod Fertil Dev 6643-645；Schnieke等，(1997)Science 2782130-2133；和Amoah，(1997)JAnimal Science 75578-585)。
將核酸片段引入能夠重組的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的方法可以是任何利于進(jìn)行多個(gè)核酸分子的共轉(zhuǎn)化的方法。用于生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的詳細(xì)過(guò)程對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)很容易獲得，包括US專利號(hào)5,489,743和US專利號(hào)5,602,307所公開的內(nèi)容。
L.診斷方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的基因和蛋白在胃癌細(xì)胞和其它惡性腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)不同于在同類型的非癌性組織中的表達(dá)，因此本發(fā)明的基因和蛋白可以被用來(lái)診斷或監(jiān)控這種癌或跟蹤疾病的進(jìn)程。一種利用本發(fā)明的核酸分子或蛋白診斷包括胃癌在內(nèi)的癌癥的手段涉及從活體如活檢組織樣本中獲得組織。
分子生物學(xué)工具的利用已經(jīng)成為常規(guī)的法醫(yī)技術(shù)。例如，含有SEQID NO1，3，5，7，9，11，13或17所示序列的全長(zhǎng)序列或至少部分序列的核酸探針可以被用來(lái)測(cè)定法醫(yī)/病理樣本中的核酸分子的表達(dá)。而且，核酸分析可以通過(guò)任何轉(zhuǎn)錄圖譜分析手段來(lái)進(jìn)行。除了核酸分析，本發(fā)明的法醫(yī)方法可以指向本發(fā)明的蛋白，尤其是一種含SEQID NO2，4，6，8，10，12，14，16，18或20的蛋白，來(lái)確定基因的上調(diào)或下調(diào)(Shiverick等，(1975)Biochim Biophys Acta393124-133)。
本發(fā)明的方法可以包括利用膠原酶或其它蛋白酶進(jìn)行的組織處理來(lái)使組織易于細(xì)胞溶解(Semenov等，(1987)Biull Eksp Biol Med104113-116)。而且，有可能從分析用的胃的不同區(qū)域獲得活檢組織樣品。
檢測(cè)本發(fā)明核酸或蛋白分子的試驗(yàn)可以是任何可利用的形式。用于核酸分子的常規(guī)測(cè)定方法包括雜交或基于PCR的方法。用于檢測(cè)本發(fā)明的蛋白、多肽或肽的常規(guī)試驗(yàn)包括任何可利用形式的抗體探針的使用，如原位結(jié)合試驗(yàn)等(參見(jiàn)Harlow & Lane，Antibodies-ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，NY，1988)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，試驗(yàn)利用適當(dāng)?shù)膶?duì)照來(lái)進(jìn)行。
上述方法還可以被用于其它診斷方案，包括檢測(cè)其它組織或器官的疾病狀況的方案和方法，例如其中檢測(cè)到表達(dá)本發(fā)明的核酸分子的組織。
無(wú)需再描述，確信本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能夠利用前面的描述和下面的說(shuō)明性實(shí)施例制備和利用本發(fā)明的化合物并實(shí)施所要求的方法。因此下面的實(shí)施例具體指出了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案。并且無(wú)論如何不應(yīng)被解釋為是對(duì)所公開的其余部分的限定。
實(shí)施例
實(shí)施例 1a
對(duì)晚期胃癌中差異表達(dá)的mRNA進(jìn)行的鑒定
材料和方法
將患者組織樣品從5名年齡在47-68歲的朝鮮患者(包括四名男性和一名女性)體內(nèi)取出，所述朝鮮患者被診斷患有晚期胃癌。對(duì)于每名患者來(lái)說(shuō)，從胃的兩個(gè)區(qū)域中取得組織來(lái)制備一套活檢組織樣品，所述兩個(gè)區(qū)域是胃腫瘤和非癌性區(qū)域。對(duì)每個(gè)組織樣品進(jìn)行組織學(xué)分析，并將樣品分類成非癌類或癌類。
按照Affymetrix GeneChip Expression Analysis Manual(稍加改動(dòng))制備樣品。首先利用Spex Certiprep 6800 Freezer Mil將冷凍組織研磨成粉末。然后利用Trizol(Life Technologies)提取總RNA。每個(gè)樣品的總RNA產(chǎn)率(組織平均重量為300mg)是200-500μg。接著，利用Oligotex mRNA Midi試劑盒(Qiagen)分離mRNA。由于mRNA洗脫于終體積400μl中，因此需要通過(guò)乙醇沉淀步驟將濃度變到1μg/μl。利用1-5μg的mRNA，通過(guò)SuperScript Choice系統(tǒng)(Gibco-BRL)制備雙鏈cDNA。采用T7-(dT24)寡核苷酸引發(fā)第一鏈cDNA鏈的合成。然后對(duì)cDNA進(jìn)行酚-氯仿提取，并且進(jìn)行乙醇沉淀直到終濃度為1μg/μl。
從2μg的cDNA，按照常規(guī)方法合成cRNA。為了對(duì)cRNA進(jìn)行生物素標(biāo)記，將核苷酸Bio-11-CTP和Bio-16-UTP(Enzo Diagnostics)加到反應(yīng)物中。在37℃下溫育6小時(shí)后，按照RNeasy Mini試劑盒方案(Qiagen)清理被標(biāo)記的cRNA。然后在94℃下對(duì)cRNA進(jìn)行35分鐘的片段化(5×片段化緩沖液200mM Tris-醋酸鹽(pH 8.1)，500mMKOAc，150mM MgOAc)。
在45℃的雜交箱中以60rpm將55μg片段化的cRNA雜交到Affymetrix Human Genome裝置U95和U133的陣列上，雜交進(jìn)行24小時(shí)。沖洗芯片并在Affymetrix流體平臺(tái)中用StreptavidinPhycoerythrin(SAPE)(Molecular Probes)對(duì)所述芯片進(jìn)行染色。為了增強(qiáng)染色，兩次加入SAPE溶液，在兩次之間有一個(gè)抗-鏈霉親和素生物素化抗體(Vector Laboratories)染色步驟。利用熒光測(cè)定掃描技術(shù)(Hewlett Packard Gene Array Scanner)檢測(cè)探針陣列上的雜交。雜交和掃描后，對(duì)微陣列圖像進(jìn)行分析以進(jìn)行質(zhì)量控制，尋找出芯片的主要缺陷或雜交信號(hào)中的異常。當(dāng)所有芯片通過(guò)QC后，利用Affymetrix Microarray Suite(v4.0)和LIMS(v1.5)分析U95的數(shù)據(jù)，或用Affymetrix Microarray Suite(v5.0)和LIMS(v3.0)分析U133的數(shù)據(jù)。
按照以下統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，通過(guò)利用Affymetrix human GeneChip裝置U95和U133來(lái)測(cè)定癌性或非癌性肝組織樣品之間的基因差異性表達(dá)。(1)對(duì)于每種基因，Affymetrix GeneChip的U95平均差值通過(guò)利用Affymetrix Microarray Suite(v4.0)來(lái)測(cè)定，其中AffymetrixMicroarray Suite(v4.0)還針對(duì)每個(gè)GeneChip單元設(shè)定“Absent”(＝未檢測(cè)到)，“Present”(＝檢測(cè)到的)或“Marginal”(＝不能清楚地確定Absent或Present)這三個(gè)指征。U133的信號(hào)值通過(guò)AffymetrixMicroarray Suite(v5.0)來(lái)測(cè)定，Affymetrix Microarray Suite(v5.0)也設(shè)定了Absent、Present或Marginal這三個(gè)指征。(2)以癌性和非癌性肝組織樣品中的至少10％Present指征以及癌性或非癌性肝組織樣品組中的至少40％Present指征為標(biāo)準(zhǔn)，選擇一組基因用于進(jìn)一步分析。(3)基于U95數(shù)據(jù)的平均差值，將該組基因分成兩組，一個(gè)高表達(dá)組和一個(gè)低表達(dá)組。高表達(dá)組含有在癌性和非癌性樣品中平均差值大于或等于5的基因。其余的基因被包含在低表達(dá)組中。對(duì)于高表達(dá)組來(lái)說(shuō)，平均差值被轉(zhuǎn)化成對(duì)數(shù)值，而對(duì)于低表達(dá)組來(lái)說(shuō)沒(méi)有轉(zhuǎn)化。對(duì)于U133數(shù)據(jù)，所有信號(hào)值都被轉(zhuǎn)化為對(duì)數(shù)值，而不考慮表達(dá)水平。(4)Analysis of Variance(ANOVA)方法被用于數(shù)據(jù)分析(Steel等，Principles and Procedures of StatisticsA Biome tricalApproach，Third Ed.，McGraw-Hill，1997)。在進(jìn)行最終分析前，排除法(leave-one-out)被用于外部(outlier)檢測(cè)。ANOVA分析中每次排除一個(gè)樣品來(lái)確定是否從分析中省略一個(gè)特定樣品對(duì)最終結(jié)果具有顯著影響。如果有影響，就從最終分析中排除那個(gè)特定樣品。外部檢測(cè)后，差異表達(dá)的p值小于或等于0.05的一列基因通過(guò)ANOVA來(lái)產(chǎn)生。來(lái)源于Affymetrix GeneChip U133芯片的數(shù)據(jù)也利用相似方法來(lái)分析。(5)另外兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)被用來(lái)減少基因列表中的得自U95的基因數(shù)目。首先，比較非癌性對(duì)照組樣品與癌癥組樣品之間的幾何平均值從而獲得一組表達(dá)水平提高或降低至少2倍的基因。其次，變化倍數(shù)值與p值的比例應(yīng)該為400或更高。
結(jié)果與分析
a)LBFL301基因家族
芯片數(shù)據(jù)的分析結(jié)果表明胃癌樣品與得自正常胃組織的樣品相比，標(biāo)記物L(fēng)BFL301的表達(dá)明顯上調(diào)了(13.75-倍；p＝0.0172)。這些數(shù)據(jù)表明LBFL301的上調(diào)可以被用于胃癌的診斷。
LBFL301(SEQ ID NO1或3)的表達(dá)水平可以分別采用AffymetrixGeneChipsU95和U133，通過(guò)利用序號(hào)為48774_at和225681_at的芯片序列片段來(lái)測(cè)定。不同惡性腫瘤中的48774_at和225681_at相對(duì)于正常對(duì)照組織的表達(dá)水平見(jiàn)表1a，其中還顯示了變化倍數(shù)和變化的趨勢(shì)(上調(diào)或下調(diào))。變化倍數(shù)大于1.5的被認(rèn)為是顯著的。
表1a Affy ID組織疾病形態(tài)學(xué)變化倍數(shù)趨勢(shì)T-Stat 48774_at骨頭，NOS惡性骨癌，NOS骨巨細(xì)胞瘤，NOS5.7上調(diào)3.5 225681_at乳房，NOS女性惡性乳腺癌，NOS浸潤(rùn)管癌3.4上調(diào)12.1 225681_at浸潤(rùn)管和小葉癌3.3上調(diào)3.3 225681_at浸潤(rùn)小葉癌2.8上調(diào)5.3 225681_at子 宮頸，NOS惡性子宮頸癌鱗狀細(xì)胞癌，NOS3.6上調(diào)3.4 225681_at結(jié)腸，NOS惡性結(jié)腸癌，NOS粘液性腺癌12.7上調(diào)2.5 225681_at腺癌，NOS6.9上調(diào)7.9 225681_at子宮內(nèi)膜，NOS惡性子宮內(nèi)膜癌米勒混合瘤11.0上調(diào)5.5腺癌，NOS2.2上調(diào)3.7 225681_at食管，NOS惡性食管癌，NOS腺癌，NOS7.2上調(diào)3.6 225681_at腎，NOS惡性腎癌，NOS透明細(xì)胞腺癌，NOS9.8上調(diào)5.4 225681_at維耳姆斯氏瘤7.2上調(diào)3.4 225681_at喉，NOS惡性喉癌，NOS鱗狀細(xì)胞瘤，NOS6.6上調(diào)4.3 225681_at肝臟，NOS繼發(fā)性惡性肝癌，NOS腺癌，NOS12.4上調(diào)3.5 225681_at肺，NOS惡性肺癌，NOS鱗狀細(xì)胞癌，NOS5.4上調(diào)5.4 225681_at腺癌，NOS4.4上調(diào)5.1 225681_at淋 巴結(jié)，NOS繼發(fā)性惡性淋巴結(jié)癌，NOS鱗狀細(xì)胞癌4.1上調(diào)2.7 225681_at惡性淋巴和組織細(xì)胞組織癌，NOS惡性淋巴瘤，NOS-4.3下調(diào)-3.2 225681_at網(wǎng)膜，NOS惡性網(wǎng)膜癌乳頭狀漿液腺癌7.2上調(diào)4.1 225681_at繼發(fā)性惡性網(wǎng)膜癌乳頭狀漿液腺癌4.8上調(diào)4.3 225681_at米勒混合瘤4.7上調(diào)11.0 225681_at卵惡性卵巢癌腺癌，NOS13.8上調(diào)2.6
225681_at 巢，NOS 漿液囊細(xì)胞腺癌， NOS 10.7 上調(diào) 2.8 225681_at 卵巢不明性質(zhì) 的癌 卵巢甲狀腺腫樣 瘤 9.5 上調(diào) 6.4 225681_at 惡性卵巢癌 乳頭狀漿液腺瘤 7.7 上調(diào) 3.7 225681_at 繼發(fā)性惡性卵 巢癌 腺癌，NOS 6.9 上調(diào) 3.7 225681_at 卵巢不明性質(zhì) 的癌 漿液囊細(xì)胞腺癌， 邊緣癌 5.3 上調(diào) 7.2 225681_at 胰 腺，NOS 惡性胰腺 癌，NOS 腺癌，NOS 7.8 上調(diào) 9.3 225681_at 直 腸，NOS 惡性直腸癌 腺癌，NOS 7.7 上調(diào) 5.8 225681_at 軟 組 織，NOS 結(jié)締組織和其 它軟組織不明 性質(zhì)的腫 瘤，NOS 纖維瘤 12.5 上調(diào) 7.6 225681_at 結(jié)締組織和其 它軟組織的繼 地性惡性 病，NOS 鱗狀細(xì)胞癌，NOS 5.3 上調(diào) 3.2 225681_at 結(jié)締組織和其 它軟組織的惡 性病，NOS 纖維組織細(xì)胞瘤， 惡性 3.7 上調(diào) 3.1 225681_at 胃，NOS 惡性胃癌，NOS 腺癌，NOS 3.6 上調(diào) 3.5 225681_at 印戒細(xì)胞癌 3.5 上調(diào) 4.5 225681_at 甲 狀 腺NOS 惡性甲狀腺癌 乳頭狀瘤，NOS 4.5 上調(diào) 4.1
表2列出了從利用Affymetrix GeneChip的實(shí)驗(yàn)中收集的組織類型差異表達(dá)數(shù)據(jù)。對(duì)芯片進(jìn)行掃描并利用相關(guān)專利申請(qǐng)60/331,182，60/388,745和60/390,608中記載的GX Scan算法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，其中所述專利申請(qǐng)的題目全部是“用于組織和采集得自具有綜合臨床特性的生物樣品的基因表達(dá)數(shù)據(jù)的基于自動(dòng)化計(jì)算機(jī)的數(shù)據(jù)處理法(An Automated Computer-based Algorithm for Organizing andMining Gene Expression Data Derived from Biological Sampleswith Complex Clinical Attributes)”，而且其全部?jī)?nèi)容被引入本文作參考。
表2-LBFL301(U9548774_at，U133225681_at)克隆AD12 & CH4
源自U95數(shù)據(jù)的48774_at 源自U133數(shù)據(jù)的225681_at
1.骨 升高 —
2.乳房 升高 升高
3.子宮頸 升高 升高
4.結(jié)腸 升高 升高
5.子宮內(nèi)膜 升高 升高
6.食道 升高 升高
7.腎 升高 升高
8.喉 升高 升高
9.肝臟 升高 升高
10.肺升高 升高
11.網(wǎng)膜 升高 升高
12.卵巢 升高 升高
13.胰腺 升高 升高
14.直腸 升高 升高
15.軟組織升高 升高
16.胃升高 升高
17.甲狀腺升高 升高
通過(guò)使樣品與芯片序列片段48774_at結(jié)合測(cè)定到的GeneChip表達(dá)結(jié)果由利用Taqman檢測(cè)物(Perkin-Elmer)的定量RT-PCR得到證實(shí)。在測(cè)定中使用了由特定的Affymetrix片段(48774_at)的sif序列設(shè)計(jì)的PCR引物。每個(gè)RNA樣品(10ng的總RNA)中的靶基因相對(duì)于外源性摻入(spike)的參比基因進(jìn)行分析。出于這一目的，四環(huán)素抗性基因被用作外源添加的摻入物。該方法提供了通過(guò)由靶mRNA的循環(huán)閾值(cycle threshold)(Ct)相對(duì)于恒定的Tet摻入物的Ct值測(cè)定的相對(duì)表達(dá)。樣品組包括用U95 GeneChip測(cè)定的正常胃組織和晚期胃癌組織RNA。另外，沒(méi)有用GeneChip分析的幾個(gè)新樣品被用于定量RT-PCR中以對(duì)表達(dá)進(jìn)行驗(yàn)證。Q-RT-PCR數(shù)據(jù)證實(shí)了晚期胃癌中觀察到的LBFL301的上調(diào)。
b)LBFL304基因家族
芯片數(shù)據(jù)的分析表明AGC樣品中的標(biāo)記物L(fēng)BFL304的表達(dá)與得自正常胃組織的樣品中的標(biāo)記物L(fēng)BFL304的表達(dá)相比被明顯地上調(diào)了(對(duì)于U95為3.5-倍，p＝2.54×10-3；對(duì)于U133為6.13-倍，p＝2.43×10-4)。該數(shù)據(jù)表明LBFL304的上調(diào)可被用于胃癌的診斷。
LBFL304(SEQ ID NO5，7，9或11)的表達(dá)水平可以通過(guò)利用Affymetrix GeneChipsU95上的序號(hào)為35832_at的芯片序列片段和利用Affymetrix GeneChipsU133上的序號(hào)為212344_at，212353_at和212354的芯片序列片段來(lái)測(cè)定。相對(duì)于正常對(duì)照組織，各種惡性腫瘤中的51263_at，212344_at，212353_at，和212354_at的表達(dá)水平被列于表1b，其中還顯示了變化倍數(shù)和變化趨勢(shì)(上調(diào)或下調(diào))。變化倍數(shù)大于1.5的被認(rèn)為是顯著的。
通過(guò)使樣品結(jié)合到序號(hào)為35832_at的芯片序列片段而測(cè)定的GeneChip表達(dá)結(jié)果通過(guò)利用Taqman分析法(Perkin-Elmer)的定量RT-PCR(Q-RT-PCR)得到了驗(yàn)證。由特定Affymetrix片段(35832_at)的序列信息文件設(shè)計(jì)的PCR引物被用于分析當(dāng)中。相對(duì)于外源加入的參比基因，檢測(cè)了每一RNA樣品(10ng總RNA)中的目標(biāo)基因。為了這個(gè)目的，將四環(huán)素抗性基因用作外源添加的摻入物。該方法提供了通過(guò)由靶mRNA的循環(huán)閾值(Ct)相對(duì)于恒定量的Tet摻入物的Ct而測(cè)定的相對(duì)表達(dá)。樣品組包括用U95 GeneChip測(cè)定的正常胃(Normal)組織和晚期胃癌(AGC)組織RNA。另外，沒(méi)有用GeneChip分析的幾個(gè)新樣品被用于通過(guò)Q-RT-PCR對(duì)表達(dá)進(jìn)行驗(yàn)證。相對(duì)于正常胃活檢組織樣品，Q-RT-PCR數(shù)據(jù)證實(shí)了AGC中觀察到的LBFL304的上調(diào)。
表1b 表1 Affy ID組織疾病形態(tài)學(xué)變化倍數(shù)趨勢(shì)T-Stat 212344_at骨頭，NOS惡性骨癌，NOS骨巨細(xì)胞瘤，NOS6.8上調(diào)6.9 212353_at惡性骨癌，NOS骨巨細(xì)胞瘤，NOS5.5上調(diào)5.7 212354_at惡性骨癌，NOS骨巨細(xì)胞瘤，NOS5.9上調(diào)7.1 35832_at惡性骨癌，NOS骨巨細(xì)胞瘤，NOS10.6上調(diào)5.7 212344_at結(jié)腸，NOS惡性結(jié)腸癌，NOS粘液性腺癌3.7上調(diào)2.8 212344_at惡性結(jié)腸癌，NOS腺癌，NOS2.7上調(diào)7.9 212353_at惡性結(jié)腸癌，NOS粘液性腺癌5.7上調(diào)3.7 212353_at惡性結(jié)腸癌，NOS腺癌，NOS4.1上調(diào)9.0 212354_at惡性結(jié)腸癌，NOS粘液性腺癌4.7上調(diào)3.5 212354_at惡性結(jié)腸癌，NOS腺癌，NOS3.0上調(diào)8.6 35832_at惡性結(jié)腸癌，NOS粘液性腺癌9.4上調(diào)3.8 35832_at惡性結(jié)腸癌，NOS腺癌，NOS6.5上調(diào)10.2
表1b表1 Affy ID組織疾病形態(tài)學(xué)變化倍數(shù)趨勢(shì)T-Stat 212344_at軟 組織，NOS結(jié)締組織和其它軟組織惡性癌，NOS纖維組織細(xì)胞癌，惡性的2.7上調(diào)3.2 212353_at結(jié)締組織和其它軟組織惡性癌，NOS纖維組織細(xì)胞癌，惡性的2.1上調(diào)2.2 212353_at結(jié)締組織和其它軟組織惡性癌，NOS粘液樣脂肉瘤-2.7下調(diào)-2.4 212354_at結(jié)締組織和其它軟組織惡性癌，NOS纖維組織細(xì)胞瘤，惡性的2.2上調(diào)2.6 35832_at結(jié)締組織和其它軟組織惡性癌，NOS纖維組織細(xì)胞瘤，惡性的3.5上調(diào)2.6 35822_at結(jié)締組織和其它軟組織惡性癌，NOS脂肪肉瘤，NOS4.8上調(diào)2.6 212344_at子宮內(nèi)膜，NOS惡性子宮內(nèi)膜癌米勒混合瘤2.4上調(diào)3.3 212344_at惡性子宮內(nèi)膜癌腺癌，NOS2.2上調(diào)5.5 212353_at惡性子宮內(nèi)膜癌米勒混合瘤1.9上調(diào)2.9 212353_at惡性子宮內(nèi)膜癌腺癌，NOS2.0上調(diào)4.2 212354_at惡性子宮內(nèi)膜癌米勒混合瘤2.0上調(diào)2.7 212354_at惡性子宮內(nèi)膜癌腺癌，NOS1.9上調(diào)4.7 35832_at惡性子宮內(nèi)膜癌米勒混合瘤3.0上調(diào)3.9 35832_at惡性子宮內(nèi)膜癌腺癌，NOS2.4上調(diào)4.7 212344_at食管，NOS惡性食管癌，NOS腺癌，NOS1.7上調(diào)2.3 212353_at惡性食管癌，NOS腺癌，NOS5.5上調(diào)3.2 212354_at惡性食管癌，NOS腺癌，NOS2.9上調(diào)3.1 35832_at惡性食管癌，NOS腺癌，NOS10.7上調(diào)3.2
212344_at 乳房 ，NOS 女性惡性乳腺 癌，NOS 粘液性腺癌 3.3 上調(diào) 4.8 212344_at 女性惡性乳腺 癌，NOS 浸潤(rùn)小葉癌 1.6 上調(diào) 2.9 212344_at 女性惡性乳腺 癌，NOS 浸潤(rùn)管癌 2.5 上調(diào) 8.7 212344_at 女性惡性乳腺 癌，NOS 浸潤(rùn)管和小葉 癌 2.6 上調(diào) 2.8 212353_at 女性惡性乳腺 癌，NOS 浸潤(rùn)小葉癌 2.8 上調(diào) 4.7 212354_at 女性惡性乳腺 癌，NOS 浸潤(rùn)管癌 3.9 上調(diào) 13.0 212353_at 女性惡性乳腺 癌，NOS 浸潤(rùn)管和小葉 癌 3.4 上調(diào) 3.7 212354_at 女性惡性乳腺 癌，NOS 浸潤(rùn)小葉癌 1.7 上調(diào) 3.1 212354_at 女性惡性乳腺 癌，NOS 浸潤(rùn)管癌 2.6 上調(diào) 8.5 212354_at 女性惡性乳腺 癌，NOS 浸潤(rùn)管和小葉 癌 2.7 上調(diào) 2.6 35832_at 女性惡性乳腺 癌，NOS 粘液性腺癌 4.0 上調(diào) 5.5 35832_at 女性惡性乳腺 癌，NOS 浸潤(rùn)小葉癌 3.2 上調(diào) 4.4 35832_at 女性惡性乳腺 癌，NOS 浸潤(rùn)管癌 4.5 上調(diào) 12.0 35832_at 女性惡性乳腺 癌，NOS 浸潤(rùn)管和小葉 癌 4.3 上調(diào) 4.5 212353_at 腎，NOS 惡性腎癌，NOS 透明細(xì)胞腺 癌，NOS 2.8 上調(diào) 5.5 212354_at 惡性腎癌，NOS 透明細(xì)胞腺 癌，NOS 2.4 上調(diào) 5.3 35832_at 惡性腎癌，NOS 透明細(xì)胞腺 癌，NOS 6.1 上調(diào) 5.6
212344_at 喉，NOS 惡性喉癌，NOS 鱗狀細(xì)胞腺 癌，NOS 3.0 上調(diào) 3.3 212353_at 惡性喉癌，NOS 鱗狀細(xì)胞 癌，NOS 5.1 上調(diào) 3.8 212354_at 惡性喉癌，NOS 鱗狀細(xì)胞 癌，NOS 3.7 上調(diào) 3.6 35832_at 惡性喉癌，NOS 鱗狀細(xì)胞 癌，NOS 7.2 上調(diào) 3.7 212344_at 肺，NOS 惡性肺癌，NOS 癌，NOS 4.1 上調(diào) 3.9 212344_at 惡性肺癌，NOS 鱗狀細(xì)胞 癌，NOS 3.1 上調(diào) 5.8 212344_at 惡性肺癌，NOS 巨細(xì)胞癌，NOS 2.7 上調(diào) 2.5 212344_at 惡性肺癌，NOS 腺癌，NOS 2.8 上調(diào) 6.2 212353_at 惡性肺癌，NOS 癌，NOS 4.1 上調(diào) 3.2 212353_at 惡性肺癌，NOS 鱗狀細(xì)胞 癌，NOS 3.6 上調(diào) 6.5 212353_at 惡性肺癌，NOS 巨細(xì)胞癌，NOS 3.8 上調(diào) 2.7 212353_at 惡性肺癌，NOS 腺癌，NOS 3.6 上調(diào) 6.9 212354_at 惡性肺癌，NOS 癌，NOS 3.5 上調(diào) 2.9 212354_at 惡性肺癌，NOS 鱗狀細(xì)胞 癌，NOS 3.1 上調(diào) 5.6 212354_at 惡性肺癌，NOS 巨細(xì)胞癌，NOS 2.9 上調(diào) 2.6 212354_at 惡性肺癌，NOS 腺癌，NOS 2.9 上調(diào) 6.2 35832_at 惡性肺癌，NOS 鱗狀細(xì)胞 癌，NOS 8.8 上調(diào) 6.0 35832_at 惡性肺癌，NOS 腺癌，NOS 8.9 上調(diào) 7.2 212344_at 卵 巢，NOS 惡性卵巢癌 乳頭狀漿液腺 癌 3.0 上調(diào) 3.9 212353_at 惡性卵巢癌 乳頭狀漿液腺 癌 3.6 上調(diào) 3.9 212354_at 惡性卵巢癌 乳頭狀漿液腺 癌 2.6 上調(diào) 3.4 212344_at 胰 腺，NOS 惡性胰腺癌，NOS 腺癌，NOS 6.9 上調(diào) 9.0 212353_at 惡性胰腺癌，NOS 腺癌，NOS 7.8 上調(diào) 11.2 212354_at 惡性胰腺癌，NOS 腺癌，NOS 8.6 上調(diào) 11.0
35832_at 惡性胰腺癌，NOS 腺癌，NOS 99.8 上調(diào) 11.1 212353_at 前列 腺，NOS 惡性前列腺癌 非典型疑似惡 性 -2.2 下調(diào) -4.7 212353_at 惡性前列腺癌 腺癌，NOS -1.5 下調(diào) -2.5 212354_at 惡性前列腺癌 非典型疑似惡 性 -1.8 下調(diào) -3.8 212354_at 惡性前列腺癌 腺癌，NOS -1.7 下調(diào) -3.8 35832_at 惡性前列腺癌 非典型疑似惡 性 -4.3 下調(diào) -4.4 35832_at 惡性前列腺癌 腺癌，NOS -1.7 下調(diào) -2.6 212344_at 直 腸，NOS 惡性直腸癌 腺癌，NOS 3.0 上調(diào) 6.9 212353_at 惡性直腸癌 腺癌，NOS 4.1 上調(diào) 7.6 212354_at 惡性直腸癌 腺癌，NOS 3.0 上調(diào) 7.2 35832_at 惡性直腸癌 腺癌，NOS 5.4 上調(diào) 8.8 212344_at 皮 膚，NOS 惡性皮膚癌，NOS 鱗狀細(xì)胞 癌，NOS 2.8 上調(diào) 2.4 212353_at 惡性皮膚癌，NOS 鱗狀細(xì)胞 癌，NOS 3.5 上調(diào) 2.4 35832_at 惡性皮膚癌，NOS 基底細(xì)胞 癌，NOS 3.6 上調(diào) 2.5 35832_at 惡性皮膚癌，NOS 鱗狀細(xì)胞 癌，NOS 5.5 上調(diào) 3.0 212344_at 胃，NOS 惡性胃癌，NOS 粘液性腺癌 7.6 上調(diào) 3.1 212344_at 惡性胃癌，NOS 印戒細(xì)胞癌 3.9 上調(diào) 2.4 212344_at 惡性胃癌，NOS 腺癌，NOS 2.5 上調(diào) 4.9 212353_at 惡性胃癌，NOS 粘液性腺癌 11.0 上調(diào) 3.7 212353_at 惡性胃癌，NOS 印戒細(xì)胞癌 4.9 上調(diào) 2.9 212353_at 惡性胃癌，NOS 腺癌，NOS 3.4 上調(diào) 5.6 212354_at 惡性胃癌，NOS 粘液性腺癌 7.5 上調(diào) 3.2 212354_at 惡性胃癌，NOS 印戒細(xì)胞癌 3.7 上調(diào) 2.4 212354_at 惡性胃癌，NOS 腺癌，NOS 2.7 上調(diào) 5.1 35832_at 惡性胃癌，NOS 印戒細(xì)胞癌 8.4 上調(diào) 3.4 35832_at 惡性胃癌，NOS 腺癌，NOS 8.6 上調(diào) 6.7 212344_at 睪 丸，NOS 惡性睪丸癌，NOS 混合型生殖細(xì) 胞瘤 2.0 上調(diào) 2.4
212353_at 惡性睪丸癌，NOS 混合型生殖細(xì) 胞瘤 4.1 上調(diào) 2.8 212354_at 惡性睪丸癌，NOS 混合型生殖細(xì) 胞瘤 3.4 上調(diào) 2.6 212353_at 網(wǎng) 膜，NOS 惡性網(wǎng)膜癌 乳頭狀漿液腺 癌 1.7 上調(diào) 2.6 35832_at 甲 狀 腺，NOS 惡性甲狀腺癌 乳頭狀瘤，NOS 2.5 上調(diào) 2.5 35832_at 子 宮 頸，NOS 惡性子宮頸癌 鱗狀細(xì)胞 癌，NOS 3.5 上調(diào) 2.3
c)LBFL305基因家族
芯片數(shù)據(jù)的分析表明胃癌樣品中的標(biāo)記物L(fēng)BFL305的表達(dá)與得自正常胃組織的樣品中的標(biāo)記物L(fēng)BFL305的表達(dá)相比被明顯地上調(diào)了(2.2-倍，p＝0.0051，利用U95 GeneChip；2.14-倍，p＝0.0109，利用U133 GeneChip)。該數(shù)據(jù)表明LBFL305的上調(diào)可被用于胃癌的診斷。
LBFL305(SEQ ID NO13)的表達(dá)水平可以通過(guò)分別利用AffymetrixGeneChipsU95和U133上的序號(hào)為53858_at和225364_at的芯片序列來(lái)測(cè)定。從利用Affymetrix GeneChips的實(shí)驗(yàn)收集通過(guò)組織類型進(jìn)行差異表達(dá)的數(shù)據(jù)并利用GX Scan算法對(duì)這些數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，GXScan算法被記載在相關(guān)專利申請(qǐng)60/331,182，60/388,745和60/390,608中，其中所述專利申請(qǐng)的題目全部是“用于組織和采集得自具有綜合臨床特性的生物樣品的基因表達(dá)數(shù)據(jù)的基于自動(dòng)化計(jì)算機(jī)的數(shù)據(jù)處理法(An Automated Computer-based Algorithm forOrganizing and Mining Gene Expression Data Derived fromBiological Samples with Complex Clinical Attributes)”，而且其全部?jī)?nèi)容被引入本文作參考。相對(duì)于正常對(duì)照組織，各種惡性腫瘤中的53858_at和225364_at的表達(dá)水平被列于表1c，其中還顯示了變化倍數(shù)和變化趨勢(shì)(上調(diào)或下調(diào))。變化倍數(shù)大于1.5的被認(rèn)為是顯著的。
表1c Affy ID組織疾病形態(tài)學(xué) 變化 倍數(shù)趨勢(shì)T-Stat 53858_at膀胱，NOS女性惡性膀胱癌，NOS過(guò)渡細(xì)胞癌，NOS 1.691上調(diào)2.377 53858_at乳房，NOS女性惡性乳腺癌，NOS浸潤(rùn)管癌 1.538上調(diào)6.824 53858_at女性惡性乳腺癌，NOS浸潤(rùn)管和小葉癌 1.599上調(diào)2.408 225364_at女性惡性乳腺癌，NOS浸潤(rùn)管和小葉癌 1.525上調(diào)3.251 53858_at子宮頸，NOS惡性子宮頸癌鱗狀細(xì)胞癌，NOS 1.637上調(diào)4.056 53858_at子宮內(nèi)膜，NOS惡性子宮內(nèi)膜癌米勒混合瘤 1.548上調(diào)2.647 53858_at食管，NOS惡性食管癌，NOS腺癌，NOS 2.079上調(diào)3.145 225364_at惡性食管癌，NOS腺癌，NOS 1.615上調(diào)2.915 53858_at腎，NOS惡性腎癌，NOS腎細(xì)胞癌 1.864上調(diào)6.093 53858_at惡性腎癌，NOS透明細(xì)胞腺癌，NOS 2.167上調(diào)6.877 225364_at惡性腎癌，NOS腎細(xì)胞癌 1.593上調(diào)5.045 225364_at惡性腎癌，NOS透明細(xì)胞腺癌，NOS 1.683上調(diào)7.924 225364_at肺，NOS惡性肺癌，NOS小細(xì)胞癌，NOS -1.79下調(diào)-7.071 53858_at淋巴結(jié)，NOS何杰金氏病，多位點(diǎn)淋巴結(jié)的NOS何杰金氏病，NOS 1.539上調(diào)2.519 53858_at惡性淋巴和組織細(xì)胞組織瘤惡性淋巴癌，NOS 1.635上調(diào)3.243 53858_at胰腺，NOS惡性胰島癌島細(xì)胞癌 3.845上調(diào)7.929 53858_at惡性胰腺癌，NOS腺癌，NOS 4.171上調(diào)7.165 225364_at惡性胰島癌島細(xì)胞癌 2.343上調(diào)3.551 225364_at惡性胰腺癌，NOS腺癌，NOS 2.278上調(diào)10.793 225364_at前列腺，NOS惡性前列腺癌非典型疑性惡性 -1.641下調(diào)-4.8 53858_at直腸，NOS惡性直腸癌腺癌，NOS 1.935上調(diào)5.416
53858_at小腸，NOS惡性淋巴癌，未確定的，結(jié)節(jié)外的或?qū)嶓w器官位點(diǎn)的NOS惡性淋巴癌，NOS 3.935上調(diào)3.535 225364_at惡性淋巴癌，未確定的，結(jié)節(jié)外的或?qū)嶓w器官位點(diǎn)的NOS惡性淋巴癌，NOS 3.024上調(diào)3.816 53858_at胃，NOS惡性胃癌，NOS印戒細(xì)胞癌 1.507上調(diào)2.46 53858_at惡性胃癌，NOS腺癌，NOS 2.076上調(diào)5.928 225364_at惡性胃癌，NOS印戒細(xì)胞癌 1.524上調(diào)3.076 225364_at惡性胃癌，NOS腺癌，NOS 1.637上調(diào)6.053 225364_at甲狀腺，NOS惡性淋巴癌，未確定的，結(jié)節(jié)外的或?qū)嶓w器官位點(diǎn)的NOS惡性淋巴癌，NOS 4.371上調(diào)9.429 225364_at惡性甲狀腺癌乳頭狀癌，NOS 1.634上調(diào)3.22 53858_at女陰，NOS惡性女陰癌，NOS鱗狀細(xì)胞癌，NOS 1.505上調(diào)2.596
通過(guò)使樣品結(jié)合到序號(hào)為53858_at的芯片序列片段而測(cè)定的GeneChip表達(dá)結(jié)果通過(guò)利用Taqman分析法(Perkin-Elmer)的定量RT-PCR(Q-RT-PCR)得到了驗(yàn)證。由特定Affymetrix片段(53858_at)的序列信息文件設(shè)計(jì)的PCR引物被用于分析當(dāng)中。每個(gè)RNA樣品(10ng的總RNA)中的靶基因相對(duì)于外源摻入的參比基因進(jìn)行分析。出于這一目的，四環(huán)素抗性基因被用作外源添加的摻入物。該方法提供了通過(guò)由靶mRNA的循環(huán)閾值(Ct)相對(duì)于恒定量的Tet摻入物的Ct而測(cè)定的相對(duì)表達(dá)。樣品組包括用U95 GeneChip測(cè)定的正常胃組織和晚期胃癌組織RNA。另外，沒(méi)有用GeneChip分析的幾個(gè)新樣品被用于通過(guò)定量RT-PCR對(duì)表達(dá)進(jìn)行的驗(yàn)證。Q-RT-PCR數(shù)據(jù)證實(shí)了晚期胃癌中觀察到的LBFL305的上調(diào)。
d)LBFL306基因家族
芯片數(shù)據(jù)的分析表明胃癌樣品中的標(biāo)記物L(fēng)BFL306的表達(dá)與得自正常胃組織的樣品中的標(biāo)記物L(fēng)BFL306的表達(dá)相比被明顯地上調(diào)了(3.27-倍，p＝0.00217，利用U133 GeneChip)。該數(shù)據(jù)表明LBFL306的上調(diào)可被用于胃癌的診斷。
LBFL306(SEQ ID NO17，19或21)的表達(dá)水平可以通過(guò)分別利用Affymetrix GeneChipsU95和U133上的序號(hào)為57861_at和223251_s_at的芯片序列片段來(lái)測(cè)定。從利用Affymetrix GeneChips的實(shí)驗(yàn)收集通過(guò)組織類型進(jìn)行差異表達(dá)的數(shù)據(jù)并利用GX Scan算法對(duì)這些數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，GX Scan算法被記載在相關(guān)專利申請(qǐng)60/331,182，60/388,745和60/390,608中，其中所述專利申請(qǐng)的題目全部是“用于組織和采集得自具有綜合臨床特性的生物樣品的基因表達(dá)數(shù)據(jù)的基于自動(dòng)化計(jì)算機(jī)的數(shù)據(jù)處理法(An Automated Computer-basedAlgorithm for Organizing and Mining Gene Expression DataDerived from Biological Samples with Complex ClinicalAttributes)”，而且其全部?jī)?nèi)容被引入本文作為參考。相對(duì)于正常對(duì)照組織，各種惡性腫瘤中的223251_at的表達(dá)水平被列于表1d，其中還顯示了變化倍數(shù)和變化趨勢(shì)(上調(diào)或下調(diào))。變化倍數(shù)大于1.5的被認(rèn)為是顯著的。所述數(shù)據(jù)表明除了胃癌外，膀胱癌、結(jié)腸癌、食道癌、腎癌、網(wǎng)膜癌、胰腺癌、直腸癌和軟組織癌中的LBFL306的表達(dá)也被上調(diào)了，并且這種基因家族的表達(dá)在乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌和小腸癌中被下調(diào)了。
序列為SEQ ID NO17或19或21的全長(zhǎng)cDNA通過(guò)利用GeneTrappercDNA Positive Selection System Kits(Invitrogen)而獲得。所獲得的cDNA被轉(zhuǎn)化成雙鏈質(zhì)粒DNA，該雙鏈質(zhì)粒DNA被用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌細(xì)胞(DH10B)，并篩選出最長(zhǎng)的cDNA。通過(guò)利用基因-特異性引物由PCR證實(shí)了陽(yáng)性篩選后，對(duì)cDNA克隆進(jìn)行DNA測(cè)序。
進(jìn)行RNA印跡分析來(lái)測(cè)定對(duì)應(yīng)于LBFL306的mRNA轉(zhuǎn)錄物大小。使用了含有得自各種人組織的總RNA的RNA印跡物(ClonTech H12)，并且通過(guò)隨機(jī)引物法對(duì)LBFL306-GE2(SEQ ID NO21)進(jìn)行放射性標(biāo)記后用于探測(cè)印跡物。這些印跡物在65℃下于Church和Gilbert緩沖液中進(jìn)行雜交并在室溫下用含0.1％SDS的0.1×SSC沖洗。RNA印跡顯示了該基因的具有約1.5kb大小的單一轉(zhuǎn)錄物。這對(duì)應(yīng)于全長(zhǎng)克隆中的插入物的大小，其也為約1.5kb。
通過(guò)使樣品結(jié)合到序號(hào)為223251_s_at的芯片序列片段而測(cè)定的GeneChip表達(dá)結(jié)果通過(guò)利用Taqman分析法(Perkin-Elmer)的定量RT-PCR(Q-RT-PCR)得到了驗(yàn)證。由特定Affymetrix片段(223251_s_at)的序列信息文件設(shè)計(jì)的PCR引物被用于分析中。每個(gè)RNA樣品(10ng的總RNA)中的靶基因相對(duì)于外源摻入的參比基因進(jìn)行分析。出于這一目的，四環(huán)素抗性基因被用作外源添加的摻入物。該方法提供了通過(guò)由靶mRNA的循環(huán)閾值(Ct)相對(duì)于恒定量的Tet摻入物的Ct而測(cè)定的相對(duì)表達(dá)。樣品組包括用U133 GeneChip測(cè)定的正常胃組織和晚期胃癌組織RNA。另外，沒(méi)有用GeneChip分析的幾個(gè)新樣品被用于通過(guò)Q-RT-PCR對(duì)表達(dá)進(jìn)行的驗(yàn)證。Q-RT-PCR數(shù)據(jù)證實(shí)了晚期胃癌中觀察到的LBFL306的上調(diào)。
表1d 芯片位置號(hào)組織疾病形態(tài)學(xué)變化倍數(shù)趨勢(shì)T-Stat 223251_s_at膀胱，NOS膀胱惡性腫瘤，NOS過(guò)渡細(xì)胞癌，NOS1.649上調(diào)2.572 223251_s_at乳房，NOS女性乳腺惡性腫瘤，NOS管內(nèi)癌，NOS-1.701下調(diào)-5.202 223251_s_at結(jié)腸，NOS結(jié)腸惡性腫瘤，NOS腺癌，NOS2.651上調(diào)8.164 223251_s_at子宮內(nèi)膜，NOS子宮內(nèi)膜惡性腫瘤米勒混合腫瘤-1.806下調(diào)-2.367 223251_s_at食道，NOS食管惡性腫瘤，NOS腺癌，NOS5.016上調(diào)4.269 223251_s_at腎，NOS腎惡性腫瘤，NOS過(guò)渡細(xì)胞癌，NOS1.755上調(diào)4.563 223251_s_at腎惡性腫瘤，NOS透明細(xì)胞腺癌，NOS1.611上調(diào)4.054 223251_s_at腎惡性腫瘤，NOS Wilm′s腫瘤4.565上調(diào)3.891 223251_s_at網(wǎng)膜，NOS網(wǎng)膜惡性腫瘤乳頭狀漿液腺癌1.762上調(diào)3.398 223251s_at胰腺，NOS胰腺惡性腫瘤，NOS腺癌，NOS2.672上調(diào)7.13 223251_s_at直腸，NOS直腸惡性腫瘤腺癌，NOS2.482上調(diào)6.042 223251_s_at小腸，NOS小腸惡性腫瘤，NOS肉瘤，NOS-1.944下調(diào)-5.716
223251_s_at軟組織，NOS結(jié)締組織和其它軟組織的惡性腫瘤，NOS粘液性脂肉瘤 1.878上調(diào)3.894 223251_s_at胃，NOS胃惡性腫瘤，NOS腺癌，NOS 2.522上調(diào)5.101
實(shí)施例2
對(duì)應(yīng)于差異表達(dá)的mRNA品種的全長(zhǎng)人cDNA(LBFL301，LBFL304，LBFL305和LBFL306)的克隆
通過(guò)寡核苷酸-牽引(oligo-pulling)法獲得序列為SEQ ID NO1，3，5，7，9，11，13，17，19或21的全長(zhǎng)cDNA。簡(jiǎn)要地說(shuō)，在LBFL301，LBFL304，LBFL305或LBFL306的序列基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)基因-特異性寡核苷酸。該寡核苷酸被標(biāo)記上生物素后按照Sambrook等的方法與2μg的單鏈質(zhì)粒DNA(cDNA重組體)進(jìn)行雜交，其中所述單鏈質(zhì)粒DNA得自完全分化的胃腺癌文庫(kù)(NCI CGAP Gas 4)或由Jurkat細(xì)胞制備的文庫(kù)。利用結(jié)合了鏈霉親和素的珠子分離所述雜交cDNA并通過(guò)加熱洗脫。洗脫下來(lái)的cDNA被轉(zhuǎn)化成雙鏈質(zhì)粒DNA并被用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌細(xì)胞(DH10B)，篩選出最長(zhǎng)的cDNA。利用基因-特異性引物證實(shí)陽(yáng)性篩選后，對(duì)所述cDNA克隆進(jìn)行DNA測(cè)序。
對(duì)應(yīng)于以上檢測(cè)的差異調(diào)控的mRNA的全長(zhǎng)人cDNA的核苷酸序列如SEQ ID NOS1，3，5，7，9，11，13，17，19和21所示。在SEQID NO 1中，所述cDNA含1272個(gè)堿基對(duì)(1255個(gè)堿基對(duì)和一個(gè)多聚腺苷酸尾)。在SEQ ID NO 3中，cDNA含1355個(gè)堿基對(duì)(1334個(gè)堿基對(duì)和一個(gè)多聚腺苷酸尾)。LBFL304具有幾個(gè)可能的啟動(dòng)密碼子，并且它們被命名為SEQ ID NOS5，7，9和11。SEQ ID NO13中的cDNA含6405個(gè)堿基對(duì)(6369個(gè)堿基對(duì)和一個(gè)多聚腺苷酸尾)。與SEQ IDNO17對(duì)應(yīng)的cDNA含1299個(gè)堿基對(duì)(1284個(gè)堿基對(duì)和一個(gè)多聚腺苷酸尾)。與SEQ ID NO19對(duì)應(yīng)的cDNA含2451個(gè)堿基對(duì)(2435個(gè)堿基對(duì)和一個(gè)多聚腺苷酸尾)。與SEQ ID NO21對(duì)應(yīng)的cDNA含1194個(gè)堿基對(duì)(1178個(gè)堿基對(duì)和一個(gè)多聚腺苷酸尾)。
SEQ ID NO1所示的cDNA核苷酸序列內(nèi)的可讀框位于第131-859位核苷酸(131-862位含終止密碼子)，編碼243個(gè)氨基酸的蛋白。對(duì)應(yīng)于由SEQ ID NO1編碼的預(yù)測(cè)蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO2所示。
SEQ ID NO3所示的cDNA核苷酸序列內(nèi)的可讀框位于第174-584位核苷酸(174-587位含終止密碼子)，編碼137個(gè)氨基酸的蛋白。對(duì)應(yīng)于由SEQ ID NO3編碼的預(yù)測(cè)蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO4所示。SEQ ID NO4的蛋白序列與SEQ ID NO2的蛋白序列在前124個(gè)氨基酸上相同，而SEQ ID NO4的最后13個(gè)氨基酸是獨(dú)特的。如圖1所示，與SEQ ID NO4對(duì)應(yīng)的蛋白序列的終端是由45-bp插入子產(chǎn)生，所述插入子在可讀框中引進(jìn)了終止密碼子。
SEQ ID NO2和4稍微類似于胰凝乳蛋白酶絲氨酸蛋白酶家族基序(signature)(S1)和NUDIX水解酶家族基序。胰凝乳蛋白酶絲氨酸蛋白酶家族基序(S1)含有三個(gè)區(qū)域，第三個(gè)區(qū)域不存在于SEQ ID NO4中。另外，兩種蛋白都含有膠原三螺旋重復(fù)區(qū)域。
圖2和3表示對(duì)SEQ ID NO2和4的氨基酸序列的疏水性進(jìn)行分析的結(jié)果。如上所述，親水性區(qū)域可被用來(lái)制備抗原肽。兩個(gè)序列都具有疏水性的N-端，約30個(gè)氨基酸長(zhǎng)度，最強(qiáng)疏水性部分集中在第20位氨基酸的附近。由SPScan(GCG Wisconsin Package)進(jìn)行的進(jìn)一步的蛋白序列分析展示出由1-30位氨基酸形成的疏水區(qū)域似乎就是分泌信號(hào)肽。
SEQ ID NO5所示的cDNA核苷酸序列內(nèi)的可讀框位于第38-892位核苷酸(38-895位含終止密碼子)，編碼285個(gè)氨基酸的蛋白。對(duì)應(yīng)于由SEQ ID NO5編碼的預(yù)測(cè)蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO6所示。SEQ ID NO6稍微類似于胰凝乳蛋白酶絲氨酸蛋白酶家族基序(S1)。圖4表示對(duì)SEQ ID NO6的氨基酸序列的疏水性進(jìn)行分析的結(jié)果。如上所述，親水性區(qū)域可被用來(lái)制備抗原肽。
SEQ ID NO7所示的cDNA核苷酸序列內(nèi)的可讀框位于第53-892位核苷酸(53-895位含終止密碼子)，編碼280個(gè)氨基酸的蛋白。對(duì)應(yīng)于由SEQ ID NO7編碼的預(yù)測(cè)蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO8所示。SEQ ID NO8的蛋白序列與SEQ ID NO6的蛋白序列相同， 但是SEQ ID NO8缺乏SEQ ID NO6的N-端的頭五個(gè)氨基酸。
SEQ ID NO9所示的cDNA核苷酸序列內(nèi)的可讀框位于第65-892位核苷酸(65-895位含終止密碼子)，編碼276個(gè)氨基酸的蛋白。對(duì)應(yīng)于由SEQ ID NO9編碼的預(yù)測(cè)蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO10所示。SEQ ID NO10的蛋白序列與SEQ ID NO6的蛋白序列相同，但是SEQ ID NO10缺乏SEQ ID NO6的N-端的頭九個(gè)氨基酸。
SEQ ID NO11所示的cDNA核苷酸序列內(nèi)的可讀框位于第92-892位核苷酸(92-895位含終止密碼子)，編碼267個(gè)氨基酸的蛋白。對(duì)應(yīng)于由SEQ ID NO11編碼的預(yù)測(cè)蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO12所示。SEQ ID NO12的蛋白序列與SEQ ID NO6的蛋白序列相同，但是SEQ ID NO12缺乏SEQ ID NO6的N-端的頭18個(gè)氨基酸。
SEQ ID NO13所示的cDNA核苷酸序列內(nèi)的可讀框位于第49-1434位核苷酸(49-1437位含終止密碼子)，編碼462個(gè)氨基酸的蛋白。對(duì)應(yīng)于由SEQ ID NO13編碼的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO14所示。
BLAST檢索結(jié)果和兩個(gè)序列間的高度同源性表明LBFL305是Mst1的(例如，SEQ ID NO16的)剪接變體。比對(duì)序列的下劃線氨基酸殘基表示SEQ ID NO14與SEQ ID NO18之間的差異?；贛st1的公開的研究，SEQ ID NO14含有激酶區(qū)域(氨基酸位點(diǎn)1-299)(Creasy等，(1996)J Biol Chem 27121049-21053)，接下來(lái)的是調(diào)節(jié)激酶功能的調(diào)控區(qū)域(氨基酸位點(diǎn)300-462)(Creasy等，(1996)JBiol Chem 27121049-21053)。在氨基酸位點(diǎn)326-327與349-350之間(Graves等，(2001)J Biol Chem 27614909-14915)還存在兩個(gè)caspase裂解位點(diǎn)，和一個(gè)NES域(氨基酸位點(diǎn)361-370)(Ura等，(2002)Proc Nat1 Acad Sci USA 9810148-10153)。與SEQ ID NO16相比，SEQ ID NO14缺失了第二個(gè)NES域(SEQ ID NO16中的氨基酸位點(diǎn)441-451)(Ura等，(2002)Proc Nat1 Acad Sci USA 9810148-10153)。而且，SEQ ID NO14不含自身締合所需的多聚化區(qū)域(Mst1中的氨基酸位點(diǎn)431-4871)(Creasy等，(1996)J Biol Chem27121049-21053)。有趣地是，與NORE(一種假設(shè)的Ras效應(yīng)物)發(fā)生相互作用所需的Mst1中的區(qū)域(SEQ ID NO16中的氨基酸位點(diǎn)449-487)(Khokh1atchev等，Curr Biol 12253-265)不存在于SEQ IDNO14中。
圖5表示對(duì)SEQ ID NO14所示氨基酸序列進(jìn)行疏水性分析的結(jié)果。如上所述，親水區(qū)域可以被用來(lái)制備抗原肽。
SEQ ID NO17所示的cDNA核苷酸序列內(nèi)的可讀框位于第75-572位核苷酸(75-575位含終止密碼子)，編碼166個(gè)氨基酸的蛋白。對(duì)應(yīng)于由SEQ ID NO17編碼的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO18所示。圖7表示對(duì)SEQ ID NO18所示氨基酸序列進(jìn)行疏水性分析的結(jié)果。如上所述，親水區(qū)域可以被用來(lái)制備抗原肽。
SEQ ID NO19所示的cDNA核苷酸序列內(nèi)的可讀框位于第78-1337位核苷酸(78-1340位含終止密碼子)，編碼420個(gè)氨基酸的蛋白。對(duì)應(yīng)于由SEQ ID NO19編碼的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO20所示。圖8表示對(duì)SEQ ID NO20所示氨基酸序列進(jìn)行疏水性分析的結(jié)果。如上所述，親水區(qū)域可以被用來(lái)制備抗原肽。
SEQ ID NO21所示的cDNA核苷酸序列內(nèi)的可讀框位于第78-737位核苷酸(78-740位含終止密碼子)，編碼220個(gè)氨基酸的蛋白。對(duì)應(yīng)于由SEQ ID NO21編碼的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO22所示。圖9表示對(duì)SEQ ID NO22所示氨基酸序列進(jìn)行疏水性分析的結(jié)果。如上所述，親水區(qū)域可以被用來(lái)制備抗原肽。
利用GCG Wisconsin軟件包通過(guò)hmmerpfam確定全部三個(gè)LBFL306克隆，即EF3(SEQ ID NO17)，GC7(SEQ ID NO19)和GE2(SEQ ID NO21)都含多個(gè)錨蛋白重復(fù)序列。所述錨蛋白重復(fù)序列是從EF3，GC7和GE2中的氨基酸殘基57至89，91至123和124至156。除了這三個(gè)錨蛋白重復(fù)序列，GC7還含從157至190的另一個(gè)錨蛋白重復(fù)子。
通過(guò)進(jìn)行RNA印跡分析來(lái)確定對(duì)應(yīng)于LBFL301，LBFL304和LBFL305的mRNA轉(zhuǎn)錄物的大小。采用含有源自各種人體組織的總RNA的RNA印跡物(ClonTech)，而且克隆CH4(SEQ ID NO3)、克隆EA10(SEQ ID NO5，7，9或11)和LBFL305(SEQ ID NO13)通過(guò)隨機(jī)引物法被放射性標(biāo)記后用于探測(cè)所述印跡物。所述印跡物在65℃下于Church和Gilbert緩沖液中進(jìn)行雜交，然后在室溫下用含0.1％SDS的0.1×SSC緩沖液沖洗。RNA印跡分析結(jié)果顯示了每個(gè)基因的單個(gè)轉(zhuǎn)錄物，大小約為1.57kb(LBFL301)，2.6kb(LBFL304)和7.95kb(LBFL305)。這與克隆CH4(1.355kb)，克隆EA10(SEQID NO5，7，9或11)和LBFL305(6.5kb)中的插入物大小相對(duì)應(yīng)。當(dāng)克隆AD12(SEQ ID NO1)的序列被用作探針時(shí)，檢測(cè)到了1.44kb的轉(zhuǎn)錄物，其對(duì)應(yīng)于克隆AD12中插入物的大小，即1.272kb。
為了檢測(cè)各種正常組織中的LBFL301，LBFL304，LBFL305或LBFL306的表達(dá)，按照以下方法制備電子RNA印跡(e-Northern)。利用實(shí)施例1中的芯片和方法，將如表3中所示的得自一組正常組織的mRNA雜交到Affymetrix U95 human GeneChip上。這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果被列于表3中。針對(duì)每種組織類型，被注明有或無(wú)的樣品數(shù)目與樣品組中樣品的總數(shù)目一起列了出來(lái)。另外，列出了每種組織類型中的中值和25％和75％的點(diǎn)。有趣地是，盡管該基因在胃癌中是上調(diào)的，但是在大多數(shù)正常胃組織樣品中沒(méi)能檢測(cè)到LBFL301或LBFL304的表達(dá)。另外，盡管在檢測(cè)的大多數(shù)正常胃組織樣品中發(fā)現(xiàn)了LBFL305和LBFL306，但是表達(dá)水平比大多數(shù)其它被檢測(cè)的正常胃組織中的表達(dá)水平低。如下所述，這種觀察結(jié)果表明LBFL301，LBFL304，LBFL305或LBFL306可被用作診斷試劑或標(biāo)記物以檢測(cè)或篩選胃癌。LBFL301的表達(dá)水平似乎在皮膚組織中最高，其次是胎盤、動(dòng)物脂肪、動(dòng)脈、膀胱、骨頭、乳房和軟組織。盡管在肝臟或大腦和心臟的大部分區(qū)域中沒(méi)有檢測(cè)到該基因，但是在表3a中列出的其它大多數(shù)組織中檢測(cè)到了較低水平的表達(dá)。LBFL304的表達(dá)水平似乎在動(dòng)脈、網(wǎng)膜、子宮、子宮內(nèi)膜、子宮肌層和前列腺中最高。LBFL305的表達(dá)水平似乎在免疫系統(tǒng)中的器官(例如白細(xì)胞、淋巴結(jié)、脾臟和胸腺)中最高，其次是得自闌尾、動(dòng)脈、骨頭和肺的樣品。而且在表3c中所列的其它大多數(shù)組織中檢測(cè)到了更低的表達(dá)水平。LBFL306的表達(dá)水平似乎在免疫系統(tǒng)的器官(例如淋巴結(jié)、脾臟和胸腺)和生殖系統(tǒng)的器官(例如乳房、子宮內(nèi)膜、前列腺和子宮)中最高。
表3a-48774_at的e-Northern數(shù)據(jù)正常組織中的LBFL301基因表達(dá)總存在頻率組織存在不存在下面25％ 平均上面75％0.5492脂肪29/33 4/33 130.90 200.78 302.98腎上腺1/12 11/12 -4.10 8.75 22.07闌尾1/3 2/3 21.54 31.31 71.81動(dòng)脈3/3 0/3 148.46 203.96 262.32膀胱6/7 1/7 142.72 195.44 361.02骨2/4 2/4 75.00 240.38 412.62乳房74/82 8/82 104.43 222.98 506.27小腦0/5 5/5 -7.5 1 -6.91 0.94子宮頸75/99 24/99 42.04 93.36 144.25結(jié)腸36/148 112/148 1.75 12.16 29.05皮層前葉1/7 6/7 5.96 14.07 18.05皮層顳葉0/3 3/3 -0.59 4.13 4.66十二指腸9/61 52/61 3.99 11.54 20.62子宮內(nèi)膜16/21 5/21 46.25 85.18 113.55食管14/27 13/27 17.91 42.08 81.58輸卵管21/51 30/51 7.97 20.39 33.96膽囊4/8 4/8 16.22 80.97 400.47心臟0/3 3/3 -3.80 6.00 11.57海馬1/5 4/5 -6.49 -0.18 7.81腎12/87 75/87 -14.80 -4.61 9.24喉4/4 0/4 48.51 119.88 248.62左心房64/141 77/141 8.19 27.15 61.94左心室2/15 13/15 -7.49 7.08 13.24肝0/33 33/33 -15.13 -8.62 0.03肺43/92 49/92 10.45 30.14 63.21淋巴結(jié)9/12 3/12 43.28 81.96 225.75肌肉19/38 19/38 23.70 40.22 108.40子宮肌層68/106 38/106 19.39 56.42 99.78網(wǎng)膜12/16 4/16 76.26 148.41 236.54卵巢26/75 49/75 4.20 21.96 47.43
胰腺7/34 27/34 -12.61 0.83 17.69胎盤5/5 0/5 284.63 361.07 414.51前列腺7/32 25/32 0.03 12.08 36.90直腸17/44 27/44 3.23 12.57 37.41右心房60/171 111/171 2.99 15.73 53.22右心室43/160 117/160 1.85 16.64 39.58皮膚56/59 3/59 321.45 906.78 1515.60小腸18/68 50/68 0.41 12.19 28.53軟組織5/6 1/6 148.50 202.33 794.03脾5/29 24/29 -3.61 3.04 12.46胃15/45 30/45 7.73 18.66 50.97睪丸3/5 2/5 14.11 27.34 64.24胸腺19/71 52/71 4.06 25.61 40.45甲狀腺7/19 12/19 12.43 32.64 40.31子宮35/56 21/56 32.20 44.73 143.10WBC 1/41 40/41 -18.91 -13.33 -6.24
表3b-35832_at的e-Northern數(shù)據(jù)正常組織中的LBFL304基因表達(dá)片段總存在頻率組織存在不存在下面25％平均上面75％35832_at 0.5228脂肪26/34 8/34 29.09 59.51 89.67腎上腺1/12 11/12 -11.00 -6.08 8.14闌尾1/3 2/3 43.26 53.50 66.52動(dòng)脈3/4 1/4 182.70 291.81 428.36膀胱5/7 2/7 56.36 62.71 64.68骨3/4 1/4 19.34 77.40 167.06乳房65/82 17/82 33.67 63.19 108.61小腦0/5 5/5 -19.26 -14.78 -13.16子宮頸69/102 33/102 18.76 57.45 94.99結(jié)腸85/146 61/146 10.73 35.22 87.91皮層前葉1/7 6/7 -5.03 8.78 14.71皮層顳葉0/3 3/3 -16.73 -16.67 -15.85十二指腸19/53 34/53 6.47 20.39 41.95子宮內(nèi)膜15/21 6/21 31.44 93.20 137.68
食管15/27 12/27 5.12 27.03 52.89輸卵管19/47 28/47 5.38 22.48 54.99膽囊2/7 5/7 8.71 28.94 50.85心臟0/3 3/3 -35.98 -28.2 5 -6.72海馬2/5 3/5 -7.43 -3.64 5.68腎28/89 61/89 1.67 20.45 45.18喉4/4 0/4 36.13 54.20 79.75左心房80/141 61/141 8.32 25.37 52.28左心室0/15 15/15 -21.85 -17.01 -8.17肝2/35 33/35 -10.51 0.02 8.05肺29/93 64/93 2.56 19.47 43.63淋巴結(jié)3/12 9/12 -17.5 8 -2.85 9.56肌肉12/42 30/42 -13.74 3.99 23.23子宮肌層92/108 16/108 67.57 129.39 203.58網(wǎng)膜14/15 1/15 176.65 310.28 368.41卵巢31/74 43/74 0.66 27.78 54.33胰腺4/33 29/33 -9.60 2.09 9.94胎盤0/5 5/5 -21.32 -3.06 6.08前列腺30/32 2/32 82.37 104.56 190.72直腸37/44 7/44 51.53 86.73 125.67右心房69/170 101/17 0 -3.30 8.80 33.56右心室35/160 125/16 0 -11.65 -0.46 16.02皮膚28/61 33/61 4.2 2 25.33 67.56小腸36/67 31/67 10.76 33.92 64.75軟組織4/6 2/6 25.95 40.91 58.70脾1/29 28/29 -19.20 -13.77 -6.69胃16/47 31/47 -8.30 13.38 47.93睪丸1/5 4/5 -18.20 5.01 37.66胸腺1/73 72/73 -22.55 -12.50 -3.27甲狀腺14/19 5/19 45.56 98.30 141.24子宮43/58 15/58 37.47 103.26 180.98 WBC0/43 43/43 -33.45 -25.32-20.23
表3c-48774_at的e-Northern數(shù)據(jù)正常組織中的LBFL305基因表達(dá)總存在頻率組織存在不存在下面25％平均上面75％0.9444脂肪31/32 1/32 221.82 286.63 38 0.88腎上腺12/12 0/12 162.12 214.21 310.82闌尾3/3 0/3 352.94 506.01 633.71動(dòng)脈3/3 0/3 343.80 419.88 643.55膀胱5/5 0/5 221.82 290.82 301.11骨3/3 0/3 410.63 508.38 662.78乳房80/80 0/80 236.84 279.81 338.22小腦5/5 0/5 182.09 198.28 283.55子宮頸97/101 4/101 179.11 246.50 317.62結(jié)腸146/151 5/151 247.18 314.49 389.23皮層前葉7/7 0/7 222.19 230.28 268.13皮層顳葉3/3 0/3 305.66 365.62 377.16十二指腸58/61 3/61 206.17 276.14 331.91子宮內(nèi)膜21/21 0/21 158.91 193.40 257.17食管25/27 2/27 182.29 223.24 303.93輸卵管50/51 1/51 168.69 220.72 265.95膽囊7/8 1/8 237.67 270.08 312.45心臟2/3 1/3 44.79 55.84 56.46海馬5/5 0/5 165.94 212.72 32 8.59腎79/86 7/86 121.83 158.99 209.67喉4/4 0/4 140.76 209.46 302.84左心房127/141 14/141 58.48 92.78 123.06左心室9/15 6/15 50.50 74.69 101.06肝27/34 7/34 87.73 146.60 197.27肺92/93 1/93 365.58 454.87 550.48淋巴結(jié)11/11 0/11 493.34 943.95 1141.06肌肉19/39 20/39 41.41 64.44 110.74子宮肌層104/106 2/106 188.94 263.73 322.65網(wǎng)膜15/15 0/15 198.02 244.56 334.75卵巢70/74 4/74 133.44 181.39 246.40胰腺13/34 21/34 24.30 53.13 84.64胎盤4/5 1/5 156.58 174.21 182.71前列腺32/32 0/32 184.16 234.60 289.05直腸42/43 1/43 284.60 365.66 434.01右心房148/169 21/169 54.96 89.92 129.13
右心室132/160 28/160 55.58 78.85 114.70皮膚57/59 2/59 250.81 320.57 398.56小腸64/68 4/68 196.50 279.29 393.83軟組織6/6 0/6 234.21 307.07 363.66脾31/31 0/31 775.25 879.84 1022.49胃41/47 6/47 137.91 217.53 3 38.54睪丸5/5 0/5 326.62 358.69 377.26胸腺71/71 0/71 691.12 802.96 9 84.42甲狀腺18/18 0/18 121.11 162.16 238.53子宮57/58 1/58 157.19 202.53 265.91 WBC38/40 2/40 1863.06 2264.27 2743.82
表3d-48774_at的e-Northern數(shù)據(jù)正常組織中的LBFL306基因表達(dá)總存在頻率組織存在不存在下面25％ 平均上面75％0.8143脂肪31/32 1/32 184.04 242.67 285.20腎上腺6/12 6/12 130.70 157.08 187.26闌尾3/3 0/3 259.39 301.05 388.31動(dòng)脈4/4 0/4 168.95 207.06 295.97膀胱7/8 1/8 196.52 239.43 374.54骨4/4 0/4 209.35 226.22 292.55乳房60/61 1/61 238.09 315.29 421.47子宮頸92/102 10/102 180.90 224.31 342.25結(jié)腸168/192 24/192 147.41 175.83 215.95皮層前葉5/5 0/5 133.94 148.22 162.91皮層顳葉3/3 0/3 137.28 147.77 172.44十二指腸68/68 0/68 186.24 218.73 336.00子宮內(nèi)膜19/19 0/19 273.57 359.17 436.85食管14/25 11/25 105.83 140.56 195.89膽囊7/8 1/8 232.71 293.00 410.47心臟1/3 2/3 86.39 100.48 129.68海馬9/10 1/10 125.62 140.94 194.06腎53/91 38/91 108.29 147.35 186.69喉3/4 1/4 160.96 190.50 219.55左心房65/143 78/143 100.94 128.86 157.57左心室0/13 13/13 82.54 106.63 117.06肝15/44 29/44 145.82 204.77 244.58肺104/114 10/114 168.03 203.35 283.11淋巴結(jié)14/14 0/14 207.66 319.53 366.70
淋巴細(xì)胞(B+T細(xì)胞)24/24 0/24 224.46 292.01 348.07肌肉31/40 9/40 183.43 24 0.15 329.99子宮肌層122/128 6/128 209.83 244.58 294.20網(wǎng)膜13/15 2/15 162.83 236.23 265.24卵巢80/81 1/81 219.28 259.00 331.64胰腺8/40 32/40 97.07 136.80 174.54前列腺47/47 0/47 318.31 397.81 525.43直腸38/46 8/46 143.79 188.95 232.42右心房87/162 75/162 104.22 132.56 161.54皮膚38/44 6/44 162.29 198.90 236.86小腸72/79 7/79 184.41 230.96 270.34軟組織5/5 0/5 240.30 258.33 499.21脾36/36 0/36 253.03 322.87 390.61胃32/54 22/54 139.62 174.76 269.47胸腺70/70 0/70 352.12 438.94 511.11甲狀腺25/25 0/25 177.32 211.27 276.25子宮54/56 2/56 243.74 312.71 387.50WBC21/25 4/25 149.63 176.72 209.49
工業(yè)實(shí)用性
實(shí)施例3
用于胃癌篩選的LBFL301，LBFL304，LBFL305或LBFL306mRNA的檢測(cè)
如實(shí)施例1中所述，即通過(guò)利用GeneChip篩選mRNA樣品，或者如實(shí)施例2中所述，即通過(guò)利用RNA印跡篩選mRNA樣品，測(cè)定了對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO1，3，5，7，9，11，13，17，19或21的mRNA在胃組織活檢樣品中的表達(dá)水平?；蛘?，可以對(duì)得自惡性狀態(tài)或非惡性狀態(tài)的非-胃增生組織的樣品進(jìn)行分析。得自胃癌患者的胃組織樣品和得自正常個(gè)體的胃組織樣品可以被用作陽(yáng)性和陰性對(duì)照。利用任何分析基因表達(dá)的手段進(jìn)行檢測(cè)，表達(dá)水平高于正常對(duì)照則是胃癌的表征或表示有可能患上胃癌。
盡管參照上述實(shí)施例已經(jīng)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳盡的描述，但是應(yīng)當(dāng)理解可以進(jìn)行各種修改而不偏離本發(fā)明的實(shí)質(zhì)。因此，本發(fā)明僅僅通過(guò)下列權(quán)利要求得到限定。本申請(qǐng)中引用的所有專利、專利申請(qǐng)和公開出版物被本文全部引入作為參考。
序列表
<110>LG Life Sciences Ltd.
<120>胃癌相關(guān)的基因家族
<130>PC03015-LG
<150>US 60/402,904
<151>2002-08-14
<150>US 60/404,408
<151>2002-08-20
<150>US 60/405,304
<151>2002-08-23
<150>US 60/421,582
<151>2002-10-28
<160>22
<170>KopatentIn 1.71
<210>1
<211>1272
<212>DNA
<213>智人
<220>
<221>CDS
<222>(131)..(859)
<223>基因LBFL301，克隆AD12
<400>1
ggcgcgcggg tgaaaggcgc attgatgcag cctgcggcgg cctcggagcg cggcggagcc60
agacgctgac cacgttcctc tcctcggtct cctccgcctc cagctccgcg ctgcccggca120
gccgggagcc atg cga ccc cag ggc ccc gcc gcc tcc ccg cag cgg ctc cgc 172
Met Arg Pro Gln Gly Pro Ala Ala Ser Pro Gln Arg Leu Arg
1 5 10
ggc ctc ctg ctg ctc ctg ctg ctg cag ctg ccc gcg ccg tcg agc gcc 220
Gly Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gln Leu Pro Ala Pro Ser Ser Ala
15 20 25 30
tct gag atc ccc aag ggg aag caa aag gcg cag ctc cgg cag agg gag 268
Ser Glu Ile Pro Lys Gly Lys Gln Lys Ala Gln Leu Arg Gln Arg Glu
35 40 45
gtg gtg gac ctg tat aat gga atg tgc tta caa ggg cca gca gga gtg316
Val Val Asp Leu Tyr Asn Gly Met Cys Leu Gln Gly Pro Ala Gly Val
50 55 60
cct ggt cga gac ggg agc cct ggg gcc aat ggc att ccg ggt aca cct364
Pro Gly Arg Asp Gly Ser Pro Gly Ala Asn Gly Ile Pro Gly Thr Pro
65 70 75
ggg atc cca ggt cgg gat gga ttc aaa gga gaa aag ggg gaa tgt ctg412
Gly Ile Pro Gly Arg Asp Gly Phe Lys Gly Glu Lys Gly Glu Cys Leu
80 85 90
agg gaa agc ttt gag gag tcc tgg aca ccc aac tac aag cag tgt tca460
Arg Glu Ser Phe Glu Glu Ser Trp Thr Pro Asn Tyr Lys Gln Cys Ser
95 100 105 110
tgg agt tca ttg aat tat ggc ata gat ctt ggg aaa att gcg gag tgt508
Trp Ser Ser Leu Asn Tyr Gly Ile Asp Leu Gly Lys Ile Ala Glu Cys
115 120 125
aca ttt aca aag atg cgt tca aat agt gct cta aga gtt ttg ttc agt556
Thr Phe Thr Lys Met Arg Ser Asn Ser Ala Leu Arg Val Leu Phe Ser
130 135 140
ggc tca ctt cgg cta aaa tgc aga aat gca tgc tgt cag cgt tgg tat604
Gly Ser Leu Arg Leu Lys Cys Arg Asn Ala Cys Cys Gln Arg Trp Tyr
145 150 155
ttc aca ttc aat gga gct gaa tgt tca gga cct ctt ccc att gaa gct652
Phe Thr Phe Asn Gly Ala Glu Cys Ser Gly Pro Leu Pro Ile Glu Ala
160 165 170
ata att tat ttg gac caa gga agc cct gaa atg aat tca aca att aat700
Ile Ile Tyr Leu Asp Gln Gly Ser Pro Glu Met Asn Ser Thr Ile Asn
175 180 185 190
att cat cgc act tct tct gtg gaa gga ctt tgt gaa gga att ggt gct748
Ile His Arg Thr Ser Ser Val Glu Gly Leu Cys Glu Gly Ile Gly Ala
195 200 205
gga tta gtg gat gtt gct atc tgg gtt ggc act tgt tca gat tac cca796
Gly Leu Val Asp Val Ala Ile Trp Val Gly Thr Cys Ser Asp Tyr Pro
210 215 220
aaa gga gat gct tct act gga tgg aat tca gtt tct cgc atc att att844
Lys Gly Asp Ala Ser Thr Gly Trp Asn Ser Val Ser Arg Ile Ile Ile
225 230 235
gaa gaa cta cca aaa t aaatgcttta attttcattt gctacctctt tttttattat900
Glu Glu Leu Pro Lys
240
gccttggaat ggttcactta aatgacattt taaataagtt tatgtataca tctgaatgaa960
aagcaaagct aaatatgttt acagaccaaa gtgtgatttc acactgtttt taaatctagc1020
attattcatt ttgcttcaat caaaagtggt ttcaatattt tttttagttg gttagaatac1080
tttcttcata gtcacattct ctcaacctat aatttggaat attgttgtgg tcttttgttt1140
tttctcttag tatagcattt ttaaaaaaat ataaaagcta ccaatctttg tacaatttgt1200
aaatgttaag aatttttttt atatctgtta aataaaaatt atttccaaca accttaaaaa1260
aaaaaaaaaa aa1272
<210>2
<211>243
<212>PRT
<213>智人
<400>2
Met Arg Pro Gln Gly Pro Ala Ala Ser Pro Gln Arg Leu Arg Gly Leu
1 5 10 15
Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gln Leu Pro Ala Pro Ser Ser Ala Ser Glu
20 25 30
Ile Pro Lys Gly Lys Gln Lys Ala Gln Leu Arg Gln Arg Glu Val Val
35 40 45
Asp Leu Tyr Asn Gly Met Cys Leu Gln Gly Pro Ala Gly Val Pro Gly
50 55 60
Arg Asp Gly Ser Pro Gly Ala Asn Gly Ile Pro Gly Thr Pro Gly Ile
65 70 75 80
Pro Gly Arg Asp Gly Phe Lys Gly Glu Lys Gly Glu Cys Leu Arg Glu
85 90 95
Ser Phe Glu Glu Ser Trp Thr Pro Asn Tyr Lys Gln Cys Ser Trp Ser
100 105 110
Ser Leu Asn Tyr Gly Ile Asp Leu Gly Lys Ile Ala Glu Cys Thr Phe
115 120 125
Thr Lys Met Arg Ser Asn Ser Ala Leu Arg Val Leu Phe Ser Gly Ser
130 135 140
Leu Arg Leu Lys Cys Arg Asn Ala Cys Cys Gln Arg Trp Tyr Phe Thr
145 150 155 160
Phe Asn Gly Ala Glu Cys Ser Gly Pro Leu Pro Ile Glu Ala Ile Ile
165 170 175
Tyr Leu Asp Gln Gly Ser Pro Glu Met Asn Ser Thr Ile Asn Ile His
180 185 190
Arg Thr Ser Ser Val Glu Gly Leu Cys Glu Gly Ile Gly Ala Gly Leu
195 200 205
Val Asp Val Ala Ile Trp Val Gly Thr Cys Ser Asp Tyr Pro Lys Gly
210 215 220
Asp Ala Ser Thr Gly Trp Asn Ser Val Ser Arg Ile Ile Ile Glu Glu
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Leu Pro Lys
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<220>
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ctctcctcgg tctcctccgc ctccagctcc gcgctgcccg gcagccggga gcc 173
atg cga ccc cag ggc ccc gcc gcc tcc ccg cag cgg ctc cgc ggc ctc 221
Met Arg Pro Gln Gly Pro Ala Ala Ser Pro Gln Arg Leu Arg Gly Leu
1 5 10 15
ctg ctg ctc ctg ctg ctg cag ctg ccc gcg ccg tcg agc gcc tct gag 269
Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gln Leu Pro Ala Pro Ser Ser Ala Ser Glu
20 25 30
atc ccc aag ggg aag caa aag gcg cag ctc cgg cag agg gag gtg gtg 317
Ile Pro Lys Gly Lys Gln Lys Ala Gln Leu Arg Gln Arg Glu Val Val
35 40 45
gac ctg tat aat gga atg tgc tta caa ggg cca gca gga gtg cct ggt 365
Asp Leu Tyr Asn Gly Met Cys Leu Gln Gly Pro Ala Gly Val Pro Gly
50 55 60
cga gac ggg agc cct ggg gcc aat ggc att ccg ggt aca cct ggg atc 413
Arg Asp Gly Ser Pro Gly Ala Asn Gly Ile Pro Gly Thr Pro Gly Ile
65 70 75 80
cca ggt cgg gat gga ttc aaa gga gaa aag ggg gaa tgt ctg agg gaa 461
Pro Gly Arg Asp Gly Phe Lys Gly Glu Lys Gly Glu Cys Leu Arg Glu
85 90 95
agc ttt gag gag tcc tgg aca ccc aac tac aag cag tgt tca tgg agt 509
Ser Phe Glu Glu Ser Trp Thr Pro Asn Tyr Lys Gln Cys Ser Trp Ser
100 105 110
tca ttg aat tat ggc ata gat ctt ggg aaa att gcg aaa cac gtc aag 557
Ser Leu Asn Tyr Gly Ile Asp Leu Gly Lys Ile Ala Lys His Val Lys
115 120 125
agt caa tac gaa tgg aca gaa cta gtc tagaat gagtgtacat ttacaaagat610
Ser Gln Tyr Glu Trp Thr Glu Leu Val
130 135
gcgttcaaat agtgctctaa gagttttgtt cagtggctca cttcggctaa aatgcagaaa 670
tgcatgctgt cagcgttggt atttcacatt caatggagct gaatgttcag gacctcttcc 730
cattgaagct ataatttatt tggaccaagg aagccctgaa atgaattcaa caattaatat 790
tcatcgcact tcttctgtgg aaggactttg tgaaggaatt ggtgctggat tagtggatgt 850
tgctatctgg gttggcactt gttcagatta cccaaaagga gatgcttcta ctggatggaa 910
ttcagtttct cgcatcatta ttgaagaact accaaaataa atgctttaat tttcatttgc 970
tacctctttt tttattatgc cttggaatgg ttcacttaaa tgacatttta aataagttta 1030
tgtatacatc tgaatgaaaa gcaaagctaa atatgtttac agaccaaagt gtgatttcac 1090
actgttttta aatctagcat tattcatttt gcttcaatca aaagtggttt caatattttt 1150
tttagttggt tagaatactt tcttcatagt cacattctct caacctataa tttggaatat 1210
tgttgtggtc ttttgttttt tctcttagta tagcattttt aaaaaaatat aaaagctacc 1270
aatctttgta caatttgtaa atgttaagaa ttttttttat atctgttaaa taaaaattat1330
ttccaacaaa aaaaaaaaaa aaaaa 1355
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<212>PRT
<213>智人
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Met Arg Pro Gln Gly Pro Ala Ala Ser Pro Gln Arg Leu Arg Gly Leu
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Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gln Leu Pro Ala Pro Ser Set Ala Ser Glu
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Ile Pro Lys Gly Lys Gln Lys Ala Gln Leu Arg Gln Arg Glu Val Val
35 40 45
Asp Leu Tyr Asn Gly Met Cys Leu Gln Gly Pro Ala Gly Val Pro Gly
50 55 60
Arg Asp Gly Ser Pro Gly Ala Asn Gly Ile Pro Gly Thr Pro Gly Ile
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Pro Gly Arg Asp Gly Phe Lys Gly Glu Lys Gly Glu Cys Leu Arg Glu
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1 5
atg gag gaa gct atg acc tac aca gag gac agt tat ggg atg gat ggg 100
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10 15 20
aag gtt aat cag ccc cgt ctc act gca gac atc aac tgg caa ggc cta 148
Lys Val Asn Gln Pro Arg Leu Thr Ala Asp Ile Asn Trp Gln Gly Leu
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gag gag cta cac agt gtg aat gaa aac atc tat gag tac aga caa aac 196
Glu Glu Leu His Ser Val Asn Glu Asn Ile Tyr Glu Tyr Arg Gln Asn
40 45 50
tac aga ctt agt ctg gtg gac tgg act aat tac ttg aag gat tta gat 244
Tyr Arg Leu Ser Leu Val Asp Trp Thr Asn Tyr Leu Lys Asp Leu Asp
55 60 65
aga gta ttt gca ctg ctg aag agt cac tat gag caa aat aaa aca aat 292
Arg Val Phe Ala Leu Leu Lys Ser His Tyr Glu Gln Asn Lys Thr Asn
70 75 80 85
aag act caa act gct caa agt gac ggg ttc ttg gtt gtc tct gct gag 340
Lys Thr Gln Thr Ala Gln Ser Asp Gly Phe Leu Val Val Ser Ala Glu
90 95 100
cac gct gtg tca atg gag atg gcc tct gct gac tca gat gaa gac cca 388
His Ala Val Ser Met Glu Met Ala Ser Ala Asp Ser Asp Glu Asp Pro
105 110 115
agg cat aag gtt ggg aaa aca cct cat ttg acc ttg cca gct gac ctt 436
Arg His Lys Val Gly Lys Thr Pro His Leu Thr Leu Pro Ala Asp Leu
120 125 130
caa acc ctg cat ttg aac cga cca aca tta agt cca gag agt aaa ctt 484
Gln Thr Leu His Leu Asn Arg Pro Thr Leu Ser Pro Glu Ser Lys Leu
135 140 145
gaa tgg aat aac gac att cca gaa gtt aat cat ttg aat tct gaa cac 532
Glu Trp Asn Asn Asp Ile Pro Glu Val Asn His Leu Asn Ser Glu His
150 155 160 165
tgg aga aaa acc gaa aaa tgg acg ggg cat gaa gag act aat cat ctg 580
Trp Arg Lys Thr Glu Lys Trp Thr Gly His Glu Glu Thr Asn His Leu
170 175 180
gaa acc gat ttc agt ggc gat ggc atg aca gag cta gag ctc ggg ccc 628
Glu Thr Asp Phe Ser Gly Asp Gly Met Thr Glu Leu Glu Leu Gly Pro
185 190 195
agc ccc agg ctg cag ccc att cgc agg cac ccg aaa gaa ctt ccc cag676
Ser Pro Arg Leu Gln Pro Ile Arg Arg His Pro Lys Glu Leu Pro Gln
200 205 210
tat ggt ggt cct gga aag gac att ttt gaa gat caa cta tat ctt cct724
Tyr Gly Gly Pro Gly Lys Asp Ile Phe Glu Asp Gln Leu Tyr Leu Pro
215 220 225
gtg cat tcc gat gga att tca gtt cat cag atg ttc acc atg gcc acc772
Val His Ser Asp Gly Ile Ser Val His Gln Met Phe Thr Met Ala Thr
230 235 240 245
gca gaa cac cga agt aat tcc agc ata gcg ggg aag atg ttg acc aag820
Ala Glu His Arg Ser Asn Ser Ser Ile Ala Gly Lys Met Leu Thr Lys
250 255 260
gtg gag aag aat cac gaa aag gag aag tca cag cac cta gaa ggc agc868
Val Glu Lys Asn His Glu Lys Glu Lys Ser Gln His Leu Glu Gly Ser
265 270 275
gcc tcc tct tca ctc tcc tct gat tagatgaa actgttacct taccctaaac920
Ala Ser Ser Ser Leu Ser Ser Asp
280285
acagtatttc tttttaactt ttttatttgt aaactaataa aggtaatcac agccaccaac 980
attccaagct accctgggta cctttgtgca gtagaagcta gtgagcatgt gagcaagcgg 1040
tgtgcacacg gagactcatc gttataattt actatctgcc aagagtagaa agaaaggctg 1100
gggatatttg ggttggcttg gttttgattt tttgcttgtt tgtttgtttt gtactaaaac 1160
agtattatct tttgaatatc gtagggacat aagtatatac atgttatcca atcaagatgg 1220
ctagaatggt gcctttctga gtgtctaaaa cttgacaccc ctggtaaatc tttcaacaca 1280
cttccactgc ctgcgtaatg aagttttgat tcatttttaa ccactggaat ttttcaatgc 1340
cgtcattttc agttagatga ttttgcactt tgagattaaa atgccatgtc tatttgatta 1400
gtcttatttt tttattttta caggcttatc agtctcactg ttggctgtca ttgtgacaaa 1460
gtcaaataaa cccccaagga cgacacacag tatggatcac atattgtttg acattaagct 1520
tttgccagaa aatgttgcat gtgttttacc tcgacttgct aaaatcgatt agcagaaagg 1580
catggctaat aatgttggtg gtgaaaataa ataaataagt aaacaaaatg aagattgcct 1640
gctctctctg tgcctagcct caaagcgttc atcatacatc atacctttaa gattgctata1700
ttttgggtta ttttcttgac aggagaaaaa gatctaaaga tcttttattt tcatcttttt1760
tggttttctt ggcatgacta agaagcttaa atgttgataa aatatgacta gttttgaatt1820
tacaccaaga acttctcaat aaaagaaaat catgaatgct ccacaatttc aacataccac1880
aagagaagtt aatttcttaa cattgtgttc tatgattatt tgtaagacct tcaccaagtt1940
ctgatatctt ttaaagacat agttcaaaat tgcttttgaa aatctgtatt cttgaaaata2000
tccttgttgt gtattaggtt tttaaatacc agctaaagga ttacctcact gagtcatcag2060
taccctccta ttcagctccc caagatgatg tgtttttgct taccctaaga gaggttttct2120
tcttattttt agataattca agtgcttaga taaattatgt tttctttaag tgtttatggt2180
aaactctttt aaagaaaatt taatatgtta tagctgaatc tttttggtaa ctttaaatct2240
ttatcataga ctctgtacat atgttcaaat tagctgcttg cctgatgtgt gtatcatcgg2300
tgggatgaca gaacaaacat atttatgatc atgaataatg tgctttgtaa aaagatttca2360
agttattagg aagcatactc tgttttttaa tcatgtataa tattccatga tacttttata2420
gaacaattct ggcttcagga aagtctagaa gcaatatttc ttcaaataaa aggtgtttaa2480
actttaaaaa aaaaaaaaaa2500
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<213>智人
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Met Leu Glu Ile Lys Met Glu Glu Ala Met Thr Tyr Thr Glu Asp Ser
1 5 10 15
Tyr Gly Met Asp Gly Lys Val Asn Gln Pro Arg Leu Thr Ala Asp Ile
20 25 30
Asn Trp Gln Gly Leu Glu Glu Leu His Ser Val Asn Glu Asn Ile Tyr
35 40 45
Glu Tyr Arg Gln Asn Tyr Arg Leu Ser Leu Val Asp Trp Thr Asn Tyr
50 55 60
Leu Lys Asp Leu Asp Arg Val Phe Ala Leu Leu Lys Ser His Tyr Glu
65 70 75 80
Gln Asn Lys Thr Asn Lys Thr Gln Thr Ala Gln Ser Asp Gly Phe Leu
85 90 95
Val Val Ser Ala Glu His Ala Val Ser Met Glu Met Ala Set Ala Asp
100 105 110
Ser Asp Glu Asp Pro Arg His Lys Val Gly Lys Thr Pro His Leu Thr
115 120 125
Leu Pro Ala Asp Leu Gln Thr Leu His Leu Asn Arg Pro Thr Leu Ser
130 135 140
Pro Glu Ser Lys Leu Glu Trp Asn Asn Asp Ile Pro Glu Val Asn His
145 150 155 160
Leu Asn Ser Glu His Trp Arg Lys Thr Glu Lys Trp Thr Gly His Glu
165 170 175
Glu Thr Asn His Leu Glu Thr Asp Phe Ser Gly Asp Gly Met Thr Glu
180 185 190
Leu Glu Leu Gly Pro Ser Pro Arg Leu Gln Pro Ile Arg Arg His Pro
195 200 205
Lys Glu Leu Pro Gln Tyr Gly Gly Pro Gly Lys Asp Ile Phe Glu Asp
210 215 220
Gln Leu Tyr Leu Pro Val His Ser Asp Gly Ile Ser Val His Gln Met
225 230 235 240
Phe Thr Met Ala Thr Ala Glu His Arg Ser Asn Ser Ser Ile Ala Gly
245 250 255
Lys Met Leu Thr Lys Val Glu Lys Asn His Glu Lys Glu Lys Ser Gln
260 265 270
His Leu Glu Gly Ser Ala Ser Ser Ser Leu Ser Ser Asp
275 280 285
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<220>
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atg gag gaa gct atg acc tac aca gag gac agt tat ggg atg gat ggg100
Met Glu Glu Ala Met Thr Tyr Thr Glu Asp Ser Tyr Gly Met Asp Gly
1 5 10 15
aag gtt aat cag ccc cgt ctc act gca gac atc aac tgg caa ggc cta148
Lys Val Asn Gln Pro Arg Leu Thr Ala Asp Ile Asn Trp Gln Gly Leu
20 25 30
gag gag cta cac agt gtg aat gaa aac atc tat gag tac aga caa aac196
Glu Glu Leu His Ser Val Asn Glu Asn Ile Tyr Glu Tyr Arg Gln Asn
35 40 45
tac aga ctt agt ctg gtg gac tgg act aat tac ttg aag gat tta gat244
Tyr Arg Leu Ser Leu Val Asp Trp Thr Asn Tyr Leu Lys Asp Leu Asp
50 55 60
aga gta ttt gca ctg ctg aag agt cac tat gag caa aat aaa aca aat292
Arg Val Phe Ala Leu Leu Lys Ser His Tyr Glu Gln Asn Lys Thr Asn
65 70 75 80
aag act caa act gct caa agt gac ggg ttc ttg gtt gtc tct gct gag340
Lys Thr Gln Thr Ala Gln Ser Asp Gly Phe Leu Val Val Ser Ala Glu
85 90 95
cac gct gtg tca atg gag atg gcc tct gct gac tca gat gaa gac cca388
His Ala Val Ser Met Glu Met Ala Ser Ala Asp Ser Asp Glu Asp Pro
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agg cat aag gtt ggg aaa aca cct cat ttg acc ttg cca gct gac ctt436
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180 185 190
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225 230 235 240
gca gaa cac cga agt aat tcc agc ata gcg ggg aag atg ttg acc aag 820
Ala Glu His Arg Ser Asn Ser Ser Ile Ala Gly Lys Met Leu Thr Lys
245 250 255
gtg gag aag aat cac gaa aag gag aag tca cag cac cta gaa ggc agc 868
Val Glu Lys Asn His Glu Lys Glu Lys Ser Gln His Leu Glu Gly Ser
260 265 270
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Ala Ser Ser Ser Leu Ser Ser Asp
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tcttattttt agataattca agtgcttaga taaattatgt tttctttaag tgtttatggt2180
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ttatcataga ctctgtacat atgttcaaat tagctgcttg cctgatgtgt gtatcatcgg2300
tgggatgaca gaacaaacat atttatgatc atgaataatg tgctttgtaa aaagatttca2360
agttattagg aagcatactc tgttttttaa tcatgtataa tattccatga tacttttata2420
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130 135 140
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15 20 25 30
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Leu His Ser Val Asn Glu Asn Ile Tyr Glu Tyr Arg Gln Asn Tyr Arg
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165 170 175
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Lys Arg Asn Thr Val Ile Gly Thr Pro Phe Trp Met Ala Pro Glu Val
180 185 190 195
att cag gaa att gga tac aac tgt gta gca gac atc tgg tcc ctg gga681
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200 205 210
ata act gcc ata gaa atg gct gaa gga aag ccc cct tat gct gat atc729
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230 235 240
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Phe Arg Lys Pro Glu Leu Trp Ser Asp Asn Phe Thr Asp Phe Val Lys
245 250 255
cag tgt ctt gta aag agc cct gag cag agg gcc aca gcc act cag ctc873
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260 265 270 275
ctg cag cac cca ttt gtc agg agt gcc aaa gga gtg tca ata ctg cga 921
Leu Gln His Pro Phe Val Arg Ser Ala Lys Gly Val Ser Ile Leu Arg
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gac tta att aat gaa gcc atg gat gtg aaa ctg aaa cgc cag gaa tcc969
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aaa act agc caa gaa cag cag tct gga aaa gac ata tgt atc caa aat 1401
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tgc cag gga aac ctg ctg tgt aga tac gct ttc tgagaa accacatgct1450
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ctttcaattg ttctttctgg aagactttta aaaaaatata aatatgcata tatatatata1990
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ctttacctct ttccctcaga tggggagcca tgactgggtt gcacctcagg atactgtaat3190
ttgactccat aattgctttt gctcctgaaa cctgggaatc aatggaaagg cagggaatgt3250
gcctcttctg tggccagatt ctgttatttg caattaaagc aagtttttaa aaaatgcaag3310
aggcagttgt tagtcttcag ggcttggcaa ctgaaatagc tatgtggcgg atacggaaaa3370
cagaggacaa tttgaggatc ttgctggaat aataaatgac agctaccatt tgttgagcac3430
ctattatata tcaggcactg agctgggtag gctctaaact tcacaataac cctgtgactt3490
aactacttta tctccatttt gtagttgaag aaataagttc agagagaaag attccttccc3550
aaggtcatgc agctagtaaa tgatagaatc aggattcata gcatcactat agggggtcaa3610
tatttacaca aaaaaggaaa gtcacaagcc tgtttaaaat gaagtgacca ccttttcttg3670
catagactaa ataactcgaa ctggcatttt taggttggaa agacagctga attagtagtt3730
aagtctgata gccaagtaag ttttaaaaac caaagcatcc aggatgcaca cccctgcacc3790
atttgctgtg cgaattaata gttctgtctc tctctctctt tcttttttct ttttattctt3850
tgagatggat tttcgctctt gtcgcccagg ctggagtaca atggcacgat cttggctcac3910
tgcaacctcc gcctcccggg ttcaagcgat tcttctgctg ggattacagc atatgccacc3970
atgcccagat tatttttttg tatttgtagt agagacgggg tttcaccatg tcagtcaggc4030
tggtcttgaa ctcctgacct caggtgatcc acccgcctca gcctcccaca ctgctgggat4090
tacaggcatg agccaccgct cctggcctct ctttcttttt taaacaaaga actttgcact4150
tggccagaga ggaggagaaa gcccattttc tcccttccta agctagatcc aaataaaaga4210
aagttcagtt ttcccccata actattcttg ggtcatgaac tttgatctgg agtttgtttt4270
gtttcaggaa tgtgtgcacc cagcttgctg atccaacaaa gtctattgct taccagtcta4330
gcttgatgaa gccttttggc cagaagtcaa tttgttttgg atcagagaaa tttcctgaca4390
aggtatattt gttttctagt gacagaaagg caaaggaaca agtcctagtt gttgttgttg4450
ttgttgaata ctaaatttaa gatatgtcag cttgctttca atgagccttg ggcttctgtt4510
attgcttgag catttggaac tcgagcttcc agagaaattt gaggtcctcg cttgttctct4570
gccttcaaga aacaatgacc tgattctgtc tttaaaaaaa aaatctcaga attctttttt4630
tgtttgtgtt tttttttttg agacagagtc tcactctgtt gcccaggctg gagtgcagtg4690
gcgccatctc ggctcactgc aacctccgcc tcccaggttc aagcaattct cctgcctcag4750
cctcccaggt agctgccact acaggtgctg caccaccacg cccggctaat ttttgtattt4810
ttagtagaga cagggtttca ccatattagc caggtgggtc ttgaactcct gaccttgtga4870
tccacccgcc tcggcctccc aaagtgctgg gattacaggc gtgagccacc ttgcctggcc4930
aaaaatctca gaattcttta agactgtttt aattgctcca tcagtaattt tgaagcactt4990
tccttttttt ttttcccctt tttgtccctt tccccaagcc accaattgga tggatgaatg5050
tttgacgggg aagaggaagg gtaggaggat gcatggatga gtggatgagt ggatcgatgg5110
atgtattgat aaatagatag aaccagtcat ctgaagcaac ttaagaattg tagccttgac5170
tccttgagac tgtagatttc gatccaggaa acatttattt agcacctgcc agatgccaga5230
aatttatacc atttaaaact cagtaagtct tttaaatatc aggaaggaga gaagcgacat5290
catgatacat cctatgggta ttaaaaagcc aatagaatat tatgaataat tttatgctaa5350
taaatttaac aacttcaaca tcataaacaa attccttgaa aaataaaaag taccaaaatt5410
cattcaagaa gaaatagata ccagcctgag caacatggca aaatcccatc tctacaaaac5470
atcaaaaaaa aaaaattagt cgggcatggt ggtgcacacc tgtaatccca gcttgtcagg5530
aggctgaagt gggaggatca cctgagccca gggaggtcaa ggatgcagtg agccatggtc5590
tcaccactgc actctagcct aggtgacaga atgagacccc gtctcaaaaa aaaagaagaa5650
gtagataatc tgaatagccc tatatctata gaaacttaat agtgctggga gatataggta5710
ttattatcct cattttacag atgtgaaaat tgaggctcag agaagtaaag tctattgctc5770
aaggtcatgt ggctagaata tggcagagcc atgattcaga tccaggtctt ctgattctta5830
ttccagtgtc ctttctagca taccatgttg cctctaaaga ttgcagctcc ttatttacta5890
gaaaattgtt cctgcccaat ctacatctcc acctcacccc atcttttctt aagcactatg5950
tttgtgtttt tatcagtatt atattcattg tctttggaat acatgttctt gtttgtgttt6010
ggaaaaaaaa tctcttttac cagcttgcac tcggaccaac ttggaaaaaa aaagcttaaa6070
tgtttttgct atgtacagtt taaaaatgtg aagtttgtag ctttaacttt ttgtaagaaa6130
atctaataac actggcttaa gtgctgactt gaaatgctat tttgtaaggt ttggatgtaa6190
gtaatcaatt gaggtcagca gtttgtatga gacatagctt cctccattgc ccccactcct6250
tttttctttt ttaagtttga gatgcttcct gtgtttttat gttagaattg ttgttctcct6310
tcttttcttc ttcctatacc tcatcacgtt tgttttaaat aaactgtcct ttggaccaca6370
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 6405
<210>14
<211>462
<212>PRT
<213>智人
<400>14
Met Glu Thr Val Gln Leu Arg Asn Pro Pro Arg Arg Gln Leu Lys Lys
1 5 10 15
Leu Asp Glu Asp Ser Leu Thr Lys Gln Pro Glu Glu Val Phe Asp Val
20 25 30
Leu Glu Lys Leu Gly Glu Gly Ser Tyr Gly Ser Val Tyr Lys Ala Ile
35 40 45
His Lys Glu Thr Gly Gln Ile Val Ala Ile Lys Gln Val Pro Val Glu
50 55 60
Ser Asp Leu Gln Glu Ile Ile Lys Glu Ile Ser Ile Met Gln Gln Cys
65 70 75 80
Asp Ser Pro His Val Val Lys Tyr Tyr Gly Ser Tyr Phe Lys Asn Thr
85 90 95
Asp Leu Trp Ile Val Met Glu Tyr Cys Gly Ala Gly Ser Val Ser Asp
100 105 110
Ile Ile Arg Leu Arg Asn Lys Thr Leu Thr Glu Asp Glu Ile Ala Thr
115 120 125
Ile Leu Gln Ser Thr Leu Lys Gly Leu Glu Tyr Leu His Phe Met Arg
130 135 140
Lys Ile His Arg Asp Ile Lys Ala Gly Asn Ile Leu Leu Asn Thr Glu
145 150 155 160
Gly His Ala Lys Leu Ala Asp Phe Gly Val Ala Gly Gln Leu Thr Asp
165 170 175
Thr Met Ala Lys Arg Asn Thr Val Ile Gly Thr Pro Phe Trp Met Ala
180 185 190
Pro Glu Val Ile Gln Glu Ile Gly Tyr Asn Cys Val Ala Asp Ile Trp
195 200 205
Ser Leu Gly Ile Thr Ala Ile Glu Met Ala Glu Gly Lys Pro Pro Tyr
210 215 220
Ala Asp Ile His Pro Met Arg Ala Ile Phe Met Ile Pro Thr Asn Pro
225 230 235 240
Pro Pro Thr Phe Arg Lys Pro Glu Leu Trp Ser Asp Asn Phe Thr Asp
245 250 255
Phe Val Lys Gln Cys Leu Val Lys Ser Pro Glu Gln Arg Ala Thr Ala
260 265 270
Thr Gln Leu Leu Gln His Pro Phe Val Arg Ser Ala Lys Gly Val Ser
275 280 285
Ile Leu Arg Asp Leu Ile Asn Glu Ala Met Asp Val Lys Leu Lys Arg
290 295 300
Gln Glu Ser Gln Gln Arg Glu ValAsp Gln Asp Asp Glu Glu Asn Ser
305 310315 320
Glu Glu Asp Glu Met Asp Ser Gly Thr Met Val Arg Ala Val Gly Asp
325 330 335
Glu Met Gly Thr Val Arg Val Ala Ser Thr Met Thr Asp Gly Ala Asn
340 345 350
Thr Met Ile Glu His Asp Asp Thr Leu Pro Ser Gln Leu Gly Thr Met
355 360 365
Val Ile Asn Ala Glu Asp Glu Glu Glu Glu Gly Thr Met Lys Arg Arg
370 375 380
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Gln Lys Glu Lys Glu Asn Gln Ile Asn Ser Phe Gly Lys Ser Val Pro
405 410 415
Gly Pro Leu Lys Asn Ser Ser Asp Trp Lys Ile Pro Gln Asp Gly Asp
420 425 430
Tyr Glu Phe Lys Thr Ser Gln Glu Gln Gln Ser Gly Lys Asp Ile Cys
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<220>
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cggcacgaga gtgagcgggt ctgggcggct gctggcagcg cc atg gag acg51
Met Glu Thr
1
gta cag ctg agg aac ccg ccg cgc cgg cag ctg aaa aag ttg gat gaa 99
Val Gln Leu Arg Asn Pro Pro Arg Arg Gln Leu Lys Lys Leu Asp Glu
5 10 15
gat agt tta acc aaa caa cca gaa gaa gta ttt gat gtc tta gag aaa 147
Asp Ser Leu Thr Lys Gln Pro Glu Glu Val Phe Asp Val Leu Glu Lys
20 25 30 35
ctt gga gaa ggg tcc tat ggc agc gta tac aaa gct att cat aaa gag 195
Leu Gly Glu Gly Ser Tyr Gly Ser Val Tyr Lys Ala Ile His Lys Glu
40 45 50
acc ggc cag att gtt gct att aag caa gtt cct gtg gaa tca gac ctc 243
Thr Gly Gln Ile Val Ala Ile Lys Gln Val Pro Val Glu Ser Asp Leu
55 60 65
cag gag ata atc aaa gaa atc tct ata atg cag caa tgt gac agc cct 291
Gln Glu Ile Ile Lys Glu Ile Ser Ile Met Gln Gln Cys Asp Ser Pro
70 75 80
cat gta gtc aaa tat tat ggc agt tat ttt aag aac aca gac tta tgg 339
His Val Val Lys Tyr Tyr Gly Ser Tyr Phe Lys Asn Thr Asp Leu Trp
85 90 95
atc gtt atg gag tac tgt ggg gct ggt tct gta tct gat atc att cga 387
Ile Val Met Glu Tyr Cys Gly Ala Gly Ser Val Ser Asp Ile Ile Arg
100 105 110 115
tta cga aat aaa acg tta aca gaa gat gaa ata gct aca ata tta caa 435
Leu Arg Asn Lys Thr Leu Thr Glu Asp Glu Ile Ala Thr Ile Leu Gln
120 125 130
tca act ctt aag gga ctt gaa tac ctt cat ttt atg aga aaa ata cac 483
Ser Thr Leu Lys Gly Leu Glu Tyr Leu His Phe Met Arg Lys Ile His
135 140 145
cga gat atc aag gca gga aat att ttg cta aat aca gaa gga cat gca 531
Arg Asp Ile Lys Ala Gly Asn Ile Leu Leu Asn Thr Glu Gly His Ala
150 155 160
aaa ctt gca gat ttt ggg gta gca ggt caa ctt aca gat acc atg gcc 579
Lys Leu Ala Asp Phe Gly Val Ala Gly Gln Leu Thr Asp Thr Met Ala
165 170 175
aag cgg aat aca gtg ata gga aca cca ttt tgg atg gct cca gaa gtg 627
Lys Arg Asn Thr Val Ile Gly Thr Pro Phe Trp Met Ala Pro Glu Val
180 185 190 195
att cag gaa att gga tac aac tgt gta gca gac atc tgg tcc ctg gga 675
Ile Gln Glu Ile Gly Tyr Asn Cys Val Ala Asp Ile Trp Ser Leu Gly
200 205 210
ata act gcc ata gaa atg gct gaa gga aag ccc cct tat gct gat atc 723
Ile Thr Ala Ile Glu Met Ala Glu Gly Lys Pro Pro Tyr Ala Asp Ile
215 220 225
cat cca atg agg gca atc ttc atg att cct aca aat cct cct ccc aca 771
His Pro Met Arg Ala Ile Phe Met Ile Pro Thr Asn Pro Pro Pro Thr
230 235 240
ttc cga aaa cca gag cta tgg tca gat aac ttt aca gat ttt gtg aaa 819
Phe Arg Lys Pro Glu Leu Trp Ser Asp Asn Phe Thr Asp Phe Val Lys
245 250 255
cag tgt ctt gta aag agc cct gag cag agg gcc aca gcc act cag ctc 867
Gln Cys Leu Val Lys Ser Pro Glu Gln Arg Ala Thr Ala Thr Gln Leu
260 265 270 275
ctg cag cac cca ttt gtc agg agt gcc aaa gga gtg tca ata ctg cga 915
Leu Gln His Pro Phe Val Arg Ser Ala Lys Gly Val Ser Ile Leu Arg
280 285 290
gac tta att aat gaa gcc atg gat gtg aaa ctg aaa cgc cag gaa tcc 963
Asp Leu Ile Asn Glu Ala Met Asp Val Lys Leu Lys Arg Gln Glu Ser
295 300 305
cag cag cgg gaa gtg gac cag gac gat gaa gaa aac tca gaa gag gat1011
Gln Gln Arg Glu Val Asp Gln Asp Asp Glu Glu Asn Ser Glu Glu Asp
310 315 320
gaa atg gat tct ggc acg atg gtt cga gca gtg ggt gat gag atg ggc1059
Glu Met Asp Ser Gly Thr Met Val Arg Ala Val Gly Asp Glu Met Gly
325 330 335
act gtc cga gta gcc agc acc atg act gat gga gcc aat act atg att1107
Thr Val Arg Val Ala Ser Thr Met Thr Asp Gly Ala Asn Thr Met Ile
340 345 350 355
gag cac gat gac acg ttg cca tca caa ctg ggc acc atg gtg atc aat1155
Glu His Asp Asp Thr Leu Pro Ser Gln Leu Gly Thr Met Val Ile Asn
360 365 370
gca gag gat gag gaa gag gaa gga act atg aaa aga agg gat gag acc1203
Ala Glu Asp Glu Glu Glu Glu Gly Thr Met Lys Arg Arg Asp Glu Thr
375 380 385
atg cag cct gcg aaa cca tcc ttt ctt gaa tat ttt gaa caa aaa gaa 1251
Met Gln Pro Ala Lys Pro Ser Phe Leu Glu Tyr Phe Glu Gln Lys Glu
390 395 400
aag gaa aac cag atc aac agc ttt ggc aag agt gta cct ggt cca ctg 1299
Lys Glu Asn Gln Ile Asn Ser Phe Gly Lys Ser Val Pro Gly Pro Leu
405 410 415
aaa aat tct tca gat tgg aaa ata cca cag gat gga gac tac gag ttt 1347
Lys Asn Ser Ser Asp Trp Lys Ile Pro Gln Asp Gly Asp Tyr Glu Phe
420 425 430 435
ctt aag agt tgg aca gtg gag gac ctt cag aag agg ctc ttg gcc ctg 1395
Leu Lys Ser Trp Thr Val Glu Asp Leu Gln Lys Arg Leu Leu Ala Leu
440 445 450
gac ccc atg atg gag cag gag att gaa gag atc cgg cag aag tac cag 1443
Asp Pro Met Met Glu Gln Glu Ile Glu Glu Ile Arg Gln Lys Tyr Gln
455 460 465
tcc aag cgg cag ccc atc ctg gat gcc ata gag gct aag aag aga cgg 1491
Ser Lys Arg Gln Pro Ile Leu Asp Ala Ile Glu Ala Lys Lys Arg Arg
470 475 480
caa caa aac ttc tgagcaa ggccaggctg tgagggcccc agctccaccc 1540
Gln Gln Asn Phe
485
aggctttggg tgaattctgg atggcttgcc tcatgtttgt tagccagcac ttctgctctg 1600
tcgtctctcc acagcacctt tgtgaactca ggaatgtgcg ccagtgggaa gggctctctt 1660
gacagtcagc gtgccatctt gatgtgtgta tgtacattgg tcaggtatat tatctcaaag 1720
gatttatatt ggcgctttta actcagagtt ttaaacccca ggaacagaga ctcctagttg 1780
agtgatagct gggaaagttt tacattgtct gtttttcttc tcccaatagc tttcaattgt 1840
tctttctgga agacttttaa aaaaatataa atatgcatat atatatataa attataaata 1900
gattccccac gcaggtggtg gcatctctgt a 1931
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<212>PRT
<213>智人
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Met Glu Thr Val Gln Leu Arg Asn Pro Pro Arg Arg Gln Leu Lys Lys
1 5 10 15
Leu Asp Glu Asp Ser Leu Thr Lys Gln Pro Glu Glu Val Phe Asp Val
20 25 30
Leu Glu Lys Leu Gly Glu Gly Ser Tyr Gly Ser Val Tyr Lys Ala Ile
35 40 45
His Lys Glu Thr Gly Gln Ile Val Ala Ile Lys Gln Val Pro Val Glu
50 55 60
Ser Asp Leu Gln Glu Ile Ile Lys Glu Ile Ser Ile Met Gln Gln Cys
65 70 75 80
Asp Ser Pro His Val Val Lys Tyr Tyr Gly Ser Tyr Phe Lys Asn Thr
85 90 95
Asp Leu Trp Ile Val Met Glu Tyr Cys Gly Ala Gly Ser Val Ser Asp
100 105 110
Ile Ile Arg Leu Arg Asn Lys Thr Leu Thr Glu Asp Glu Ile Ala Thr
115 120 125
Ile Leu Gln Ser Thr Leu Lys Gly Leu Glu Tyr Leu His Phe Met Arg
130 135 140
Lys Ile His Arg Asp Ile Lys Ala Gly Asn Ile Leu Leu Asn Thr Glu
145 150 155 160
Gly His Ala Lys Leu Ala Asp Phe Gly Val Ala Gly Gln Leu Thr Asp
165 170 175
Thr Met Ala Lys Arg Asn Thr Val Ile Gly Thr Pro Phe Trp Met Ala
180 185 190
Pro Glu Val Ile Gln Glu Ile Gly Tyr Asn Cys Val Ala Asp Ile Trp
195 200 205
Ser Leu Gly Ile Thr Ala Ile Glu Met Ala Glu Gly Lys Pro Pro Tyr
210 215 220
Ala Asp Ile His Pro Met Arg Ala Ile Phe Met Ile Pro Thr Asn Pro
225 230 235 240
Pro Pro Thr Phe Arg Lys Pro Glu Leu Trp Ser Asp Asn Phe Thr Asp
245 250 255
Phe Val Lys Gln Cys Leu Val Lys Ser Pro Glu Gln Arg Ala Thr Ala
260 265 270
Thr Gln Leu Leu Gln His Pro Phe Val Arg Ser Ala Lys Gly Val Ser
275 280 285
Ile Leu Arg Asp Leu Ile Asn Glu Ala Met Asp Val Lys Leu Lys Arg
290 295 300
Gln Glu Ser Gln Gln Arg Glu Val Asp Gln Asp Asp Glu Glu Asn Ser
305 310 315 320
Glu Glu Asp Glu Met Asp Ser Gly Thr Met Val Arg Ala Val Gly Asp
325 330 335
Glu Met Gly Thr Val Arg Val Ala Ser Thr Met Thr Asp Gly Ala Asn
340 345 350
Thr Met Ile Glu His Asp Asp Thr Leu Pro Ser Gln Leu Gly Thr Met
355 360 365
Val Ile Asn Ala Glu Asp Glu Glu Glu Glu Gly Thr Met Lys Arg Arg
370 375 380
Asp Glu Thr Met Gln Pro Ala Lys Pro Ser Phe Leu Glu Tyr Phe Glu
385 390 395 400
Gln Lys Glu Lys Glu Asn Gln Ile Asn Ser Phe Gly Lys Ser Val Pro
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Gly Pro Leu Lys Asn Ser Ser Asp Trp Lys Ile Pro Gln Asp Gly Asp
420 425 430
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435 440 445
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Met Ser Ala Ala Gly Ala Gly Ala Gly Val Glu
1 5 10
gcg ggc ttc tcc agc gag gag ctg ctc tcg ctc cgt ttc ccg ctg cac 155
Ala Gly Phe Ser Ser Glu Glu Leu Leu Ser Leu Arg Phe Pro Leu His
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cgc gcc tgc cgc gac ggg gac ctg gcc acg ctc tgc tcg ctg ctg cag 203
Arg Ala Cys Arg Asp Gly Asp Leu Ala Thr Leu Cys Ser Leu Leu Gln
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cag aca ccc cac gcc cac ctg gcc tct gag gac tcc ttc tat ggc tgg 251
Gln Thr Pro His Ala His Leu Ala Ser Glu Asp Ser Phe Tyr Gly Trp
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acg ccc gtg cac tgg gcc gcg cat ttc ggc aag ttg gag tgc tta gtg 299
Thr Pro Val His Trp Ala Ala His Phe Gly Lys Leu Glu Cys Leu Val
60 65 70 75
cag ttg gtg aga gcg gga gcc aca ctc aac gtc tcc acc aca cgg tac 347
Gln Leu Val Arg Ala Gly Ala Thr Leu Asn Val Ser Thr Thr Arg Tyr
80 85 90
gcg cag acg cca gcc cac att gca gcc ttt ggg gga cat cct cag tgc 395
Ala Gln Thr Pro Ala His Ile Ala Ala Phe Gly Gly His Pro Gln Cys
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ctg gtc tgg ctg att caa gca gga gcc aac att aac aaa ccg gat tgt 443
Leu Val Trp Leu Ile Gln Ala Gly Ala Asn Ile Asn Lys Pro Asp Cys
110 115120
gag ggt gaa act ccc att cac aag gca gct cgc tct ggg agc cta gaa 491
Glu Gly Glu Thr Pro Ile His Lys Ala Ala Arg Ser Gly Ser Leu Glu
125 130 135
tgc atc agt gcc ctt gtg gcg aat ggg gct cac gtc gat aac ccc aag 539
Cys Ile Ser Ala Leu Val Ala Asn Gly Ala His Val Asp Asn Pro Lys
140 145 150 155
aaa ggc atc agg gtt ctg gag tgg ttg ttt gag tgacacag cacaaggcct 590
Lys Gly Ile Arg Val Leu Glu Trp Leu Phe Glu
160 165
tgatttcatc atgcttttgc tgtggatgta gtgtagcttg ctgaacaggt ttatttcaca 650
gagcagtgta cattcttgtc ttccagggga acttcaacat ggagttactt ttgatccctc 710
agttttaatt cagtgtctaa agcctgagaa atgccagtgg cctgacagca gcagacattg 770
cacaaaccca gggtttccaa gagtgtgccc agtttctctt gaacctccag aattgtcatc 830
tgaaccattt ctataacaat ggcatcttaa atgggggtca tcagaatgta tttcctaatc 890
atattagtgt gggaacaaat cgaaagagat gcttggaaga ctcagaagac tttggagtaa 950
agaaagctag aactgaaggt gagaccgctt tgcgggtggg aagagcacac ttatttttcc1010
tttctgtaat atgttttctt tttatggctg agcgcacctt cgagatgaga ccttcacttc1070
aggtggtaat gcgcctggtg gattgtgcgg tgacggtgga gatttctcct gtactgccac1130
tgcgaagatg ggacacttaa caaaagggaa tgtgagggaa atactgatgg cccaagtgta1190
aatgtctatg tggaactttt tgagcaccca tgtttacctg ccgtgaatta gattttttaa1250
tttgttgtat ctgtttgaaa tatatctatt aaagaaaaaa aaaaaaaaa1299
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<212>PRT
<213>智人
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Met Ser Ala Ala Gly Ala Gly Ala Gly Val Glu Ala Gly Phe Ser Ser
1 5 10 15
Glu Glu Leu Leu Ser Leu Arg Phe Pro Leu His Arg Ala Cys Arg Asp
20 25 30
Gly Asp Leu Ala Thr Leu Cys Ser Leu Leu Gln Gln Thr Pro His Ala
35 40 45
His Leu Ala Ser Glu Asp Ser Phe Tyr Gly Trp Thr Pro Val His Trp
50 55 60
Ala Ala His Phe Gly Lys Leu Glu Cys Leu Val Gln Leu Val Arg Ala
65 70 75 80
Gly Ala Thr Leu Asn Val Ser Thr Thr Arg Tyr Ala Gln Thr Pro Ala
85 90 95
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115 120 125
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145 150 155 160
Leu Glu Trp Leu Phe Glu
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<212>DNA
<213>智人
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<221>CDS
<222>(78)..(1337)
<223>克隆no.LBFL306-GC7
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gctgcggcgg cggcttctcg agtcctcccc gacgcgtcct ctaggccagc gagccccgcg 60
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Met Ser Ala Ala Gly Ala Gly Ala Gly Val Glu
1 5 10
gcg ggc ttc tcc agc gag gag ctg ctc tcg ctc cgt ttc ccg ctg cac 158
Ala Gly Phe Ser Ser Glu Glu Leu Leu Ser Leu Arg Phe Pro Leu His
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cgc gcc tgc cgc gac ggg gac ctg gcc acg ctc tgc tcg ctg ctg cag 206
Arg Ala Cys Arg Asp Gly Asp Leu Ala Thr Leu Cys Ser Leu Leu Gln
30 35 40
cag aca ccc cac gcc cac ctg gcc tct gag gac tcc ttc tat ggc tgg 254
Gln Thr Pro His Ala His Leu Ala Ser Glu Asp Ser Phe Tyr Gly Trp
45 50 55
acg ccc gtg cac tgg gcc gcg cat ttc ggc aag ttg gag tgc tta gtg 302
Thr Pro Val His Trp Ala Ala His Phe Gly Lys Leu Glu Cys Leu Val
60 65 70 75
cag ttg gtg aga gcg gga gcc aca ctc aac gtc tcc acc aca cgg tac350
Gln Leu Val Arg Ala Gly Ala Thr Leu Asn Val Ser Thr Thr Arg Tyr
80 85 90
gcg cag acg cca gcc cac att gca gcc ttt ggg gga cat cct cag tgc398
Ala Gln Thr Pro Ala His Ile Ala Ala Phe Gly Gly His Pro Gln Cys
95 100 105
ctg gtc tgg ctg att caa gca gga gcc aac att aac aaa ccg gat tgt446
Leu Val Trp Leu Ile Gln Ala Gly Ala Asn Ile Asn Lys Pro Asp Cys
110 115 120
gag ggt gaa act ccc att cac aag gca gct cgc tct ggg agc cta gaa494
Glu Gly Glu Thr Pro Ile His Lys Ala Ala Arg Ser Gly Ser Leu Glu
125 130 135
tgc atc agt gcc ctt gtg gcg aat ggg gct cac gtc gac ctg aga aat542
Cys Ile Ser Ala Leu Val Ala Asn Gly Ala His Val Asp Leu Arg Asn
140 145 150 155
gcc agt ggc ctg aca gca gca gac att gca caa acc cag ggt ttc caa590
Ala Ser Gly Leu Thr Ala Ala Asp Ile Ala Gln Thr Gln Gly Phe Gln
160 165 170
gag tgt gcc cag ttt ctc ttg aac ctc cag aat tgt cat ctg aac cat638
Glu Cys Ala Gln Phe Leu Leu Asn Leu Gln Asn Cys His Leu Asn His
175 180 185
ttc tat aac aat ggc atc tta aat ggg ggt cat cag aat gta ttt cct686
Phe Tyr Asn Asn Gly Ile Leu Asn Gly Gly His Gln Asn Val Phe Pro
190 195 200
aat cat att agt gtg gga aca aat cga aag aga tgc ttg gaa gac tca734
Asn His Ile Ser Val Gly Thr Asn Arg Lys Arg Cys Leu Glu Asp Ser
205 210 215
gaa gac ttt gga gta aag aaa gct aga act gaa gct caa agc ttg gat782
Glu Asp Phe Gly Val Lys Lys Ala Arg Thr Glu Ala Gln Ser Leu Asp
220 225 230 235
tct gcc gtg cca ctc acg aat ggc gac aca gaa gac gat gct gac aaa830
Ser Ala Val Pro Leu Thr Asn Gly Asp Thr Glu Asp Asp Ala Asp Lys
240 245 250
atg cac gtt gat agg gag ttt gct gtt gta aca gat atg aaa aac agt878
Met His Val Asp Arg Glu Phe Ala Val Val Thr Asp Met Lys Asn Ser
255 260 265
agc tcc gta tcg aat aca ttg aca aat gga tgt gtc atc aat gga cat 926
Ser Ser Val Ser Asn Thr Leu Thr Asn Gly Cys Val Ile Asn Gly His
270 275 280
ttg gac ttc ccc tcc acg acc ccg ctc agt ggg atg gaa agc agg aat 974
Leu Asp Phe Pro Ser Thr Thr Pro Leu Ser Gly Met Glu Ser Arg Asn
285 290 295
ggc cag tgc ttg aca gga act aac gga att agc agt gga tta gcc cca 1022
Gly Gln Cys Leu Thr Gly Thr Asn Gly Ile Ser Ser Gly Leu Ala Pro
300 305 310 315
gga cag ccg ttt ccg agt agc cag ggt tct ctc tgc att agt ggg act 1070
Gly Gln Pro Phe Pro Ser Ser Gln Gly Ser Leu Cys Ile Ser Gly Thr
320 325 330
gag gag cca gag aag acc ctg aga gct aac cct gag ttg tgc ggt tct 1118
Glu Glu Pro Glu Lys Thr Leu Arg Ala Asn Pro Glu Leu Cys Gly Ser
335 340 345
ctg cac ctg aac ggg agt cca agt agc tgc ata gcc agt agg cct tcc 1166
Leu His Leu Asn Gly Ser Pro Ser Ser Cys Ile Ala Ser Arg Pro Ser
350 355 360
tgg gtg gaa gac att ggg gat aac ctg tac tat gga cac tac cac ggg 1214
Trp Val Glu Asp Ile Gly Asp Asn Leu Tyr Tyr Gly His Tyr His Gly
365 370 375
ttt ggg gac act gct gaa agc atc cca gaa ctg aac agt gtg gtc gag 1262
Phe Gly Asp Thr Ala Glu Ser Ile Pro Glu Leu Asn Ser Val Val Glu
380 385 390 395
cat tcc aag tcc gtg aag gtg cag gag cgg tac gac agt gcc gtg ctg 1310
His Ser Lys Ser Val Lys Val Gln Glu Arg Tyr Asp Ser Ala Val Leu
400 405 410
ggc acc atg cac ctg cac cac ggc tcc tag agacgctgac ctggctctcg1360
Gly Thr Met His Leu His His Gly Ser
415 420
gaaacgcagg agtccttcct ggtagccagc tcagaatacc catgtagcag caacttgaac1420
gaatgtcaca acttgtacgt tttttatata cttcaacttt ctgaaaaagt aaacttcgac1480
aagttcccag caactgcttg tttgtgcatg agtagggctt actaagtgca tagatgtttc1540
tacagtgagg tgtccttttt ataaggtgca cttttggagt tcttctgatg ccaatctcaa1600
cattgtcttt ttaatactgt caccagatat tgccattttt ctttttgtta aaagattata1660
tgatcaagat aaattggggt ggtaaatcag gtgcctggta atttatctct ttgcacatgg1720
gcatcatttt aaaaagcttg cttccactct tttctgtaga atttgacgga acacagctat1780
ttccctatgc aaggtacagc cttacaaaga tttctgcagt gatttgtgtg aagaagagaa1840
cgtttgtctt tttcaatgaa gctttgcaga tcaccatgtg gttgaaggtt ttagttgtgg1900
acacagtggt ccctccttaa tgatgaagat cactgccttg ggcttcatgg aaaacaggcc1960
cagcctgggg ctgcgtttgg atttattgtt tttattccac acttcctact tggtctctgg2020
aagttttacc acatgtaaca gattccttta tatgtagtgg aaatcactat ttgtagaaac2080
tgtcaggtca aaatatttaa ctgactgttg acatgtattt tcttttttcc ttgtttttgt2140
tttttagggt tttctgcttt aagatatata ccactatgta tatccagtta actgagagaa2200
ttttgactct cttaataaaa ctgcattaag tttttgattt tgtagaaatt agcttttgtc2260
taggcaacta gtggttatac tctgcaaata ttgtaatgaa tttttacttt tttgattttt2320
gtaataaaaa ttggtgcaga taaaatgtca aatgaacaaa ccagtgttct aagagtgtta2380
ctaacatttt gttctaaaac tgtccttcac aaattgaata aaaaactctc acactcaaaa2440
aaaaaaaaaa a 2451
<210>20
<211>420
<212>PRT
<213>智人
<400>20
Met Ser Ala Ala Gly Ala Gly Ala Gly Val Glu Ala Gly Phe Ser Ser
1 5 10 15
Glu Glu Leu Leu Ser Leu Arg Phe Pro Leu His Arg Ala Cys Arg Asp
20 25 30
Gly Asp Leu Ala Thr Leu Cys Ser Leu Leu Gln Gln Thr Pro His Ala
35 40 45
His Leu Ala Ser Glu Asp Ser Phe Tyr Gly Trp Thr Pro Val His Trp
50 55 60
Ala Ala His Phe Gly Lys Leu Glu Cys Leu Val Gln Leu Val Arg Ala
65 70 75 80
Gly Ala Thr Leu Asn Val Ser Thr Thr Arg Tyr Ala Gln Thr Pro Ala
85 90 95
His Ile Ala Ala Phe Gly Gly His Pro Gln Cys Leu Val Trp Leu Ile
100 105 110
Gln Ala Gly Ala Asn Ile Asn Lys Pro Asp Cys Glu Gly Glu Thr Pro
115 120 125
Ile His Lys Ala Ala Arg Ser Gly Ser Leu Glu Cys Ile Ser Ala Leu
130 135 140
Val Ala Asn Gly Ala His Val Asp Leu Arg Asn Ala Ser Gly Leu Thr
145 150 155 160
Ala Ala Asp Ile Ala Gln Thr Gln Gly Phe Gln Glu Cys Ala Gln Phe
165 170 175
Leu Leu Asn Leu Gln Asn Cys His Leu Asn His Phe Tyr Asn Asn Gly
180 185 190
Ile Leu Asn Gly Gly His Gln Asn Val Phe Pro Asn His Ile Ser Val
195 200 205
Gly Thr Asn Arg Lys Arg Cys Leu Glu Asp Ser Glu Asp Phe Gly Val
210 215 220
Lys Lys Ala Arg Thr Glu Ala Gln Ser Leu Asp Ser Ala Val Pro Leu
225 230 235 240
Thr Asn Gly Asp Thr Glu Asp Asp Ala Asp Lys Met His Val Asp Arg
245 250 255
Glu Phe Ala Val Val Thr Asp Met Lys Asn Ser Ser Ser Val Ser Asn
260 265 270
Thr Leu Thr Asn Gly Cys Val Ile Asn Gly His Leu Asp Phe Pro Ser
275 280 285
Thr Thr Pro Leu Ser Gly Met Glu Ser Arg Asn Gly Gln Cys Leu Thr
290 295 300
Gly Thr Asn Gly Ile Ser Ser Gly Leu Ala Pro Gly Gln Pro Phe Pro
305 310 315 320
Ser Ser Gln Gly Ser Leu Cys Ile Ser Gly Thr Glu Glu Pro Glu Lys
325 330 335
Thr Leu Arg Ala Asn Pro Glu Leu Cys Gly Ser Leu His Leu Asn Gly
340 345 350
Ser Pro Ser Ser Cys Ile Ala Ser Arg Pro Ser Trp Val Glu Asp Ile
355 360 365
Gly Asp Asn Leu Tyr Tyr Gly His Tyr His Gly Phe Gly Asp Thr Ala
370 375 380
Glu Ser Ile Pro Glu Leu Asn Ser Val Val Glu His Ser Lys Ser Val
385 390 395 400
Lys Val Gln Glu Arg Tyr Asp Ser Ala Val Leu Gly Thr Met His Leu
405 410 415
His His Gly Ser
420
<210>21
<211>1194
<212>DNA
<213>智人
<220>
<221>CDS
<222>(78)..(737)
<223>克隆no.LBFL-306-GE2
<400>21
gctgcggcgg cggcttctcg agtcctcccc gacgcgtcct ctaggccagc gagccccgcg60
ctctccggtg acggaccatg tcg gcg gcg gga gcg ggc gcg ggc gta gag110
Met Ser Ala Ala Gly Ala Gly Ala Gly Val Glu
1 5 10
gcg ggc ttc tcc agc gag gag ctg ctc tcg ctc cgt ttc ccg ctg cac 158
Ala Gly Phe Ser Ser Glu Glu Leu Leu Ser Leu Arg Phe Pro Leu His
15 20 25
cgc gcc tgc cgc gac ggg gac ctg gcc acg ctc tgc tcg ctg ctg cag206
Arg Ala Cys Arg Asp Gly Asp Leu Ala Thr Leu Cys Ser Leu Leu Gln
30 35 40
cag aca ccc cac gcc cac ctg gcc tct gag gac tcc ttc tat ggc tgg254
Gln Thr Pro His Ala His Leu Ala Ser Glu Asp Ser Phe Tyr Gly Trp
45 50 55
acg ccc gtg cac tgg gcc gcg cat ttc ggc aag ttg gag tgc tta gtg302
Thr Pro Val His Trp Ala Ala His Phe Gly Lys Leu Glu Cys Leu Val
60 65 70 75
cag ttg gtg aga gcg gga gcc aca ctc aac gtc tcc acc aca cgg tac 350
Gln Leu Val Arg Ala Gly Ala Thr Leu Asn Val Ser Thr Thr Arg Tyr
80 85 90
gcg cag acg cca gcc cac att gca gcc ttt ggg gga cat cct cag tgc 398
Ala Gln Thr Pro Ala His Ile Ala Ala Phe Gly Gly His Pro Gln Cys
95 100 105
ctg gtc tgg ctg att caa gca gga gcc aac att aac aaa ccg gat tgt 446
Leu Val Trp Leu Ile Gln Ala Gly Ala Asn Ile Asn Lys Pro Asp Cys
110 115 120
gag ggt gaa act ccc att cac aag gca gct cgc tct ggg agc cta gaa 494
Glu Gly Glu Thr Pro Ile His Lys Ala Ala Arg Ser Gly Ser Leu Glu
125 130 135
tgc atc agt gcc ctt gtg gcg aat ggg gct cac gtc gag ttt att tca 542
Cys Ile Ser Ala Leu Val Ala Asn Gly Ala His Val Glu Phe Ile Ser
140 145 150 155
cag agc agt gta cat tct tgt ctt cca ggg gaa ctt caa cat gga gtt 590
Gln Ser Ser Val His Ser Cys Leu Pro Gly Glu Leu Gln His Gly Val
160 165 170
act ttt gat ccc tca gtt tta att cag tgt cta aag cct gag aaa tgc 638
Thr Phe Asp Pro Ser Val Leu Ile Gln Cys Leu Lys Pro Glu Lys Cys
175 180 185
cag tgg cct gac agc agc aga cat tgc aca aac cca ggg ttt cca aga 686
Gln Trp Pro Asp Ser Ser Arg His Cys Thr Asn Pro Gly Phe Pro Arg
190 195 200
gtg tgc cca gtt tct ctt gaa cct cca gaa ttg tca tct gaa cca ttt 734
Val Cys Pro Val Ser Leu Glu Pro Pro Glu Leu Ser Ser Glu Pro Phe
205 210 215
ctataa caatggcatc ttaaatgggg gtcatcagaa tgtatttcct aatcatatta790
Leu
220
gtgtgggaac aaatcgaaag agatgcttgg aagactcaga agactttgga gtaaagaaag850
ctagaactga aggtgagacc gctttgcggg tgggaagagc acacttattt ttcctttctg910
taatatgttt tctttttatg gctgagcgca ccttcgagat gagaccttca cttcaggtgg970
taatgcgcct ggtggattgt gcggtgacgg tggagatttc tcctgtactg ccactgcgaa 1030
gatgggacac ttaacaaaag ggaatgtgag ggaaatactg atggcccaag tgtaaatgtc1090
tatgtggaac tttttgagca cccatgttta cctgccgtga attagatttt ttaatttgtt1150
gtatctgttt gaaatatatc tattaaagaa aaaaaaaaaa aaaa 1194
<210>22
<211>220
<212>PRT
<213>智人
<400>22
Met Ser Ala Ala Gly Ala Gly Ala Gly Val Glu Ala Gly Phe Ser Ser
1 5 10 15
Glu Glu Leu Leu Ser Leu Arg Phe Pro Leu Hi s Arg Ala Cys Arg Asp
20 25 30
Gly Asp Leu Ala Thr Leu Cys Ser Leu Leu Gln Gln Thr Pro His Ala
35 40 45
His Leu Ala Ser Glu Asp Ser Phe Tyr Gly Trp Thr Pro Val His Trp
50 55 60
Ala Ala His Phe Gly Lys Leu Glu Cys Leu Val Gln Leu Val Arg Ala
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Gly Ala Thr Leu Asn Val Ser Thr Thr Arg Tyr Ala Gln Thr Pro Ala
85 90 95
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100 105 110
Gln Ala Gly Ala Asn Ile Asn Lys Pro Asp Cys Glu Gly Glu Thr Pro
115 120 125
Ile His Lys Ala Ala Arg Ser Gly Ser Leu Glu Cys Ile Ser Ala Leu
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Val Ala Asn Gly Ala His Val Glu Phe Ile Ser Gln Ser Ser Val His
145 150 155 160
Ser Cys Leu Pro Gly Glu Leu Gln His Gly Val Thr Phe Asp Pro Ser
165 170 175
Val Leu Ile Gln Cys Leu Lys Pro Glu Lys Cys Gln Trp Pro Asp Ser
180 185 190
Ser Arg His Cys Thr Asn Pro Gly Phe Pro Arg Val Cys Pro Val Ser
195 200205
Leu Glu Pro Pro Glu Leu Ser Ser Glu Pro Phe Leu
210 215 220
權(quán)利要求
1.一種分離的核酸分子，該分離的核酸分子選自(a)含有SEQID NO3，5，7，9，11，13，17或19的分離核酸分子；(b)編碼SEQID NO4，14或18的氨基酸序列的分離核酸分子；(c)編碼在胃癌中被表達(dá)的蛋白并與SEQ ID NO3或17的全長(zhǎng)具有至少約92％核苷酸序列相同性的分離核酸分子；(d)編碼在胃癌中被表達(dá)的蛋白并與SEQID NO13的全長(zhǎng)具有至少約95％核苷酸序列相同性的分離核酸分子；(e)含有(a)，(b)，(c)或(d)的核酸分子的互補(bǔ)鏈的分離核酸分子。
2.如權(quán)利要求1所述的分離的核酸分子，其中所述核酸分子含有SEQ ID NO3的174-584位核苷酸。
3.如權(quán)利要求1所述的分離的核酸分子，其中所述核酸分子由SEQ ID NO3的174-584位核苷酸組成。
4.如權(quán)利要求1所述的分離的核酸分子，其中所述核酸分子包含SEQ ID NO3的174-587位核苷酸。
5.如權(quán)利要求1所述的分離的核酸分子，其中所述核酸分子選自以下由SEQ ID NO5的38-892位核苷酸組成的核酸分子和由SEQID NO5的38-895位核苷酸組成的核酸分子。
6.如權(quán)利要求1所述的分離的核酸分子，其中所述核酸分子選自以下由SEQ ID NO7的53-892位核苷酸組成的核酸分子和由SEQID NO7的53-895位核苷酸組成的核酸分子。
7.如權(quán)利要求1所述的分離的核酸分子，其中所述核酸分子選自以下由SEQ ID NO9的65-892位核苷酸組成的核酸分子和由SEQID NO9的65-895位核苷酸組成的核酸分子。
8.如權(quán)利要求1所述的分離的核酸分子，其中所述核酸分子選自以下由SEQ ID NO11的92-892位核苷酸組成的核酸分子和由SEQ ID NO11的92-895位核苷酸組成的核酸分子。
9.如權(quán)利要求1所述的分離的核酸分子，其中所述核酸分子含有SEQ ID NO13的49-1434位核苷酸。
10.如權(quán)利要求1所述的分離的核酸分子，其中所述核酸分子由SEQ ID NO13的49-1437位核苷酸組成。
11.如權(quán)利要求1所述的分離的核酸分子，其中所述核酸分子含有SEQ ID NO13的49-1437位核苷酸。
12.如權(quán)利要求1所述的分離的核酸分子，其中所述核酸分子含有SEQ ID NO17的75-575位核苷酸。
13.如權(quán)利要求1所述的分離的核酸分子，其中所述核酸分子由SEQ ID NO17的75-575位核苷酸組成。
14.如權(quán)利要求1所述的分離的核酸分子，其中所述核酸分子含有SEQ ID NO17的75-572位核苷酸。
15.如權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)所述的分離的核酸分子，其中所述核酸分子與一個(gè)或多個(gè)表達(dá)控制元件進(jìn)行可操作性的連接。
16.一種含有權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)所述的分離的核酸分子的載體。
17.一種被轉(zhuǎn)化而含有權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)所述的核酸分子的宿主細(xì)胞。
18.一種含有權(quán)利要求16的載體的宿主細(xì)胞。
19.如權(quán)利要求18所述的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞選自原核宿主細(xì)胞和真核宿主細(xì)胞。
20.一種用于生產(chǎn)多肽或蛋白的方法，包括在由核酸編碼的所述多肽或蛋白表達(dá)的條件下培養(yǎng)被權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)所述的核酸分子轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
21.如權(quán)利要求20所述的方法，其中所述宿主細(xì)胞選自原核宿主細(xì)胞和真核宿主細(xì)胞。
22.一種由權(quán)利要求21所述的方法生產(chǎn)的分離的多肽或蛋白。
23.一種分離的多肽或蛋白，選自以下(a)含SEQ ID NO4，6，8，10，12，14或18的氨基酸序列的分離多肽或蛋白；(b)與SEQ IDNO4具有至少約92％氨基酸序列相同性的分離多肽或蛋白；(c)由SEQID NO4的31-137位氨基酸組成的分離多肽或蛋白；(d)含SEQ ID NO6，8，10或12的至少10個(gè)氨基酸的片段的分離多肽；(e)含SEQ IDNO6，8，10或12的保守氨基酸取代物的分離多肽；(f)含SEQ ID NO6，8，10或12的自然存在的氨基酸序列變異體的分離多肽；(g)與SEQID NO6，8，10或12具有至少約75％氨基酸序列相同性的分離多肽；(h)與SEQ ID NO14具有至少約95％氨基酸序列相同性的分離多肽或蛋白；和(i)與SEQ ID NO18具有至少約92％氨基酸序列相同性的分離多肽或蛋白。
24.一種與權(quán)利要求23所述的多肽或蛋白結(jié)合的或與含有SEQ IDNO2的氨基酸序列的分離多肽或蛋白結(jié)合的分離的抗體或抗原-結(jié)合型抗體片段。
25.如權(quán)利要求24所述的抗體，其中所述抗體是單克隆或多克隆抗體。
26.調(diào)控編碼權(quán)利要求23的蛋白、含SEQ ID NO2，20或22所示氨基酸序列的蛋白、或Mst1蛋白或Mst1剪接變體蛋白的核酸分子表達(dá)的介質(zhì)的鑒定方法，該方法包括
使表達(dá)所述核酸的細(xì)胞與所述介質(zhì)接觸；和
確定所述介質(zhì)是否調(diào)控所述核酸的表達(dá)，從而鑒定出調(diào)控編碼所述蛋白的核酸分子的表達(dá)的介質(zhì)。
27.調(diào)控權(quán)利要求23的蛋白、含SEQ ID NO2，20或22所示氨基酸序列的蛋白、或Mst1蛋白或Mst1剪接變體蛋白的水平或至少一種活性的介質(zhì)的鑒定方法，該方法包括
使表達(dá)所述蛋白的細(xì)胞與所述介質(zhì)接觸；和
確定所述介質(zhì)是否調(diào)控所述蛋白的水平或至少一種活性，從而鑒定出調(diào)控所述蛋白的水平或至少一種活性的介質(zhì)。
28.如權(quán)利要求27的方法，其中所述介質(zhì)調(diào)控所述蛋白的一種活性。
29.一種鑒定權(quán)利要求23的蛋白或含SEQ ID NO2所示氨基酸序列的蛋白的結(jié)合配偶體的方法，該方法包括以下步驟
使所述蛋白與潛在的結(jié)合配偶體接觸；和
確定所述潛在的結(jié)合配偶體是否與所述蛋白結(jié)合，從而鑒定出所述蛋白的結(jié)合配偶體。
30.對(duì)編碼權(quán)利要求23的蛋白、含SEQ ID NO2，20或22所示氨基酸序列的蛋白、或Mst1蛋白或Mst1剪接變體蛋白的核酸分子的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控的方法，該方法包括以下步驟
施用有效量的調(diào)控編碼所述蛋白的核酸分子的表達(dá)的介質(zhì)。
31.對(duì)權(quán)利要求23的蛋白、含SEQ ID NO2，20或22所示氨基酸序列的蛋白、或Mst1蛋白或Mst1剪接變體蛋白的至少一種活性進(jìn)行調(diào)控的方法，該方法包括以下步驟
施用有效量的調(diào)控所述蛋白的至少一種活性的介質(zhì)。
32.一種經(jīng)修飾而含有權(quán)利要求1-14中的任一項(xiàng)所述的核酸分子的非人類轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。
33.如權(quán)利要求32所述的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，其中所述核酸分子含有防止被編碼蛋白進(jìn)行表達(dá)的突變。
34.在受試者中診斷疾病狀態(tài)的方法，包括
確定權(quán)利要求1-14中的任一項(xiàng)所述的核酸分子或編碼Mst1蛋白或Mst1剪接變體蛋白的核酸分子的表達(dá)水平，或者確定權(quán)利要求23的蛋白或含SEQ ID NO2，20或22所示氨基酸序列的蛋白或Mst1蛋白或Mst1剪接變體蛋白的表達(dá)水平。
35.如權(quán)利要求34所述的方法，其中所述疾病狀態(tài)是胃癌。
36.如權(quán)利要求34所述的方法，其中所述疾病狀態(tài)是晚期胃癌。
37.如權(quán)利要求34所述的方法，其中所述疾病狀態(tài)是惡性腫瘤。
38.如權(quán)利要求37所述的方法，其中所述惡性腫瘤發(fā)生在軟組織、骨頭、乳房、子宮頸、結(jié)腸、子宮內(nèi)膜、食道、腎、喉、肝臟、肺、網(wǎng)膜、卵巢、胰腺、直腸、甲狀腺、子宮肌層、前列腺、皮膚、小腸、膀胱、脾或胃。
39.如權(quán)利要求16-21或24-25中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述剪接變體是SEQ ID NO13或SEQ ID NO14。
40.含有稀釋劑和多肽或蛋白的組合物，其中所述多肽或蛋白選自以下(a)含SEQ ID NO4，6，8，10，12，14，18，20或22所示氨基酸序列的分離多肽或蛋白；(b)與SEQ ID NO4或18具有至少約92％氨基酸序列相同性的分離多肽或蛋白；(c)由SEQ ID NO4的31-137位氨基酸組成的分離多肽或蛋白；(d)含SEQ ID NO6，8，10或12的至少10個(gè)氨基酸的片段的分離多肽；(e)含SEQ ID NO6，8，10或12的保守氨基酸取代物的分離多肽；(f)含SEQ ID NO6，8，10或12的自然存在的氨基酸序列變異體的分離多肽；(g)與SEQ ID NO6，8，10或12具有至少約75％氨基酸序列相同性的分離多肽；(h)與SEQ ID NO14具有至少約95％氨基酸序列相同性的分離多肽。
全文摘要
本發(fā)明一般涉及胃癌中的基因表達(dá)的變化。本發(fā)明具體涉及對(duì)應(yīng)于mRNA的人類基因家族，所述mRNA在癌性胃組織和正常胃組織中進(jìn)行差異表達(dá)。
文檔編號(hào)C07K14/47GK1681835SQ0382197
公開日2005年10月12日 申請(qǐng)日期2003年8月14日 優(yōu)先權(quán)日2002年8月14日
發(fā)明者高祥錫, 劉晴, 鄭賢鎬, 曾文, 李福萬(wàn), 宋始英 申請(qǐng)人:株式會(huì)社Lg生命科學(xué)