專利名稱：從大豆異黃酮中快速分離殘留dna的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明為生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種從大豆異黃酮中快速分離殘留DNA的方法。
背景技術(shù)：
1986年，美國科學(xué)家發(fā)現(xiàn)大豆中抑制癌細(xì)胞的異黃酮。異黃酮在自然界中的分布只局限于豆科的蝶形花亞科等極少數(shù)植物中，如大豆、墨西哥小白豆、苜蓿和綠豆等植物中，其中異黃酮含量最高的只有苜蓿和大豆，一般苜蓿中異黃酮的含量為0.5％-3.5％，大豆中異黃酮含量為0.1％-0.5％。大豆異黃酮是大豆生長中形成的一類次生代謝產(chǎn)物，是生物黃酮中的一種，也是一種植物雌激素。它主要分布于大豆種子的子葉和胚軸中，種皮中含量極少。80％-90％的異黃酮存在于子葉中，濃度為0.1％-0.3％。胚軸中所含異黃酮種類較多且濃度較高，為1％-2％，但由于胚只占種子總重量的2％，因此盡管濃度很高，所占比例卻很少(10％-20％)。目前已明確大豆異黃酮抗癌的主要作用機(jī)制，包括以下幾個(gè)方面類似女性雌激素作用以及抗激素作用；抑制與癌相關(guān)酶活性的作用，特別是酪蛋酸激酶；在癌細(xì)胞增殖的促進(jìn)階段，具有抑制血管增生作用；消除活性氧，從而具有抗氧化作用；調(diào)節(jié)細(xì)胞周期；此外，還確認(rèn)染料木黃酮具有抑制一些與DNA切斷有關(guān)酶活性的作用等。從大豆中獲取異黃酮在技術(shù)上并不復(fù)雜，將大豆粉碎脫脂后就可用酒精萃取和純化。我國的豆制品主要是豆腐，傳統(tǒng)生產(chǎn)豆腐時(shí)水溶性的異黃酮大量從廢水中排出?，F(xiàn)在，科技人員設(shè)計(jì)了從豆腐黃漿水中回收異黃酮的工藝。直接將豆腐黃漿水的水分蒸發(fā)掉就可用于純化，但消耗能量很多。作為工業(yè)生產(chǎn)以吸附沉淀為宜，建議采用活性氧化鋁等吸附能力強(qiáng)的吸附劑，然后再用酒精萃取和純化。這也可作為解決豆制品廠環(huán)境污染的綜合措施之一。
各種大豆制品中異黃酮含量和種類分布不同，不僅與大豆品種和栽培環(huán)境有關(guān)，還與大豆制品的加工工藝密切相關(guān)。水處理、熱處理、凝固、發(fā)酵等加工環(huán)節(jié)和方法顯著地影響了大豆制品中異黃酮的含量和種類分布，特別是大豆?jié)饪s蛋白和大豆分離蛋白的不同提取方法其中異黃酮含量影響極大。隨著人們對大豆異黃酮的生理功能的認(rèn)識以及對大豆的大量需求，使我國每年進(jìn)口大量的大豆和大豆異黃酮產(chǎn)品。然而，世界上主要大豆生產(chǎn)國美國和巴西所生產(chǎn)的大豆及其相應(yīng)的產(chǎn)品多為轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品，這就涉及到轉(zhuǎn)基因生物安全性檢測問題。雖然大豆異黃酮的提取過程簡單，但水處理、熱處理、凝固、發(fā)酵、脫脂、萃取和純化等加工環(huán)節(jié)都顯著影響從大豆異黃酮產(chǎn)品中有效地提取痕跡量DNA，并進(jìn)行隨后的轉(zhuǎn)基因生物安全性檢測。
鑒于此，本發(fā)明建立了一種從商品化的大豆異黃酮中快速分離殘留DNA的方法，Chelex溶液熱處理及Sephadex-G 25柱分離兩個(gè)步驟，不僅能有效地從高濃度大豆異黃酮中分離出痕跡量DNA、而且能夠去除混雜的小分子發(fā)酵產(chǎn)物以及其它的次生代謝物質(zhì)，最終獲得可用于PCR等分子檢測手段的較高質(zhì)量的DNA，該方法簡單且有效、成本低、靈敏度和檢出率高，所獲得的痕跡量DNA可用于定性和定量PCR擴(kuò)增。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種從商品化的大豆異黃酮中快速分離殘留DNA的方法。
方法的步驟為1)取0.1g大豆異黃酮粉末，加入200μl 10％的Chelex溶液，充分混勻，100℃煮5-10分鐘；2)12,000rpm離心10-15min，吸取上清液，3)Sephadex-G 25柱離心過柱后的溶液直接用于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是1)與常規(guī)DNA提取技術(shù)相比較，該方法能快速從大豆異黃酮中提取痕跡量DNA，大大縮短了DNA提取時(shí)間。2)運(yùn)用Sephadex-G 25柱分離能有效去除所得DNA中的可能抑制PCR反應(yīng)的抑制因子，從而獲得可用于PCR等分子檢測手段的痕跡量DNA；3)該方法簡單有效、成本低，其靈敏度和檢出率高于常規(guī)DNA提取方法。


圖1.lectin基因PCR擴(kuò)增結(jié)果，圖中M為分子量標(biāo)記，1為大豆陽性對照，2為試劑盒抽提DNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，3為CTAB法抽提DNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，4為Chelex直接煮沸法抽提DNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，5為本發(fā)明的方法抽提DNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，6為陰性對照；圖2.35S-CTP基因PCR擴(kuò)增結(jié)果，圖中M為分子量標(biāo)記，1為大豆陽性對照，2為試劑盒抽提DNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，3為CTAB法抽提DNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，4為Chelex直接煮沸法抽提DNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，5為本發(fā)明的方法抽提DNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，6為陰性對照；圖3.Cp4-epsps基因PCR擴(kuò)增結(jié)果，圖中M為分子量標(biāo)記，1為大豆陽性對照，2為試劑盒抽提DNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，3為CTAB法抽提DNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，4為Chelex直接煮沸法抽提DNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，5為本發(fā)明的方法抽提DNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，6為陰性對照；圖4.Nos終止子基因PCR擴(kuò)增結(jié)果，圖中M為分子量標(biāo)記，1為大豆陽性對照，2為試劑盒抽提DNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，3為CTAB法抽提DNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，4為Chelex直接煮沸法抽提DNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，5為本發(fā)明的方法抽提DNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，6為陰性對照；圖5.CaMV35S啟動子基因PCR擴(kuò)增結(jié)果，圖中M為分子量標(biāo)記，1為大豆陽性對照，2為試劑盒抽提DNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，3為CTAB法抽提DNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，4為Chelex直接煮沸法抽提DNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，5為本發(fā)明的方法抽提DNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，6為陰性對照。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1.
本實(shí)施例中所用的試劑除氯仿、乙醇、異戊醇、異丙醇為國產(chǎn)試劑外，其余試劑均為promega產(chǎn)品。
(一)CTAB法抽提殘留DNA取0.1g大豆異黃酮粉末。將粉末狀的干物質(zhì)加入400μl預(yù)冷的CTAB提取緩沖液(100mmol/L Tris-Cl，10mmol/L EDTA，700mmol/L NaCl，pH8.0)中。加入500μl 65℃預(yù)熱的CTAB提取緩沖液II(2％CTAB，50mmol/L Tris-Cl，10mmol/LEDTA，800mmol/L NaCl，pH8.0)，1μl 2-巰基乙醇，混勻，65℃保溫30-90分鐘，其間不時(shí)輕緩顛倒混勻。待冷至室溫后加入450μl氯仿/異戊醇，輕緩顛倒混勻至溶液呈乳濁狀。12000rpm離心2min至分相。將上清液轉(zhuǎn)移至干凈的離心管中，加入5μl Rnase A儲液，室溫下保溫30min。依次加入600μl異丙醇及60μl乙酸鈉溶液，輕緩顛倒混勻。12,000rpm離心10min，沉淀DNA。棄上清液后，加入800μl 76％乙醇，12,000rpm離心10min，棄上清液后，再加入100μl 70％乙醇洗滌沉淀，12,000rpm離心5min，沉淀DNA，除去殘留的乙醇。DNA沉淀溶解于100μl TE緩沖液中，4℃保存?zhèn)溆谩?br> (二)Chelex直接煮沸法取0.1g大豆異黃酮粉末。取200μl 10％的Chelex溶液溶解沉淀；振蕩數(shù)分鐘，使沉淀充分溶解于Chelex溶液中，100℃煮5～10min，12,000rpm離心5min，上清液即可用于PCR。
(三)試劑盒法抽提殘留DNA取0.1g大豆異黃酮粉末。加入25ml正己烷，充分混合后2小時(shí)后，加入2.5ml BufferA后，再65℃水浴中加熱，并不斷混合，2小時(shí)后以12,000rpm離心10min，使有機(jī)相和水相分開，取水相并加入40μl(500ng/μl)鮭魚精DNA。加入與上清等體積的Buffer B，混勻，常溫放置10min后，12,000g離心5min，棄上清，保留沉淀；在沉淀中加入60μl Buffer C，37℃放置2min后用槍頭將其充分混合(很重要)后，于37℃溶解沉淀，5min后加入300μl Buffer D，上下顛倒充分混勻10次后，取出離心柱，將離心柱放置在一個(gè)2ml的套管上，將溶液加入到離心柱中，放置2min；將離心柱和2ml套管一起用8000g離心30秒后，棄2ml套管中的溶液，在離心柱中加入200μl Wash Buffer I，8000g離心30秒后，棄去溶液；在離心柱中加入200μl Wash Buffer II(第一次使用前請按照試劑瓶上的提示加入乙醇)，8000g離心30秒后，棄去溶液；在離心柱中加入200μl WashBuffer II，8000g離心30秒后，棄去溶液；12,000g離心30秒，以除去離心柱中痕量殘余溶液；將離心柱放置在一個(gè)新的1.5ml離心管中，網(wǎng)離心柱底部中央小心加入50μl Elution Buffer，37℃放置2min后，12,000g離心30秒；若需提高得率，可用離心下來的50μl Elution Buffer重新進(jìn)行洗脫，即37℃放置2min后，12,000g再離心30秒；離心管中的溶液即可作為PCR反應(yīng)的模板，建議一個(gè)PCR反應(yīng)使用2μl DNA，其余樣品保存在-20℃。
(四)《分子克隆》法抽提殘留DNA取0.1g大豆異黃酮粉末。在50ml離心管中加入20ml提取緩沖液I(100mmol/L Tris·Cl，pH8.0，20mmol/L EDTA，500mmol/L NaCl，1.5％SDS)，60℃水浴預(yù)熱。將上述干物質(zhì)在研缽中加液氮磨成粉狀后立即倒入預(yù)熱的離心管中，劇烈搖動混勻，60℃水浴保溫30-60min(時(shí)間長，DNA產(chǎn)量高)，不時(shí)搖動。加入20ml氯仿/戊醇/乙醇溶液，顛倒混勻(需帶手套，防止損傷皮膚)，室溫下靜置5-10min，使水相和有機(jī)相分層(必要時(shí)可重新混勻)。室溫下5000rpm離心5min。仔細(xì)移取上清液至另一50ml離心管，加入1倍體積異丙醇，混勻，室溫下放置30min，用5000rpm離心5min，再將沉淀移入TE管中。這樣收集的沉淀，往往難溶解于TE，可在60℃水浴放置15min以上，以幫助溶解。將DNA溶液3000rpm離心5分鐘，上清液倒入干凈的5ml離心管。加入5μl RNaseA(10μg/μl)，37℃10min，除去RNA(RNA對DNA的操作、分析一般無影響，可省略該步驟)。加入1/10體積的3mol/L NaAc及2×體積的冰乙醇，混勻，-20℃放置20min左右，12,000rpm離心10min，70％乙醇漂洗，將DNA重溶解于1ml TE緩沖液(10mmo/L Tris·Cl(pH8.0)，1mmol/L EDTA(pH8.0))，-20℃貯存。
(五)本發(fā)明的方法提取大豆異黃酮中提取殘留DNA的方法1)取0.1g大豆異黃酮粉末，加入200μl 10％的Chelex溶液，充分混勻，100℃煮5分鐘；2)12,000rpm離心10min，吸取上清液，3)Sephadex-G 25柱離心過柱后的溶液直接用于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增。
(六)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增總反應(yīng)體系為50μl，10μl上述四種方法所提取的不同來源的模板DNA，5μl10×PCR反應(yīng)緩沖液(500mmol/L KCl，100mmol/L Tris·Cl，在25℃下，pH9.0，1.0％ Triton X-100)，4μl 25mmol/L MgCl2，4μl 4種dNTP(每種2.5mmol/L)，0.5μl上游引物(100ng/μl)，0.5μl下游引物(100ng/μl)，1μl Taq DNA聚合酶(5U/μl)，重蒸水25μl，混勻后離心5秒。將混合物在94℃下加熱5min后冰冷，迅速離心數(shù)秒，使管壁上液滴沉至管底，加入Taq DNA聚合酶(0.5μl約2.5U)，混勻后稍離心。95℃變性5min，用95℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，進(jìn)行35次擴(kuò)增反應(yīng)循環(huán)，進(jìn)行PCR。最后一輪循環(huán)結(jié)束后，于72℃下保溫10min，使反應(yīng)產(chǎn)物擴(kuò)增充分。
PCR擴(kuò)增的引物分別為1.lectin基因Lec-F15’GCCCTCTACTCCACCCCCATCC3’Lec-R15’GCCCATCTGCAAGCCTTTTTGTG3’2.35S-CTP基因SC-F15’TGATGTGATATCTCCACTGACG3’SC-R15’TGTATCCCTTGAGCCATGTTGT3’3.Cp4-epsps基因CE-F15’CCTTCATGTTCGGCGGTCTCG3’CE-R15’GCGTCATGATCGGCTCGATG3’4.Nos終止子基因Pnos-F15’GAATCCTGTTGCCGGTCTTG3’
Pnos-R15’TTATCCTAGTTTGCGCGCTA3’5.CaMV35S啟動子基因35S-F5’GCTCCTACAAATGCCATCATTGC3’35S-R5’GATAGTGGGATTGTGCGTCATCCC3’(七)瓊脂糖凝膠電泳用0.5×TBE電泳緩沖液(45mmol/L Tris堿，45mmol/L硼酸，1mmol/L EDTA，pH8.0)，配制1％的瓊脂糖凝膠液；加入10mg/ml溴化乙錠(EB)溶液母液，使其終濃度為0.5μg/ml；用制膠板制備相應(yīng)的凝膠板；取10μl PCR產(chǎn)物與2μl 6×載樣緩沖液(0.25％溴酚藍(lán)，40％(w/v)蔗糖水溶液)混勻，用微量移液槍小心加入凝膠板的樣品槽中；控制電壓保持在60-80V，電流在40mA以上，立即接通電源進(jìn)行電泳；當(dāng)溴酚藍(lán)條帶移動到距凝膠前沿約2cm時(shí)，停止電泳；在波長為254nm的長波長紫外燈下觀察染色并拍照。
實(shí)施例2.
(一)CTAB法抽提殘留DNA取0.1g大豆異黃酮粉末。將粉末狀的干物質(zhì)加入400μl預(yù)冷的CTAB提取緩沖液(100mmol/L Tris-Cl，10mmol/L EDTA，700mmol/L NaCl，pH8.0)中。加入500μl 65℃預(yù)熱的CTAB提取緩沖液II(2％CTAB，50mmol/L Tris-Cl，10mmol/LEDTA，800mmol/L NaCl，pH8.0)，1μl 2-巰基乙醇，混勻，65℃保溫30-90分鐘，其間不時(shí)輕緩顛倒混勻。待冷至室溫后加入450μl氯仿/異戊醇，輕緩顛倒混勻至溶液呈乳濁狀。12000rpm離心2min至分相。將上清液轉(zhuǎn)移至干凈的離心管中，加入5μl Rnase A儲液，室溫下保溫30min。依次加入600μl異丙醇及60μl乙酸鈉溶液，輕緩顛倒混勻。12,000rpm離心10min，沉淀DNA。棄上清液后，加入800μl 76％乙醇，12,000rpm離心10min，棄上清液后，再加入100μl 70％乙醇洗滌沉淀，12,000rpm離心5min，沉淀DNA，除去殘留的乙醇。DNA沉淀溶解于100μl TE緩沖液中，4℃保存?zhèn)溆谩?br> (二)Chelex直接煮沸法取0.1g大豆異黃酮粉末。取200μl 10％的Chelex溶液溶解沉淀；振蕩數(shù)分鐘，使沉淀充分溶解于Chelex溶液中，100℃煮5～10min，12,000rpm離心5min，上清液即可用于PCR。
(三)試劑盒法抽提殘留DNA取0.1g大豆異黃酮粉末。加入25ml正己烷，充分混合后2小時(shí)后，加入2.5ml Buffer A后，再65℃水浴中加熱，并不斷混合，2小時(shí)后以12,000rpm離心10min，使有機(jī)相和水相分開，取水相并加入40μl(500ng/μl)鮭魚精DNA。加入與上清等體積的Buffer B，混勻，常溫放置10min后，12,000g離心5min，棄上清，保留沉淀；在沉淀中加入60μl Buffer C，37℃放置2min后用槍頭將其充分混合(很重要)后，于37℃溶解沉淀，5min后加入300μl Buffer D，上下顛倒充分混勻10次后，取出離心柱，將離心柱放置在一個(gè)2ml的套管上，將溶液加入到離心柱中，放置2min；將離心柱和2ml套管一起用8000g離心30秒后，棄2ml套管中的溶液，在離心柱中加入200μl Wash Buffer I，8000g離心30秒后，棄去溶液；在離心柱中加入200μl Wash Buffer II(第一次使用前請按照試劑瓶上的提示加入乙醇)，8000g離心30秒后，棄去溶液；在離心柱中加入200μl WashBuffer II，8000g離心30秒后，棄去溶液；12,000g離心30秒，以除去離心柱中痕量殘余溶液；將離心柱放置在一個(gè)新的1.5ml離心管中，網(wǎng)離心柱底部中央小心加入50μl Elution Buffer，37℃放置2min后，12,000g離心30秒；若需提高得率，可用離心下來的50μl Elution Buffer重新進(jìn)行洗脫，即37℃放置2min后，12,000g再離心30秒；離心管中的溶液即可作為PCR反應(yīng)的模板，建議一個(gè)PCR反應(yīng)使用2μl DNA，其余樣品保存在-20℃。
(四)《分子克隆》法抽提殘留DNA取0.1g大豆異黃酮粉末。在50ml離心管中加入20ml提取緩沖液I(100mmol/L Tris.Cl，pH8.0，20mmol/L EDTA，500mmol/L NaCl，1.5％SDS)，60℃水浴預(yù)熱。將上述干物質(zhì)在研缽中加液氮磨成粉狀后立即倒入預(yù)熱的離心管中，劇烈搖動混勻，60℃水浴保溫30-60min(時(shí)間長，DNA產(chǎn)量高)，不時(shí)搖動。加入20ml氯仿/戊醇/乙醇溶液，顛倒混勻(需帶手套，防止損傷皮膚)，室溫下靜置5-10min，使水相和有機(jī)相分層(必要時(shí)可重新混勻)。室溫下5000rpm離心5min。仔細(xì)移取上清液至另一50ml離心管，加入1倍體積異丙醇，混勻，室溫下放置30min，用5000rpm離心5min，再將沉淀移入TE管中。這樣收集的沉淀，往往難溶解于TE，可在60℃水浴放置15min以上，以幫助溶解。將DNA溶液3000rpm離心5分鐘，上清液倒入干凈的5ml離心管。加入5μl RNaseA(10μg/μl)，37℃10min，除去RNA(RNA對DNA的操作、分析一般無影響，可省略該步驟)。加入1/10體積的3mol/L NaAc及2×體積的冰乙醇，混勻，-20℃放置20min左右，12,000rpm離心10min，70％乙醇漂洗，將DNA重溶解于1ml TE緩沖液(10mmo/L Tris.Cl(pH8.0)，1mmol/L EDTA(pH8.0))，-20℃貯存。
(五)本發(fā)明的方法提取大豆異黃酮中提取殘留DNA的方法1)取0.1g大豆異黃酮粉末，加入200μl 10％的Chelex溶液，充分混勻，100℃煮10分鐘；2)12,000rpm離心15min，吸取上清液，3)Sephadex-G 25柱離心過柱后的溶液直接用于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增。
(六)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增總反應(yīng)體系為50μl，10μl上述四種方法所提取的不同來源的模板DNA，5μl10×PCR反應(yīng)緩沖液(500mmol/L KCl，100mmol/L Tris·Cl，在25℃下，pH9.0，1.0％ Triton X-100)，4μl 25mmol/L MgCl2，4μl 4種dNTP(每種2.5mmol/L)，0.5μl上游引物(100ng/μl)，0.5μl下游引物(100ng/μl)，1μl Taq DNA聚合酶(5U/μl)，重蒸水25μl，混勻后離心5秒。將混合物在94℃下加熱5min后冰冷，迅速離心數(shù)秒，使管壁上液滴沉至管底，加入Taq DNA聚合酶(0.5μl約2.5U)，混勻后稍離心。95℃變性5min，用95℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，進(jìn)行35次擴(kuò)增反應(yīng)循環(huán)，進(jìn)行PCR。最后一輪循環(huán)結(jié)束后，于72℃下保溫10min，使反應(yīng)產(chǎn)物擴(kuò)增充分。
PCR擴(kuò)增的引物分別為1.lectin基因Lec-F15’GCCCTCTACTCCACCCCCATCC3’Lec-R15’GCCCATCTGCAAGCCTTTTTGTG3’2.35S-CTP基因SC-F15’TGATGTGATATCTCCACTGACG3’SC-R15’TGTATCCCTTGAGCCATGTTGT3’3.Cp4-epsps基因CE-F15’CCTTCATGTTCGGCGGTCTCG3’CE-R15’GCGTCATGATCGGCTCGATG3’4.Nos終止子基因Pnos-F15’GAATCCTGTTGCCGGTCTTG3’Pnos-R15’TTATCCTAGTTTGCGCGCTA3’5.CaMV35S啟動子基因35S-F5’GCTCCTACAAATGCCATCATTGC3’35S-R5’GATAGTGGGATTGTGCGTCATCCC3’(七)瓊脂糖凝膠電泳用0.5×TBE電泳緩沖液(45mmol/L Tris堿，45mmol/L硼酸，1mmol/L EDTA，pH8.0)，配制1％的瓊脂糖凝膠液；加入10mg/ml溴化乙錠(EB)溶液母液，使其終濃度為0.5μg/ml；用制膠板制備相應(yīng)的凝膠板；取10μl PCR產(chǎn)物與2μl 6×載樣緩沖液(0.25％溴酚藍(lán)，40％(w/v)蔗糖水溶液)混勻，用微量移液槍小心加入凝膠板的樣品槽中；控制電壓保持在60-80V，電流在40mA以上，立即接通電源進(jìn)行電泳；當(dāng)溴酚藍(lán)條帶移動到距凝膠前沿約2cm時(shí)，停止電泳；在波長為254nm的長波長紫外燈下觀察染色并拍照。
權(quán)利要求
1.一種從大豆異黃酮中快速分離殘留DNA的方法。其特征在于，方法的步驟為1)取0.1g大豆異黃酮粉末，加入200μl 10％的Chelex溶液，充分混勻，100℃煮5-10分鐘；2)12,000rpm離心10-15min，吸取上清液，3)Sephadex-G 25柱離心過柱后的溶液直接用于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從大豆異黃酮中分離殘留DNA的方法。其特征在于，所說Sephadex-G 25柱的制備方法為取10g Sephadex-G 25緩慢加入無菌的蒸餾水中反復(fù)洗滌，除去可溶性的葡聚糖，用TE緩沖液平衡凝膠，高壓滅菌15min，TE緩沖液為10mmo/L Tris堿，1mmol/L乙二胺四乙酸，pH7.6；將0.45μm的微孔濾膜放入試管柱中，用Sephadex-G 50裝柱，1×TEN緩沖液平衡，不斷加入凝膠直至試管柱完全裝滿，1×TEN緩沖液為10mmol/L Tris堿，1mmol/L乙二胺四乙酸，100mmol/L氯化鈉，pH8.0；1600g離心4min后，繼續(xù)補(bǔ)加凝膠使柱床體積達(dá)到0.9ml；將0.1ml 1×TEN緩沖液加入柱中，1600g離心4min，并重復(fù)2次，加滿1×TEN緩沖液密封4℃保存?zhèn)溆谩?br> 全文摘要
本發(fā)明公開了一種從大豆異黃酮中快速分離殘留DNA的方法。方法的步驟為取0.1g大豆異黃酮粉末，加入200μl 10％的Chelex溶液，充分混勻，100℃煮5－10min；12,000rpm離心10－15min，吸取上清液，Sephadex－G 25柱離心過柱后的溶液直接用于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增。與常規(guī)DNA提取方法相比，該方法可快速從大豆異黃酮中分離殘留DNA，該技術(shù)流程可有效去除所得DNA中抑制PCR反應(yīng)的抑制因子，可用于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的模板。該方法簡單、快速、成本低、靈敏度和檢出率高，所獲得的痕跡量DNA可用于定性和定量PCR擴(kuò)增。該技術(shù)流程適用于轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品的多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢驗(yàn)及相關(guān)領(lǐng)域，也可用于大豆異黃酮提取工藝的質(zhì)控和優(yōu)化。
文檔編號C07H1/06GK1660880SQ20041009315
公開日2005年8月31日 申請日期2004年12月17日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月17日
發(fā)明者李德葆, 董海濤, 戴承恩, 婁沂春, 姜玉新 申請人:浙江大學(xué)