專利名稱：改進(jìn)的提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種改進(jìn)的提取方法，本發(fā)明尤其涉及一種從動(dòng)物組織分離低分子量肽的改進(jìn)提取方法。
背景技術(shù)：
在保健食品和生物醫(yī)藥市場(chǎng)中，對(duì)動(dòng)物產(chǎn)品提取物的需求不斷增長(zhǎng)，其中包括高濃度的生長(zhǎng)因子和其它低分子量的多肽。造成這種需求的原因是，相對(duì)于組織或者其它原材料中的大型蛋白質(zhì)，更小型的多肽具有增強(qiáng)的生物活性，并經(jīng)常表現(xiàn)出更大的溶解度和穩(wěn)定性。特別是，低分子量的肽和生長(zhǎng)因子的提取物具有使其適用于多種用途的特性，其中包括醫(yī)療(例比，治療外傷)產(chǎn)品、食品添加劑的成分、化妝品以及培養(yǎng)基。
水性提取動(dòng)物組織的多種標(biāo)準(zhǔn)方法已經(jīng)被開(kāi)發(fā)并廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)的分離，Scopes R.K.(1987)。常規(guī)的水性提取方法包括使用某些粉碎細(xì)胞的方法，例如在水或者鹽溶液或緩沖液的存在下，用超聲波或者機(jī)械攪拌(在攪拌機(jī)中)。有時(shí)提取系統(tǒng)的PH值是可調(diào)節(jié)的，或者使用除垢劑或者其它添加劑，從而增強(qiáng)特定目標(biāo)蛋白質(zhì)(例如，與膜相關(guān)酶)的溶解度。然而，通常初始的蛋白質(zhì)提取物包含大范圍分子量的蛋白質(zhì)。因此，還需要進(jìn)一步的處理步驟，從所有的蛋白質(zhì)提取物中有選擇性地富集生長(zhǎng)因子和其它低分子量的多肽。
為了獲得濃縮低分子量肽的、富集生長(zhǎng)因子組織提取物的商業(yè)產(chǎn)品，需要可實(shí)施的成本有效的方法，從混合物中去除不需要的高分子量的蛋白質(zhì)。目前的方法適用于在工業(yè)規(guī)模下獲得富含生長(zhǎng)因子的組織提取物部分或者其它動(dòng)物來(lái)源的材料(例如，血液、牛奶和初乳)，其中包括超濾法；凝膠過(guò)濾色譜法(GFC)(又名排阻色譜法)；其它色譜分級(jí)分離系統(tǒng)(如離子交換分離、疏水性相互作用分離、親和性分離)；多相系統(tǒng)中的液相分離；利用水溶性有機(jī)溶劑(乙醇和丙酮)從水溶液(例如，液相)中沉淀，通常有機(jī)溶劑被冷凍處理，有時(shí)也加入非水溶性有機(jī)溶劑(氯仿)以增強(qiáng)其變性的效果，Scopes，R.K.(1987)；使用中性鹽或者氨基酸進(jìn)行鹽析處理。
然而，在大部分的實(shí)例中，這些方法已經(jīng)被用于分離酶或者其它中度的大分子蛋白質(zhì)，而并非用于濃縮生長(zhǎng)因子和其它的肽。例如，采用冷乙醇沉淀是傳統(tǒng)Cohn分離方法的基礎(chǔ)，該方法用于從血漿制備白蛋白和其它蛋白。因此，這些方法存在一些缺點(diǎn)，換句話說(shuō)不適用于濃縮生長(zhǎng)因子和其它低分子量的多肽。
超濾法和GFC法都需要昂貴的資金投入，都對(duì)污垢十分敏感，而GFC法會(huì)造成所需低分子量片段的稀釋。其它色譜分離系統(tǒng)操作花費(fèi)昂貴，趨向提純特定的肽，而不是將高分子量或者低分子量的片段分離。
當(dāng)不穩(wěn)定蛋白質(zhì)(例如，酶)是所需要的產(chǎn)物，此蛋白質(zhì)被始終保留在水相環(huán)境中時(shí)，需要特別使用多相系統(tǒng)中的液相分離(例如，濁點(diǎn)提取物和水的雙相系統(tǒng))，Skopes R.K.(1987)，Tani H.et al.(1997)。由此有助于保留分子的生物活性。此方法的缺點(diǎn)是，需要去除的大量的除垢劑、鹽和/或水溶性聚合體存在的條件下獲得所需的產(chǎn)品。由此提高了操作費(fèi)用，通常還需要使用附加的步驟，例如超濾。
其它保留方法也都會(huì)造成添加了必須從多肽溶液中除去的其它大量化學(xué)物質(zhì)(有機(jī)溶劑、氨基酸或者鹽)。由于需要附加的處理步驟，費(fèi)用不斷提高，在大量使用易燃和/或有毒溶劑的情況下，會(huì)引發(fā)安全問(wèn)題。上述溶劑的安全處理和最后的清除需要使用特殊的設(shè)計(jì)、以及通常費(fèi)用高昂的操作裝置和設(shè)備。
所有的參考文獻(xiàn)，包括本說(shuō)明書(shū)引用的任何專利或者專利申請(qǐng)通過(guò)在此引述合并于本文。不需要任何允許，所有文獻(xiàn)均構(gòu)成現(xiàn)有技術(shù)。這些文獻(xiàn)的論述包括作者的聲明，申請(qǐng)人保留質(zhì)疑引用文件的精確度和相關(guān)性的權(quán)利?？梢郧宄睦斫?，盡管本文引用了許多種現(xiàn)有技術(shù)的公開(kāi)出版物，但是，在新西蘭或者其它國(guó)家這些文獻(xiàn)沒(méi)有構(gòu)成一種許可，使所有這些文件構(gòu)成本領(lǐng)域內(nèi)的部分公知常識(shí)。
在此確認(rèn)，名詞“包括”在不同的條件下既有排除的意思，也有包含的意思。在本說(shuō)明書(shū)中除了另做聲明，名詞“包括”應(yīng)該具有包含的意思—也就是不僅包括文獻(xiàn)直接列出的成份，還包括其它未限定的成份與元素。當(dāng)涉及方法或者工藝的一個(gè)或者多個(gè)步驟使用名詞“包括”時(shí)，也同樣采用的是上述概念。
本發(fā)明的目的是提出上述問(wèn)題或者至少向公眾提供有用的選擇。
通過(guò)以實(shí)施例方式給出的后續(xù)說(shuō)明，本發(fā)明的其它方面和優(yōu)點(diǎn)將顯而易見(jiàn)。

發(fā)明內(nèi)容
這些從組織提取液去除大分子蛋白質(zhì)多種方法的缺點(diǎn)是當(dāng)小分子量肽是目標(biāo)肽時(shí)，發(fā)明人不得不考慮新型的替換方法。也就是，在水性提取前，使用一種有機(jī)溶劑(優(yōu)選乙醇)在組織內(nèi)原位變性，從而阻止高分子量的蛋白質(zhì)片斷的初始分解。以前已經(jīng)使用過(guò)有機(jī)溶劑處理固體組織，但是只特別用于組織的去脂與脫水(Scopes，RK(1987)，Betzing，H et al(1975))，而不是提高后續(xù)水性提取物中低分子量多肽的濃度。因此，還需要分離低分子量的肽。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供一種從原始組織分離低分子量(LMW)肽的方法，其中包括如下步驟a)使組織均質(zhì)化；b)將有機(jī)溶劑和均質(zhì)化組織混合，形成完全濕潤(rùn)的漿液；c)靜置或者攪拌漿液使組織內(nèi)的蛋白質(zhì)原位變性；d)從組織去除有機(jī)溶劑；e)將步驟(b)中有機(jī)溶劑處理的組織與足量的水或者水溶液混合提取肽；f)從步驟(e)的組織殘?jiān)蟹蛛x液體提取物，獲得含有從組織中去除的低分子量肽部分的水溶液。
貫穿全文的名詞“肽”，“多肽”和“蛋白質(zhì)”可以交替使用，而且，意為含有一個(gè)或多個(gè)氨基酸組成的至少一個(gè)鏈的分子。
名詞“分離”意為完全的分離，或者是在低分子量肽離析的組織內(nèi)從高分子量的肽或者其它不需要的材料中提純。
貫穿全文的名詞“低分子量肽”或者“LMW肽”意為一種分子量為10,000道爾頓或者以下的肽。
貫穿全文，名詞“分子量”用在本發(fā)明表示為用凝膠過(guò)濾色譜法確定的肽分子量。
貫穿全文的名詞“總蛋白質(zhì)提取物”用在這里表示一種使用標(biāo)準(zhǔn)現(xiàn)有技術(shù)的液相提取技術(shù)制備而成的組織提取提取物，例如背景技術(shù)中詳細(xì)描述的技術(shù)，此技術(shù)并未試圖控制提取物所含蛋白質(zhì)的分子量。
貫穿全文，名詞“攪拌”或者其語(yǔ)法變換都指的是，為了達(dá)到混合效果攪拌、震動(dòng)或者用超聲波照射的方法。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，其它水溶性(非肽)成分(“NPC”)還可以與采用本發(fā)明方法制備的LMW肽一起分離出來(lái)。在一些實(shí)例中，這些NPC的確是提取工藝所需要的成份，既可以是與LMW肽一起被提取，也可以替代LMW肽作為提取成份。
組織可以是任何動(dòng)物的組織，或者是需要提取LMW肽的其它完全固態(tài)的動(dòng)物產(chǎn)品(包括干燥血液、乳液或者初乳，且不限于此)。
總之，可以通過(guò)超聲波或者機(jī)械攪拌均化組織，使其完全分解。例如，可以使用研缽和研棒、攪拌器或者任何其它適合的設(shè)備，使組織均質(zhì)化。然而，上述所列的方式不應(yīng)視為限定。
總之，在均質(zhì)化之前，組織可以隨意進(jìn)行干燥預(yù)處理步驟，有利于組織的均質(zhì)化或者保存。
組織可以采用任何可以去除組織水份且不會(huì)影響組織內(nèi)目標(biāo)LMW肽特性的方法干燥。
在優(yōu)選的實(shí)施例中，組織可以進(jìn)行冷凍干燥，從而不影響熱敏感的生長(zhǎng)因子。
有機(jī)溶劑可以是不影響目標(biāo)LMW肽性質(zhì)的任何有機(jī)溶劑。
在一些實(shí)施例中，有機(jī)溶劑可以是丙酮，乙睛，丙醇，丙烷-1-醇或者丙烷-2-醇。上述列表不應(yīng)視為限定。
在優(yōu)選實(shí)施例中，由于其抗微生物活性和低毒性，有機(jī)溶劑可以是乙醇。最優(yōu)選的是，在干燥組織的情況下可以使用70％的乙醇。
在優(yōu)選實(shí)施例中，當(dāng)向新鮮組織使用本發(fā)明的提取方法時(shí)，可以加入足量的純態(tài)乙醇，以提供對(duì)應(yīng)大約30％乙醇體積的總含水量?？蛇x擇性的是，當(dāng)達(dá)到此水含量時(shí)，如果需要，可以進(jìn)一步加入70％的乙醇，生成充分濕潤(rùn)的松軟漿液。
本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)為，可以任選使用更高或者更低濃度的乙醇，在70％乙醇的優(yōu)選濃度下出現(xiàn)了乙醇最佳的抗微生物活性。
為了便于參照，現(xiàn)僅將有機(jī)溶劑設(shè)定為乙醇。
貫穿全文，名詞“充分濕潤(rùn)”意為向細(xì)微分離的固體加入足量的液體，從而生成自由流動(dòng)的漿液。
用在此處的名詞“液相”指的是常規(guī)固體(例如，蛋白質(zhì))材料溶液的應(yīng)用，從而使本發(fā)明方法的操作完全在液體環(huán)境中進(jìn)行。
貫穿全文，名詞“環(huán)境溫度”意為周?chē)h(huán)境的溫度，應(yīng)該在10-30℃的范圍。
總之，可以在環(huán)境溫度下將充分濕潤(rùn)的漿液靜置或者攪拌，并持續(xù)至少1個(gè)小時(shí)。最優(yōu)選的是，在環(huán)境溫度下將充分濕潤(rùn)的漿液靜置或者攪拌，并持續(xù)至少3個(gè)小時(shí)或者更長(zhǎng)的時(shí)間。但是，如果需要保留LMW肽的生物活性，本發(fā)明方法不排除在更低的溫度下完成上述步驟(例如，低于環(huán)境溫度)。在優(yōu)選的實(shí)施例中，與單純使?jié){液靜置相比，優(yōu)選采用攪拌處理，本領(lǐng)域技術(shù)人員有理由認(rèn)為，攪拌可以從組織中更有效地提取可溶性成份。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可以認(rèn)定，靜置充分濕潤(rùn)漿液的時(shí)間應(yīng)該足夠長(zhǎng)，從而使組織內(nèi)的蛋白質(zhì)原位變性。同時(shí)也減少了漿液的微生物負(fù)載。在將充分濕潤(rùn)的漿液靜置后，可以采取多種不同方法去除乙醇。
在一些實(shí)施例中，可以采用過(guò)濾、濃縮、或者其它物理方式去除乙醇。但是，已經(jīng)成為共識(shí)的是，采用此種方式去除乙醇，會(huì)導(dǎo)致最終水溶液中LMW肽產(chǎn)量降低。同時(shí)會(huì)發(fā)生一些不溶于水的肽或者LMW肽部分溶解到有機(jī)溶劑中。
因此，在優(yōu)選的實(shí)施例中，可以采用在真空中直接蒸發(fā)有機(jī)溶劑的方式去除乙醇。最優(yōu)選的是，僅使用輕度加熱就可以實(shí)現(xiàn)蒸發(fā)，由此使溫度保持在30℃以下，目的在于保護(hù)熱敏感的生長(zhǎng)因子。
一旦乙醇被去除，乙醇處理的組織可以在強(qiáng)真空條件下充分干燥，例如，在冷凍干燥機(jī)或者類(lèi)似設(shè)備中干燥。當(dāng)需要去除微量有機(jī)溶劑，從而在此步驟保存組織，或者減少微量有機(jī)溶劑影響LMW肽產(chǎn)量或者成份的幾率時(shí)，推薦使用此任選步驟，所述LMW肽是從本方法后續(xù)步驟f)或者步驟g)的最終水基提取物中獲得，步驟g)將在下面詳細(xì)論述。
用在這里的名詞“水溶液”意為一種溶劑是水、并且包括鹽溶液或者緩沖液的溶液。
在一些優(yōu)選的實(shí)施例中，還包括一個(gè)附加步驟d1)，其中步驟d)的溶劑處理組織可以在進(jìn)行步驟e)之前充分干燥。
在步驟d)或者d1)中的乙醇處理組織可以與水或者適合的鹽溶液或者緩沖溶劑混合(包括磷酸鹽緩沖液、檸檬酸鹽緩沖液、醋酸鹽緩沖液、TRIS緩沖液、或者稀釋的氯化鈉溶液，且不限于此)。優(yōu)選的是，將所得混合物充分?jǐn)嚢?個(gè)小時(shí)。為了保護(hù)生長(zhǎng)因子，可以在低溫條件下—即環(huán)境溫度下或者更低的溫度下進(jìn)行上述步驟。
可以想象，采用多種不同的方法從步驟e)中的乙醇處理組織中分離出液態(tài)提取物。
例如，可以采用下列方法分離液態(tài)提取物(如，從固體殘?jiān)蟹蛛x)傾析法；離心法；
過(guò)濾法；或者對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的其它適當(dāng)方法。
最優(yōu)選的是，采用離心法、精細(xì)過(guò)濾法、或者其它適合的凈化方法澄清液體提取物。
在一些優(yōu)選的實(shí)施例中，還可以包括附加步驟g)，其中步驟g)可以是一遍或者是多遍地重復(fù)步驟e)和f)，以提高由步驟e)的組織殘?jiān)蝎@得液體提取物的產(chǎn)量。
一旦從步驟f)或者g)中獲得低分子量的肽溶液，為了儲(chǔ)存或者進(jìn)一步加工(例如，產(chǎn)品制劑)，可以任選干燥此液體提取物。
在優(yōu)選的實(shí)施例中，為了獲得低分子量的肽，可以干燥步驟f)或者g)的液體提取物。
盡管其它干燥方式有可能取決于低分子量目標(biāo)肽的特性，最優(yōu)選的是，采取冷凍干燥的方式實(shí)現(xiàn)步驟f)或者g)低分子量肽溶液的干燥。
本發(fā)明另一方面，還提供了由本發(fā)明方法獲得的低分子量肽分離混合物。
本發(fā)明另一方面，還提供了有機(jī)溶劑在組織內(nèi)原位變性蛋白質(zhì)的用途，此應(yīng)用可以作為從組織分離低分子量肽的分離方法的一部分。
因此，與現(xiàn)有技術(shù)的提取方法相比，本發(fā)明原位提取LMV方法的優(yōu)選實(shí)施例包括許多優(yōu)點(diǎn)，其中包括1.同現(xiàn)有技術(shù)的提取方法相比，本發(fā)明提供了一種獲得分離LMW肽提取物、且具有更高LMW肽濃度的簡(jiǎn)便方法。
2.提供一種特別分離LMW肽的方法。
3.提供一種將使用大量昂貴或者危險(xiǎn)溶劑的可能性最小化的方法。


參照以實(shí)施例方式給予的下列說(shuō)明以及附圖，本發(fā)明的其它方面將會(huì)顯而易見(jiàn)圖1a表示了鹿茸總蛋白質(zhì)提取物的凝膠過(guò)濾色譜圖像。
圖1b表示了采用本發(fā)明新型原位提取法制備的鹿茸LMW提取物，并且在色譜圖下方給出了近似的分子量尺度。
圖2在液相中加入冷乙醇從鹿茸總蛋白提取物沉淀高分子量的蛋白制備的LMW提取物。
圖3表示了鹿茸LMW提取物的凝膠過(guò)濾色譜圖譜，該提取物是由新型原位提取方法制備的，并且在預(yù)處理的培養(yǎng)步驟中使用不同濃度的乙醇(持續(xù)了3小時(shí))。
圖4圖解說(shuō)明了鹿茸LMW提取物中LMW和HMW蛋白的比率，該提取物是由新型原位提取方法制備的，并且在預(yù)處理的培養(yǎng)步驟中使用不同濃度的乙醇(持續(xù)了3小時(shí))。
圖5表示了鹿茸LMW提取物的凝膠過(guò)濾色譜圖譜，該提取物是由新型原位提取方法制備的，并且在預(yù)處理的培養(yǎng)步驟中使用不同濃度的乙醇(持續(xù)了16.5小時(shí))。
圖6圖解說(shuō)明了鹿茸LMW提取物中LMW和HMW蛋白的比率，該提取物是由新型原位提取方法制備的，并且在預(yù)處理培養(yǎng)步驟的不同時(shí)期使用70％的乙醇。
圖7圖解說(shuō)明了鹿茸LMW提取物中LMW和HMW蛋白的比率，該提取物是由新型原位提取方法制備的，并且在預(yù)處理培養(yǎng)步驟中使用不同比率的70％乙醇。
圖8表示了鹿茸LMW提取物的凝膠過(guò)濾色譜圖形，該提取物是由新型原位提取方法制備的，并且在預(yù)處理步驟中使用不同的有機(jī)溶劑。
圖9表示了鹿茸LMW提取物的凝膠過(guò)濾色譜圖形，該提取物是由新型原位提取方法制備的，并且在水合提取的步驟中使用多種緩沖液。
圖10表示了鹿胎盤(pán)LMW提取物的凝膠過(guò)濾色譜圖形，該提取物是由新型原位提取方法制備的，并且在預(yù)處理的培養(yǎng)步驟中使用不同濃度的乙醇。
圖11表示了鹿LMW提取物的凝膠過(guò)濾色譜圖形，該提取物是由新型原位提取方法制備的，并且在預(yù)處理的培養(yǎng)步驟中使用不同濃度的乙醇。
圖12表示了羊肝LMW提取物的凝膠過(guò)濾色譜圖形，該提取物是由新型原位提取方法制備的，并且在預(yù)處理的培養(yǎng)步驟中使用不同濃度的乙醇。
圖13表示了羊肝LMW提取物的凝膠過(guò)濾色譜圖形，該提取物是由新型原位提取方法制備的，并且在水性提取步驟中使用不同的緩沖液。
圖14表示了，與從冷凍干燥鹿茸組織制備的相似提取物相比，采用新型原位提取方法從冷凍鹿茸組織制備的LMW提取物的凝膠過(guò)濾色譜圖形。
本發(fā)明的最佳實(shí)施方式LMW原位提取方法—熱干燥和冷凍干燥的鹿茸稱取5.00克由傳統(tǒng)(熱)干燥鹿角中間部位獲得的鹿茸粉末，再放入500ml的Buchi蒸餾瓶中。加入足量的70％乙醇(大約30毫升)生成可流動(dòng)的漿液，并且在環(huán)境溫度(20℃)下用磁力攪拌器攪拌混合物1小時(shí)。然后，使用帶有30℃水浴的Buchi蒸發(fā)器，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除溶劑。在高度真空條件下使用油泵(Edward)去除微量的殘留溶劑1小時(shí)。將100ml去離子水加入干燥的殘留物中，并且在環(huán)境溫度(20℃)下使用磁攪拌器攪拌混合物3小時(shí)。接著使用玻璃纖維濾紙(Whatman GF/A)，4℃下采用14,600g離心過(guò)濾30分鐘。將上清液倒入玻璃瓶中，然后在冷凍干燥機(jī)中薄層冷凍并冷凍干燥，從而提供鹿茸LMW提取物(0.297g，5.9％產(chǎn)量)，其表現(xiàn)為褐色微粘的固體。經(jīng)測(cè)定，獲得的LMW提取物中IGF-1的含量為0.32ug/g，參見(jiàn)表1。
使用由冷凍干燥鹿角獲得的5.00克復(fù)合鹿茸粉末，重復(fù)上述提取方法。獲得了0.312克的LMW提取物(6.2％)，其呈自由流動(dòng)的褐色固體。經(jīng)測(cè)定，LMW提取物中IGF-1含量為0.32ug/g，參見(jiàn)表1。
表1.在原材料(鹿茸粉末)和用本發(fā)明方法從原材料獲得的LMW提取物中生長(zhǎng)因子IGF-1和TGFβ2的含量

在提取條件的比較中使用小規(guī)模LMW原位提取方法精確稱量500mg的組織(鹿茸、鹿胎盤(pán)、羊肝臟)或者冷凍干燥的鹿血，加入帶有特氟隆襯帽的玻璃試管。加入足量的有機(jī)溶劑，以提供對(duì)應(yīng)固體材料所需的比率，在環(huán)境溫度(20℃)下使用震動(dòng)攪拌器(IKA)將混合物攪拌至所需的時(shí)間。在大部分實(shí)例中，除非另做說(shuō)明，加入3ml溶劑(比率6∶1，v/w)，持續(xù)混合3小時(shí)。接著，使用真空離心機(jī)(Heto)去除大多數(shù)的有機(jī)溶劑，在強(qiáng)真空條件下使用冷凍干燥機(jī)(FTS)去除剩余微量的有機(jī)溶劑。
向有機(jī)溶劑處理的試驗(yàn)材料加入10ml水合緩沖液。在大部分的實(shí)例中，除非另做說(shuō)明，使用的緩沖液是0.05M磷酸鹽緩沖液(PH6.9)。在環(huán)境溫度(20℃)下使用Vibramax攪拌器(IKA)攪拌混合物1小時(shí)，然后，在4℃下以2000g離心15分鐘。將上清液轉(zhuǎn)移至干凈試管，在4℃下以4000g離心15分鐘。在對(duì)生長(zhǎng)因子做GFC(在下文做詳細(xì)描述)分析之前將完全澄清的上清液轉(zhuǎn)移至干凈試管。在一些試驗(yàn)中，使用真空烤箱在預(yù)先稱重的試管中充分干燥5.0ml的等分試樣，以確定提取物的產(chǎn)量。
在許多實(shí)例中，如上所述，未進(jìn)行有機(jī)溶劑的預(yù)處理，而是使用緩沖液提取試驗(yàn)原料。這些樣品用做對(duì)照樣品，以確定使用溶劑預(yù)處理去除高分子量蛋白質(zhì)的有效性。
低分子量提取物的分析在superose 12 HR 10/30柱(Amersham Biosciences)中采用GFC方法分析低分子量的提取物，既可以使用含有0.3M氯化鈉和0.05％疊氮化鈉的0.05M磷酸鹽緩沖液(PH6.9)，也可以使用0.05M碳酸氫銨作為洗脫液。先將固體提取物樣品溶解在磷酸鹽緩沖液中，濃度大約為5mg/ml，再將每種溶液10ul注入柱內(nèi)，并以每分鐘0.75毫升的流速洗脫。直接注入10ul按照小規(guī)模LMW原位提取方法制備的提取物溶液，并在相同的條件下洗脫。通過(guò)測(cè)定280納米處的紫外吸收值，檢測(cè)蛋白質(zhì)。
在上述條件下，通過(guò)分離具有已知分子量的已知蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)混合物，確定Superose 12柱的分子量標(biāo)準(zhǔn)。然后，以蛋白質(zhì)分子量的對(duì)數(shù)為自變量，保留時(shí)間為因變量，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。使用標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過(guò)內(nèi)插法確定洗脫蛋白質(zhì)峰值的近似分子量。
使用了Turbochrom 4.1(PE Nelson)，開(kāi)發(fā)了數(shù)據(jù)自動(dòng)處理方法，用于比較提取物中低分子量和高分子量蛋白質(zhì)的比率。此方法可以匯總出在使用磷酸鹽緩沖液洗脫的樣品的色譜圖中保留時(shí)間小于20.5分鐘的所有峰值區(qū)域(“高分子量”峰值，由于分子量大于8000道爾頓的蛋白質(zhì))，和保留時(shí)間大于20.5分鐘的峰值區(qū)域(“低分子量”峰值，由于分子量小于8000道爾頓的蛋白質(zhì))。對(duì)于用碳酸氫銨洗脫的樣品，在18.5分鐘保留時(shí)間下高分子量和低分子量的峰值之間等量均分。
已有技術(shù)—制備鹿茸總蛋白質(zhì)提取物用于GFC分析冷凍干燥的光滑鹿茸粉(0.1克)與0.05M的磷酸鹽緩沖液(PH6.9，3ml)用渦流混合器混合。接著，用2000g離心混合物5分鐘，并在20℃條件下，在超聲波清理室(Crest Ultrasonics)超聲處理1小時(shí)。4℃下以12700g離心15分鐘，澄清制備的總蛋白質(zhì)提取物。然后，采用GFC法直接分析上清液—參照?qǐng)D1a)?？偟鞍踪|(zhì)提取物的方法是以現(xiàn)有技術(shù)中蛋白質(zhì)提取方法為基礎(chǔ)的，如Scopes，R.K.(1987)所述的。
已有技術(shù)—使用乙醇從液相的鹿茸總蛋白質(zhì)提取物中沉淀高分子量蛋白質(zhì)用于GFC分析在環(huán)境溫度下輕微震動(dòng)100毫升去離子水中10克干燥的鹿茸粉末3小時(shí)，制備鹿茸總蛋白提取物。以2100g離心混合物15分鐘，將上清液轉(zhuǎn)移至第二離心瓶中。再以21000g離心15分鐘，為了澄清水性提取物，再冷卻到4℃。在不斷攪拌下逐漸加入3倍體積的100％冷乙醇。在4℃下以21000g離心渾濁的混合物30分鐘，去除沉淀的蛋白質(zhì)。在做GFC分析之前，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中將上清液蒸發(fā)至干燥狀態(tài)，參見(jiàn)圖2?？偟鞍踪|(zhì)提取方法是以現(xiàn)有技術(shù)的蛋白質(zhì)提取方法為基礎(chǔ)的，如Scopes，R.K.(1987)所述。
IGF-1的分析由Endolab(Canterbury Health Laboratories)采用對(duì)應(yīng)人類(lèi)IGF-1的放射性免疫測(cè)定法，分析樣品的胰島素類(lèi)生長(zhǎng)因子IGF-1。此測(cè)定法具有0.39ug/g的ED50值，對(duì)應(yīng)冷凍干燥的提取樣品具有0.02ug/g的檢測(cè)極限。對(duì)于提取物的溶液，檢測(cè)的ED50值是50ug/L，并且檢測(cè)極限是4.1ug/L。
IGF-2的分析由Endolab(Canterbury Health Laboratories)采用對(duì)應(yīng)人類(lèi)IGF-2的放射性免疫測(cè)定法，分析提取物溶液樣品的胰島素類(lèi)生長(zhǎng)因子2(IGF-2)。此測(cè)定法具有1132ug/L的ED50值和32ug/L的檢測(cè)極限。
EGF類(lèi)的活性分析采用放射性受體測(cè)定法，測(cè)定提取物溶液樣品的表皮生長(zhǎng)因子類(lèi)(EGF類(lèi))的活性。該測(cè)定法測(cè)定了樣品中此類(lèi)物質(zhì)從培養(yǎng)基中A431細(xì)胞(表皮癌細(xì)胞系)上其受體替換放射性標(biāo)記鼠EGF(Amersham)的能力。因?yàn)槠渌L(zhǎng)因子可以與EGF受體相結(jié)合，因此測(cè)定此結(jié)合活性作為EGF類(lèi)的活性。
TGFβ1分析使用EMAX免疫測(cè)定系統(tǒng)(Promega Corporation)測(cè)定樣品的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGFβ1)。此測(cè)定特別針對(duì)TGFβ1(≤1.6％同TGFβ2的交叉活性和≤0.7％TGFβ3)，并且具有32pg/ml的檢測(cè)極限。
TGFβ2分析使用EMAX免疫測(cè)定系統(tǒng)(Promega Corporation)測(cè)定樣品的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β2(TGFβ2)。此測(cè)定特別針對(duì)TGFβ2(≤3％與TGFβ1和TGFβ3的交叉活性)，并且具有32pg/ml的測(cè)試極限(相當(dāng)于固體樣品的032ng/g)。
結(jié)論IGF-1和TGFβ2采用新提取方法由冷凍干燥和/或熱處理的鹿茸粉末制備的低分子量提取物的IGF-1和TGFβ2含量之間的比較列于上述的表1中。在每個(gè)例子中，與其原料鹿茸粉末測(cè)定的結(jié)果相比，由新方法制得的LMW提取物具有更高濃度的免疫活性IGF-1和TGFβ2。
使用本發(fā)明新方法制備的鹿茸低分子量提取物的分子量分布在圖1中將使用70％乙醇預(yù)處理鹿茸粉末的水提取物的凝膠過(guò)濾圖形與未經(jīng)處理鹿茸粉末的可比提取物相比較。從圖1(a)中可知，分子量大于10000道爾頓的蛋白質(zhì)包括在未經(jīng)升溫的條件下從鹿茸中得到的大體積水基總蛋白提取物。通過(guò)比較，使用新型乙醇預(yù)處理方法(如圖1(b))，實(shí)質(zhì)上所有的高分子量蛋白質(zhì)都不會(huì)出現(xiàn)在低分子量提取物中。
為了分離LMW肽，從標(biāo)準(zhǔn)水性鹿茸提取物沉淀高分子量的蛋白質(zhì)，此操作在水相中進(jìn)行。采用此方法是為了將由標(biāo)準(zhǔn)現(xiàn)有技術(shù)中蛋白質(zhì)化學(xué)技術(shù)去除的蛋白質(zhì)的分子量分布與本發(fā)明新方法去除的蛋白質(zhì)分子量分布進(jìn)行比較。如圖2所示，向鹿茸總蛋白質(zhì)水溶液加入3∶1比率的乙醇，也會(huì)基本上全部去除分子量大于10000道爾頓的蛋白質(zhì)。圖1b)和2中兩種GFC色譜圖之間的相似性說(shuō)明，在本發(fā)明的新型提取方法中，乙醇產(chǎn)生了與液相中相同的非水溶性高分子量蛋白質(zhì)(組織內(nèi)原位)光譜。
本發(fā)明新方法中使用乙醇濃度的影響使用比率為6∶1(v/w)的30％，40％，50％，60％，70％，80％或90％乙醇預(yù)處理3小時(shí)或者未經(jīng)預(yù)處理后，用0.05M磷酸鹽緩沖液(pH6.9)提取的冷凍干燥鹿茸樣品的凝膠過(guò)濾色譜圖形如圖3所示。此圖說(shuō)明，低濃度的乙醇(30％，40％)和高濃度的乙醇(90％)去除高分子量蛋白質(zhì)的能力低于中等濃度乙醇(50-80％)的能力。
如圖4所示，由于低分子量蛋白質(zhì)的原因，在乙醇濃度范圍60-70％下總結(jié)合峰值區(qū)域的百分率到達(dá)最大值。低分子量峰值的絕對(duì)區(qū)域(用V.SEC表示)與取代蛋白質(zhì)的濃度成正比，而且隨著乙醇濃度從30％增加到90％緩慢降低。相反的是，高分子量峰值的絕對(duì)區(qū)域(用V.sec表達(dá))隨著乙醇濃度從30％升高到50％急劇下降，在乙醇濃度50-80％的低水平下保持平穩(wěn)，在使用90％乙醇時(shí)，再次輕微上升。
在本發(fā)明新方法中使用乙醇培養(yǎng)時(shí)間的影響如上述試驗(yàn)所述在緩沖液提取之前，用不同的濃度的乙醇處理鹿茸，并做整夜的預(yù)處理(16.5小時(shí))，將預(yù)處理時(shí)間調(diào)整為3小時(shí)，重復(fù)上述試驗(yàn)。通過(guò)比較圖3和圖5可知，預(yù)處理時(shí)間的增長(zhǎng)僅使提取無(wú)溶液的凝膠過(guò)濾色譜法的圖譜有輕微的變化。最明顯的變化是，相對(duì)于3個(gè)小時(shí)的預(yù)處理期，在前17分鐘重色譜柱洗滌時(shí)，表現(xiàn)出較高的去除高分子量蛋白質(zhì)的能力。
使用70％乙醇采用不同的培養(yǎng)時(shí)間，對(duì)高分子量和低分子量蛋白質(zhì)比例的影響結(jié)果參見(jiàn)圖6。低分子量蛋白質(zhì)的絕對(duì)區(qū)域(V.sec)從培養(yǎng)時(shí)間30分鐘到16小時(shí)(過(guò)夜)基本保持恒定，但是隨著時(shí)間的變化這些峰值按比例輕微上升。這是因?yàn)楦叻肿恿康鞍踪|(zhì)的絕對(duì)峰值區(qū)域(in V.sec)逐漸下降，由于隨著乙醇培養(yǎng)時(shí)間的增長(zhǎng)，可以更有效地去除這些蛋白質(zhì)。
本發(fā)明新方法中所用乙醇比率的影響圖7所示，對(duì)應(yīng)于提取的冷凍干燥鹿茸組織用量，本發(fā)明新方法中所用70％乙醇在2∶1和10∶1(v/w)之間不同比率的影響。在最后的提取物中高分子量和低分子量峰值比率在整個(gè)范圍內(nèi)保持適度的恒定，但是絕對(duì)峰值區(qū)域穩(wěn)步下降。由于低分子量蛋白的原因，在峰值區(qū)域中上述效果最大，這說(shuō)明，隨著加入組織中乙醇的比率增加，這些蛋白質(zhì)的產(chǎn)量降低。
本發(fā)明新方法使用的有機(jī)溶劑的影響圖8中比較了使用不同緩沖液取代70％乙醇預(yù)處理冷凍干燥鹿茸對(duì)磷酸鹽緩沖液提取物蛋白質(zhì)圖譜的影響，這些緩沖液分別為70％乙睛，70％丙酮，70％丙烷-2-醇或70％甲醇。在每種提取物中，很接近的高分子量蛋白質(zhì)范圍不復(fù)存在，這說(shuō)明了每一種有機(jī)溶劑在本發(fā)明的新方法中都是有效的。
本發(fā)明新方法所用的水合緩沖液的影響圖9比較了用不同水合緩沖液代替0.05M磷酸鹽緩沖液(PH6.9)對(duì)于最終提取物的蛋白質(zhì)圖譜中水合提取物的影響，所述的水合緩沖機(jī)為水，0.05M氯化鈉，0.05M檸檬酸鹽緩沖液(PH4.1)，0.05M醋酸鹽緩沖液(PH4.9)，0.05M tris緩沖液(PH7.8)，0.05M碳酸鹽緩沖液(PH10.0)。在PH數(shù)值接近中性時(shí)(用水，氯化鈉，tris或磷酸鹽緩沖液)，在提取物中會(huì)出現(xiàn)范圍非常相似的蛋白質(zhì))。但是，很少有高分子量蛋白質(zhì)出現(xiàn)在低PH情況下(使用檸檬酸鹽或醋酸鹽緩沖液)制備的提取物中，然而，在高PH的情況下(用碳酸鹽緩沖液)制備的提取物中，蛋白質(zhì)圖形中會(huì)明顯出現(xiàn)更大范圍的高分子量蛋白質(zhì)。
上述每一種提取物的產(chǎn)量和生長(zhǎng)因子含量都在表2中列出。在每一個(gè)例子中，在校正加入鹽含量后，產(chǎn)量可以用提取物的干重計(jì)算，并以冷凍干燥鹿茸粉末初始重量的百分率表達(dá)。盡管根據(jù)水合提取物媒介的PH值而變化，但是所有提取物都含有可測(cè)含量的生長(zhǎng)因子。EGF類(lèi)的活性在低的PH值(用檸檬酸或者醋酸緩沖液)或者高PH值(用碳酸鹽緩沖液)條件下制備的提取物中特異性增高。
表2.產(chǎn)物，IGF-1，IGF-2，TGFβ1，TGFβ2和EGF類(lèi)似物在本發(fā)明LMW提取方法制得的鹿茸粉末提取物中的濃度

使用鹿茸以外材料新方法的應(yīng)用用凝膠過(guò)濾色譜法對(duì)冷凍干燥的鹿胎盤(pán)、冷凍干燥的鹿血以及冷凍干燥的羊肝樣品的提取物測(cè)定出色譜圖，這些樣品用0.05M磷酸鹽緩沖液(PH6.9)提取，用30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％(重量)乙醇以質(zhì)量比為6∶1的比率對(duì)樣品進(jìn)行3小時(shí)的預(yù)處理，或者測(cè)定未經(jīng)過(guò)預(yù)處理的樣品，如圖10，11和12分別所示。這些數(shù)據(jù)說(shuō)明，用一定濃度范圍的乙醇(特別是70％的乙醇)來(lái)做預(yù)處理，對(duì)于減少上述原料的水合提取物中的高分子量蛋白質(zhì)是十分有效的，這些結(jié)果和以冷凍干燥光滑鹿茸為原料所得的結(jié)果是相似的。
將緩沖液用于羊肝水合提取物的前處理，用70％的乙醇以重量比為6∶1的比率預(yù)處理樣品3小時(shí)的效果，如圖13所示。至于光滑鹿茸，當(dāng)水合提取的過(guò)程在酸性條件下操作時(shí)(用檸檬酸鹽或者醋酸鹽)，羊肝中高分子量蛋白質(zhì)提取物是十分不明顯的。
因此，新方法可以表現(xiàn)為適用于光滑鹿茸之外的其它組織和原料。
在新方法中應(yīng)用冷凍光滑鹿茸組織如圖14所示，LMW提取物的凝膠過(guò)濾圖像，該提取物是用本發(fā)明所述方法從粉碎的冷凍光滑鹿茸組織提取而得，并將其同從冷凍干燥鹿茸所得的相似的提取物相比較。實(shí)質(zhì)上，沒(méi)有高分子量蛋白質(zhì)在冷凍樣品提取物的蛋白質(zhì)圖譜上出現(xiàn)。這說(shuō)明了，本發(fā)明所述的新方法很大程度上減少了在冷凍組織水合提取物中高分子蛋白質(zhì)的比例，此中情況同干燥的組織相類(lèi)似。
討論我們已經(jīng)展示了在水合提取物中蛋白質(zhì)分子量的分布，該提取物由用有機(jī)溶劑(乙醇)預(yù)處理的組織提取而得，該過(guò)程同下述過(guò)程相似，從水合溶液中獲得的高分子蛋白質(zhì)沉淀物，該水合溶液為附加冷處理有機(jī)溶劑的標(biāo)準(zhǔn)總蛋白質(zhì)提取物。
新方法已經(jīng)用乙醇、乙睛、丙酮、甲醇以及propan-2-ol作為例證，但是其它有機(jī)溶劑(包括但是不限于propan-1-ol，butan-1-ol)通過(guò)合理的推定可以應(yīng)用。
新方法相對(duì)于液相方法的主要優(yōu)點(diǎn)為
●用很少的有機(jī)溶劑；●不會(huì)導(dǎo)致組織提取無(wú)的稀釋。
這些減少了使用可燃性有機(jī)溶劑的危險(xiǎn)性又可以解決液相操作困難的問(wèn)題。更進(jìn)一步的說(shuō)，新方法去除了對(duì)于去掉蛋白質(zhì)沉淀物的分開(kāi)澄清的必要步驟。取而代之的，高分子量蛋白質(zhì)很簡(jiǎn)單的呈現(xiàn)不溶解性在組織的SITU中。因此，在水合條件下的提取物，以致只有低分子量蛋白質(zhì)和肽段solubilisation分理出來(lái)。
應(yīng)用乙醇在新方法中作為有機(jī)溶劑的一個(gè)主要的原因是由于它的抗微生物的活性(尤其是濃度為70％的乙醇)。這樣就顯著的減少了水合提取之前的組織原材料的細(xì)菌負(fù)載量。
在光滑鹿茸提取物中的高水平的IGF-1，IGF-2，TGFβ1，TGFβ2和EGF類(lèi)似物活性，表示了新的生產(chǎn)方法保留了生長(zhǎng)因子的活性。由此，可以合理的推定用乙醇預(yù)處理的組織提取物中富含其它生長(zhǎng)因子。
新的方法已經(jīng)用光滑鹿茸、鹿胎盤(pán)、鹿血和羊肝作為例證。與之相似的是，可以合理的假定，除了以上列舉的，其它組織中的蛋白質(zhì)也會(huì)呈現(xiàn)出乙醇預(yù)處理過(guò)程中的不溶解性，以便在后續(xù)的水合提取過(guò)程中提供豐富的低分子量蛋白質(zhì)片斷。
在新的方法中，已經(jīng)使用干燥的和冷凍的鹿茸作為例證。與之相似的，可以合理的假定其它組織也可以應(yīng)用在新方法中無(wú)論是非干燥的(冷凍魚(yú))或是干燥的狀態(tài)。
本發(fā)明的各個(gè)方面已經(jīng)用實(shí)施例的方式加以描述，在被審查的權(quán)利要求中，所做的不偏離原始保護(hù)范圍的修改和增加都是允許的。
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Betzing，H.and Lekim，D.(1975)″Process of manufacturing enzymepreparation rich in lipase″，Patent GB1454983.
權(quán)利要求
1.一種從原始組織分離低分子量肽的方法，包括如下步驟(a)將組織均質(zhì)化；(b)將均質(zhì)化的組織和有機(jī)溶劑混合，形成一種充分濕潤(rùn)的漿液；(c)靜置或攪拌漿液，使組織中的原始蛋白質(zhì)變性；(d)從組織中去除有機(jī)溶劑；(e)將步驟(d)中所得的經(jīng)有機(jī)溶劑處理的組織與足量的水或者水溶液混合以提取肽；(f)從步驟(e)的組織殘?jiān)蟹蛛x出液態(tài)提取物，從而獲得含有從組織去除的低分子量肽片斷的水溶液；
2.權(quán)利要求1所述的方法，其中在步驟(a)之前所述組織經(jīng)過(guò)干燥的預(yù)處理步驟。
3.權(quán)利要求2所述的方法，其中組織經(jīng)過(guò)冷凍干燥處理。
4.權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟(b)中所用的有機(jī)溶劑是乙醇。
5.權(quán)利要求1或4所述的方法，其中步驟(b)中所用的有機(jī)溶劑是70％乙醇。
6.權(quán)利要求1或4所述的方法，其中步驟(b)中所用的有機(jī)溶劑是濃度范圍在50％-80％的乙醇。
7.權(quán)利要求1或4所述的方法，其中步驟(b)中所用的有機(jī)溶劑是濃度范圍在60％-70％的乙醇。
8.權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟(b)中所用的有機(jī)溶劑是純態(tài)乙醇，其被加入到均質(zhì)組織中以提供占乙醇30體積％的總水含量。
9.權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟(c)中靜置或者攪拌漿液，并持續(xù)至少1小時(shí)。
10.如權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟(c)中靜置或者攪拌漿液，并持續(xù)3小時(shí)或者更長(zhǎng)的時(shí)間。
11.權(quán)利要求9或10所述方法，其中在本文限定的環(huán)境溫度下靜置或者攪拌漿液。
12.權(quán)利要求1所述的方法，包括附加步驟(d1)，其中在進(jìn)行(e)步驟之前、步驟(d)所得的有機(jī)溶劑處理的組織經(jīng)過(guò)充分的干燥處理。
13.權(quán)利要求1或12所述的方法，其中將步驟(d)或(d1)所得的有機(jī)溶劑處理的組織與水或者水溶液充分混合1小時(shí)。
14.權(quán)利要求13所述的方法，其中在本文限定的環(huán)境溫度或者更低的溫度下進(jìn)行混合。
15.權(quán)利要求1所述的方法，還包括附加的步驟(g)，其中該步驟是將步驟(e)和(f)重復(fù)操作一次或多次，從而提高從步驟(e)中組織殘?jiān)@得液相提取物的產(chǎn)量。
16.權(quán)利要求1或15所述的方法，其中將從步驟(f)或者步驟(g)中所得到的液態(tài)提取物干燥，獲得低分子量肽的提取物。
17.由權(quán)利要求1所述方法制得的分離的低分子量肽混合物。
18.有機(jī)溶劑在變性組織中原始蛋白質(zhì)的應(yīng)用，此用途作為從組織離析低分子量肽提取物的部分離析方法。
全文摘要
一種從原始組織分離低分子量肽的方法，包括如下步驟(a)將組織均質(zhì)化；(b)將均質(zhì)化的組織和有機(jī)溶劑混合，形成一種充分濕潤(rùn)的漿液；(c)靜置或攪拌漿液，使組織中的原始蛋白質(zhì)變性；(d)從組織中去除有機(jī)溶劑；(e)將(d)步驟中所得的經(jīng)有機(jī)溶劑處理的組織與足量的水或者溶液混合，以提取肽；(f)從(e)步驟的組織殘?jiān)蟹蛛x出液態(tài)提取物，從而獲得含有從組織去除的低分子量肽片斷的水溶液。
文檔編號(hào)C07K14/435GK1697792SQ200480000428
公開(kāi)日2005年11月16日 申請(qǐng)日期2004年3月19日 優(yōu)先權(quán)日2003年3月21日
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