專利名稱：在甲醇酵母PichiaPastoris中表達重組牛生長激素的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及在甲醇酵母Pichia Pastoris中表達重組牛生長激素(bovineGrowth Hormone，bGH)。二十世紀七十年代，菲利普石油公司就利用P.Pastoris在連續(xù)培養(yǎng)基上進行高密度發(fā)酵，每升細胞干重可達130mg蛋白的表達體系。在近二十年的開發(fā)使用中，P.Pastoris已用于許多外源基因的表達，比其他真核表達系統(tǒng)相比具有快捷，方便，和便宜的特點，而且通常能得到更高的表達量。P.pastoris酵母分泌型表達體系具有如下幾個明顯的優(yōu)點(1)高表達量在醇脫氫酶啟動子的啟動作用下，酵母細胞可高效啟動其后目的基因的轉錄、表達。
(2)高穩(wěn)定性外援基因?qū)虢湍负蟛皇且宰灾鲝椭频男问酱嬖?，而是整合人酵母的染色體上，因此表達菌株穩(wěn)定。
(3)高分泌性利用S.Cerevisiae的α-factor因子分泌和信號肽序列將外源蛋白分泌出胞外，產(chǎn)生極少量的酵母自身蛋白，使分泌的外源蛋白極易純化。
(4)表達出有活性的蛋白，且有合適的糖基化或磷酸化修飾作用。
本發(fā)明構建一種能夠在胞內(nèi)或胞外高效表達牛生長激素的酵母工程菌Pichia Pastoris，可以作為餌料添加劑。
以下是具體方法的詳細描述本發(fā)明通過PCR方法從牛腦cDNA中克隆了生長激素基因并插入pPIC9k質(zhì)粒載體，電擊轉化到甲醇營養(yǎng)型酵母GS115中，經(jīng)不同濃度的G418篩選得到高拷貝插入的重組菌株，表型為His+Mut+。Western Blotting、SDS-PAGE電泳等實驗證明表達產(chǎn)物存在于表達上清中，蛋白可以和生長激素多抗結合。在搖瓶表達培養(yǎng)基中以甲醇誘導外源基因的表達，表達上清經(jīng)50kDa和3kDa超濾膜純化后再經(jīng)S-Sepharose Fast Flow及Sephadex-G25幾步純化后，得到蛋白重組牛生長激素。重組牛生長激素的純化流程的整體流程圖如圖2所示。
一.材料1.載體與菌株DH5α菌株，pPIC9K及P.pastoris蛋白表達系統(tǒng) 美國Invitrogen公司。
2.試劑SCED山梨醇1M，檸檬酸納(pH7.5)10mM，EDTA 10mM，DTT 10mM酵母氮源堿基(YNB)Difco Laborotories，層析介質(zhì) Pharmacia公司。
玻璃奶(Glass Milk)DNA純化試劑盒 華綠淵公司DNA分子量標準Takara公司蛋白分子量標準 Promega公司限制性內(nèi)切酶，DNA Ligase Britain Biolab公司Taq-plusDNA聚合酶及PCR引物 上海生物工程公司。
3.培養(yǎng)基酵母YPD培養(yǎng)基酵母抽提物1％，蛋白胨2％，葡萄糖2％酵母MGY培養(yǎng)基甘油1％，酵母抽提物1％，蛋白胨2％，YNB1.34％，生物素4×10-5％酵母MM培養(yǎng)基酵母氮源堿基1.34％，生物素4×10-5％，甲醇0.5％酵母MD培養(yǎng)基YNB1.34％，生物素4×10-5％，葡萄糖2％MM，MD及YPD固體培養(yǎng)基都加入1.5％瓊脂二.方法(一)牛生長激素在甲醇酵母中的克隆1.牛生長激素表達載體的構建牛生長激素的基因序列為SEQUENCE LISTING<110>任，宏偉韓，鐵鋼<120>在甲醇酵母PichiaPastoris中表達重組牛生長激素<130>補正書(初步審查程序)<140>2003101001982<141>2004-01-12<150>2003101001982<151>2003-10-17<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>786
<212>DNA<213>Bos taurus<400>1acggctcagg gtccgtgacg ctcaccagct atgatggctg caggcccccg gacctccctg60ctcctggctt tcgccctgct ctgcctgccc tggactcagg tggtgggcgc cttcccagcc 120atgtccttgt ccggcctgtt tgccaacgct gtgctccggg ctcagcacct ccaccagctg 180gctgctgaca ccttcaaaga gtttgagcgt acctacatcc ccgagggaca gagatactcc 240atccagaaca cccaggttgc cttctgcttc tccgaaacca tcccggcccc cacgggcaag 300aatgaggccc agcagaaatc agacttggag ctgcttcgca tctcactgct cctcatccag 360tcgtggcttg ggcccctgca gtttctcagc agagtcttca ccaacagctt ggtgtttggc 420acctcggacc gtgtctatga gaagctgaag gacctggagg aaggcatctt ggccctgatg 480cgggagctgg aagatggcac cccccgggct gggcagatcc tcaagcagac ctatgacaaa 540tttgacacaa acatgcgcag tgacgacgcg ctgctcaaga actacggtct gctctcctgc 600ttccggaagg acctgcataa gaccgagacg tacctgaggg tcatgaagtg ccgccgcttc 660ggggaggcca gctgtgcctt ctagttgcca gccatctgtt gtttgcccct cccccgtgcc 720ttccttgacc ctggaaggtg ccactcccac tgtcctttcc taataaaatg aggaaattgc 780atcgca 786合成的引物用無菌水稀釋到5mM，在Taq-plus DNA聚合酶的作用下，以牛腦cDNA為模板進行PCR反應，經(jīng)2％瓊脂糖凝膠電泳檢測反應產(chǎn)物條帶。挑選一種陽性克隆產(chǎn)物，經(jīng)EcoRI和XhoI雙酶切后用玻璃奶在2％的瓊脂糖凝膠上回收目的片段，然后連入EcoRI和XhoI雙酶切的pPIC9K質(zhì)粒，并轉染感受態(tài)的大腸桿菌DH5α，氨芐平板挑取單克隆，用質(zhì)粒pPIC9K上的測序引物進行擴增驗證目的片段插入，然后進行基因測序進一步鑒定插入片段。用不含插入片段的載體質(zhì)粒作為負對照。PCR反應條件如下94℃，1min；56℃，1min；72℃，1min，30循環(huán)。構建方法如

圖1所示。
2.表達載體在酵母菌GS115中的整合2.1酵母感受態(tài)細胞的制備1.在3ml YPD中培養(yǎng)酵母菌GS115種子液過夜。
2.在500ml錐形瓶中加入50mlYPD，接入0.1ml上述種子液，30℃培養(yǎng)至OD600約為1.3-1.5。
3.將培養(yǎng)液于4℃，1500g離心5min，去除上清，然后用50ml冰預冷的蒸餾水重懸細胞。
4.重復步驟3再次離心，細胞重懸于20ml冰預冷的蒸餾水，離心，細胞重懸于50ml冰預冷的1M山梨醇，再次離心，細胞重懸于0.2ml山梨醇，置于冰上，感受態(tài)細胞現(xiàn)用現(xiàn)制。
2.2轉化質(zhì)粒的線性化提取約20μg pPIC9K-牛生長激素質(zhì)粒DNA，用SalI單酶切，電泳檢測酶切完全后，用酚仿抽提，乙醇沉淀回收DNA，溶于10μl ddH2O中。
2.3酵母感受態(tài)細胞的電擊轉化1.將0.1ml的感受態(tài)細胞與5-20μg的線性化DNA混合后轉移至冰預冷的電擊杯中。
2.用電擊儀進行轉化，轉化條件如下電壓1500V，電容50μF，電阻200Ω。在0.2cm的電擊杯中，此條件下可達到每厘米7500V的電壓，持續(xù)7-10mS。
3.電擊后立即在杯中加入1ml冰預冷的1M山梨醇。將杯中的混合物轉移至一無菌微量離心管中。在30℃溫育1個小時，不要振動。
4.吸取200-500μl轉化產(chǎn)物，涂在MD培養(yǎng)基，30℃保溫2-3天后長出的菌落全部為His+重組子。
3.His+/Mut+表型菌及高拷貝插入菌株的篩選和鑒定3.1His+/Mut+表型菌的篩選鑒定由于His+重組子中會出現(xiàn)Mut+和Muts兩種基因型，為了選擇His+/Mut+表型菌，我們將第一步篩到的His+菌體同時點種到MM和MD平板上，根據(jù)Mut+和Muts兩種表型在MM(碳源為甲醇)培養(yǎng)基上和MD(碳源為葡萄糖)培養(yǎng)基上的生長狀態(tài)的差異，區(qū)分出Mut+和Muts。Mut+可以快速利用甲醇為C源，因而在MD和MM兩種平板上的生長狀況無差別；而Muts利用甲醇的速度遠遠低于利用葡萄糖的速度，因此生長一段時間后同一菌落在不同平板上的大小有明顯差異，根據(jù)這種方法區(qū)分出His+Mut+和His+Muts轉化子。挑取His+轉化子同時接入MM及MD平板，30℃培養(yǎng)2-3天后，MD上出現(xiàn)菌落而MM上無菌落者或者較小菌落者為Muts型，否則為Mut+。
3.2高拷貝插入菌株的篩選從MM和MD培養(yǎng)基上篩選出的His+Mut+菌落約400-500株左右，挑取各個單菌落于含有0.5、1.0、2.0、3.0、4.0g/L G418的YPD平板上進行逐級篩選，3-5天可以在不同濃度的G418平板上長出菌落。
3.3轉化子的PCR鑒定挑取最高濃度G418平板上長出的單菌落，按如下方法提取酵母基因組DNA1.在10mL MD上28℃培養(yǎng)高濃度抗性菌至OD600＝5～10，1500g室溫下離心5-10分鐘。
2.用10mL H2O洗滌菌體后，室溫下1500g再次離心5-10分鐘。
3.重懸細胞于2mL新配置的SCED溶液，加入0.1mg溶菌酶，37℃放置50分鐘。
4.加入2mL 1％的SDS溶液，輕輕振勻，冰浴5分鐘。
5.加入1.5mL 5M KAc，4℃ 1000g離心5分鐘。
6.上清加入2倍體積的無水乙醇，室溫下1000g離心15分鐘。
7.用70％乙醇洗滌一次后再次離心，沉淀37℃烘干后溶于200μl TE待用。
以提取的各基因組DNA為模板，用AOX1 5’和3’引物進行PCR反應，鑒定陽性重組子，用含插入基因的重組質(zhì)粒作為正對照。PCR反應條件如下94℃，1min；55℃，1min；72℃，2.5min，30個循環(huán)。用0.8％瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。
(二)重組蛋白的表達與純化1重組蛋白的搖瓶發(fā)酵表達及表達條件的摸索挑取轉化子單菌落，接入3ml MGY，28℃振蕩培養(yǎng)后將菌液接入MGY培養(yǎng)基中，培養(yǎng)到菌體OD600＝2～6，1500g離心去上清，沉淀轉移到100mL表達培養(yǎng)基MM上，1-2h后用甲醇進行誘導表達，在表達過程中每隔24h補加一次甲醇。定時取出培養(yǎng)液，離心取上清，紫外檢測蛋白含量，以空白發(fā)酵液為對照，用SDS-PAGE分析表達量的大小。為提高重組牛生長激素在畢赤酵母中的表達量，研究了轉化子生長的培養(yǎng)條件，包括不同碳源對轉化子生長的影響和接種量、甲醇濃度、pH值、搖瓶轉速及不同誘導時間對牛生長激素表達的影響。
1.1碳源對轉化子生長的影響將5mL菌液接入100mL分別以2％葡萄糖，2％甘油，2％甲醇，2％乙醇為碳源的基礎生長培養(yǎng)基上，定時取樣，監(jiān)測各種培養(yǎng)基中菌體密度OD600達到5.0的時間。
1.2接種量對牛生長激素表達的影響菌體密度OD600達到5.0后，分別將50mL，100mL，200mL，300mL培養(yǎng)基生長的菌體離心，接種到100mL含有0.5％甲醇，pH6.0的誘導培養(yǎng)基上，每隔24h補加一次初始濃度的甲醇，培養(yǎng)48h后收獲發(fā)酵液，檢測菌體生長密度及上清中蛋白總含量，進行SDS-PAGE電泳，紫外薄層掃描檢測上清蛋白表達量。
1.3甲醇濃度對牛生長激素表達的影響將生長培養(yǎng)基的菌體等量接入含有甲醇百分比濃度分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0的誘導培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，24h后補加相同濃度的甲醇，誘導48h后收獲發(fā)酵液，按上述方法進行檢測。
1.4pH對牛生長激素分泌的影響以100mmol/L的Na2HPO4-NaH2PO4為緩沖液，將生長培養(yǎng)基的菌體等量接入pH4.0、5.0、6.0、7.0、8.0的誘導培養(yǎng)基，誘導48h，按上述方法進行檢測。
1.5搖瓶轉速對牛生長激素表達的影響分別在80、120、160、200、240r/min不同轉速下誘導培養(yǎng)48h，按上述方法進行檢測。
1.6誘導時間對牛生長激素表達的影響將生長培養(yǎng)基的轉化子離心后菌體接入誘導培養(yǎng)基，連續(xù)誘導表達64h。每隔6h取樣一次，測定菌體密度和蛋白量。
2.重組蛋白的SDS-PAGE電泳和Western免疫印跡取500μL發(fā)酵液上清，經(jīng)15％三氯乙酸(TCA)-20℃沉淀1h以上，12,000r/min，離心10min，小心吸出上清，加入1ml丙酮，輕搖后，12,000r/min離心5min，小心吸出上清。沉淀于37℃烘干后溶于30μL體系中進行15％的SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍染色，以紫外薄層掃描直接分析目的條帶在總蛋白中的含量。用兔抗牛生長激素的多抗對表達產(chǎn)物進行Western Blotting鑒定，二抗為辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG。
3.表達產(chǎn)物的分離純化表達上清經(jīng)50kD和3kD超濾膜超濾后調(diào)節(jié)電導率7ms，pH至3.7后上樣到S-Sepharose Fast Flow柱上(2.0cm×20cm)，以0.02mol/L的甲酸緩沖液(pH3.7)平衡后，用含有0～1mol/L NaCl的平衡緩沖液進行梯度洗脫。收集目的峰濃縮后用G25純化后真空冷凍收集目的蛋白。純化流程如圖2所示。
權利要求
1.本發(fā)明涉及一種在甲醇酵母Pichia Pastoris中表達重組牛生長激素的方法。
2.根據(jù)權利要求1所述，該方法包括以下步驟(1)通過PCR方法從牛腦cDNA中克隆了生長激素基因；(2)將牛生長激素基因克隆到pPIC9k質(zhì)粒載體中；(3)將克隆有牛生長激素基因的pPIC9k載體電擊轉化到甲醇營養(yǎng)型酵母GS115中(4)經(jīng)不同濃度的G418篩選得到高拷貝插入的重組菌株，表型為His+Mut+。(5)用Western Blotting、SDS-PAGE電泳等實驗證明表達產(chǎn)物存在于表達上清中，蛋白可以和生長激素多抗結合。(6)在搖瓶表達培養(yǎng)基中以甲醇誘導外源基因的表達，表達上清經(jīng)50kDa和3kDa超濾膜純化后再經(jīng)S-Sepharose Fast Flow及Sephadex-G25幾步純化后，得到蛋白重組牛生長激素。
全文摘要
本發(fā)明涉及在甲醇酵母PichiaPastoris中表達重組牛生長激素。在近二十年的開發(fā)使用中，P.Pastoris已用于許多外源基因的表達，比其他真核表達系統(tǒng)相比具有快捷，方便，和便宜的特點，而且通常能得到更高的表達量。本發(fā)明構建一種能夠在胞內(nèi)或胞外高效表達牛生長激素的酵母工程菌PichiaPastoris，可以作為餌料添加劑。
文檔編號C07K14/435GK1609214SQ200310100198
公開日2005年4月27日 申請日期2003年10月17日 優(yōu)先權日2003年10月17日
發(fā)明者任宏偉, 韓鐵鋼 申請人:任宏偉, 韓鐵鋼