專利名稱：鯊肌醇的制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及通過微生物轉化由肌醇制備鯊肌醇的方法。
本發(fā)明還涉及新型的NAD+非依賴型肌醇2-脫氫酶及其制備方法。本發(fā)明還涉及以NAD+非依賴型肌醇2-脫氫酶活性為指標的制備青蟹肌糖用微生物的篩選方法。本發(fā)明進一步涉及使用NAD+非依賴型肌醇2-脫氫酶或該酶的高活性株的青蟹肌糖及鯊肌醇的制備方法。
本發(fā)明還涉及新型酶，即鯊肌醇脫氫酶、以及利用該酶的鯊肌醇的制備方法。更詳細地，涉及催化鯊肌醇與青蟹肌糖間的氧化還原反應、在NADH或NADPH存在下將青蟹肌糖立體特異地還原成鯊肌醇的新型酶鯊肌醇脫氫酶、及利用了該酶的鯊肌醇的制備方法。
本發(fā)明進一步涉及用含有鯊肌醇及鯊肌醇以外的中性糖的混合液高效率地制備鯊肌醇的方法。
鯊肌醇能夠作為阿爾茨海默病的治療藥物、或生理活性物質的合成原料、液晶化合物的合成原料而利用。
背景技術：
肌醇是如下述立體結構式(A)所示的天然存在的已知物質。
另外，青蟹肌糖是如下述立體結構式(B)所示的已知物質。

又，鯊肌醇是如下述立體結構式(C)所示的已知物質。
鯊肌醇是肌醇的立體異構體之一，是廣泛見于動物·植物中的物質。另外，青蟹肌糖是具有氧化了肌醇的2位的軸向羥基的結構的化合物，它也作為天然物質普遍地存在。
鯊肌醇是有望作為阿爾茨海默病的治療藥物(參照非專利文獻1)、或生理活性物質的合成原料(參照專利文獻1)、液晶化合物的合成原料(參照專利文獻2)的用途的物質。
在化學合成手法中，作為青蟹肌糖或鯊肌醇的制法，有(i)用阮內(nèi)鎳還原六羥基苯，得到鯊肌醇的方法(參照非專利文獻2)；(ii)由呋喃葡萄糖衍生物通過5步的反應得到青蟹肌糖，進行還原，得到鯊肌醇的方法(參照非專利文獻3)；(iii)以順式-三-三均苯為原料，通過4步以上的反應得到鯊肌醇的方法(參照非專利文獻4)；(iv)用鉑催化劑氧化肌醇得到青蟹肌糖，接著進行酯化之后，進行還原和水解，得到鯊肌醇的方法(參照專利文獻2)；等等。
另外，作為利用微生物將肌醇轉化成鯊肌醇的方法，已知使用土壤桿菌屬細菌的方法(參照專利文獻3)?？墒?，在該方法中，鯊肌醇的收得率低，還產(chǎn)生其他的轉化物，因此不能工業(yè)規(guī)模地利用。
另一方面知道，醋酸桿菌屬細菌(參照非專利文獻5)，與肌醇作用，吸收氧，氧化成青蟹肌糖，但詳細的機理未研討。
將肌醇氧化成青蟹肌糖的酶(肌醇2-脫氫酶)，有來自動物·藻類·酵母·細菌等很多的生物種的報告，其是在自然界廣泛存在的酶。作為具有上述酶的代表性的微生物，有產(chǎn)氣氣桿菌(Aerobacteraerogenes)(參照非專利文獻6)、芽孢桿菌屬(Bacillus)細菌(參照非專利文獻7或8，參照專利文獻4-6)、假單孢菌屬(Pesudomonas)細菌等(參照非專利文獻9或10)。
可是，這些報告中的肌醇2-脫氫酶是NAD+依賴型的酶，為了氧化，需要NAD+或NADP+，在工業(yè)規(guī)模下使之作用時，為了再利用這些輔酶，就必須采用發(fā)酵生產(chǎn)，使底物的一部分被分解，此外，在工業(yè)規(guī)模下生產(chǎn)時存在必須保持低底物濃度等問題。
另一方面，關于鯊肌醇脫氫酶，有存在于牛腦中、和蟑螂脂肪組織中的報告例(參照非專利文獻11)，一般認為，這種酶，當將青蟹肌糖作為底物，使之用NADPH還原時，產(chǎn)生鯊肌醇、和肌醇這兩種物質?？墒?，因為底物特異性低，又未使用高純度的酶，各種性質也不明確，因此該酶可能是具有低底物特異性的醇脫氫酶，具有未在酶手冊(朝倉書店發(fā)行)中記載的情況。這樣，雖然在動物中有報告例，但是其真?zhèn)尾磺宄?br> 另外，還已知通過化學還原由微生物氧化而制備的青蟹肌糖，來制備鯊肌醇的方法(參照專利文獻7)?？墒牵ㄟ^青蟹肌糖的化學還原而得到的物質是鯊肌醇和肌醇的混合物，因此，脫鹽純化混合物，再由濃縮液通過結晶析出而得到溶解度低的鯊肌醇這一操作是必要的。為此，這樣的方法需要較多的操作，在鯊肌醇收得率這點上還有改善的余地。在上述狀況之下，人們希望開發(fā)從還原青蟹肌糖所得的鯊肌醇和肌醇的混合物中制備純化鯊肌醇的方法，由此簡便而高效率地制備鯊肌醇。
在溶液中使用NaBH4還原青蟹肌糖時，在反應后的溶液中除了肌醇、鯊肌醇之外，還少量含有鯊肌醇·硼酸復合體。已知可以通過下述方法得到鯊肌醇對于上述的鯊肌醇·硼酸復合體，首先將其作為沉淀物過濾，溶解于稀硫酸中，加入甲醇使之與硼酸共沸，從而去除硼酸，將殘留的溶液用離子交換樹脂脫鹽，從而得到鯊肌醇(參照非專利文獻12)。
該鯊肌醇·硼酸復合體是由下述立體結構式(D)所示的物質。

然而，在如上述的使用NaBH4還原青蟹肌糖的方法中，產(chǎn)生的鯊肌醇·硼酸復合體的比例低，在溶液中也生成鯊肌醇，因此有必要分離復合體和溶液成分，分別從中得到鯊肌醇。而且，為了用復合體得到鯊肌醇，需要大量的有機溶劑，因此在經(jīng)濟性方面還有改善的余地。因此，人們希望得到在工業(yè)規(guī)模下，簡便且高效率地制備鯊肌醇的方法。
專利文獻1美國專利第5,412,080號說明書專利文獻2德國聯(lián)邦共和國專利第3,405,663號說明書專利文獻3特開平9-140388號公報專利文獻4特開平4-126075號公報專利文獻5特開平05-192163號公報專利文獻6特開平06-007158號公報專利文獻7特開平2003-102492號公報非專利文獻1“The Journal of Biological Chemistry”(美國)，2000年，275卷(No.24)，p.18495-18502非專利文獻2“Journal of the American Chemical Society”(美國)，1948年，70卷，p.2931-2935非專利文獻3“Journal of the American Chemical Society”(美國)，1968年，90卷，p.3289-3290非專利文獻4“Angewandte Chemie”(德國)，1973年，85卷，p.1110-1111非專利文獻5“The Journal of Biological Chemistry”(美國)，1948年，174卷，p.173-188非專利文獻6“Archives of Biochemistry and Biophysics”(美國)，1956年，J，Larner et al.，60卷，p.352-363
非專利文獻7“The Journal of Biological Chemistry”(美國)，1979年，254卷，p.7684-7690非專利文獻8“Microbiology”(美國)，1994年，140卷，p.2289-2298非專利文獻9“Monatshefte fur Chemie”(德國)，1969年，100卷，p.1327-1337非專利文獻10“Journal of Bacteriology”(美國)，1977年，131卷，p.872-875非專利文獻11“生物化學和生物物理學研究報告”(美國)，第68卷，p.1133(1976年)非專利文獻12“Journal of organic Chemistry”(美國)，1958年，23卷，p.329-330發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供用肌醇直接地只通過微生物轉化，以高收獲量制備鯊肌醇的方法。
本發(fā)明又一目的是提供催化將肌醇轉化成青蟹肌糖的反應的新型酶、及使用該酶的青蟹肌糖和鯊肌醇的新型制備方法。
本發(fā)明又一目的是提供催化鯊肌醇與青蟹肌糖間的氧化還原反應、在NADH或NADPH存在下，將青蟹肌糖立體特異地還原成鯊肌醇的新型酶鯊肌醇脫氫酶、及利用了該酶的鯊肌醇的新型制備方法。
本發(fā)明又一目的是提供用含有鯊肌醇及鯊肌醇以外的中性糖的混合液高效率地制備高純度的鯊肌醇的新方法。
本發(fā)明人通過尋求具有由肌醇生成青蟹肌糖的能力的微生物的研究，發(fā)現(xiàn)了從自然界分離的屬于醋酸桿菌屬的細菌(AB10253)，該菌株在獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術綜合研究所特許生物保藏中心以保藏號FERM P-18868(國際保藏號FERM BP-10136)保藏。而且，確立了用肌醇制備青蟹肌糖的方法、及將得到的青蟹肌糖通過化學還原而制備鯊肌醇的方法(特開平2003-102492號公報)。
那以后，出于提高向青蟹肌糖轉化的能力，將該菌株通過突變來育種便發(fā)現(xiàn)在這些突變菌株之中存在將由肌醇生成的青蟹肌糖生物還原成少量鯊肌醇的菌株。于是，本發(fā)明人對這些菌株進一步的突變育種，以期得到只通過培養(yǎng)轉化即可由肌醇直接、大量地生成并積累鯊肌醇的菌株。結果成功地得到所期望的突變株，具有將由肌醇氧化所產(chǎn)生的青蟹肌糖還原成鯊肌醇并積累在培養(yǎng)基中的能力的菌株。
進一步地，在自然界中發(fā)現(xiàn)了雖然轉化能力比AB10253低，但具有由肌醇生成鯊肌醇的能力的菌株，通過16SrRNA的堿基序列鑒定確定了所述菌株是屬于啤酒醋桿菌(Acetobacter cerevisiae)、Acetobacter malorum、或須芒草伯克霍爾德氏菌(Burkholderiaandropogonis)的微生物。
發(fā)現(xiàn)利用這些微生物能夠高效率地制備鯊肌醇。
本發(fā)明人進一步地認為如果能夠取得能將肌醇高效率地轉化成青蟹肌糖的酶，則利用此種酶可以由高濃度的底物肌醇高效率地制備青蟹肌糖。另外，如果能夠通過篩選分離出該酶的高活性株，則可將其用于青蟹肌糖的制備。
于是，本發(fā)明人在下述的假說的基礎上為分離該酶而進行了刻苦研究，該假說是具有能夠催化由肌醇向青蟹肌糖轉化的反應的、以往未知的新型的NAD+非依賴型肌醇2-脫氫酶。研究結果發(fā)現(xiàn)，在屬于醋酸桿菌屬的醋酸桿菌的AB10253中存在NAD+非依賴型的肌醇2-脫氫酶。進一步地，本發(fā)明人通過利用該酶、或該酶的活性高的微生物，能夠高效率地制備青蟹肌糖，通過還原得到的青蟹肌糖，成功地、高效率地制備了高純度的鯊肌醇。
本發(fā)明人接著研究了在由上述肌醇直接地生成鯊肌醇的菌株的菌體中怎樣地由肌醇向鯊肌醇轉化，結果發(fā)現(xiàn)以氧依賴的方式氧化肌醇的2位羥基使其轉變?yōu)榍嘈芳√呛?，在具有以NADH或NADPH依賴的方式將青蟹肌糖還原成鯊肌醇的活性的酶的作用下生成鯊肌醇。基于上述活性，本發(fā)明人成功地純化了具有將青蟹肌糖還原成鯊肌醇的活性的酶。這種酶具有以NADPH依賴的方式將青蟹肌糖立體特異地還原成鯊肌醇的活性、以及以NADP+依賴的方式將鯊肌醇氧化成青蟹肌糖的活性，將這種酶命名為“鯊肌醇脫氫酶”。另外本發(fā)明的酶由于也具有氧化肌醇的5位的羥基的能力，因此也可稱為肌醇5-脫氫酶。
進一步地，由大腸桿菌或土壤桿菌屬、枯草芽孢桿菌、野油菜黃單胞菌(Xanthomonas campestris)的基因組，利用PCR法成功地克隆了編碼鯊肌醇脫氫酶的基因。
另外，本研究人在本發(fā)明的酶以NAD+或NADP+依賴的方式進行氧化還原反應的事實基礎上認為，通過使之與已經(jīng)存在的肌醇2-脫氫酶(具有以NAD+或NADP+依賴的方式將青蟹肌糖還原成肌醇的活性；EC1.1.1.18)聯(lián)合(參照

圖1)，能夠從肌醇經(jīng)由青蟹肌糖向鯊肌醇直接轉換，并取得了成功。
進一步地，本發(fā)明人認為，為了由含有通過青蟹肌糖的還原等而得到的、鯊肌醇、及肌醇等的中性糖的混合液高效率地制備鯊肌醇，形成鯊肌醇·硼酸復合體是有利的?；谶@樣的想法，本研究人刻苦研究了只將鯊肌醇和肌醇的混合液中的鯊肌醇高效率地導入到鯊肌醇·硼酸復合體中的方法。其結果發(fā)現(xiàn)由鯊肌醇、硼酸、及金屬離子構成的鯊肌醇·硼酸復合體，具有特異的鍵，是在其他的中性糖的復合體中看不到的溶解度低的復合體。進而發(fā)現(xiàn)通過向混合液中加入相當于溶解鯊肌醇2倍摩爾以上、優(yōu)選2-3倍摩爾的硼酸和金屬鹽，且將溶液保持在pH8.0-11.0、優(yōu)選pH9.0-10.0的堿性，可使鯊肌醇·硼酸復合體高效率地形成、沉淀。在這樣的條件之下，由含有鯊肌醇、及肌醇等的中性糖的混合液形成鯊肌醇·硼酸復合體，使該復合體溶解于酸之后，使用離子交換樹脂和水溶性有機溶劑等純化，由此可成功地高效率制備鯊肌醇。
根據(jù)上述完成了本發(fā)明。
即，本發(fā)明如下。
(1)一種鯊肌醇的制備方法，其特征在于，通過使屬于醋酸桿菌屬或伯克霍爾德氏菌屬的、具有將肌醇轉化成鯊肌醇的能力的微生物在含有肌醇的溶液中與肌醇作用，從而使上述溶液中生成、積累鯊肌醇，然后從該溶液中收集鯊肌醇。
(2)根據(jù)(1)所述的制備方法，其特征在于，上述含有肌醇的溶液是含有肌醇的液體培養(yǎng)基，通過在該液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)上述微生物，從而使之與肌醇作用。
(3)根據(jù)(1)所述的制備方法，其特征在于，使通過培養(yǎng)得到的上述微生物菌體在上述溶液中與肌醇作用。
(4)根據(jù)(1)-(3)的任1項所述的制備方法，其中，上述微生物是屬于啤酒醋桿菌(Acetobacter cerevisiae)、Acetobactermalorum、或須芒草伯克霍爾德氏菌(Burkholderia andropogonis)的微生物。
(5)根據(jù)(1)-(3)的任1項所述的制備方法，其中，上述微生物是醋酸桿菌AB10281FERM BP-10119或其突變株。
(6)一種具有將肌醇轉化成鯊肌醇的能力的醋酸桿菌AB10281FERM BP-10119或其突變株。
(7)一種至少具有下述理化性質的NAD+非依賴型肌醇2-脫氫酶，(a)作用在電子受容物的存在下，催化從肌醇奪取電子，生成青蟹肌糖的反應；(b)最適pH在pH4.5-5.5下活性顯示出最大值；(c)輔因子每1摩爾的酶中含有1摩爾的血紅素鐵；(d)抑制劑酶活性被1mM的Sn2+離子抑制在1％以下；(e)亞單位結構是至少含有分子量76k道爾頓和46k道爾頓的蛋白質的異聚體；(f)底物特異性與D-chiro-肌醇、muco-肌醇、肌醇反應，分別轉化成D-chiro-1-肌糖、L-chiro-2-肌糖、青蟹肌糖，不與allo-肌醇、鯊肌醇、L-chiro-肌醇、葡萄糖反應。
(8)一種肌醇2-脫氫酶的制備方法，其特征在于，培養(yǎng)具有生產(chǎn)NAD+非依賴型肌醇2-脫氫酶能力的屬于醋酸桿菌屬的微生物，從所培養(yǎng)的微生物菌體分離純化肌醇2-脫氫酶。
(9)根據(jù)(8)所述的制備方法，其中，上述微生物是醋酸桿菌AB10253FERM BP-10136。
(10)一種青蟹肌糖的制備方法，其特征在于，在含有肌醇和電子受體的溶液中使NAD+非依賴型肌醇2-脫氫酶與肌醇作用，生成青蟹肌糖，從溶液中分離純化生成的青蟹肌糖。
(11)一種鯊肌醇的制備方法，包括在含有肌醇和電子受體的溶液中使NAD+非依賴型肌醇2-脫氫酶與肌醇作用，生成青蟹肌糖的步驟；使還原劑與上述青蟹肌糖作用，生成鯊肌醇的步驟；以及，分離純化上述鯊肌醇的步驟。
(12)一種制備青蟹肌糖用微生物的篩選方法，其特征在于，誘變處理醋酸桿菌AB10253，以NAD+非依賴型肌醇2-脫氫酶活性為指標，對得到的突變株進行篩選。
(13)一種制備青蟹肌糖用微生物的篩選方法，其特征在于，從含有微生物的天然試樣之中分離微生物，以NAD+非依賴型肌醇2-脫氫酶活性為指標，對經(jīng)分離的微生物進行篩選。
(14)一種青蟹肌糖的制備方法，其特征在于，通過在含有肌醇的培養(yǎng)基中培養(yǎng)由(12)或(13)所述的篩選方法得到的制備青蟹肌糖用微生物，由肌醇生成青蟹肌糖，從培養(yǎng)基分離純化生成的青蟹肌糖。
(15)一種鯊肌醇的制備方法，包括通過在含有肌醇的培養(yǎng)基中培養(yǎng)由(12)或(13)所述的篩選方法得到的制備青蟹肌糖用微生物，由肌醇生成青蟹肌糖的步驟；使還原劑與上述青蟹肌糖作用，生成鯊肌醇的步驟；以及，分離純化上述鯊肌醇的步驟。
(16)一種具有下述理化性質的鯊肌醇脫氫酶，反應如下述反應式所示，催化鯊肌醇與青蟹肌糖間的氧化還原反應、在NADH或NADPH存在下將青蟹肌糖立體特異地還原成鯊肌醇。
(17)根據(jù)(16)所述的鯊肌醇脫氫酶，其中，還進一步具有下述的理化性質，(a)分子量及締合特性38-46k道爾頓，形成2聚體或3聚體；(b)輔酶將NAD+或NADP+或者NADH或NADPH作為輔酶；(c)活化重金屬在Co2+離子的存在下被活化；(d)抑制重金屬在Sn2+離子的存在下被抑制；(e)最適pH在pH5-9下具有活性。
(18)下述(A)或(B)的蛋白質，(A)包含SEQ.ID.NO28所示的氨基酸序列的蛋白質；(B)在SEQ.ID.NO28所示的氨基酸序列中，有1個或多個氨基酸發(fā)生取代、缺失、插入、和/或附加的氨基酸序列，具有催化鯊肌醇與青蟹肌糖間的氧化還原反應、在NADH或NADPH存在下將青蟹肌糖立體特異地還原成鯊肌醇的酶活性的蛋白質。
(19)編碼以下(A)或(B)的蛋白質的DNA，(A)包含SEQ.ID.NO28所示的氨基酸序列的蛋白質；(B)包含在SEQ.ID.NO28所示的氨基酸序列中有1個或多個氨基酸發(fā)生取代、缺失、插入、和/或附加的氨基酸序列，并具有催化鯊肌醇與青蟹肌糖間的氧化還原反應、在NADH或NADPH存在下將青蟹肌糖立體特異地還原成鯊肌醇的酶活性的蛋白質。
(20)下述(a)或(b)的DNA，(a)包含SEQ.ID.NO27所示的堿基序列的編碼區(qū)的DNA；(b)與具有SEQ.ID.NO27所示的堿基序列或與該堿基序列互補的堿基序列的DNA在嚴格條件下雜交，并編碼具有催化鯊肌醇與青蟹肌糖間的氧化還原反應、在NADH或NADPH存在下將青蟹肌糖立體特異地還原成鯊肌醇的酶活性的蛋白質的DNA。
(21)一種包含(19)或(20)所述的DNA的載體。
(22)一種包含(19)或(20)所述的DNA、或者(21)所述的載體的轉化微生物。
(23)根據(jù)(22)所述的轉化微生物，轉化的宿主是大腸桿菌。
(24)一種鯊肌醇脫氫酶的制備方法，其特征在于，培養(yǎng)(22)或(23)所述的轉化微生物，從培養(yǎng)物收集鯊肌醇脫氫酶。
(25)一種鯊肌醇的制備方法，其特征在于，使(16)所述的鯊肌醇脫氫酶、和催化在NAD+或NADP+存在下氧化肌醇生成青蟹肌糖的反應的肌醇2-脫氫酶(EC1.1.1.18)共存的溶液中，在pH6.0-8.5下且在NAD+或NADP+存在下，將肌醇作為底物，使之發(fā)生酶轉化反應成為鯊肌醇。
(26)根據(jù)(25)所述的鯊肌醇的制備方法，其特征在于，在溶液中添加青蟹肌糖并使之達到0.01-3％。
(27)根據(jù)(25)所述的鯊肌醇的制備方法，其特征在于，在溶液中添加青蟹肌糖并使之達到0.2-0.5％。
(28)根據(jù)(25)所述的鯊肌醇的制備方法，其特征在于，在溶液中添加Co鹽和/或Mg鹽，并使之達到0.01-5.0mM。
(29)根據(jù)(25)所述的鯊肌醇的制備方法，其特征在于，在溶液中添加Co鹽和/或Mg鹽，并使之達到0.2-2.0mM。
(30)根據(jù)(25)所述的鯊肌醇的制備方法，其特征在于，進行制備使得溶液中的肌醇濃度達到5-22％，使經(jīng)酶反應生成的鯊肌醇在反應溶液中結晶化，將鯊肌醇以晶體形式篩選到體系外。
(31)根據(jù)(25)所述的制備方法，其中，鯊肌醇脫氫酶是下述(A)或(B)的蛋白質，(A)包含SEQ.ID.NO28所示的氨基酸序列的蛋白質；(B)包含在SEQ.ID.NO28所示的氨基酸序列中有1個或多個氨基酸發(fā)生取代、缺失、插入、和/或附加的氨基酸序列，并具有催化鯊肌醇與青蟹肌糖間的氧化還原反應、在NADH或NADPH存在下將青蟹肌糖立體特異地還原成鯊肌醇的酶活性的蛋白質。
(32)根據(jù)(25)所述的制備方法，其中，鯊肌醇脫氫酶是由下述(a)或(b)的DNA編碼的蛋白質，(a)包含SEQ.ID.NO27所示的堿基序列的編碼區(qū)的DNA；(b)與具有SEQ.ID.NO27所示的堿基序列或與該堿基序列互補的堿基序列的DNA在嚴格條件下雜交，并編碼具有催化鯊肌醇與青蟹肌糖間的氧化還原反應、在NADH或NADPH存在下將青蟹肌糖立體特異地還原成鯊肌醇的酶活性的蛋白質的DNA。
(33)根據(jù)(25)所述的制備方法，其中，鯊肌醇脫氫酶是下述(C)或(D)的蛋白質，(C)包含SEQ.ID.NO2、4、6、8、10、12或14所示的氨基酸序列的蛋白質；(D)包含在SEQ.ID.NO2、4、6、8、10、12或14所示的氨基酸序列中有1個或多個氨基酸發(fā)生取代、缺失、插入、和/或附加的氨基酸序列，并具有催化鯊肌醇與青蟹肌糖間的氧化還原反應、在NADH或NADPH存在下將青蟹肌糖立體特異地還原成鯊肌醇的酶活性的蛋白質。
(34)根據(jù)(25)所述的制備方法，其中，鯊肌醇脫氫酶是由下述(c)或(d)的DNA編碼的蛋白質，(c)包含SEQ.ID.NO1、3、5、7、9、11或13所示的堿基序列的編碼區(qū)的DNA；(d)與具有SEQ.ID.NO1、3、5、7、9、11或13所示的堿基序列或與該堿基序列互補的堿基序列的DNA在嚴格條件下雜交，并編碼具有催化鯊肌醇與青蟹肌糖間的氧化還原反應、在NADH或NADPH存在下將青蟹肌糖立體特異地還原成鯊肌醇的酶活性的蛋白質的DNA。
(35)一種鯊肌醇的制備方法，包括，在含有鯊肌醇及鯊肌醇以外的中性糖的混合液中，加入在該混合液中溶解的鯊肌醇的2倍摩爾以上的量的硼酸和金屬鹽，且將該混合液的pH調至8.0-11.0，形成鯊肌醇·硼酸復合體的第1步驟；從混合液中分離上述復合體的第2步驟；使經(jīng)分離的復合體溶解于酸中，使之分解為鯊肌醇和硼酸的第3步驟；由在第3步驟中得到的酸性溶液或酸性懸浮液分離純化鯊肌醇的第4步驟。
(36)根據(jù)(35)所述的制備方法，其特征在于，在上述第1步驟中，加入的硼酸和金屬鹽的量是在上述溶解于混合液中的鯊肌醇的2倍摩爾以上、且3倍摩爾以下。
(37)根據(jù)(35)所述的制備方法，其特征在于，在上述第1步驟中，將上述混合液的pH調整為9.0-10.0。
(38)根據(jù)(35)所述的制備方法，其中，上述金屬鹽是選自NaCl、NaHCO3、Na2CO3、Na2SO4、NaHSO4、NaH2PO4、Na2HPO4、Na3PO4、硼砂、KCl、KHCO3、K2CO3、K2SO4、KHSO4、KH2PO4、K2HPO4、K3PO4、MgCl2、MgCO3、及MgSO4的1種或2種以上的金屬鹽。
(39)根據(jù)(35)所述的制備方法，其中，上述含有鯊肌醇及鯊肌醇以外的中性糖的混合液，是通過在含有青蟹肌糖的溶液中還原青蟹肌糖而得到的含有肌醇和鯊肌醇的混合液。
(40)根據(jù)(35)所述的制備方法，其特征在于，在上述第3步驟中，將使上述復合體溶解于酸而得到的溶液調整為0.1當量以上的酸性，并且，在上述第4步驟中，使上述酸性溶液與強酸性離子交換樹脂、及強堿性離子交換樹脂或硼酸選擇性吸附樹脂接觸后，從該酸性溶液析出鯊肌醇。
(41)根據(jù)(35)所述的制備方法，其特征在于，在上述第4步驟中，向上述酸性溶液或酸性懸浮液中加入水溶性有機溶劑，使鯊肌醇析出。
(42)根據(jù)(41)所述的制備方法，其特征在于，上述水溶性有機溶劑是乙醇或甲醇，相對于上述酸性溶液或酸性懸浮液，加入0.3-3倍容積的乙醇、或0.3-5倍容積的甲醇。
(43)根據(jù)(41)所述的制備方法，其特征在于，上述水溶性有機溶劑是乙醇或甲醇，相對于上述酸性溶液或酸性懸浮液，加入0.6-1.5倍容積的乙醇、或0.9-2倍容積的甲醇。
(44)一種鯊肌醇的制備方法，包括，在含有青蟹肌糖的溶液中，使用硼氫化金屬鹽(metal salt of boron hydirde)還原青蟹肌糖，得到含有肌醇和鯊肌醇的混合液的第1步驟；向上述混合液中加入酸，使混合液中的鯊肌醇·硼酸復合體溶解，并且將溶液調至0.01當量以上的酸性溶液的第2步驟；以及，以肌醇不析出的量向上述酸性溶液中加入水溶性有機溶劑，只使鯊肌醇析出的第3步驟。
(45)根據(jù)(44)所述的制備方法，其特征在于，在上述第3步驟中，加入的水溶性有機溶劑是乙醇、甲醇或者1-丙醇，相對于上述酸性溶液，加入0.2-0.4倍容積的乙醇、0.2-0.8倍容積的甲醇、或者0.2-0.4倍容積的1-丙醇。
(46)根據(jù)(44)所述的制備方法，其特征在于，在上述第3步驟中，加入的水溶性有機溶劑是乙醇、甲醇或者1-丙醇，相對于上述酸性溶液，加入0.35-0.45倍容積的乙醇、0.45-0.55倍容積的甲醇、或者0.35-0.45倍容積的1-丙醇。
附圖的簡單說明圖1是表示通過酶的締合來制備鯊肌醇的原理的圖。
實施發(fā)明的最佳方案1.使用醋酸桿菌屬或伯克霍爾德氏菌屬的微生物的制備鯊肌醇的方法本發(fā)明的一個方案，涉及鯊肌醇的制備方法，該制備方法的特征在于，通過使屬于醋酸桿菌屬或伯克霍爾德氏菌屬的、具有將肌醇轉化成鯊肌醇的能力的微生物在含有肌醇的溶液中與肌醇作用，從而使上述溶液中生成、積累鯊肌醇，然后從該溶液中收集鯊肌醇。
在該制備方法中使用的微生物，是屬于醋酸桿菌屬或者伯克霍爾德氏菌屬的微生物，是具有將肌醇轉化成鯊肌醇的能力的微生物。在此，作為屬于醋酸桿菌屬的微生物，可舉出啤酒醋桿菌(Acetobactercerevisiae)、Acetobacter malorum、Acetobacter orleanensis、Acetobacterindonesiensis、東方醋桿菌(Acetobacter orientalis)、醋化醋桿菌(Acetobacter aceti)、液化醋桿菌(Acetobacter liquefaciens)、巴氏醋桿菌(Acetobacter pasteurianus)、漢氏醋桿菌(Acetobacterhansenii)、或者上述屬中種未鑒定菌株(sp.)。作為屬于伯克霍爾德氏菌屬的微生物，可舉出須芒草伯克霍爾德氏菌(Burkholderiaandropogonis)、石竹伯克霍爾德氏菌(Burkholderia caryophylli)、草根伯克霍爾德氏菌(Burkholderia graminis)。其中，特別優(yōu)選啤酒醋桿菌、Acetobacter malorum、或者須芒草伯克霍爾德氏菌。所謂“將肌醇轉化成鯊肌醇的能力”，例如是指在含有肌醇的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時，在該培養(yǎng)基中積累鯊肌醇的能力。
作為上述微生物的具體例，可舉出醋酸桿菌AB10281。該菌株是將醋酸桿菌AB10253FERM BP-10136誘變育種，賦予將肌醇轉化成鯊肌醇的能力的菌株，在2004年1月20日在獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術綜合研究所特許生物保藏中心(日本國茨城縣筑波東1丁目1番地1中央第6郵編305-8566)保藏，保藏號FERM P-19639。并基于布達佩斯條約轉為國際保藏，保藏號為FERM BP-10119。
另外，也可以利用上述醋酸桿菌AB10281或者醋酸桿菌AB10253等的屬于醋酸桿菌屬的微生物的衍生株。衍生株，將上述微生物誘變育種，從導入了變異的菌株選擇具有能夠將肌醇直接選擇性地轉化成鯊肌醇的特性的菌株而得。作為誘變育種的方法，例如除了UV照射、放射線照射等物理誘變方法以外，還可例舉出通過混合N-亞硝基胍、甲磺酸乙酯、亞硝酸、甲磺酸甲酯、吖啶色素、苯并芘、硫酸二甲酯等誘變劑而進行的化學誘變方法。
作為使上述的微生物在含有肌醇的溶液中與肌醇作用的方法，首先可舉出在含有肌醇的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)本發(fā)明的微生物的方法。
在該情況下，所使用的液體培養(yǎng)基的組成，只要能夠所述目的則沒有特別的限制，只要是除了含有向鯊肌醇轉化的原料肌醇以外還含有碳源、氮源、有機營養(yǎng)源、無機鹽類等的培養(yǎng)基即可，合成培養(yǎng)基·天然培養(yǎng)基均可使用。肌醇優(yōu)選添加0.1％-40％，更優(yōu)選添加10％-30％，作為碳源，添加甘油、蔗糖、麥芽糖或者淀粉，添加量優(yōu)選為0.1％-20％、更優(yōu)選為0.3-5％，作為氮源，添加酵母提取物、蛋白胨、酪蛋白水解物、硫酸銨、氯化銨、硝酸銨或尿素等，添加量優(yōu)選為0.01％-5.0％、更優(yōu)選為0.5％-2.0％。此外，還能夠根據(jù)需要在培養(yǎng)基中添加能夠生成鈉、鉀、鈣、鎂、鈷、錳、鋅、鐵、銅、鉬、磷酸、硫酸等的離子的無機鹽類。培養(yǎng)液中的氫離子濃度不需要特別調制，但優(yōu)選調至pH4-10、更優(yōu)選調至pH5-9而培養(yǎng)，如此即可高效率地得到鯊肌醇。
培養(yǎng)條件根據(jù)培養(yǎng)基的種類不同而異，但培養(yǎng)溫度為12-35℃，優(yōu)選為20-27℃，另外，通過液體搖床振蕩培養(yǎng)，或向液體培養(yǎng)基中吹入空氣或氧氣等需氧培養(yǎng)即可。在該培養(yǎng)中，肌醇在培養(yǎng)初期被氧化，產(chǎn)生的青蟹肌糖在培養(yǎng)后期在有機體中被還原，產(chǎn)生鯊肌醇。當進一步進行培養(yǎng)時，鯊肌醇也緩慢地分解。因此，培養(yǎng)期間，只要進行到鯊肌醇顯示最大或必要量的積累量即可，通常為1-10天，優(yōu)選為3-8天。
另外，也可以使通過培養(yǎng)而得到的微生物菌體在含有肌醇的溶液中與肌醇作用。在此，作為通過培養(yǎng)而得到的菌體，既可以使用另行在適當?shù)呐囵B(yǎng)條件下培養(yǎng)微生物而得到的菌體，也可以再度使用從培養(yǎng)液分離用于制備肌醇的微生物而收集的菌體?？梢岳秒x心分離、過濾等公知的方法收集菌體。
通過如如上所述使微生物與肌醇作用，在溶液中積累鯊肌醇。從培養(yǎng)液收集鯊肌醇的方法，可應用通常的分離純化水溶性中性物質的一般的方法。即，從培養(yǎng)液去除菌體之后，通過用活性炭和離子交換樹脂等處理培養(yǎng)液上清，可基本除掉鯊肌醇以外的雜質。然后，通過使用再結晶等的方法，可分離目的物質。
更具體地，出于去除不希望有的成分的目的，使積累了鯊肌醇的培養(yǎng)液上清在填充有強酸性陽離子交換樹脂、例如DuoliteC-20(H+型)的柱中通過，收集通過液，然后使去離子水在該柱中通過，洗滌，收集洗滌液，合并所得到的通過液和洗滌液。使所得的溶液在填充有強堿性陰離子交換樹脂、例如DuoliteA116(OH-型)的柱中通過，收集通過液，然后使去離子水在該柱中通過，洗滌，收集洗滌液，合并所得到的通過液和洗滌液，取得含有鯊肌醇、幾乎不含其它的雜質的水溶液。在濃縮該水溶液而得到的鯊肌醇的濃稠溶液中加入適當量的乙醇，在室溫或低溫放置一夜，就能夠結晶析出純的鯊肌醇晶體。另外，利用鯊肌醇的水溶解性低，只濃縮并過濾該水溶液也能結晶析出純的鯊肌醇晶體。而且，在進行柱操作時，也能夠使用以脫色為目的而填充有活性炭的柱。
作為其他的純化方法，采用下述的方法也能夠得到純的鯊肌醇的晶體在后述的、含有通過培養(yǎng)而得到的鯊肌醇的溶液中加入硼酸、NaCl，制備鯊肌醇硼酸復合體，將其過濾出后，采用酸使硼酸游離，通過加入甲醇之類的有機溶劑使鯊肌醇結晶化。
而且，在本菌株的培養(yǎng)中，在常溫下水溶解性低(溶解度約1.6％)的鯊肌醇結晶化，產(chǎn)生沉淀。為此，在該培養(yǎng)過程中，追加加入肌醇，再使鯊肌醇以晶體形式積累也可以。
2.新型的NAD+非依賴型肌醇2-脫氫酶、以及使用該酶的青蟹肌糖和鯊肌醇的制法本發(fā)明的另一方案涉及新型的NAD+非依賴型肌醇2-脫氫酶、以及使用該酶的青蟹肌糖和鯊肌醇的制法。
<2-1>新型的NAD+非依賴型肌醇2-脫氫酶本發(fā)明的NAD+非依賴型肌醇2-脫氫酶，至少具有下述理化性質。
(a)作用在電子受容物的存在下，催化從肌醇奪取電子，生成青蟹肌糖的反應；(b)最適pH在pH4.5-5.5下活性顯示出最大值；(c)輔因子每1摩爾的酶中含有1摩爾的血紅素鐵；(d)抑制劑酶活性被1mM的Sn2+離子抑制在1％以下；(e)亞單位結構是至少含有分子量76k道爾頓和46k道爾頓的蛋白質的異聚體；(f)底物特異性與D-chiro-肌醇、muco-肌醇、肌醇反應，分別轉化成D-chiro-1-肌糖、L-chiro-2-肌糖、青蟹肌糖，不與allo-肌醇、鯊肌醇、L-chiro-肌醇、葡萄糖反應。
(a)的作用，通過在電子受容物的存在下，測定肌醇2-脫氫酶活性就能確認。在此，作為電子受容物，可例舉出氧化型DCIP、PMS(吩嗪硫酸甲酯)、亞甲基藍、Fe3+離子等，可組合這些物質來使用，但優(yōu)選使用氧化型DCIP。肌醇2-脫氫酶活性，例如可將由100mM磷酸緩沖液(pH5.0)、肌醇5mg、2，4-二氯吲哚酚(氧化型DCIP)0.4mg組成的1mL溶液中的600nm的吸光度變化換算成反應速度，將每1min氧化1μmol的肌醇的活性作為1單位而測定。(b)的最適pH，在各pH下測定肌醇2-脫氫酶活性，尋找酶活性顯示最大值的pH范圍，由此得以確認。另外，(d)的性質，在酶活性測定體系中添加Sn2+離子，測定酶活性，與未添加Sn2+離子時的活性比較，由此得以確認。另外，(e)的亞單位結構，例如通過SDS-PAGE(十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳)等得以確認。再者，各亞單位的76k道爾頓和46k道爾頓分子量，分別是近似的值，其可以是上下相差幾千道爾頓的值。
本發(fā)明的NAD+非依賴型肌醇2-脫氫酶，只要具有上述性質即可，無其它特別限定，例如舉出來源于醋酸桿菌AB10253的該種酶。本發(fā)明的NAD+非依賴型肌醇2-脫氫酶的底物特異性如上所述，但關于來源于醋酸桿菌AB10253的酶，顯示在底物濃度50mM下的相對活性和Km值，如下所示。即為D-chiro-肌醇(相對活性100％、Km＝8.8mM)、D-chiro-肌醇(相對活性100％、Km＝8.8mM)、muco-肌醇(相對活性68％、Km＝14.5mM)、肌醇(相對活性53％、Km＝20mM)。
本發(fā)明的NAD+非依賴型肌醇2-脫氫酶，是與已知的NAD+依賴型的肌醇2-脫氫酶不同的類型的NAD+非依賴型肌醇2-脫氫酶。關于兩種酶不同點的比較如下述表1所示。
表1

<2-2>NAD+非依賴型肌醇2-脫氫酶的制備方法本發(fā)明的NAD+非依賴型肌醇2-脫氫酶的制備方法，其特征在于，培養(yǎng)具有生產(chǎn)NAD+非依賴型肌醇2-脫氫酶的能力的、屬于醋酸桿菌屬的微生物，從所培養(yǎng)的微生物菌體分離純化肌醇2-脫氫酶。
作為能夠用于制備NAD+非依賴型肌醇2-脫氫酶的微生物，只要具有生產(chǎn)NAD+非依賴型肌醇2-脫氫酶的能力即可，無其它特別限定，例如舉出醋酸桿菌AB10253FERM BP-10136。為培養(yǎng)微生物所使用的培養(yǎng)基是已知的一般的微生物培養(yǎng)所使用的培養(yǎng)基，可使用含有碳源、氮源、其他營養(yǎng)源等的培養(yǎng)基。在此，作為碳源可例舉出葡萄糖、蔗糖、麥芽糖或者淀粉等，其濃度優(yōu)選為0.1-20％、更優(yōu)選為0.3-5％。作為氮源，可例舉出蛋白胨、酵母提取物、酪蛋白水解物、硫酸銨、氯化銨、硝酸銨、尿素或者肉膏等，其濃度優(yōu)選為0.01-5.0％、更優(yōu)選為0.5-2.0％。此外，優(yōu)選根據(jù)需要在培養(yǎng)基中添加能夠生成鈉、鉀、鈣、鎂、鈷、錳、鋅、鐵、銅、鉬、磷酸、硫酸等的離子的無機鹽類。培養(yǎng)液中的氫離子濃度調至pH3-10、優(yōu)選調至pH5-7而培養(yǎng)，如此即能夠高效率地誘導本發(fā)明的酶的表達。用％表示的值指w/v的百分率，用％表示濃度時也包含相同的含義。
再有，為了誘導NAD+非依賴型肌醇2-脫氫酶的表達，優(yōu)選使用含有肌醇的培養(yǎng)基。該情況下，加入的肌醇的濃度，適宜為0.2-15％，優(yōu)選為1％-5％，更優(yōu)選為3％。
培養(yǎng)條件也根據(jù)培養(yǎng)基的種類不同而不同，但培養(yǎng)溫度優(yōu)選為12-35℃，更優(yōu)選為20-27℃，另外以液體培養(yǎng)基搖床振蕩培養(yǎng)，或向液體培養(yǎng)基中吹入空氣或氧氣等需氧培養(yǎng)為好。培養(yǎng)期間，優(yōu)選進行到在培養(yǎng)液中肌醇完全消失，且青蟹肌糖顯示最大的積累量，通常是1-10天，優(yōu)選是3-8天。
通過從這樣培養(yǎng)的菌體分離純化酶，能夠得到本發(fā)明的酶。酶的分離純化可與通常的蛋白質的純化方法同樣地進行。以下舉出具體例說明，但分離純化方法不限定于這些方法。
首先通過離心分離和過濾器過濾等將培養(yǎng)得到的菌體沉淀或濃縮。然后，將得到的菌體沉淀物、或菌體懸浮液破碎。破碎可使用細胞壓碎器、dyna磨、超聲波破碎等方法，但優(yōu)選超聲波破碎。例如，從1升培養(yǎng)液收集菌體時，用水進行洗滌，最終懸浮在50ml的水中，向該懸浮液照射超聲波，將細胞破碎，通過12000rpm的離心分離而得到沉淀。進而將得到的沉淀懸浮在適當?shù)木彌_液、例如Tris緩沖液、磷酸緩沖液(濃度為2mM-100mM，pH為pH6.0-8.0)中，通過向其中加入表面活性劑，能夠提取膜酶。作為表面活性劑的種類，可例舉出TritonX-100(注冊商標)、Tween20(注冊商標)、Tween80(注冊商標)等，其濃度可為0.02％-1.0％，但優(yōu)選以0.6％的濃度使用TritonX-100。
將上述得到的加入了表面活性劑的懸浮液在低溫下孵化1-5小時左右，由此能提取酶。此后，再度進行離心分離，能夠得到可溶化到上清液中的酶。所得的酶液可以原樣地用于青蟹肌糖的制備，但如果需要，則能夠采用通常的酶濃縮所使用的方法將酶濃縮后再使用。作為酶濃縮方法，例如可例舉出硫酸銨分餾、超濾等。另外，為了更高度地純化，優(yōu)選進一步進行以下的處理。
對于已溶解的酶，優(yōu)選進行柱色譜純化。作為柱色譜，例如DEAE柱色譜等。DEAE柱如果有DEAE基，則即使載體的性狀特別不同也能使用。優(yōu)選可例舉出DEAE Toyopearl(日本Tosoh公司制)。使用DEAE Toyopearl純化時，上述的酶液制備成鹽度20mM再加入到柱中為好。接著，由不含表面活性劑、但含線性濃度梯度的NaCl或KCl溶液的20mM的緩沖液(pH為pH6.0-8.0)通過柱以洗脫吸附于柱上的蛋白質。NaCl時，使用0mM-500mM的濃度梯度，KCl時，使用0mM-350mM的濃度梯度。然后，不含表面活性劑的20mM的緩沖液(pH為pH6.0-8.0)再度通過該柱以洗滌柱，然后使不含表面活性劑、但含線性濃度梯度的NaCl或KCl的溶液的20mM的緩沖液(pH為pH6.0-8.0)通過以洗脫蛋白質。NaCl時，使用0mM-500mM的濃度梯度，KCl時，使用0mM-350mM的濃度梯度。所添加的表面活性劑，可例舉出TritonX-100、Tween20、Tween80等，其濃度可為0.02％-1.0％，但優(yōu)選以0.1％的濃度使用TritonX-100。在這樣的條件下，本發(fā)明的酶可利用含有表面活性劑以及100-170mM的NaCl的20mM的緩沖液從柱上洗脫出來。所得的酶液可以原樣地用于青蟹肌糖的制備，但為了更高度地純化，進一步進行處理。
以酶活性為指標而純化時，酶活性的測定，例如在由100mM磷酸緩沖液(pH5.0)、5mg肌醇、0.4mg 2，4-二氯吲哚酚(氧化型DCIP)組成的1ml溶液中加入蛋白質溶液，將600nm的吸光度變化換算成反應速度，將每1min氧化1μmol的肌醇的活性作為1單位而測定。
進一步純化本發(fā)明的酶時，優(yōu)選將本發(fā)明的酶液通過透析、或超濾脫鹽后，加入到例如羥基磷灰石柱中。此時，吸附于羥基磷灰石上的蛋白質，可以通過含有表面活性劑的線性濃度梯度磷酸緩沖液(pH7.0)洗脫。所述磷酸緩沖液的濃度梯度可使用0mM-500mM。另外，所添加的表面活性劑可例舉出TritonX-100、Tween20、Tween80等，其濃度可為0.02％-1.0％，但優(yōu)選以0.1％的濃度使用TritonX-100。在這樣的條件下，本發(fā)明的酶，利用含有表面活性劑的210-260mM的磷酸緩沖液從柱上洗脫。所得的酶液含有基本上純的NAD+非依賴型肌醇2-脫氫酶，能夠原樣地用于青蟹肌糖的制備。
<2-3>篩選制備青蟹肌糖用微生物的方法本發(fā)明還涉及一種篩選制備青蟹肌糖用微生物的方法，其特征在于，誘變處理醋酸桿菌AB10253，以NAD+非依賴型肌醇2-脫氫酶活性為指標，篩選所得到的突變株。
在此作為指標的NAD+非依賴型肌醇2-脫氫酶活性的測定，可通過例如將從微生物菌體得到的膜組分加入到由100mM磷酸緩沖液(pH5.0)、5mg肌醇、0.4mg 2，4-二氯吲哚酚(氧化型DCIP)組成的1mL溶液中，測定600nm的吸光度變化來進行。作為篩選的基準，例如在采用上述方法測定活性進行比較，將顯示出非變異AB10253的1.2倍以上、優(yōu)選2倍以上的NAD+非依賴型肌醇2-脫氫酶活性的菌株篩選出來。
誘變處理醋酸桿菌AB10253的方法，可使用通常的微生物誘變方法。例如除了UV照射、放射線照射等物理誘變方法以外，還可例舉出通過混合N-亞硝基胍、甲磺酸乙酯、亞硝酸、甲磺酸甲酯、吖啶色素、苯并芘、硫酸二甲酯等誘變劑而進行的化學誘變方法。
以下例舉從這些實施了誘變處理的醋酸桿菌篩選制備青蟹肌糖用微生物的方法。但是，篩選方法，只要以NAD+非依賴型肌醇2-脫氫酶活性為指標進行即可，并不限定于該方法。
將經(jīng)誘變處理的AB10253在含有肌醇和營養(yǎng)成分的瓊脂培養(yǎng)基中按每個直徑9cm的培養(yǎng)皿形成10-300集落、優(yōu)選形成100-150集落的方式涂布。在此，作為培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分而加入的碳源、氮源、其他營養(yǎng)源，可使用已知的一般的微生物培養(yǎng)所用的物質。例如，作為碳源，可例舉出葡萄糖、蔗糖、麥芽糖或者淀粉等。其濃度優(yōu)選為0.1％-20％、更優(yōu)選為0.3-5％。作為氮源，可例舉出蛋白胨、酵母提取物、酪蛋白水解物、硫酸銨、氯化銨、硝酸銨、尿素或肉膏等。其濃度優(yōu)選為0.01-5.0％、優(yōu)選為0.5-2.0％。
此外，根據(jù)需要在培養(yǎng)基中添加能夠生成鈉、鉀、鈣、鎂、鈷、錳、鋅、鐵、銅、鉬、磷酸、硫酸等的離子的無機鹽類是有效的。培養(yǎng)液中的氫離子濃度調至pH3-10、優(yōu)選調至pH5-7而培養(yǎng)，如此即能夠高效率地誘導本發(fā)明的酶。
所述培養(yǎng)進行到形成大量集落時即可，用約3天形成集落。培養(yǎng)溫度，優(yōu)選在菌株的適合生長溫度25-30℃、更優(yōu)選在27℃下培養(yǎng)。
分離集落并培養(yǎng)，逐個地測定NAD+非依賴型肌醇2-脫氫酶活性，以期篩選出活性強的菌株，能夠如下述，利用直徑9cm的培養(yǎng)皿在瓊脂培養(yǎng)基上高效率地篩選。
培養(yǎng)后，在形成于直徑9cm的培養(yǎng)皿上的集落之上緩慢注入10ml檢定用瓊脂培養(yǎng)基。用于分析的瓊脂培養(yǎng)基是如下制備的粘稠的溶液在由100mM磷酸緩沖液、1％肌醇、0.4％氧化型DCIP構成的組分中加入瓊脂并使瓊脂達到0.5％，瓊脂溶解后冷卻到36℃，制備使得瓊脂不凝固的。進行了上述處理的分析用瓊脂培養(yǎng)基，在27℃緩慢冷卻，在形成于直徑9cm的培養(yǎng)皿上的集落之上以復層的形式固化。
處理后，在27℃孵化培養(yǎng)皿，由此按照NAD+非依賴型肌醇2-脫氫酶活性的大小，在瓊脂培養(yǎng)基上在一面上緩慢地展開的氧化型DCIP的藍色，只有集落的周圍開始變得透明。此時，將很快地變得透明的地方的集落轉移到新的培養(yǎng)基中傳代，能夠取得NAD+非依賴型肌醇2-脫氫酶活性高的菌株。
另外，對在此得到的生產(chǎn)青蟹肌糖用微生物進一步實施誘變處理，以有氧呼吸能力為指標進行篩選，由此能夠育種以氧為電子受體、具有將肌醇轉化成青蟹肌糖的能力的菌株。在此，所謂有氧呼吸能力是指在低氧條件下很好地生長的能力，所謂低氧條件，是指例如氧濃度3％以下的條件。醋酸桿菌AB10253是絕對需氧菌，通過將在低氧條件下生長良好地的集落在新的培養(yǎng)基中傳代，能夠得到有氧呼吸能力高的菌株。
而且，上述的篩選方法也能夠對天然的微生物進行篩選。即，本發(fā)明的另一個篩選方法，其特征在于，從含有微生物的天然試樣之中分離微生物，以NAD+非依賴型肌醇2-脫氫酶活性為指標，從經(jīng)分離的微生物中篩選。在此，所謂天然的含有微生物的試樣，例如天然的土壤等。從天然試樣之中分離微生物的方法，例如將天然試樣的懸浮液或其稀釋液涂布在瓊脂培養(yǎng)基上，使天然試樣所含的微生物以獨立的集落的形式在瓊脂培養(yǎng)基中生長的方法等。從經(jīng)分離的微生物之中篩選制備青蟹肌糖用微生物的方法，除了使培養(yǎng)基的pH為3-4、優(yōu)選為3.5這一點之外，其他能適用與使用醋酸桿菌AB10253的情況同樣的操作。
<2-4>青蟹肌糖的制備方法本發(fā)明還涉及青蟹肌糖的制備方法，其特征在于，使NAD+非依賴型肌醇2-脫氫酶或該酶的高活性株(制備青蟹肌糖用微生物)與肌醇作用。
(i)利用NAD+非依賴型肌醇2-脫氫酶的青蟹肌糖的制備方法本發(fā)明的“利用NAD+非依賴型肌醇2-脫氫酶的青蟹肌糖的制備方法”，其特征在于，在含有肌醇和電子受體的溶液中使NAD+非依賴型肌醇2-脫氫酶與肌醇作用，生成青蟹肌糖，從溶液中分離純化生成的青蟹肌糖。在此，NAD+非依賴型肌醇2-脫氫酶可以使用由已經(jīng)敘述的方法得到的該種酶。再者，本發(fā)明的酶只要具有由肌醇生成青蟹肌糖的活性即可，無論其純化的程度如何。
在此，作為底物的肌醇在0.1％-20％、優(yōu)選5％-10％的濃度下使用。本發(fā)明的反應所使用的酶液，可使用上述的粗酶液、或者高度純化的酶液。反應時的pH優(yōu)選保持在pH5.0，除了監(jiān)測pH，并適時添加堿性溶液、或酸性溶液之外，還可以使用適當?shù)木彌_液。作為緩沖液的例子，只要是在pH5.0附近具有緩沖能力的緩沖液即可，無其它的特別限定，優(yōu)選使用磷酸緩沖液。
在使用該酶的制備方法中，需要向反應液中加入電子受容物。在此，作為電子受容物，除了氧化型DCIP以外，還可例舉出PMS(吩嗪硫酸甲酯)、亞甲基藍、Fe3+離子等。能夠組合這些物質來使用，但優(yōu)選使用氧化型DCIP。所加入的電子受容物的量，相對于肌醇1摩爾，需要1摩爾的量，可相對于相應的肌醇的摩爾數(shù)適時地加入電子受容物。隨著反應進行這些電子受容物的濃度變高時，有時析出還原型電子受容物，但該情況下，可通過離心分離、或超濾等操作去除。本發(fā)明的反應根據(jù)電子受容物的溶解度有時是不均勻體系，故優(yōu)選在攪拌下進行反應。
本發(fā)明的反應的反應溫度，只要在酶不滅活的程度下作用即可，無其它特別限定，但優(yōu)選在20℃-40℃下作用。反應時間優(yōu)選是1-72小時，更優(yōu)選是8-12小時。生成的青蟹肌糖例如可采用再結晶法等分離純化。
(ii)利用微生物的青蟹肌糖的制備方法本發(fā)明還涉及一種利用微生物的青蟹肌糖的制備方法，其特征在于，通過在含有肌醇的培養(yǎng)基中培養(yǎng)由上述篩選方法得到的制備青蟹肌糖用微生物，由肌醇生成青蟹肌糖，從培養(yǎng)基分離純化生成的青蟹肌糖。
在此使用的液體培養(yǎng)基的組成，只要使微生物能用肌醇生成青蟹肌糖，就毫無特別的限制，例如可舉出除了將轉化為青蟹肌糖的原料肌醇之外還含有碳源、氮源、有機營養(yǎng)源、無機鹽類等的培養(yǎng)基。合成培養(yǎng)基·天然培養(yǎng)基都能使用。具體地，優(yōu)選下述的培養(yǎng)基添加0.1％-40％、更優(yōu)選添加10％-30％的肌醇，作為碳源，含有甘油、蔗糖、麥芽糖或者淀粉，含量為0.1％-20％、更優(yōu)選為0.3-5％，作為氮源，含有酵母提取物、蛋白胨、酪蛋白水解物、硫酸銨、氯化銨、硝酸銨或尿素等，含量為0.01％-5.0％、優(yōu)選為0.5％-2.0％。
此外，根據(jù)需要在培養(yǎng)基中添加能夠生成鈉、鉀、鈣、鎂、鈷、錳、鋅、鐵、銅、鉬、磷酸、硫酸等的離子的無機鹽類是有效的。培養(yǎng)液中的氫離子濃度調至pH4-10、更優(yōu)選調至pH5-9進行培養(yǎng)，如此即能夠高效率地得到鯊肌醇。
培養(yǎng)條件也根據(jù)菌株或培養(yǎng)基的種類不同而不同，但培養(yǎng)溫度優(yōu)選為12-35℃，更優(yōu)選為20-27℃，另外以液體培養(yǎng)基搖床振蕩培養(yǎng)，或向液體培養(yǎng)基中吹入空氣或氧氣等需氧培養(yǎng)為好。培養(yǎng)期間，優(yōu)選進行到在培養(yǎng)液中肌醇完全消失、且青蟹肌糖顯示最大的積累量為好，通常為1-10天，優(yōu)選為3-8天。
從培養(yǎng)液分離純化目的物的方法，可應用通常的分離純化水溶性中性物質的一般的方法。例如，從培養(yǎng)液去除菌體之后，通過用活性炭和離子交換樹脂等處理培養(yǎng)液上清，可基本除掉青蟹肌糖以外的雜質。但是，因為強堿性陰離子交換樹脂的OH-型使青蟹肌糖發(fā)生化學變化，因此不使用為好。然后，通過使用再結晶等的方法，可分離目的物質。
以下例舉分離純化青蟹肌糖的具體方法。但是，分離純化的方法不限定于這些方法。首先，出于去除不希望有的成分的目的，使積累了青蟹肌糖的培養(yǎng)液上清在填充有強酸性陽離子交換樹脂、例如DuoliteC-20(H+型)(住友化學制)的柱中通過，收集通過液，然后使去離子水在該柱中通過以洗滌，收集洗滌液，合并所得到的通過液和洗滌液。使所得的溶液在填充有弱堿性陰離子交換樹脂、例如Duolite(注冊商標)A368S(游離堿基型)的柱中通過，收集通過液，然后使去離子水在該柱中通過以洗滌，收集洗滌液，混合所得到的通過液和洗滌液，取得含有青蟹肌糖、幾乎不含其它的雜質的水溶液。在濃縮該水溶液而得到的青蟹肌糖的濃稠溶液中加入適當量的乙醇，在室溫或低溫下放置一夜，就能夠結晶析出純的青蟹肌糖晶體。
<2-5>鯊肌醇的制備方法本發(fā)明還涉及一種鯊肌醇的制備方法，其特征在于，使用NAD+非依賴型肌醇2-脫氫酶或該酶的高活性株，由肌醇生成青蟹肌糖，還原所得到的青蟹肌糖，從而得到鯊肌醇。
在該制備方法中，使用NAD+非依賴型肌醇2-脫氫酶或該酶的高活性株(制備青蟹肌糖用微生物)，由肌醇生成青蟹肌糖的步驟，可采用已述的方法進行。由該步驟得到的青蟹肌糖可以分離純化而在還原步驟中使用，但也可以不分離純化就在還原步驟中使用。使用制備青蟹肌糖用微生物生成青蟹肌糖時，在培養(yǎng)液中生成、積累青蟹肌糖之后，不分離青蟹肌糖，只分離菌體而得到的培養(yǎng)濾液也可以用于還原步驟。
作為能夠在反應液體系中將青蟹肌糖還原成鯊肌醇的還原劑，無特別限定，例如舉出氫化硼鈉、氫化硼鋰、氫化硼鉀、氫化三甲氧基硼鈉、氫氰化硼鈉。當采用這些還原劑還原青蟹肌糖時，就生成鯊肌醇和肌醇。其生成比率根據(jù)反應溫度、還原試劑的種類不同而不同，一般地得到鯊肌醇∶肌醇＝約4∶6的混合物。因此，需要從混合物分離純化鯊肌醇。
從青蟹肌糖向鯊肌醇的還原，也可以使用后述的、本發(fā)明提供的新型鯊肌醇脫氫酶進行。
為了從還原反應液分離純化鯊肌醇，可應用通常的分離純化水溶性中性物質的一般的方法。例如，首先通過采用活性炭和離子交換樹脂等處理反應液，得到含有鯊肌醇和肌醇、幾乎不含其它的雜質的水溶液。為了從該水溶液只取得鯊肌醇，主要利用對于水的溶解度之差是有效的。即，濃縮上述的水溶液，使對于水的溶解度低的鯊肌醇以固體形式析出，取得鯊肌醇的方法。
另外，如后述，也可以采用這樣的方法分離純化鯊肌醇在含有得到的鯊肌醇的溶液中加入硼酸、和NaCl，制備鯊肌醇硼酸復合體，將其濾選出后，利用酸使硼酸游離，再加入甲醇之類的有機溶劑，由此使鯊肌醇結晶化。
3.鯊肌醇脫氫酶及使用該酶的制備鯊肌醇的方法本發(fā)明的另一方案涉及新型酶鯊肌醇脫氫酶、及使用該酶的制備鯊肌醇的方法<鯊肌醇脫氫酶>
本發(fā)明的鯊肌醇脫氫酶，如下述反應式所示，催化鯊肌醇與青蟹肌糖間的氧化還原反應、在NADH或NADPH存在下將青蟹肌糖立體特異地還原成鯊肌醇。
鯊肌醇脫氫酶只要是具有上述反應活性的酶，其來源無特別限定，但優(yōu)選是來源于微生物，特別優(yōu)選是大腸桿菌(Escherichia coli)、醋酸桿菌屬(Acetobacter)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、土壤桿菌屬(Agrobacterium)、黃單胞菌屬(Xanthomonas)等。進一步地，特別優(yōu)選是大腸桿菌K-12ATCC10798(Escherichia coli K-12ATCC10798)、醋酸桿菌AB10281FERM BP-10119(Acetobactersp.AB10281 FERM BP-10119)、枯草芽孢桿菌168 ATCC23857(Bacillus subtilis 168 ATCC23857)、根癌土壤桿菌C58 ATCC33970(Agrobacterium tumefacience C58 ATCC33970)、土壤桿菌AB10121FERM P-17383(Agrobacterium sp.AB10121 FERM P-17383)、野油菜黃單胞菌野油菜致病變種ATCC33913(Xanthomonascampestris pv.campestris ATCC33913)。
本發(fā)明的鯊肌醇脫氫酶包含具有下述的理化性質的鯊肌醇脫氫酶。
反應如下述反應式所示，催化鯊肌醇與青蟹肌糖間的氧化還原反應、在NADH或NADPH存在下將青蟹肌糖立體特異地還原成鯊肌醇。
鯊肌醇脫氫酶活性的測定方法，測定還原活性的方法和測定氧化活性的方法任何一個測定方法都能夠測定，但氧化活性的測定取決于來源于共存的肌醇2-脫氫酶的活性，精度低，氧化活性自身微弱，因此優(yōu)選測定還原活性。
還原活性的測定，通過將青蟹肌糖作為底物，使NADH或NADPH共存，測定NADH或NADPH的340nm的吸收的減少，由此確定。另外，用HPLC、GLC等分析裝置分析反應后的溶液，也能判斷產(chǎn)物(是鯊肌醇還是肌醇)。
本發(fā)明的鯊肌醇脫氫酶優(yōu)選進一步具有下述的理化性質。
分子量及締合特性38-46k道爾頓，形成2聚體或3聚體。
分子量，能夠由SDS-PAGE(十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳)等的結果、或由DNA的全長算出酶的推定分子量。另外，締合特性，測定用凝膠過濾柱(2000SWXL；Tosoh公司制)分餾的組分的活性，由相應的分子量組分計算分子量，將計算出的分子量除以酶的分子量得到的值取整數(shù)，由此而能夠求出。
另外，本發(fā)明的鯊肌醇脫氫酶，優(yōu)選進一步具有下述的理化性質。
輔酶將NAD+或NADP+或者NADH或NADPH作為輔酶。
輔酶的選擇性，可利用這樣的方法確認混合5μl反應液(200mMTris緩沖液pH8.0、2％NADPH或NADH、1％青蟹肌糖)、和5μl酶液，在36℃反應30min后，立即加入500μl的水，測定340nm的吸光度，測定用水代替酶液的試驗液的空白值在340nm的吸光度的減少量。用％表示的值是表示質量/體積(W/V)的百分率的，用％表示濃度時也同樣。
另外，利用上述測定法也能夠確認輔酶相對活性。利用該輔酶相對活性，本發(fā)明的酶可分成若干組，分別為具有NADPH∶NADH的比率為100∶1～100∶10的組、100∶10～100∶30的組、100∶30～100∶60的組、100∶60～100∶120的組等。
另外，本發(fā)明的鯊肌醇脫氫酶，優(yōu)選進一步具有下述的理化性質。
活化重金屬在Co2+離子的存在下被活化?；蛘咭部捎性贛n2+、Zn2+、Ca2+離子的存在下被活化的情況。
抑制重金屬在Sn2+離子的存在下被抑制?；蛘咭部捎性赯n2+離子的存在下被抑制的情況。
由該重金屬帶來的效果，可利用這樣的方法確認混合5μl反應液(200mM Tris緩沖液pH8.0、2％NADPH、1％青蟹肌糖、2mM金屬鹽)、和5μl酶液，在36℃反應30min后，立即加入500μl的水，測定340nm的吸光度，測定用水代替酶液的試驗液的空白值在340nm的吸光度的減少量。所謂“活化的”意指在將未添加重金屬區(qū)的酶活性記為100％時，1mM重金屬添加區(qū)的酶活性顯示105％以上、優(yōu)選顯示120％以上。另一方面，所謂“被抑制”意指在將未添加重金屬區(qū)的酶活性記為100％時，1mM重金屬添加區(qū)的酶活性變?yōu)?5％以下，優(yōu)選變?yōu)?0％以下。
另外，本發(fā)明的鯊肌醇脫氫酶，優(yōu)選進一步具有下述的理化性質。
最適pH本發(fā)明的酶在pH5-9具有活性。
可利用這樣的方法確認最適pH混合5μl反應液(200mM磷酸緩沖液pH5.0-9.0、2％NADPH、1％青蟹肌糖)、和5μl酶液，在36℃反應30min后，立即加500μl的水，測定340nm的吸光度，測定用水代替酶液的試驗液的空白值在340nm的吸光度的減少量。所謂最適pH意指具有最大活性的90％以上的活性。本發(fā)明的酶，例如根據(jù)最適pH的范圍也可分成在酸性區(qū)有最適pH的組(最適pH為pH5.5-6.5)、在中性區(qū)有最適pH的組(最適pH為pH6.5-7.5或pH6.5-8.5)、在堿性區(qū)有最適pH的組(最適pH為pH7.0-8.5或pH7.5-9.0)。
另外，本發(fā)明的鯊肌醇脫氫酶，優(yōu)選進一步具有下述的理化性質。
熱穩(wěn)定性本發(fā)明的鯊肌醇脫氫酶在高達60℃時穩(wěn)定。
熱穩(wěn)定性可利用這樣的方法確認將酶液在所規(guī)定的溫度處理10min之后，冷卻，混合該酶液和反應液(200mM磷酸緩沖液pH5.0-9.0、2％NADPH、1％青蟹肌糖)5μl，在36℃反應30min后，立即加入500μl的水，測定340nm的吸光度，測定用水代替酶液的試驗液的空白值在340nm的吸光度的減少量。所謂“為熱穩(wěn)定”意指將20℃10min處理區(qū)的活性記為100％，上述熱處理過的酶的活性殘存90％以上。
另外，本發(fā)明的鯊肌醇脫氫酶，優(yōu)選進一步具有下述的理化性質。
相對于青蟹肌糖的Km值相對于青蟹肌糖的Km值顯示2-13mM。
相對于青蟹肌糖的Km值可利用這樣的方法確認混合反應液(200mM Tris緩沖液pH8.0、2％NADPH、0.001-2.5％青蟹肌糖)5μl、和5μl酶液，在36℃反應30min后，立即加入500μl的水，測定340nm的吸光度，測定用水代替酶液的試驗液的空白值在340nm的吸光度的減少量。測定值按照常規(guī)方法倒數(shù)作圖，算出Km值。本發(fā)明的酶，例如也能夠分成相對于青蟹肌糖的Km值小于4mM的組、4mM以上小于10mM的組、10mM以上小于13mM的組。
另外，本發(fā)明的鯊肌醇脫氫酶，優(yōu)選進一步具有下述的理化性質。
底物特異性相對活性為70％以上的底物，可例舉出鯊肌醇(SI)、肌醇(MI)、D-chiro-肌醇(DCI)、epi-肌醇(EI)、L-chiro-肌醇(LCI)。相對活性為20％以上小于70％的底物，可例舉出L-chiro-肌醇(LCI)、epi-肌醇(EI)、muco-肌醇(MuI)、肌醇(MI)、D-chiro-肌醇(DCI)、allo-肌醇(AI)、neo-肌醇(NI)。相對活性小于20％的底物，可例舉出allo-肌醇(AI)、neo-肌醇(NI)、D-chiro-肌醇(DCI)、L-chiro-肌醇(LCI)、epi-肌醇(EI)、muco-肌醇(MuI)。
底物特異性，通過以氧化活性為指標，測定相對于對肌醇的反應性的相對活性而確認。作為肌醇異構體，可例舉出鯊肌醇(SI)、肌醇(MI)、D-chiro-肌醇(DCI)、L-chiro-肌醇(LCI)、epi-肌醇(EI)、muco-肌醇(MuI)、allo-肌醇(AI)、neo-肌醇(NI)等。本發(fā)明的鯊肌醇脫氫酶的底物特異性，能夠分為相對活性為70％以上的區(qū)、小于70％但為20％以上的區(qū)、小于20％的區(qū)。
作為測定方法，能夠通過下述方法而測定混合50μl的反應液(200mM Tris緩沖液pH8.0，包含1％的各種肌醇異構體(只有neo-肌醇為0.4％)、、0.002％NADP+、0.002％黃遞酶、0.01％硝基四唑藍)、和50μl酶液，在25℃每隔3min用微量培養(yǎng)板讀出裝置測定545nm的吸光度的增加。
這些理化性質，優(yōu)選具有理化性質的任意的組合。
<鯊肌醇脫氫酶的制備及純化>
作為能夠用于制備鯊肌醇脫氫酶的微生物，只要具有產(chǎn)生該酶的能力即可，無其它特別限定，例如可例舉出大腸桿菌K-12ATCC10798(Escherichia coli K-12 ATCC10798)(以下也叫做大腸桿菌K-12)、醋酸桿菌AB10281FERM BP-10119(Acetobacter sp.AB10281 FERMBP-10119)(以下也叫做AB10281)、枯草芽孢桿菌168 ATCC23857(Bacillus subtilis 168 ATCC23857)(以下也叫做Bacillus sub.16株、B.sub.168)、根癌土壤桿菌C58 ATCC33970(Agrobacteriumtumefacience C58 ATCC33970)(以下也叫做A.tume.C58)、土壤桿菌AB10121FERM P-17383(Agrobacterium sp.AB10121 FERM P-17383)(以下也叫做AB10121)、野油菜黃單胞菌野油菜致病變種ATCC33913(Xanthomonas campestris pv.campestris ATCC33913)(以下也叫做X.camp.)。
出于制備鯊肌醇脫氫酶的目的，為培養(yǎng)這些微生物所使用的培養(yǎng)基，可使用已知的一般的微生物用培養(yǎng)基。例如培養(yǎng)醋酸桿菌AB10281FERM BP-10119、枯草芽孢桿菌168 ATCC23857、根癌土壤桿菌C58 ATCC33970、土壤桿菌AB10121FERM P-17383、野油菜黃單胞菌野油菜致病變種ATCC33913時的培養(yǎng)基組成，只要達到目的即可無特別的限制，只要是除了含有向鯊肌醇轉化的原料肌醇以外還含有碳源、氮源、有機營養(yǎng)源、無機鹽類等的培養(yǎng)基即可，合成培養(yǎng)基·天然培養(yǎng)基都能使用。肌醇優(yōu)選添加0.1％-40％，更優(yōu)選添加10％-30％，作為碳源，添加甘油、蔗糖、麥芽糖或者淀粉，添加量優(yōu)選為0.1％-20％、更優(yōu)選為0.3-5％，作為氮源，添加酵母提取物、蛋白胨、酪蛋白水解物、硫酸銨、氯化銨、硝酸銨或尿素等，添加量為0.01％-5.0％、優(yōu)選為0.5％-2.0％。此外，還能夠根據(jù)需要在培養(yǎng)基中添加能夠生成鈉、鉀、鈣、鎂、鈷、錳、鋅、鐵、銅、鉬、磷酸、硫酸等的離子的無機鹽類。培養(yǎng)液中的氫離子濃度不需要特別地制備，但優(yōu)選調至pH4-10、更優(yōu)選調至pH5-9而培養(yǎng)，如此即能夠高效率地得到含有鯊肌醇脫氫酶的菌體。
培養(yǎng)條件也根據(jù)培養(yǎng)基的種類不同而不同，但培養(yǎng)溫度為12-38℃，優(yōu)選為20-27℃，另外，培養(yǎng)只要是如液體培養(yǎng)基搖床振蕩，或向液體培養(yǎng)基中吹入空氣或氧氣等需氧性地進行即可。培養(yǎng)期間，只要進行到鯊肌醇脫氫酶顯示最大或者必要量的活性量即可，通常為1-10天，優(yōu)選為3-8天。
另一方面，培養(yǎng)大腸桿菌K-12ATCC10798時的培養(yǎng)基組成也只要達到目的即可，無特別的限制，只要是含有碳源、氮源、有機營養(yǎng)源、無機鹽類等的培養(yǎng)基，合成培養(yǎng)基·天然培養(yǎng)基均可使用。例如可例舉出LB培養(yǎng)基、TB培養(yǎng)基和YT培養(yǎng)基等。而且，作為使大腸桿菌K-12ATCC10798的鯊肌醇脫氫酶的比活性增加約3倍的物質，優(yōu)選在培養(yǎng)基中添加0.05-1％、優(yōu)選0.5％的山梨糖。培養(yǎng)條件也根據(jù)培養(yǎng)基的種類不同而不同，但培養(yǎng)溫度為28-38℃，優(yōu)選為36℃，另外，培養(yǎng)只要以液體培養(yǎng)基搖床振蕩培養(yǎng)，或向液體培養(yǎng)基中吹入空氣或氧氣等需氧性地進行即可。培養(yǎng)期間，只要進行到鯊肌醇脫氫酶顯示最大或者必要量的活性量即可，通常為1-3天，優(yōu)選為1天。
由如此培養(yǎng)的菌體分離純化酶，能夠得到鯊肌醇脫氫酶。酶的分離純化可與通常的蛋白質純化方法同樣地進行。以下具體地說明，但分離純化方法不限定于這些方法。
首先，為了收集在培養(yǎng)后得到的菌體，可使用離心分離、和膜濃集等的方法。如果必要，則在該階段在適當?shù)娜芤褐袘腋【w，再度采用離心分離和膜濃集等的方法收集菌體，由此進行洗滌。所得的菌體接著采用自動磨機、和超聲波等的物理方法破碎，能夠提取存在于菌體內(nèi)的本發(fā)明酶。
含有經(jīng)破碎的菌體的菌體裂解液，采用離心分離和膜濃集等的方法分成可溶物和不溶物。然后，為了從可溶物分離該酶，可按照一般的酶純化的順序純化。即，除了Blue-Toyopearl(Tosoh公司制)等的親和層析柱、由DEAE柱、CM柱為代表的離子交換柱、凝膠過濾柱、羥基磷灰石柱等的柱操作以外，還能夠使用硫酸銨分餾法、等電點沉淀法等的分批式的操作法。
鯊肌醇脫氫酶活性的測定方法，可應用測定還原活性的方法和測定氧化活性的方法中的任意一種，但氧化活性的測定取決于來源于共存的肌醇2-脫氫酶的活性，精度低，氧化活性自身微弱，因此優(yōu)選測定還原活性。還原活性的測定，通過將青蟹肌糖作為底物，使NADH或NADPH共存，測定NADH或NADPH的340nm的吸收的減少，由此進行。另外，用HPLC、GLC等分析裝置分析反應后的溶液，也能判斷產(chǎn)物(是鯊肌醇還是肌醇)。
所純化的酶，可通過采用了Native-PAGE或SDS(十二烷基硫酸鈉)PAGE等的電泳確認其純化度，此外，能夠將相應的蛋白質通過轉移印跡至PVDF膜等的蛋白質吸附性膜上進行進一步地純化。
作為本發(fā)明的鯊肌醇脫氫酶，具體地可例舉出下述(a)或(b)的蛋白質。
(a)由在SEQ.ID.NO2、4、6、8、10、12、14或28所示的氨基酸序列構成的蛋白質；(b)在SEQ.ID.NO2、4、6、8、10、12、14或28所示的氨基酸序列中，有1個或多個氨基酸發(fā)生取代、缺失、插入、和/或附加的氨基酸序列，并具有催化鯊肌醇與青蟹肌糖間的氧化還原反應、在NADH或NADPH存在下將青蟹肌糖立體特異地還原成鯊肌醇的酶活性的蛋白質。
在其中，具有SEQ.ID.NO28的氨基酸序列的鯊肌醇脫氫酶是由本發(fā)明提供的新的蛋白質。
所謂上述“有1個或多個氨基酸發(fā)生取代、缺失、插入、和/或附加的氨基酸序列，并具有催化鯊肌醇與青蟹肌糖間的氧化還原反應、在NADH或NADPH存在下將青蟹肌糖立體特異地還原成鯊肌醇的酶活性的蛋白質”，表示所述的蛋白質可以具有1個或多個氨基酸殘基的取代、缺失、插入、和/或附加，但實質上不損害其催化鯊肌醇與青蟹肌糖間的氧化還原反應、在NADH或NADPH存在下將青蟹肌糖立體特異地還原成鯊肌醇的酶活性。
即，天然存在的蛋白質在純化過程中或純化之后，可以由于多態(tài)性或編碼該蛋白質的DNA的變異，或者細胞內(nèi)的修飾反應等而發(fā)生變異，例如，氨基酸序列中的取代、缺失、插入、和/或附加等，但盡管如此，已知一些發(fā)生變異的天然存在的蛋白質，仍顯示出與未發(fā)生變異的蛋白質實質上等同的生理、生物學活性。如上所述，即使在結構上有少許差異，但其功能未表現(xiàn)出大的不同的蛋白質也包含在本發(fā)明的蛋白質中。人為地向蛋白質的氨基酸序列中引入了上述的變異時也同樣，在該情況下，能進一步制備多種多樣的變異體。另外已知，某些蛋白質具有對其活性而言非必需的肽區(qū)域。例如，分泌到細胞外的蛋白質中存在的信號肽、以及在蛋白酶的前體等中存在的脯氨酸序列等肽區(qū)域，這些區(qū)域的大部分在翻譯后或在向活性型蛋白質轉化過程中被去除。這些在原生構造上以不同的形式存在，但是最終形成具有同等的功能的蛋白質均包括在本發(fā)明的鯊肌醇脫氫酶范圍內(nèi)。
本說明書中的“多個氨基酸”，表示在不喪失本發(fā)明酶的活性范圍內(nèi)發(fā)生變異的氨基酸數(shù)量，例如對于400氨基酸殘基組成的多肽的情況，表示2-20左右、優(yōu)選2-10、更優(yōu)選2-3個氨基酸。另外，表示與本發(fā)明蛋白質的同源性達到80％以上、更優(yōu)選90％以上、進一步優(yōu)選95％以上、特別優(yōu)選98％以上的蛋白質均包括在本發(fā)明的鯊肌醇脫氫酶范圍內(nèi)。
作為本發(fā)明的鯊肌醇脫氫酶，還可例舉出由下述DNA編碼的酶。
(a)包含SEQ.ID.NO1、3、5、7、9、11、13或27所示的堿基序列的編碼區(qū)的DNA；(b)與具有在SEQ.ID.NO1、3、5、7、9、11、13或27所示的堿基序列、或與該堿基序列互補的堿基序列的DNA在嚴格條件下雜交，并編碼具有催化鯊肌醇與青蟹肌糖間的氧化還原反應、在NADH或NADPH存在下將青蟹肌糖立體特異地還原成鯊肌醇的酶活性的蛋白質的DNA。
在其中，具有SEQ.ID.NO27的堿基序列的DNA，是編碼本發(fā)明的新型的鯊肌醇脫氫酶的DNA。
這里所說的“嚴格條件下”，是指形成所謂的特異性雜交、不形成非特異性雜交的條件(參照Sambrook，J.et al.，Molecular CloningA Laboratory Manual，Second Edition，Cold Spring HarborLaboratory Press(1989)等)。作為“嚴格條件下”，具體舉出下述條件在含有50％甲酰胺、4×SSC、50mM HEPES(pH7.0)、10×Denhardt溶液、100μg/ml鮭魚精子DNA的溶液中，在42℃進行雜交，接著在室溫下用2×SSC、0.1％SDS溶液洗滌，和在50℃下用0.1×SSC、0.1％SDS溶液洗滌。換句話說，可例舉出具有優(yōu)選80％以上、更優(yōu)選90％以上、進一步優(yōu)選95％以上、特別優(yōu)選98％以上的同源性的DNA特異地雜交的條件。即，與SEQ.ID.NO1、3、5、7、9、11、13或27所示的堿基序列的同源性為優(yōu)選80％以上、更優(yōu)選90％以上、進一步優(yōu)選95％以上、特別優(yōu)選98％以上的DNA，包括在編碼本發(fā)明的鯊肌醇脫氫酶的DNA中。
<使用鯊肌醇脫氫酶的制備鯊肌醇的方法>
本發(fā)明進一步涉及一種制備鯊肌醇的方法，其特征在于，在使鯊肌醇脫氫酶、和肌醇2-脫氫酶共存的溶液中，在NADH或NADPH存在下(參照圖1)，將廉價的肌醇作為底物，經(jīng)由青蟹肌糖，使之發(fā)生酶轉化反應成為鯊肌醇。
在該制備方法中使用的鯊肌醇脫氫酶，可以是通過純化上述的酶而制備的酶，還可以是通過對編碼鯊肌醇脫氫酶的DNA進行遺傳操作而制備的重組酶。
編碼鯊肌醇脫氫酶的DNA，可通過如下方式獲得，例如以從微生物提取的全基因組作為模板，通過聚合酶鏈式反應(PCR)擴增具有SEQ.ID.NO1、3、5、7、9、11、13或27等的堿基序列的DNA。
另外，編碼鯊肌醇脫氫酶的DNA，也可通過分離由其同源性檢索的而得到的同源DNA。在此，被稱為ydgJ基因的一系列的同源性高的基因為編碼鯊肌醇脫氫酶的DNA。
將所得的DNA導入到質粒載體中。所使用的質粒，優(yōu)選使用具有多克隆位點的表達質粒載體，能表達酶、且具有適當?shù)南拗泼肝稽c的其他的質粒載體也可使用。通過預先在片段的末端設定好合適的限制酶位點，將其與位于質粒載體上的相同的限制酶位點連接，由此能夠構建質粒。
另外，為了表達導入到質粒中的DNA所使用的啟動子，只要使DNA在宿主微生物中表達即可，無其它特別限定。例如可使用lac啟動子、tac啟動子等。
這樣制備的重組質粒載體能夠引入到宿主微生物中。所使用的宿主微生物，只要可以使重組質粒載體穩(wěn)定、且自主地增殖即可，無其它特別限制，優(yōu)選使用通常的基因重組用的微生物、例如屬于埃希氏桿菌屬、芽孢桿菌屬的微生物等，更優(yōu)選使用大腸桿菌。
向宿主微生物中引入重組質粒載體的方法，例如，在宿主微生物為屬于埃希氏桿菌屬的微生物時，既可以在鈣離子的存在下引入重組DNA，也可以使用感受態(tài)細胞法引入，另外，對于屬于芽孢桿菌屬的微生物，可使用感受態(tài)細胞法、原生質體法、電穿孔法、或顯微注射法。對于重組DNA是否已導入到宿主微生物中的選擇可以如下進行，在基于構成重組質粒載體的載體的耐藥性標記的選擇培養(yǎng)基中，培養(yǎng)該宿主微生物，選擇生長的宿主微生物即可。
其次，用于表達和誘導酶的培養(yǎng)基，只要是宿主微生物穩(wěn)定地增殖的培養(yǎng)基即可，無其它特別限定。例如可例舉出營養(yǎng)肉湯(NutrientBroth)、L-Broth等。另外，根據(jù)質粒載體的種類不同，既可以在培養(yǎng)基中加入異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)之類的使DNA表達的誘導物，也可以在培養(yǎng)過程中加入誘導物。
培養(yǎng)引入了具有上述DNA的重組質粒載體的宿主微生物，使之表達本發(fā)明的DNA。離心分離表達本發(fā)明酶的微生物，去除培養(yǎng)基，再用水洗滌成片的微生物后，再進行離心分離，可得到經(jīng)洗滌的菌體。使該洗滌菌體懸浮在水、或適當?shù)娜芤褐?，利用超聲波破碎菌體。破碎后離心分離，能夠得到含有來源于在上清液中的本發(fā)明DNA的重組酶的溶液。
表達重組酶的菌體，也能夠在洗滌后，原樣地加入到反應溶液中，制成菌體懸浮液使之反應，但優(yōu)選使用將菌體破碎并提取了存在于菌體內(nèi)的酶的溶液。另外，也可以純化該提取液備用。對于純化，可通過硫酸銨分級分離處理、或者吸附于離子交換樹脂上后利用鹽濃度的線性濃度梯度的柱色譜、溫度處理等來純化。而且，本發(fā)明酶也可作為固定化酶或固定化菌體使用。作為固定化法，可適用凝膠包埋法、離子交換樹脂吸附法等常用的固定化方法。
另一方面，在該方法中使用的肌醇2-脫氫酶，優(yōu)選使用在NAD+或NADP+存在下氧化肌醇生成青蟹肌糖的酶。
在該制備方法中，可使用已知的NAD+或NADP+依賴型肌醇2-脫氫酶。例如，可以使用市售的酶、從枯草芽孢桿菌、Bacillus halodurans等培養(yǎng)菌體純化而制備的酶、對于基因序列已知的，可通過基因操作而使之表達的重組酶。
作為已知的肌醇2-脫氫酶的氨基酸序列，例如在NCBI(NationalCenter for Biotechnology Information)的蛋白質數(shù)據(jù)庫中以登記號2636516、17982589、23464076、10174936、17742455、50120397、28853468、或者13422633登記的，編碼這些氨基酸序列的堿基序列信息也可通過參照上述登記號的CDS而得到。
表達重組酶的菌體也能夠在洗滌后，原樣地加入到反應溶液中，制成菌體懸浮液使之反應，但優(yōu)選使用將菌體破碎并提取了存在于菌體內(nèi)的酶的溶液。另外，也可以純化該提取液備用。作為純化，可通過硫酸銨分級分離、或者吸附于離子交換樹脂上后利用鹽濃度的線性濃度梯度柱色譜、溫度處理等來純化。而且，本發(fā)明酶也能作為固定化酶或固定化菌體使用。作為固定化法，可適用凝膠包埋法、離子交換樹脂吸附法等常用的固定化方法。
使用重組酶時，也可以通過基因操作，使肌醇2-脫氫酶和本發(fā)明酶同時表達，也可以使用如此表達所制備的酶液等。
在本反應體系中的肌醇2-脫氫酶、和鯊肌醇脫氫酶的活性量(U)的比率用單位數(shù)定義在36℃下底物為青蟹肌糖時，將在1min期間消耗1μmol的NADH或NADPH作為1U時，兩者的活性量(U)的比率希望達到1∶10～10∶1、優(yōu)選1∶2～2∶1。
在本反應體系中，需要輔酶NAD+或NADP+，在反應液中，因為轉化成NADH或NADPH，并且NADH或NADPH再轉換成NAD+或NADP+，可知輔酶可以被再利用。NAD+或NADP+和NADH或NADPH在溶液中的pH穩(wěn)定性不同，NAD+或NADP+在pH8.0以下穩(wěn)定，NADH或NADPH在pH8.0以上穩(wěn)定。因此，本反應體系中的pH優(yōu)選保持在約pH8.0。
在該酶反應中使用的輔酶，能夠以NAD+、NADH、NADP+、NADPH的任1個、或者它們的混合物的形式利用。但考慮到穩(wěn)定性，希望使用NAD+或NADP+，其濃度，希望添加0.0001-0.1％，優(yōu)選添加0.004-0.01％。
而且，通過將本反應體系的中間體青蟹肌糖添加到反應溶液中，本反應的反應速度顯著增大。因此，優(yōu)選在反應溶液中添加青蟹肌糖并使之達到0.01-3％、優(yōu)選達到0.2-0.5％。
另外，肌醇2-脫氫酶和鯊肌醇脫氫酶在pH8.0下能夠反應，因此，酶反應的溶液的pH調至pH6.0-8.5的范圍以使酶反應，但考慮NAD+或NADP+的穩(wěn)定性、青蟹肌糖的穩(wěn)定性，優(yōu)選為pH7.7-8.3，進一步優(yōu)選為pH8.0。另外，在反應中，為了在反應中保持該pH，需要時也可加入緩沖液。加入的緩沖液的種類無特別限定，但優(yōu)選為在pH8.0附近有緩沖能力的緩沖液，進一步優(yōu)選可例舉出磷酸緩沖液、Tris緩沖液等。
進一步地，肌醇2-脫氫酶由Mg2+離子活化，鯊肌醇脫氫酶由Co2+離子活化，因此通過添加這些金屬離子，反應速度增大。因此，希望向反應溶液中添加Co鹽和/或Mg鹽并使之達到0.01-5.0mM、優(yōu)選達到0.2-2.0mM。所使用的Co鹽、Mg鹽只要是溶解于水的鹽即可，可例舉出鹽酸鹽、硫酸鹽等。
在本發(fā)明中使用的底物肌醇在反應溶液中的濃度，優(yōu)選為1-30％，優(yōu)選為5-22％。當反應進行時，超過1.6％的過飽和的鯊肌醇以晶體形式析出，使肌醇減少。為此，也可向反應溶液中再添加減少了的肌醇量，將肌醇濃度維持為一定，連續(xù)地進行反應。
反應溫度，只要使反應進行即可，無特別限定，但考慮底物的溶解度、NAD+或NADP+的穩(wěn)定性、酶的耐熱性，希望在20-50℃、優(yōu)選35-40℃下使之反應。如果是懸浮菌體的方法，則因為是不均勻反應，故需要攪拌，但使用提取酶時，因為是均勻溶液，因此不需要攪拌，但為了將溫度均勻化，優(yōu)選進行攪拌。
酶反應過程中，如果反應物鯊肌醇達到溶解度以上，則能夠使之以結晶性鯊肌醇形式沉淀，因此如果使用過濾、傾濾等固液分離法，則不需要使反應停止，能夠在過濾液等的溶液中再度添加肌醇而繼續(xù)反應。
需要停止酶反應時，只要酶反應自身被停止即可，可使用加熱、改變pH、添加蛋白質變性劑等的方法?？墒?，考慮下道步驟鯊肌醇的純化，優(yōu)選采用加熱。例如可例舉出在70-120℃、優(yōu)選80-90℃下將反應溶液加熱10-20min，等等。
另外，可通過將酶分離出來使反應停止。通過使反應溶液在離子交換樹脂柱中通過將酶分離出來。使用固定化的酶時，通過將反應溶液離心分離、或者過濾操作，能夠回收固定化酶。
在反應停止后、或反應中達到過飽和的鯊肌醇以晶體形式析出。結晶性鯊肌醇可采用過濾、或離心分離等的操作分離。而且，與菌體、不溶性變性蛋白質共存時，加入水溶解結晶性鯊肌醇后，通過施加過濾、或離心分離等的操作，能夠去除菌體、不溶性變性蛋白質。
所得的結晶性鯊肌醇的純化方法可如以下所示地進行。在該階段需注意的是是結晶性鯊肌醇中所含的neo-肌醇。neo-肌醇是一部分的肌醇的5位被鯊肌醇脫氫酶氧化而產(chǎn)生的neo-青蟹肌糖，被肌醇2-脫氫酶還原而產(chǎn)生的物質，是在本反應體系中微量地產(chǎn)生的物質。另外，neo-肌醇的水溶解度低達0.5％，是易于與鯊肌醇一起引起結晶性的沉淀的物質。
可是，將該結晶性鯊肌醇再度溶解于水而得到的鯊肌醇溶液，幾乎不含肌醇，通過采用過濾或離心分離等的操作分離在再濃縮時產(chǎn)生的結晶性鯊肌醇的操作，能夠得到含有微量的neo-肌醇的鯊肌醇。另外，更高度地純化時，使之通過脫鹽柱、活性炭柱而純化后，采用過濾或離心分離等的操作分離通過濃縮液體而再度結晶化的再結晶鯊肌醇，由此能得到不含有neo-肌醇的純品鯊肌醇。
脫鹽柱優(yōu)選為使用離子交換樹脂柱。所使用的離子交換樹脂可以是強堿性離子交換樹脂和弱堿性離子交換樹脂中的任意一個、或兩者的混合物，或者強酸性離子交換樹脂和弱酸性離子交換樹脂的任1個、或兩者的混合物。離子交換樹脂的作用方法，使溶液在柱狀地裝滿的離子交換樹脂中通過的方法為最佳，但也可采用間歇式攪拌混合，通過過濾來脫鹽。
活性炭柱以脫色為目的，也可使用使溶液在柱狀地裝滿的活性炭中通過的方法，但也可采用間歇式攪拌混合，通過過濾來脫色。
其次，在酶反應停止后，在反應溶液中溶解的溶解性鯊肌醇的純化方法可如以下所示進行。在該階段需注意的是，與結晶性鯊肌醇的情況不同，是肌醇、和neo-肌醇的去除。
溶解性鯊肌醇與原料肌醇、和neo-肌醇一起溶解，可采用過濾或離心分離等的操作獲得溶液。該溶液還含有溶解性肽、鹽，因此可使之通過脫鹽柱、活性炭柱而純化后，濃縮至肌醇不析出的程度(避免使肌醇達到21％以上)，采用過濾或離心分離等的操作分離析出的結晶性鯊肌醇。如果需要，則也能夠加入水溶性的有機溶劑，使之結晶化。作為有機溶劑，可例舉出甲醇、乙醇、丙醇等。
另外，如后述，也可以采用這樣的方法分離純化鯊肌醇向含有得到的鯊肌醇的溶液中加入硼酸和NaCl，制備鯊肌醇硼酸復合體，將其過濾出后，用酸使硼酸游離，通過加入甲醇之類的有機溶劑使鯊肌醇結晶化。
4.由含有鯊肌醇及鯊肌醇以外的中性糖的混合液制備鯊肌醇的方法本發(fā)明進一步涉及由含有鯊肌醇及鯊肌醇以外的中性糖的混合液制備鯊肌醇的方法。
<4-1>
作為本發(fā)明的一個實施方案的制備純化的鯊肌醇的方法包括在含有鯊肌醇及鯊肌醇以外的中性糖的混合液中，加入在該溶解于混合液中的鯊肌醇的2倍摩爾以上的量的硼酸和金屬鹽，且將該混合液的pH調至8.0-11.0，形成鯊肌醇·硼酸復合體的第1步驟；從混合液分離上述復合體的第2步驟；使經(jīng)分離的復合體溶解于酸中，從而使之分解為鯊肌醇和硼酸的第3步驟；從在第3步驟中得到的酸性溶液或酸性懸浮液分離純化鯊肌醇的第4步驟。
該制備方法的第1步驟，是在含有鯊肌醇及鯊肌醇以外的中性糖的混合液中，加入溶解于該混合液中的鯊肌醇的2倍摩爾以上的量的硼酸和金屬鹽，且將該混合液的pH調至8.0-11.0，形成鯊肌醇·硼酸復合體的步驟。
在此使用的“含有鯊肌醇及鯊肌醇以外的中性糖的混合液”，可以是溶液也可以是懸浮液。而且，可以是含有“鯊肌醇及鯊肌醇以外的中性糖”以外的物質的混合液，還可以是預先含有少量的鯊肌醇·硼酸復合體的混合液。作為混合液中所含的中性糖，優(yōu)選四碳糖、五碳糖、六碳糖、七碳糖之類的中性糖，例如可例舉出葡萄糖、果糖、半乳糖等的醛糖、酮糖、肌醇的各種異構體、以及甘油、乙二醇等的多元醇類。在此，作為肌醇的異構體，例如可舉出肌醇、D-chiro-肌醇、L-chiro-肌醇、epi-肌醇、muco-肌醇、allo-肌醇、cis-肌醇、neo-肌醇。
這些異構體之中，可特別優(yōu)選使用肌醇，作為該情況下的“含有鯊肌醇及鯊肌醇以外的中性糖的混合液”，例如可舉出；如以下所示那樣在還原青蟹肌糖時產(chǎn)生的、含有鯊肌醇和肌醇的混合液。
用于還原反應的青蟹肌糖，例如可使用通過在培養(yǎng)基或溶液中利用微生物氧化肌醇而得到的青蟹肌糖(特開2003-102492號公報)。由微生物氧化而得到的青蟹肌糖在純化之后可以溶解使用，但也可以使用培養(yǎng)濾液。另外，也能使用用鉑催化劑氧化肌醇而制備的青蟹肌糖。
為將青蟹肌糖還原成鯊肌醇所使用的還原劑，只要是能夠在水系中將青蟹肌糖還原成鯊肌醇的還原劑即可，無其它特別限定，例如可例舉出氫化硼鈉、氫化硼鋰、氫化硼鉀、氫化三甲氧基硼鈉、氫氰化硼鈉。
青蟹肌糖的還原反應，例如可通過在以20％(w/v)以下的含量溶解青蟹肌糖的溶液中以粉末或溶液的形式添加還原劑而進行。此時優(yōu)選攪拌溶液。另外，有時因為還原反應而產(chǎn)生反應熱，但為了抑制生成的青蟹肌糖分解，希望將反應液控制成為50℃以下。而且，在使用氫化硼鈉等還原劑時，有時還原劑的一部分分解產(chǎn)生氫氣，但為了抑制氫氣的起泡，優(yōu)選添加消泡劑等。
在由青蟹肌糖的還原而得到的鯊肌醇與肌醇的混合液中，當鯊肌醇的濃度超過約1.6％(w/v)時，就緩慢地開始結晶化。通常通過還原5％(w/v)的青蟹肌糖水溶液，產(chǎn)生約3％(w/v)肌醇、及約2％(w/v)鯊肌醇，但在室溫下放置數(shù)小時時，鯊肌醇的過飽和部分的約0.4％(w/v)開始結晶化。為此，使用由青蟹肌糖的還原而得到的鯊肌醇與肌醇的混合液時，在產(chǎn)生該鯊肌醇自身的晶體之前進行形成鯊肌醇·硼酸復合體的步驟為好。更優(yōu)選在青蟹肌糖的還原反應后馬上進行形成鯊肌醇·硼酸復合體的步驟。
在第1步驟中，在上述的“含有鯊肌醇和肌醇的混合液”等的“含有鯊肌醇及鯊肌醇以外的中性糖的混合液”中，分別以在混合液中溶解的鯊肌醇的2倍摩爾以上、優(yōu)選2倍摩爾以上且3倍摩爾以下的量加入硼酸和金屬鹽，使其溶解后，將混合液的pH調至pH8.0-11.0、優(yōu)選pH9.0-10.0的堿性。在此，所謂2倍摩爾是指2倍的摩爾數(shù)。反應液的pH可采用NaOH、KOH、Na2CO3、K2CO3等堿來調整。
在此，添加的金屬鹽，例如可使用選自NaCl、NaHCO3、Na2CO3、Na2SO4、NaHSO4、NaH2PO4、Na2HPO4、Na3PO4、硼砂、KCl、KHCO3、K2CO3、K2SO4、KHSO4、KH2PO4、K2HPO4、K3PO4、MgCl2、MgCO3、及MgSO4的1種或2種以上的金屬鹽。另外，添加的硼酸量，在混合液中已經(jīng)含有硼酸時，與其量合計達到溶解鯊肌醇的量的2倍以上的摩爾數(shù)、優(yōu)選2倍以上且3倍以下的摩爾數(shù)。
第1步驟為了使硼酸或金屬鹽在混合液中高效率地溶解，以及，為了在調整pH時使溶液均一，優(yōu)選邊攪拌邊進行。該步驟希望在5℃-85℃、優(yōu)選15-40℃的范圍的溫度下進行。該步驟所需要的時間，只要得到必要量的鯊肌醇·硼酸復合體即可，無其它特別限定，但為了得到90％以上的回收率，優(yōu)選12-76小時。
用NMR確認了鯊肌醇·硼酸復合體對水的溶解度為0.01％(w/v)以下，因此在混合液中大部分以沉淀形式存在。在第2步驟中，從混合液分離該鯊肌醇·硼酸復合體。在該步驟中，可適用通常的固液分離操作，例如可適用過濾操作、離心分離操作等。在通過該步驟分離了鯊肌醇·硼酸復合體之后的混合液中殘留的鯊肌醇為0.2％(w/v)以下的濃度，因此能夠以鯊肌醇·硼酸復合體的形式回收在反應開始前的混合液中含有的鯊肌醇的大部分。另一方面，肌醇等的中性糖在溶液中以溶解狀態(tài)存在，因此在過濾操作中存在于液體中，能夠通過該步驟分離中性糖和鯊肌醇。
所經(jīng)分離的鯊肌醇·硼酸復合體，使之干燥，能夠作為粉末而分離。另外，如果需要，也可通過從熱水再結晶，從而以晶體形式分離。
接著，在第3步驟中，將經(jīng)分離的鯊肌醇·硼酸復合體溶解于酸中。通過該溶解，鯊肌醇·硼酸復合體分裂成為鯊肌醇和硼酸，而且在復合體中一直結合著的金屬離子也離解到溶液中。作為在該步驟用于溶解的酸的種類，只要能夠溶解復合體即可，無其它特別限定，但根據(jù)金屬離子的種類優(yōu)選為不形成低溶解度的鹽的酸?？蓛?yōu)選使用鹽酸、硫酸、硝酸、磷酸等無機酸，可更優(yōu)選使用鹽酸。因為這些酸與由溶解而產(chǎn)生的金屬離子引起中和反應，因此溶解鯊肌醇·硼酸復合體的溶液調至最終成為0.1當量以上的酸性溶液為好。另外，為了高效率地溶解鯊肌醇·硼酸復合體，用1當量以上的酸溶解復合體，最終形成0.1當量以上的酸性溶液為好。
在第4步驟中，從在第3步驟中得到的酸性溶液或酸性懸浮液分離純化鯊肌醇。從酸性溶液分離純化鯊肌醇的方法無特別限制，例如可使用后述的采用離子交換樹脂等樹脂的方法、利用對有機溶劑的溶解度差的方法等。
另外，也可以使用使硼酸游離之后，加入低級醇，形成低級醇與硼酸的酯，再使用減壓蒸餾的方法(Journal of Organic Chemistry，23卷，p.329-330，1958年)。
這些方法之中，使用離子交換樹脂的分離純化鯊肌醇的方法可如以下所示地進行。該場合，在第3步驟中得到的液體優(yōu)選是完全溶解了復合體的0.1當量以上的酸性溶液。另外，該酸性溶液，為了避免游離了的鯊肌醇析出，優(yōu)選是以鯊肌醇·硼酸復合體的比例達到2.5(w/v)％以下的容量加入酸而制備的溶液。
首先，為了去除金屬離子，使這樣的酸性溶液與強酸性離子交換樹脂接觸。使用的強酸性離子交換樹脂只要是吸附金屬離子的即可，無其它特別限定，例如可舉出具有硫酸基的離子交換樹脂。例如可例舉出DuoliteC20·H+(住友化學公司制)等。接觸的方法，可以通過分批地向一定量的溶液中加入強酸性離子交換樹脂并攪拌的操作而進行，但希望使溶液在柱狀地裝滿的強酸性離子交換樹脂中通過而進行。
利用強酸性離子交換樹脂去除了金屬離子的溶液，接著為了去除硼酸，使之與強堿性離子交換樹脂或吸附硼酸的樹脂接觸。這些樹脂只要是吸附硼酸的即可，無其它特別限定，例如作為強堿性離子交換樹脂，可例舉出具有季銨鹽基的該種樹脂，作為吸附硼酸的樹脂，可例舉出具有N-甲基葡萄糖胺基的樹脂等。作為強堿性離子交換樹脂具體可舉出DuoliteA116·OH-類型(住友化學公司制)等。另外，作為吸附硼酸的樹脂具體可舉出DuoliteES371N(住友化學公司制)等。接觸的方法，可以通過分批地向一定量的溶液中加入離子交換樹脂并攪拌的操作而進行，但希望使溶液在柱狀地裝滿的離子交換樹脂中通過而進行。
使溶液接觸樹脂的順序并不是隨機的，這是因為硼酸和鯊肌醇在酸性狀態(tài)下離解，開始使之與強酸性離子交換樹脂接觸，接著使之與強堿性離子交換樹脂或者吸附硼酸的樹脂接觸。
在與樹脂接觸從而去除了金屬離子和硼酸的溶液中，只含有中性糖鯊肌醇。因此，利用常規(guī)方法濃縮該溶液，使鯊肌醇析出，由此能夠以晶體或粉末的形式分離純化的鯊肌醇。
另外，在第4步驟中，利用對有機溶劑的溶解度差分離純化鯊肌醇時，可如以下所示地進行。在該方法中，因為從溶解后到添加有機溶劑的期間不采用離子交換樹脂等進行純化操作，因此通過第3步驟的酸溶解而得到的液體可以是溶解液，但也可以是懸浮液。另外，在第3步驟中，為了在溶解后鯊肌醇易于析出，希望以鯊肌醇·硼酸復合體的比例達到2.5％(w/v)以上、優(yōu)選3.0％-10％(w/v)、更優(yōu)選4.0％-6.0％(w/v)的容量加入酸。
首先，為了析出游離了的鯊肌醇，向得到的酸性溶液或懸浮液中加入水溶性有機溶劑。所使用的有機溶劑，只要是能夠在硼酸溶解、與酸形成鹽的金屬鹽溶解狀態(tài)下析出鯊肌醇的有機溶劑即可，無其它特別限定，例如舉出乙醇、甲醇。
有機溶劑的量，例如使用乙醇時，相對于酸性溶液優(yōu)選加入0.3-3倍容積的乙醇，更優(yōu)選加入0.6-1.5倍容積的乙醇。使用甲醇時，相對于酸性溶液優(yōu)選加入0.3-5倍容積的甲醇，更優(yōu)選加入0.9-2倍容積的甲醇。特別是在形成鯊肌醇·硼酸復合體時使用的金屬鹽為NaCl、NaHCO3、Na2CO3之中的任一種、或者2種以上時，以上述容量加入有機溶劑是有效的。而且，加入水溶性有機溶劑之后的混合液優(yōu)選調至為0.1當量以上的酸性溶液。
在第4步驟中，混合體系為均一溶液時，未必攪拌，為懸浮液時，也是攪拌為好。另外，混合的溫度，只要是只析出鯊肌醇的溫度即無特別限定，但優(yōu)選為-10℃至50℃，更優(yōu)選為4℃-35℃?；旌系臅r間優(yōu)選10min-24小時，更優(yōu)選3-5小時。
通過這樣的操作，能夠只析出鯊肌醇。通過過濾、或離心分離等的通常的固液分離操作，能夠將析出的鯊肌醇從溶液分離。得到的鯊肌醇為純的，但如果需要，則也可采用再結晶等的方法以晶體形式得到。為了更提高純度，可以將析出的鯊肌醇溶解于水后，利用離子交換樹脂等進一步純化。
<4-2>由青蟹肌糖不經(jīng)由鯊肌醇·硼酸復合體就制備鯊肌醇的方法接下來，對于由含有鯊肌醇和鯊肌醇以外的中性糖的混合液制備鯊肌醇的方法的又一方案進行說明。
該方法是制備鯊肌醇的方法，包括在含有青蟹肌糖的溶液中，使用硼氫化金屬鹽還原青蟹肌糖，得到含有肌醇和鯊肌醇的混合液的第1步驟；向上述混合液中加入酸，使混合液中的鯊肌醇·硼酸復合體溶解，并且將溶液調至0.01當量以上的酸性溶液的第2步驟；以及，以肌醇不析出的量向上述酸性溶液中加入水溶性有機溶劑，從而只使鯊肌醇析出的第3步驟。
在含有青蟹肌糖的溶液中，使用硼氫化金屬鹽還原青蟹肌糖時，在溶液中除了存在因被還原而產(chǎn)生的鯊肌醇和肌醇以外，還存在硼酸和金屬離子，因此鯊肌醇的一部分形成對水不溶的鯊肌醇·硼酸復合體，只從溶液成分純化鯊肌醇時，收得率降低。第2發(fā)明的目的是在含有由青蟹肌糖的還原而得到的含有肌醇和鯊肌醇的混合液中，將在該混合液中少量生成的鯊肌醇·硼酸復合體溶解于酸中，從得到的酸性溶液只析出、純化鯊肌醇。
在第1步驟中，“含有青蟹肌糖的溶液”，例如可使用通過在培養(yǎng)基或溶液中利用微生物氧化肌醇而得到(特開2003-102492號公報)的溶液。由微生物氧化而得到的青蟹肌糖在純化之后可以溶解使用，也可以使用培養(yǎng)濾波。“含有青蟹肌糖的溶液”，可以是象該培養(yǎng)濾液那樣含有青蟹肌糖以外的物質的溶液。另外，也能使用用鉑催化劑氧化肌醇而制備的青蟹肌糖。
用于還原的硼氫化金屬，只要是能夠在水系中將青蟹肌糖還原成鯊肌醇、且將硼游離的還原劑即可，無其它特別限定，例如可例舉出氫化硼鈉、氫化硼鋰、氫化硼鉀。
青蟹肌糖的還原反應，例如可通過在以20％(w/v)以下的含量溶解青蟹肌糖的溶液中以粉末或溶液的形式添加還原劑而進行。此時優(yōu)選攪拌溶液。另外，有時因為還原反應而產(chǎn)生反應熱，但為了抑制生成的青蟹肌糖分解，希望將反應液控制成為50℃以下。而且，有時還原劑的一部分分解產(chǎn)生氫氣，但為了抑制氫氣的起泡，優(yōu)選添加消泡劑等。
這樣，青蟹肌糖被還原成鯊肌醇和肌醇，在溶液中鯊肌醇和肌醇以混合狀態(tài)存在。此時，當鯊肌醇的濃度超過約1.6％(w/v)時，就緩慢地開始結晶化。通常通過還原5％(w/v)的青蟹肌糖水溶液，產(chǎn)生約3％(w/v)肌醇、及約2％(w/v)鯊肌醇，但在室溫下放置數(shù)小時時，鯊肌醇的過飽和部分的約0.4％(w/v)開始結晶化。而且，因為在由青蟹肌糖的還原而得到的鯊肌醇與肌醇的混合液中含有硼酸，因此鯊肌醇的一部分開始形成鯊肌醇·硼酸復合體。在第2發(fā)明的制備方法中，可以在第1步驟之后馬上進行第2步驟，但因為鯊肌醇·硼酸復合體通過酸處理而溶解，因此也可以在第1步驟之后放置一會兒之后進行第2步驟。
第2步驟，向由第1步驟得到的“含有肌醇和鯊肌醇的混合液”加入酸，溶解混合液中的鯊肌醇·硼酸復合體，將溶液調至0.01當量以上的酸性溶液。此時，所使用的酸可使用鹽酸、硫酸、硝酸、磷酸等無機酸，但優(yōu)選使用鹽酸或硫酸。
在第3步驟中，向在第2步驟中得到的酸性溶液加入不使肌醇析出、只使鯊肌醇析出的量的水溶性有機溶劑。此時所使用的水溶性有機溶劑，只要是滿足使鯊肌醇析出、使肌醇溶解的狀態(tài)的溶劑即可，無其它特別限定，但優(yōu)選為乙醇或甲醇或1-丙醇。
所謂不使肌醇析出、只使鯊肌醇析出的量，例如相對于酸性溶液，乙醇時為0.2-0.4倍容積，甲醇時為0.2-0.8倍容積，1-丙醇時為0.2-0.4倍容積，優(yōu)選相對于酸性溶液，乙醇時為0.35-0.45倍容積，甲醇時為0.45-0.55倍容積，1-丙醇時為0.35-0.45倍容積。
在混合水溶性有機溶劑時，混合體系為均一溶液時，未必需要攪拌，但為懸浮液時，攪拌為好?；旌蠒r的溫度，只要是只鯊肌醇析出的溫度則無特別限定，但優(yōu)選為-10℃至50℃，更優(yōu)選為4℃-35℃?；旌系臅r間優(yōu)選為15-76小時，更優(yōu)選為20-24小時。
在這樣的條件下混合水溶性有機溶劑時，只鯊肌醇析出。通過過濾或離心分離等的通常的固液分離操作，能夠以固體形式獲得析出的鯊肌醇。該固體只由基本上純的鯊肌醇構成，但如果需要，則也可采用再結晶等的方法以晶體形式得到。為了更提高純度，可以將析出的鯊肌醇溶解于水后，利用離子交換樹脂等進一步純化。
以下示出實施例具體說明本發(fā)明。
實施例1<鯊肌醇的制備方法(小規(guī)模)>
將含有10.0％肌醇、1.0％酵母提取物、1.0％蔗糖的3升液體培養(yǎng)基使用1N NaOH調至pH7.0，向30個500ml容積的帶擋板的錐形燒瓶中各分配注入100ml，用高壓釜滅菌。向各個錐形燒瓶中接種醋酸桿菌AB10281FERM BP-10119的斜面培養(yǎng)物1接種環(huán)，在27℃搖床培養(yǎng)5天。培養(yǎng)后，向各個錐形燒瓶中各加入250ml水，用搖床攪拌1小時，溶解存在于培養(yǎng)液中的結晶性的鯊肌醇。收集該培養(yǎng)液，離心分離(8,000rpm 20min)，獲得上清液作為培養(yǎng)液上清(10.2L)。
利用高速液相色譜法在下述的條件下分析了該培養(yǎng)液上清。結果顯示，在培養(yǎng)液上清中生成12.6mg/ml鯊肌醇(129g、轉化率43％)。此時的培養(yǎng)液上清中殘存2.1mg/ml青蟹肌糖，而肌醇未被檢測出。
高速液相色譜法的分析條件如下。
柱Wakosil 5NH2(4.6×250mm)柱溫度40℃注入量5μl溶劑乙腈-水＝4∶1
流量2ml/min洗脫時間青蟹肌糖11.6min肌醇17.8nin鯊肌醇18.2min上述的鯊肌醇的轉化率通過下式求出。
轉化率(％)＝(培養(yǎng)液上清中的鯊肌醇摩爾數(shù))/(培養(yǎng)前的肌醇摩爾數(shù))×100接著，使培養(yǎng)液上清在連結了填充有500ml強酸性陽離子交換樹脂DuoliteC-20(H+型)(住友化學公司制)的柱(內(nèi)徑5cm、長40cm)和填充有200ml活性炭的柱(內(nèi)徑5cm、長16cm)的柱中通過，然后，使該柱中通過500ml的離子交換水以洗滌。使該通過液和洗滌液在填充有1000ml強堿性陰離子交換樹脂DuoliteA116(OH-型)(住友化學公司制)的柱(內(nèi)徑7cm、長40cm)中通過，然后使該柱中通過1000ml的離子交換水以洗滌。在所得的通過液和水洗滌液中除上述鯊肌醇以外幾乎不存在雜質。
將通過上述而得到的水溶液在減壓下濃縮到約700ml，加入3倍量的乙醇，在5℃放置一夜，然后過濾純的鯊肌醇的無色晶體，使之干燥，得到118g。此時的純化回收收得率為92％，來自肌醇的鯊肌醇的總回收率為39％。
實施例2<鯊肌醇的制備方法(大規(guī)模)>
將含有10.0％肌醇、1.0％酵母提取物、1.0％蔗糖的40升液體培養(yǎng)基導入50L容積發(fā)酵罐中，使用1N NaOH調節(jié)pH7.0，用高壓釜滅菌。接著400ml在相同組成的培養(yǎng)基(錐形燒瓶)中培養(yǎng)的醋酸桿菌AB10281FERM BP-10119，在27℃以通氣量1vvm、轉速200rpm培養(yǎng)5天。培養(yǎng)后，向取出的約40L培養(yǎng)液中加入60L約50℃的溫水，攪拌1小時，溶解存在于培養(yǎng)液中的結晶性的鯊肌醇。將該培養(yǎng)液連續(xù)離心分離(8,000rpm)，獲得去除了菌體的液體作為培養(yǎng)除菌液(約100L)。
利用高速液相色譜法在下述的條件下分析了該培養(yǎng)除菌液。結果顯示，在培養(yǎng)除菌液中生成16.8mg/ml鯊肌醇(1.68kg、轉化率42％)。此時的培養(yǎng)除菌液中殘存2.9mg/ml青蟹肌糖，而肌醇未被檢測出。高速液相色譜法的分析條件與實施例1相同。
接著，向得到的100L溶液中加入400g氫氧化鈉，在攪拌下加熱，98℃處理1小時。然后，趁熱加入560g氫氧化鈉、1340g硼酸、1260g的NaCl，使其溶解。停止攪拌，使溶液放熱，放置到達到23℃(約24小時)。
然后，為了分離在液體中形成的鯊肌醇硼酸復合體的晶體，過濾該溶液，用水洗滌晶體直到變?yōu)榘咨珵橹?。得到的晶體(約3.9kg)取出放到另一容器中，向其中加入5.9L水、1.95L 37％鹽酸，攪拌。30min后，為了在該操作下使與硼酸分離的鯊肌醇進一步沉淀，加入9.4L甲醇，再攪拌1小時。
接著，為了分離在液體中結晶化的鯊肌醇，將該溶液過濾，用1L50％甲醇洗滌晶體。得到的微粉晶體(約1.8kg)取出放到另一容器中，向其中加入10L水，邊攪拌邊加溫，煮沸1小時。然后，將該溶液邊攪拌邊冷卻，在達到20℃的階段過濾，得到鯊肌醇微晶。干燥后，得到純的鯊肌醇的無色晶體1.35kg。此時的純化回收收得率為80％，來自肌醇的鯊肌醇的總回收率為34％。
實施例3<鯊肌醇生成菌的根據(jù)16SrRNA堿基序列進行的鑒定>
對具有將肌醇轉化成鯊肌醇的能力的3種自然分離菌株AB10285株、AB10286株、AB10287株、以及由AB10253育種的AB10281計4種菌株的16SrRNA堿基序列按照常規(guī)方法進行分析。即，從培養(yǎng)后的菌體提取基因組DNA后，用設計為能擴增約1.6kbp的16SrRNA的引物，PCR擴增出相應的DNA片段，隨后分析了約1.3kbp相關的序列(北海道系統(tǒng)科學公司)。以該序列結果為基礎與數(shù)據(jù)庫對照，鑒定了相關菌種(related species)。
表2示出了對照結果、同源性、與實施例1同樣地培養(yǎng)時向鯊肌醇的轉化率。
表2 通過16SrRNA堿基序列分析進行的菌株鑒定


由該結果表明，具有將肌醇轉化成鯊肌醇的能力的4種菌株大致可分成2組。作為第1組，AB10281和AB10285株被鑒定為啤酒醋桿菌、或Acetobacter malorum，又，作為第2組，AB10286株和AB10287株被鑒定為須芒草伯克霍爾德氏菌。
實施例4<來自醋酸桿菌AB10253的NAD+非依賴型的肌醇2-脫氫酶的分離>
在500ml容積的帶擋板的錐形燒瓶中加入3g肌醇、1g酵母提取物(FNI205；Lallemand BI公司制)、0.5g葡萄糖，溶解于水中并使之達到100ml，調至pH5.0，制備了4瓶采用高壓釜滅菌過的培養(yǎng)基，1接種環(huán)醋酸桿菌AB10253從斜面加入上述培養(yǎng)基中，在27℃搖床預培養(yǎng)2天。
接著，向50L容積發(fā)酵罐中加入1.2kg肌醇、0.4kg酵母提取物(FNI205；Lallemand BI公司制)、0.2kg葡萄糖，溶解于水中并使之達到40L，調至pH5.0，采用高壓釜滅菌。向其中加入預培養(yǎng)過的醋酸桿菌AB10253的菌液約400ml，在27℃以通氣量1vvm、轉速200rpm培養(yǎng)3天。
培養(yǎng)后，使用連續(xù)離心機以沉淀形式得到菌體。得到的菌體在2升水中再懸浮，通過離心分離得到洗滌菌體后，在2升的pH7.0的20mM Tris緩沖液中懸浮。接著，對該懸浮液照射超聲波，將菌體破碎。菌體破碎液，為了使破碎的菌體沉淀，進行離心分離，以沉淀物形式得到破碎菌體。向該沉淀物中加入500ml pH7.0的20mM Tris緩沖液、0.6％TritonX-100(Kodak公司制)，懸浮，在15℃提取酶3小時。然后，進行離心分離，取出了上清的粗酶液420ml。
420ml粗酶液利用超濾裝置(MW30000cut off)濃縮至150ml，使該濃縮液在用20mM的Tris緩沖液(pH7.0)經(jīng)平衡的400ml的DEAEToyopearl柱中通過，使之吸附蛋白質。接著使含有0mM～500mM線性梯度NaCl的、不含表面活性劑的20mM的Tris緩沖液(pH7.0)(總量1.6升)以每分鐘10ml的速度通過吸附了蛋白質的柱，以使吸附在柱上的蛋白質洗脫。洗脫液分餾成各40ml的級分。然后，再度使不含表面活性劑的20mM的Tris緩沖液(pH7.0)600ml通過該柱以洗滌，接著使含有0mM～500mM線性梯度NaCl的、含有0.1％TritonX-100的20mM的Tris緩沖液(pH7.0)(總量1.6升)以每分鐘10ml的速度在柱中通過，以洗脫蛋白質。洗脫液分餾成各40ml的級分。
各級分的酶活性的測定，作為標準的方法，將由50μl蛋白質溶液、100mM磷酸緩沖液(pH5.0)、肌醇5mg、2，4-二氯吲哚酚(氧化型DCIP)0.4mg組成的1mL溶液中的600nm的吸光度變化換算成反應速度，將每1min氧化1μmol的肌醇的活性作為1單位而測定。
其結果表明，目標酶洗脫至含有0.1％TritonX-100和100mM～170mM NaCl的20mM的Tris緩沖液(pH7.0)的溶液組分中。然后，收集該組分(240ml)，利用超濾裝置(MW30000cut off)濃縮至30ml，加入含有0.1％TritonX-100的20mM的Tris緩沖液(pH7.0)進一步濃縮，向濃縮到30ml的溶液中加入70ml的20mM的Tris緩沖液(pH7.0)，進行了脫鹽。
這樣制備的酶液，接著在用含有0.1％TritonX-100的20mM的Tris緩沖液(pH7.0)經(jīng)平衡的100ml羥基磷灰石柱中通過，使之吸附蛋白質。接著使含有0mM～500mM線性梯度磷酸緩沖液(pH7.0)的含有0.1％TritonX-100的Tris緩沖液(pH7.0)(總量400ml)以每分鐘3ml的速度通過吸附了蛋白質的柱，以使吸附在柱上的蛋白質洗脫。洗脫液分餾成各10ml的級分，測定了各級分的酶活性。
其結果表明，目標酶洗脫至含有0.1％TritonX-100和100mM～170mM磷酸緩沖液的20mM的Tris緩沖液(pH7.0)的溶液組分中。所得的酶液含有基本上純的NAD+非依賴型的肌醇2-脫氫酶。然后，收集該級分(40ml)，利用超濾裝置(MW30000cut off)濃縮至5ml，加入100ml的20mM的Tris緩沖液(pH7.0)進一步濃縮到5ml，進行了脫鹽。
使這樣制備的該酶液，再度通過用含有0.1％TritonX-100的20mM的Tris緩沖液(pH7.0)平衡的20ml-DEAE Toyopearl柱(Tosoh公司制)中通過，使柱吸附蛋白質。接著使含有50mM～250mM線性梯度NaCl的、含有0.1％TritonX-100的20mM的Tris緩沖液(pH7.0)(總量160ml)以每分鐘1ml的速度通過吸附了蛋白質的柱，以使吸附在柱上的蛋白質洗脫。洗脫液分餾成各4ml的級分，分餾后進行了各級分的酶活性測定、對有活性的各級分進行SDS電泳。
結果，由SDS電泳明確了與目標酶的酶活性有相關性的蛋白質的條帶。去除來自前后沒有活性的級分的蛋白質的條帶，表明目標酶是至少含有分子量約76k道爾頓和約46k道爾頓的蛋白質的酶。
另外，有酶活性的級分具有紅色，從UV光譜圖表明含有細胞色素C。進一步由目的蛋白質的含量、和細胞色素C的吸光度表明每1摩爾目標酶含有1摩爾的細胞色素C。
最適pH的測定，測定酶活性時改變緩沖液和pH而進行測定。緩沖液使用100mM磷酸緩沖液(pH3-8)、100mM Tris緩沖液(pH7-8)及100mM碳酸緩沖液(pH8-11)。其結果表明，目標酶在pH4.5-5.5下具有最大活性。而且，在標準酶活性測定(100mM磷酸緩沖液(pH5.0))時加入各種重金屬離子(Sn2+、Mn2+、Mg2+、Cu2+、Fe、Zn2+、Co2+、Pb2+、Ca2+、Cd2+、Ni2+)而測定，表明了目標酶被Sn2+離子特異地抑制。酶活性在1mM的Sn2+離子存在下被抑制到Sn2+離子非存在下的活性的1％以下。
另外證實了目標酶是采用TritonX-100從膜組分提取的酶，提取的酶在還原型DCIP存在下氧化肌醇，但在還原型DCIP非存在下不引起氧吸收。這意味著該酶在生物體中與細胞膜電子傳遞體系締合，從肌醇奪取電子，生成青蟹肌糖。
目標酶的底物特異性，通過在代替肌醇含有最終濃度50mM的各種糖的溶液中測定酶活性而確定。另外，關于有活性的糖，改變糖的濃度測定酶活性，測定Km值。而且，通過HPLC分析氧化反應物，測定了生成什么物質。HPLC條件，柱使用Wakosil 5NH2柱Φ4.6×250mm(柱溫度40℃)，流動相使用80％乙腈(流速2ml/min)，檢測器使用RI檢測器而測定。
作為結果，目標酶與D-chiro-肌醇(相對活性100％Km＝8.8mM)、muco-肌醇(相對活性68％Km＝14.5mM)、肌醇(相對活性53％Km＝20mM)反應，分別轉化成D-chiro-1-肌糖、L-chiro-2-肌糖、青蟹肌糖。表明不與allo-肌醇、鯊肌醇、L-chiro-肌醇、葡萄糖反應。
實施例5<利用NAD+非依賴型的肌醇2-脫氫酶進行的肌醇向鯊肌醇的轉化>
與實施例4同樣地用40L發(fā)酵罐進行純化，中途采用100ml羥基磷灰石柱進行了純化、脫鹽，將所得到的5ml的酶溶液作為酶液進行了以下的轉化反應。
在400ml容積的離心管中加入30g肌醇(166.7mmol)、15ml1M磷酸緩沖液(pH5.0)，用水稀釋至300ml，使肌醇溶解。在30℃向其中加入1ml酶液，邊攪拌邊緩慢加入8g還原型DCIP(Na鹽)。來源于還原型DCIP的藍色消失之后，通過離心分離使隨藍色的消失而產(chǎn)生的白色的不溶物(氧化型DCIP)沉淀，將上清液轉移到新的400ml容積的離心管中。再采用1當量磷酸將該溶液調至pH 5.0，邊攪拌邊進一步加入8g的還原型DCIP(Na鹽)。將該操作重復6次，加入合計48g的還原型DCIP(Na鹽)，在藍色消失了的階段，最后加入3g的還原型DCIP(Na鹽)，放置1小時后，通過離心分離取出了上清液。通過這樣的操作得到上清液292ml。操作時間需要8小時。
接著，得到的上清液，以每分鐘1.5ml的速度使溶解液在用100ml強酸性離子交換樹脂(Duolite C20、H+類型)裝滿的柱中通過，使得到的洗脫液在用150ml弱堿性離子交換樹脂(Duolite 368S、OH-類型)裝滿的柱中通過，再使得到的洗脫液在用50ml活性炭裝滿的柱中通過。濃縮得到的洗脫液，得到白色粉末26.5g(148.9mmol)(收得率89％)。將該物質采用NMR和HPLC分析的結果，在該物質中含有青蟹肌糖99％、肌醇1％。
實施例6<以NAD+非依賴型肌醇2-脫氫酶活性為指標，從突變株中篩選中醋酸桿菌AB10253>
將含有1％酵母提取物(Difco公司制)、0.5％的葡萄糖的pH5.0的5ml液體培養(yǎng)基的試管滅菌，從斜面向其中接入一環(huán)醋酸桿菌AB102531，在27℃進行了16小時振蕩培養(yǎng)。將培養(yǎng)液2.5ml取出放到滅菌管中，進行3000×g的離心分離，收集菌體。棄上清，再度懸浮在2.5ml 200mM磷酸緩沖液(pH8.0)中，進行3000×g的離心分離，收集菌體。棄上清，再度懸浮在2.5ml 200mM磷酸緩沖液(pH8.0)中，其中，將2.0ml懸浮液裝入滅菌了的100ml容積的錐形燒瓶中，加入0.5ml的40％葡萄糖溶液、和7.5ml的200mM磷酸緩沖液(pH8.0)使之混合，向其中加入20μl的甲磺酸乙酯，在30℃進行45min振蕩培養(yǎng)。處理后，取出1ml混合物放到滅菌管中，進行3000×g的離心分離，收集菌體。棄上清，懸浮在200mM磷酸緩沖液(pH7.0)2.5ml中，進行3000×g的離心分離，收集菌體。棄上清，再度懸浮在200mM磷酸緩沖液(pH7.0)2.5ml中，得到誘變處理菌液。
其次，這些實施了誘變處理的醋酸桿菌AB10253，通過將含有3％肌醇、1％酵母提取物(Difco公司制)、0.5％的葡萄糖、1.5％瓊脂的pH5.0的培養(yǎng)基滅菌，在直徑9cm的培養(yǎng)皿中固化，在固化了的瓊脂培養(yǎng)基中每個培養(yǎng)皿涂布0.12ml誘變處理菌液，由此而接種，在27℃培養(yǎng)2天。通過該操作，活菌數(shù)減少至約1.6％。另外，每個培養(yǎng)皿形成了約95-125集落。
培養(yǎng)后，在形成于直徑9cm的培養(yǎng)皿中的集落之上緩慢注入10ml下述的溶液將由100mM磷酸緩沖液、1％肌醇、0.4％氧化型DCIP組成的組成液過濾滅菌，趁著熱向其中等量混合用高壓釜滅菌過的1％瓊脂，冷卻到36℃后以瓊脂不凝固的方式制備的粘稠的溶液。進行了這樣的處理的瓊脂培養(yǎng)基在27℃緩慢地冷卻，在形成于直徑9cm的培養(yǎng)皿中的集落之上以復層的形式固化。
處理后，將培養(yǎng)皿在27℃孵化，由此根據(jù)NAD+非依賴型肌醇2-脫氫酶活性的大小，在瓊脂培養(yǎng)基上在一面上緩慢地展開的氧化型DCIP的藍色，只在集落的周圍開始變得透明。此時，將較快地變得透明的地方的集落用滅菌了的針刮取，在新的培養(yǎng)基中傳代，經(jīng)初始選擇，可從總集落數(shù)2154集落中取得NAD+非依賴型肌醇2-脫氫酶活性高的菌株22株。
其次，作為二次選擇，在含有3％肌醇、1％酵母提取物(Difco公司制)、0.5％的葡萄糖的pH5.0的5ml滅菌液體培養(yǎng)基的試管中，分別導入形成了集落的上述22株菌。在27℃進行了3天振蕩培養(yǎng)后，將取出1ml培養(yǎng)液放入試驗管中，進行3000×g的離心分離，收集菌體。棄上清，向裝有菌體的試驗管中加入含有10％肌醇、50mM磷酸緩沖液(pH5.0)的溶液1ml，在27℃進行了4小時振蕩培養(yǎng)后，16000×g的離心分離，通過HPLC測定了從上清液所含的肌醇向青蟹肌糖的轉化率。另一方面，5ml培養(yǎng)液之中，取出0.5ml放入滅菌管中，進行3000×g的離心分離，棄上清，沉淀的菌體用水洗滌后，測定了NAD+非依賴型肌醇2-脫氫酶活性。
其結果，22株的突變株之中，與變異前的菌比，NAD+非依賴型肌醇2-脫氫酶活性增加至1.3倍以上的菌株有3株(系統(tǒng)No.E6-55、H2-68、B7-14)分別增加至1.6倍、2.2倍、2.8倍。另外，它們的從肌醇向青蟹肌糖的轉化率，分別增加至1.1倍、1.4倍、1.5倍，NAD+非依賴型肌醇2-脫氫酶活性為1.3倍以下的菌株的從肌醇向青蟹肌糖的轉化率，與變異前的菌同等。由此知道，以NAD+非依賴型肌醇2-脫氫酶活性為指標的篩選，與從肌醇向青蟹肌糖的轉化率的增加有相關性。
實施例7<使用變異菌株(B7-14)使肌醇向青蟹肌糖的轉化來制備青蟹肌糖>
在500ml容積的帶擋板的錐形燒瓶中加入10g肌醇、1g酵母提取物(FNI205；Lallemand BI公司制)、0.5g葡萄糖，溶解于水中并使之達到100ml，調至pH5.0，制備了20個(相當于2升肌醇200g(1.11mol))采用高壓釜滅菌過的培養(yǎng)基，從斜面向其中分別加入變異菌株(B7-14)1接種環(huán)，在27℃搖床培養(yǎng)3天。
培養(yǎng)后，離心分離培養(yǎng)液，得到的上清液，以每分鐘10ml的速度使溶解液在用500ml強酸性離子交換樹脂(Duolite C20、H+類型)裝滿的柱中通過，使得到的洗脫液在用900ml弱堿性離子交換樹脂(Duolite 368S、OH-類型)裝滿的柱中通過，再使得到的洗脫液在用50ml活性炭裝滿的柱中通過。濃縮得到的洗脫液，得到白色粉末162g(0.91mol)(收得率82％)。將該物質采用NMR和HPLC分析的結果，在該物質中含有青蟹肌糖91％、肌醇3％、鯊肌醇6％(青蟹肌糖純度91％)。
實施例8
<使用變異菌株(B7-14)的通過從肌醇向青蟹肌糖的轉化和化學還原來制備鯊肌醇>
在500ml容積的帶擋板的錐形燒瓶中加入10g肌醇、1g酵母提取物(FNI205；Lallemand BI公司制)、0.5g葡萄糖，溶解于水中并使之達到100ml，調至pH5.0，制備了20個(相當于2升肌醇200g(1.11mol))采用高壓釜滅菌過的培養(yǎng)基，從斜面向其中分別加入變異菌株(B7-14)1接種環(huán)，在27℃搖床培養(yǎng)3天。
培養(yǎng)后，以8000×g離心分離培養(yǎng)液，將得到的上清液約2升用5當量NaOH溶液調至pH7.5。邊攪拌邊向其中加入9.2g NaBH4，進行了還原反應。因反應熱，反應液的溫度上升至37℃。30min后，不溶物緩慢顯現(xiàn)，向其中加入1.2升的水，溶解了大部分的不溶物。過濾該溶液，去除了不溶物的液體，以每分鐘10ml的速度使溶解液在用500ml強酸性離子交換樹脂(Duolite C20、H+類型)裝滿的柱中通過，使得到的洗脫液在用900ml強堿性離子交換樹脂(A116、OH-類型)裝滿的柱中通過，再使得到的洗脫液在用300ml活性炭裝滿的柱中通過。濃縮得到的洗脫液，得到白色粉末145g。將該物質采用HPLC分析的結果，在該物質中含有鯊肌醇36％、肌醇64％。
將得到的白色粉末用水懸浮并達到470ml，加熱至70℃，充分溶解肌醇。邊攪拌邊冷卻到30℃，過濾白濁的溶液，收集了不溶物。不溶物用少量的水洗滌，干燥后，得到44.2g的粉末。將該物質采用HPLC分析的結果，在該物質中含有鯊肌醇98％、肌醇2％。進一步地，在得到的粉末中加入700ml的水，加熱至85℃，使之全部溶解，邊緩慢攪拌邊冷卻到30℃，向其中加入700ml乙醇。在室溫下放置一夜后，過濾并收集得到的晶體，干燥后，得到40.1g(222.8mmol)的晶體(收得率20％)。將晶體采用NMR和HPLC分析的結果，該物質是99.9％以上的純度的鯊肌醇。
實施例9<醋酸桿菌AB10281FERM BP-10119產(chǎn)生的鯊肌醇脫氫酶的純化>
將含有10.0％肌醇、1.0％酵母提取物、3升1.0％蔗糖的液體培養(yǎng)基使用1N NaOH調至pH7.0，向500ml容積的帶擋板的錐形燒瓶30個中分配注入各100ml，用高壓釜滅菌。向各個錐形燒瓶中接種醋酸桿菌AB10281FERM BP-10119的斜面培養(yǎng)物1接種環(huán)，在27℃使用搖床(180rpm)培養(yǎng)5天。培養(yǎng)后，向各個錐形燒瓶中各加入250ml水，用搖床攪拌1小時，溶解存在于培養(yǎng)液中的結晶性的鯊肌醇。收集該培養(yǎng)液，離心分離(8,000rpm 20min)，獲得菌體(濕重量75g)。
將該菌體懸浮于300ml的水中，在10℃以下用超聲波破碎。破碎溶液顯示出pH4.8，用1N NaOH將該溶液調至pH7.0后，通過離心分離(16,000rpm 20min)分離了上清液。接著，加入MgSO4使上清液達到2mM Mg2+，將溶液填充到Blue-Toyopearl柱(Tosoh公司制；20ml)中，然后使50ml添加了2mM Mg2+的20mM Tris緩沖液(pH7.0)洗柱。然后，使添加了1M KCl的20mM Tris緩沖液(pH7.0)50ml通過柱，使吸附蛋白質洗脫。接著，將洗脫液用超濾裝置(MW30000cut off)進行濃縮，在濃縮液中加入20mM Tris緩沖液(pH7.0)50ml，再度濃縮，得到脫鹽濃縮液。接著，將該脫鹽濃縮液填充到DEAE Toyopearl柱(Tosoh公司制；20ml)中，采用含有0mM-500mM NaCl的線性濃度梯度的20mM Tris緩沖液(pH7.0)洗脫，然后將洗脫液分級分離。測定每個級分溶液中的鯊肌醇脫氫酶活性，發(fā)現(xiàn)未吸附的級分(SIDH1)、用200mM NaCl洗脫的級分(SIDH2)、用300mM NaCl洗脫的級分(SIDH3)有活性。
對于活性測定，將5μl反應液(200mM Tris緩沖液(pH8.0)、2％NADPH、1％青蟹肌糖)和5μl酶液混合，在36℃反應30min后，立即加入500μl水，測定340nm的吸光度，從用水代替酶液的試驗液的空白值測定了340nm的吸光度的減少量。根據(jù)將酶液進行稀釋。
上述柱非吸附級分，進一步填充到CM Toyopearl柱(Tosoh公司制；20ml)中，然后采用含有0mM-500mM NaCl的線性濃度梯度的20mM Tris緩沖液(pH7.0)洗脫，然后將洗脫液分級分離。測定每個級分溶液中的鯊肌醇脫氫酶活性，結果發(fā)現(xiàn)未吸附的級分有活性。用200mM NaCl洗脫的級分、用300mM NaCl洗脫的級分分別通過再度超濾脫鹽，填充到DEAE Toyopearl柱(Tosoh公司制；20ml)中，采用含有200mM-300mM NaCl的線性濃度梯度的20mM Tris緩沖液(pH7.0)洗脫，然后將洗脫液分級分離，純化。進一步地將這3種具有鯊肌醇脫氫酶活性的酶液分別用超濾裝置濃縮，填充到凝膠過濾柱(Tosoh公司制；2000SWXL)中，然后使用添加了200mM NaCl的20mM磷酸緩沖液(pH7.0)對洗脫液進行純化。將純化的酶液進行平板凝膠SDS電泳，電泳后取出凝膠，用考馬斯亮藍染色液(RapidCBB KANTO關東化學公司制)染色后脫色，用光密度計(ATTO公司制)測定蛋白質的藍帶，從而測定了目的條帶的純度，各個級分的純度均為85％以上。
實施例10<純化大腸桿菌K12株ATCC10798產(chǎn)生的本發(fā)明酶、和N末端分析>
將3升含有0.5％L-山梨糖的LB肉湯培養(yǎng)基(1％細菌用胰蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl、pH7.0)向500ml容積的坂口燒瓶30個中分配注入各100ml，用高壓釜滅菌。在各個錐形燒瓶中接種大腸桿菌K12株的斜面培養(yǎng)物1接種環(huán)，在36℃使用往復式搖動器(135rpm)培養(yǎng)1天。培養(yǎng)后，收集培養(yǎng)液，離心分離(8,000rpm20min)，得到菌體(濕重量32g)。將該菌體懸浮在100ml水中，在10℃以下用超聲波破碎。破碎溶液顯示出pH6.8，用1N NaOH溶液將該溶液調至pH7.0后，通過離心分離(16,000rpm 20min)分離上清液。接著，加入MgSO4使上清液達到2mM Mg2+，將溶液填充到Blue-Toyopearl柱(Tosoh公司制；20ml)中，然后使50ml添加了2mMMg2+的20mM Tris緩沖液(pH7.0)洗柱。然后，使添加了1M KCl的20mM Tris緩沖液(pH7.0)50ml通過柱，使吸附蛋白質洗脫。接著，將洗脫液用超濾裝置(MW30000cut off)進行濃縮，在濃縮液中加入20mM Tris緩沖液(pH7.0)50ml，再度濃縮，得到脫鹽濃縮液。接著，將該脫鹽濃縮液填充到DEAE Toyopearl柱(Tosoh公司制；20ml)中，采用含有0mM-500mM NaCl的線性濃度梯度的20mM Tris緩沖液(pH7.0)洗脫，然后將洗脫液分級分離。測定各級分溶液中的鯊肌醇脫氫酶活性，結果用300mM NaCl洗脫的級分有活性。
活性測定，與在實施例9中敘述的方法相同，測定了340nm的吸光度的減少量。根據(jù)將酶液進行稀釋。
用300mM NaCl洗脫的級分再度用超濾裝置脫鹽，然后填充到DEAE Toyopearl柱(Tosoh公司制；20ml)中，采用含有250mM-350mM NaCl的線性濃度梯度的20mM Tris緩沖液(pH7.0)洗脫，進行3次將洗脫液分級分離的操作，從而去除雜質蛋白質進行純化。進一步地，將該具有鯊肌醇脫氫酶活性的酶液分別用超濾裝置濃縮，填充到凝膠過濾柱(Tosoh公司制；2000SWXL)中，然后使用添加了200mM NaCl的20mM磷酸緩沖液(pH7.0)對洗脫液進行純化。
將純化的酶液進行平板凝膠SDS電泳，然后取出凝膠，用半干電子繪圖儀將蛋白轉移至大小與凝膠相同的PVDF膜(Immobilon PSQMillipore公司制)，取出該PVDF膜，用考馬斯亮藍染色液(Rapid CBBKANTO關東化學公司制)染色后脫色，用與在實施例9中記述的方法同樣，用光密度計測定純度，結果純度為40％。進一步地，為了去除在前后存在的不需要的蛋白質，切除相應的蛋白質部分，得到純度高的本發(fā)明酶。
然后，利用N末端氨基酸分析裝置(Hewlett Packard)對在PVDF膜上的純度高的本發(fā)明酶進行分析。其結果檢測出絲氨酸-天冬氨酸-天冬酰胺-異亮氨酸-精氨酸的序列，在大腸桿菌全部堿基序列數(shù)據(jù)庫中(數(shù)據(jù)庫名“Colibri”)檢索編碼具有上述序列的蛋白質的DNA，結果ydgJ基因(或者b1624基因)匹配。預測該基因產(chǎn)物是氧化還原酶的一種，但底物、產(chǎn)物是未知的。
實施例11<來源于大腸桿菌K12株ATCC10798的本發(fā)明DNA的分離和表達>
為了獲得認為編碼本發(fā)明的酶的ydgJ基因，首先如以下所示提取了作為模板的大腸桿菌K12株的全基因組。向100mlLB燒瓶培養(yǎng)基(1％細菌用胰蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl、pH7.0)中接種一環(huán)在LB斜面培養(yǎng)基(1％細菌用胰蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl、pH7.0、1.5％瓊脂)中培養(yǎng)的大腸桿菌K12株，在36℃需氧培養(yǎng)8小時，收集菌體。向所得的菌體中加入15ml的Saline-EDTA溶液(0.15M NaCl、0.1M EDTA、pH8.0)和50mg溶菌酶，懸浮，在37℃作用2小時。處理后，向該溶液中加入25％SDS溶液0.5ml，使菌體細胞完全溶解，加入3ml苯酚，使蛋白質變性后，離心分離，取上清，向該溶液中加入20ml的2-丙醇，使粗基因組DNA析出。離心分離出的粗基因組DNA，棄上清，在減壓下干燥。干燥了的粗基因組DNA再溶解于3ml TE液(10mM Tris-HCl、1mM EDTA、pH8.0)中后，加入0.01mg的RNAase，在36℃反應2小時，降解RNA。進一步地加入0.01mg的蛋白酶K，在36℃反應2小時，使蛋白質降解。接著，加入1ml的苯酚-氯仿(1∶1)混合液，緩慢地攪拌，使RNAase和蛋白酶K變性，離心分離成2相，取上層水相，向其中加入3M醋酸鈉溶液0.3ml，調至pH5.2。向其中加入3ml的2-丙醇，使基因組DNA析出。離心分離基因組DNA，使之沉淀，棄上清后，在減壓下干燥。干燥了的基因組DNA溶解于3ml TE液中，從向其中加入1ml的苯酚-氯仿(1∶1)混合液的操作到使之溶解于3ml TE液中的過程再度重復進行，進行離心分離，同樣在pH5.2下向上清液加入等量的2-丙醇，由此制備出大腸桿菌K12株的基因組DNA溶液。將所得的基因組DNA作為用于PCR反應的模板DNA溶液。
為了克隆來源于大腸桿菌K12株的包含ydgJ基因的核糖體結合位點(RBS)的片段，且為了作為重組酶表達，利用具有以下序列的引物進行了PCR反應。
序列號15ydgj-F 5’-catteaagcttaatgagaggcaatgacatgagcg-3’序列號16ydgj-R 5’-tcggaattcttcatgcaaggcacaaagtcgc-3’PCR反應使用寶酒造公司的Ex taq反應液，該溶液的組成為Takara ExTaq Buffer×10倍液5μl、dNTP混合物4μl、模板DNA30ng、10μM引物溶液各1μl、Takara ExTaq 0.5μl，加入水達到50μl，并覆蓋30μl的礦物油。反應條件，使用PCR擴增裝置(ASTEC公司制PC-700)，變性(94℃，30秒)、退火(55℃，1min)、延伸(72℃，1min)這3步的反應重復進行了35次。通過上述的PCR反應，擴增了約1.0kbp大小的DNA片段。反應后，重復3次用0.3ml己烷提取覆蓋的礦物油，并去除己烷層的操作，通過減壓1min，去除了礦物油。從所得的反應液50μl使用GENECLEAN(Bio101公司制)純化了PCR片段。即，加入300μl試劑盒中的NaI溶液并混合，加入10μl玻璃珠溶液并混合，在4℃靜置15min后，離心分離，使吸附了DNA片段的玻璃珠沉淀，去除上清液。進一步地加入試劑盒中的New wash溶液500μl，使玻璃珠懸浮，離心分離，去除上清液。采用該New wash溶液進行的洗滌操作重復了3次。接著，在減壓下干燥玻璃珠，干燥后，加入15μl滅菌水懸浮，在55℃加溫15min后進行離心分離，得到含有DNA片段的上清液12μl。
將純化的DNA片段導入表達載體中的操作象以下那樣進行。即，向DNA片段溶液10μl中加入表達用質粒(pUC119寶酒造公司制)0.5μg、寶酒造公司的限制酶HindIII和EcoRI各1μl、寶酒造公司的限制酶用緩沖液K buffer×10倍液2μl，加入滅菌水以便達到20μl并混合。將該反應液在36℃反應2小時。限制酶反應后，使用GENECLEAN分離DNA片段和表達載體，使它們連接。即，向限制酶反應液20μl中加入試劑盒中的NaI溶液300μl并混合，加入10μl玻璃珠溶液并混合，在4℃靜置15min后，離心分離，使吸附DNA片段和表達載體的玻璃珠沉淀，去除上清液。進一步地加入試劑盒中的New wash溶液500μl，使玻璃珠懸浮，離心分離，去除上清液。采用該New wash溶液進行的洗滌操作重復3次。接著，在減壓下干燥玻璃珠，干燥后，加入15μl滅菌水懸浮，在55℃加溫15min后進行離心分離，得到含有DNA片段和表達載體的上清液12μl。通過該操作，由限制酶產(chǎn)生的約50bp以下的小的DNA片段被去除，得到了目的DNA片段、和表達載體。
向這樣制備的溶液10μl中加入Takara Ligation kit-I溶液(寶酒造公司制)10μl，在16℃反應1小時。該溶液用于轉化感受態(tài)細胞(寶酒造公司DH5α)。即，向60μl在4℃解凍的感受態(tài)細胞溶液中加入5μl連接反應溶液并混合，進行0℃×30min的處理后，進行42℃×45秒和0℃×2min的處理，向其中加入500μl SOC溶液(2％細菌用胰蛋白胨、0.5％酵母提取物、10mM NaCl、20mM葡萄糖、10mM MgSO4、10mM MgCl2)，在36℃恢復培養(yǎng)1小時，將100μl該培養(yǎng)液涂布在含有50μg/ml氨芐青霉素、40μg/ml X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)、1mM IPTG(異丙基硫代-β-D-半乳糖苷)的LB瓊脂培養(yǎng)基(1％細菌用胰蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl、pH7.0、1.5％瓊脂)上。進而在37℃培養(yǎng)16小時。通過該培養(yǎng)，篩選白色的集落得到通過上述的質粒的引入而轉化的大腸桿菌。在含有氨芐青霉素(50μg/ml)的Lb液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)這樣分離的轉化大腸桿菌集落。從增殖的轉化大腸桿菌的菌體利用質粒純化試劑盒(QiA filter PlasmidMidi Kit，QIAGEN公司)分離和純化質粒DNA。證實了所得的質粒DNA具有與目的ydgJ基因相當?shù)募s1.0kbp的DNA片段。
其次，為了確認鯊肌醇脫氫酶活性，將作為集落而分離的菌株移植到含有50μg/ml氨芐青霉素的100ml LB培養(yǎng)基(1％細菌用胰蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl、pH7.0)中，在36℃培養(yǎng)7小時，向該培養(yǎng)液中加入200Mm IPTG溶液0.3ml，進一步在36℃培養(yǎng)3小時。培養(yǎng)結束后，通過離心分離收集菌體，用生理鹽水將其洗滌1次。進而將洗滌菌體懸浮在0.6％Triton-X100溶液3ml中，在4℃利用超聲波將菌破碎。離心分離該溶液，取出上清的酶液2.8ml，向上清加入1.2g硫酸銨，在4℃使蛋白質鹽析。通過離心分離(15,000rpm、20min)收集鹽析了的蛋白質，去除上清，使該沉淀物溶解于2.5ml的20mM Tris緩沖液(pH7.0)中，再度進行離心分離(15,000rpm、20min)，將上清應用到用20mM Tris緩沖液(pH7.0)平衡化的Shephadex G-25柱(Pharmacia K.K14ml)中，用20mM Tris緩沖液(pH7.0)洗脫，進行了脫鹽。通過該操作，得到了ydgJ基因產(chǎn)物的粗酶液3.5ml。
鯊肌醇脫氫酶的活性測定，混合反應液(200mM Tris緩沖液pH8.0、2％NADPH、1％青蟹肌糖)5μl、和5μl酶液，在36℃反應30min后，立即加入500μl的水，測定340nm的吸光度，測定用水代替酶液的試驗液的空白值在340nm的吸光度的減少量。根據(jù)將酶液進行稀釋。
另外，酶反應產(chǎn)物的測定如下述在含有青蟹肌糖10mg、NADPH40mg、1.0ml 10U相當?shù)拿傅?00mM Tris緩沖液(pH8.0)中在36℃反應4小時后，進行80℃×10min的加熱處理，冷卻后，加入強堿性陽離子交換樹脂100μl、強酸性陰離子交換樹脂100μl、活性炭10mg并攪拌，離心分離后，將上清稀釋2倍，采用HPLC(Shodex AsahipakNH2P-50 4E Φ4.6×250mmShodex公司制)，在柱溫度40℃、流動相流速1.5ml(80％乙腈)的條件下用RI檢測器測定。其結果，ydgJ基因產(chǎn)物顯示出高的鯊肌醇脫氫酶活性，該產(chǎn)物是100％還原成鯊肌醇的產(chǎn)物，作為異構體的肌醇未檢測出。作為結果，證實了來源于ydgJ基因產(chǎn)物的重組酶溶液具有高的鯊肌醇脫氫酶活性，該基因產(chǎn)物是鯊肌醇脫氫酶。另外，來自青蟹肌糖的還原反應物只檢測出鯊肌醇，是立體特異地還原成鯊肌醇的酶。另外，ydgJ基因的序列如SEQ.ID.NO1所示，相應的氨基酸序列如SEQ.ID.NO2所示。
實施例12
<從大腸桿菌ydgJ基因的同源性推定的同源DNA的分離和表達、以及其各種性質>
從大腸桿菌ydgJ基因產(chǎn)物的氨基酸序列推定三維結構，推定屬于葡萄糖-果糖氧化還原酶家族。在該家族中也包括肌醇2-脫氫酶(EC1.1.1.18)，表明了氨基酸序列之中，與NAD結合有關的序列其同源性高。而且，由葡萄糖-果糖氧化還原酶的X射線結構分析，鑒定了與底物結合有關的部位的氨基酸序列，檢索具有部分地相同的氨基酸序列、并與ydgJ基因產(chǎn)物同源的蛋白質，結果表明，無論革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌，在許多的細菌中具有同源的蛋白質。
從這些細菌之中檢索由大腸桿菌ydgJ基因的同源性推定的同源DNA，結果發(fā)現(xiàn)關于根癌土壤桿菌C58 ATCC33970(Agrobacteriumtumefacience C58 ATCC33970)基因組中的Atu4375基因、Atu3234基因、枯草芽孢桿菌168 ATCC23857(Bacillus subtilis 168ATCC23857)基因組中的BG14057基因、野油菜黃單胞菌野油菜致病變種ATCC33913(Xanthomonas campestris pv.campestrisATCC33913)基因組中的Xcc3438基因、以及具有從肌醇直接轉化成鯊肌醇的能力的微生物的土壤桿菌AB10121FERM P-17383(Agrobacterium sp.AB10121 FERM P-17383)基因組中的Atu4375基因、Atu3234基因與大腸桿菌ydgJ基因具有同源性。因此，進行了各自的DNA的分離和表達。
為了獲得上述備選DNA，如以下所示地提取了作為模板的根癌土壤桿菌C58 ATCC33970、枯草芽孢桿菌168 ATCC23857、野油菜黃單胞菌野油菜致病變種ATCC33913、及土壤桿菌AB10121FERM P-17383的全基因組。將LB斜面培養(yǎng)基(1％細菌用胰蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl、pH7.0、1.5％瓊脂)中培養(yǎng)的根癌土壤桿菌C58、野油菜黃單胞菌野油菜致病變種、及土壤桿菌AB10121各一環(huán)接種于100ml LB燒瓶培養(yǎng)基(1％細菌用胰蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl、pH7.0)中LB斜面培養(yǎng)基(1％細菌用胰蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl、pH7.0、1.5％瓊脂)中培養(yǎng)的根癌土壤桿菌C58、野油菜黃單胞菌野油菜致病變種、及土壤桿菌AB10121，在27℃需氧培養(yǎng)18小時，收集菌體。向所得的菌體中加入15ml的Saline-EDTA溶液(0.15M NaCl、0.1M EDTA、pH8.0)和50mg溶菌酶，懸浮，在37℃作用2小時。處理后，向該溶液中加入25％SDS溶液0.5ml，使菌體細胞完全溶解，加入3ml苯酚，使蛋白質變性后，離心分離，取上清，向該溶液中加入20ml的2-丙醇，使粗基因組DNA析出。離心分離出的粗基因組DNA，棄上清，在減壓下干燥。干燥了的粗基因組DNA再溶解于3ml TE液(10mM Tris-HCl、1mM EDTA、pH8.0)中后，加入0.01mg的RNAase，在36℃反應2小時，降解RNA。進一步加入0.01mg的蛋白酶K，在36℃反應2小時，使蛋白質降解。接著，加入1ml的苯酚-氯仿(1∶1)混合液，緩慢地攪拌，使RNAase和蛋白酶K變性，離心分離成2相，取上層水相，向其中加入3M醋酸鈉溶液0.3ml，調至pH5.2。向其中加入3ml的2-丙醇，使基因組DNA析出。離心分分離出的基因組DNA，使之沉淀，除掉上清液之后，在減壓下干燥。干燥了的基因組DNA溶解于3ml TE液中，從向其中加入1ml的苯酚-氯仿(1∶1)混合液重復進行純化直至使之再次溶解于3ml TE液中，進行離心分離，同樣在pH5.2下向上清液加入等量的2-丙醇，分別制備了根癌土壤桿菌C58、野油菜黃單胞菌野油菜致病變種、及土壤桿菌AB10121的基因組DNA溶液。將所得的基因組DNA作為用于PCR反應的模板DNA溶液。
對于枯草芽孢桿菌168 ATCC23857，向100mlLB燒瓶培養(yǎng)基(1％細菌用胰蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl、pH7.0)中接種1接種環(huán)在LB斜面培養(yǎng)基(1％細菌用胰蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl、pH7.0、1.5％瓊脂)中培養(yǎng)的枯草芽孢桿菌168，在36℃需氧培養(yǎng)18小時，進而取1ml加入到同樣制備的LB燒瓶培養(yǎng)基100ml中，培養(yǎng)4小時，收集菌體。集菌后的全基因組的提取方法，與土壤桿菌所用的方法同樣。
其次，為了克隆根癌土壤桿菌C58基因組中的Atu4375基因、Atu3234基因、土壤桿菌AB10121基因組中的Atu4375基因、Atu3234基因、野油菜黃單胞菌野油菜致病變種基因組中的Xcc3438基因的全部包含RBS、作為重組酶表達，使用具有下述序列的引物進行了PCR反應。
序列號17Atu4375-F 5’-ggcggatcctttgaaagggatagtcatgtcct-3’序列號18Atu4375-R 5’-attggaagcttcgattggctgcgacctag-3’序列號19Atu3234-F 5’-ttgggatcctttcaggggaaatattatggc-3’序列號20Atu3234-R 5’-gccgcaagcttgttttacagcttcac-3’序列號23Xcc3438-F 5’-tcggaattcgcgttgcggtgaatcgttttcaatg-3’序列號24Xcc3438-R 5’-ataagaagcttgctcagtcgctgctgttgccttc-3’為了克隆枯草芽孢桿菌168基因組中包括RBS的BG14057基因的克隆、作為重組酶表達，使用具有下述序列的引物進行了PCR反應。但是，從5’末端開始第10位上的a本來是t，但為了在大腸桿菌中表達而變更成a。
序列號21BG 14057-F 5’-aggaattcgatgataacgcttttaaaggggagaa-3’序列號19Atu3234-F 5’-ttgggatcctttcaggggaaatattatggc-3’序列號20Atu3234-R 5’-gccgcaagcttgttttacagcttcac-3’序列號23Xcc3438-F 5’-tcggaattcgcgttgcggtgaatcgttttcaatg-3’序列號24Xcc3438-R 5’-ataagaagcttgctcagtcgctgctgttgccttc-3’為了克隆枯草芽孢桿菌168基因組中包括RBS的BG14057基因的克隆、作為重組酶表達，使用具有下述序列的引物進行了PCR反應。但是，從5’末端開始第10位上的a本來是t，但為了在大腸桿菌中表達而變更成a。
序列號21BG14057-F 5’-aggaattcgatgataacgcttttaaaggggagaa-3’序列號22BG14057-R 5’-tttctgcagtttagtgctccagcataatggttcg-3’PCR反應使用寶酒造公司的Ex taq反應液，該溶液的組成為Takara ExTaq Buffer×10倍液5μl、dNTP混合物4μl、模板DNA30ng、10μM引物溶液 1μl、Takara ExTaq 0.5μl，加入水達到50μl，并覆蓋30μl的礦物油。反應條件，使用PCR擴增裝置(ASTEC公司制PC-700)，變性(94℃，30秒)、退火(52℃、55℃或58℃(參照表3)，1min)、延伸(72℃，1min)這3步的反應重復進行了35次。通過上述的PCR反應，擴增了約1.1kbp大小的DNA片段。
表3退火溫度一覽

反應后，重復3次用0.3ml己烷提取覆蓋的礦物油，并去除己烷層的操作，通過減壓1min，去除了礦物油。從所得的反應液50μl使用GENECLEAN(Bio101公司制)純化了PCR片段。即，加入300ul試劑盒中的NaI溶液并混合，加入10μl玻璃珠溶液并混合，在4℃靜置15min后，離心分離，使吸附DNA片段的玻璃珠沉淀，去除上清液。進一步地加入試劑盒中的New wash溶液500μl，使玻璃珠懸浮，離心分離，去除上清液。采用該New wash溶液進行的洗滌操作重復了3次。接著，在減壓下干燥玻璃珠，干燥后，加入15μl滅菌水懸浮，在55℃加溫15分后進行離心分離，得到含有DNA片段的上清液12μl。
將純化的DNA片段導入表達載體中的操作分別在以下所示的組合下進行。即，向DNA片段溶液10μl中加入表達用質粒(pUC118寶酒造公司制)0.5μg、寶酒造公司的限制酶2種各1μl、寶酒造公司的限制酶用緩沖液buffer×10倍液2μl，加入滅菌水以便達到20μl并混合。將該反應液在36℃反應2小時。因為AB10121的Atu3234基因具有HindIII位點，因此不用限制酶處理，分離后使之與pT7Blue載體(Novagen公司制)連接。
表4表達用質粒、使用的限制酶一覽

限制酶反應后，使用GENECLEAN分離DNA片段和表達載體，使它們連接。即，向限制酶反應液20μl中加入試劑盒中的NaI溶液300μl并混合，加入10μl玻璃珠溶液并混合，在4℃靜置15min后，離心分離，使吸附DNA片段和表達載體的玻璃珠沉淀，去除上清液。進一步地加入試劑盒中的New wash溶液500μl，使玻璃珠懸浮，離心分離，去除上清液。采用該New wash溶液進行的洗滌操作重復了3次。接著，在減壓下干燥玻璃珠，干燥后，加入15μl滅菌水懸浮，在55℃加溫15min后進行離心分離，得到含有DNA片段和表達載體的上清液12μl。通過該操作，由限制酶產(chǎn)生的約50bp以下的小的DNA片段被去除，得到了目的的DNA片段、和表達載體。％瓊脂)上。進而在37℃培養(yǎng)16小時。通過該培養(yǎng)，篩選白色的集落得到通過上述的質粒的引入而轉化的大腸桿菌，因此將其選擇。在含有氨芐青霉素(50μg/ml)的Lb液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)這樣分離的轉化大腸桿菌集落。從增殖的轉化大腸桿菌的菌體利用質粒純化試劑盒(QiA filter Plasmid Midi Kit，QIAGEN公司)分離和純化質粒DNA。證實了所得的質粒DNA分別具有與目的ydgJ基因相當?shù)募s1.0-1.1kbp的DNA片段。
其次，為了確認鯊肌醇脫氫酶活性，將作為集落而分離的菌株移植到含有50μg/ml氨芐青霉素的100ml LB培養(yǎng)基(1％細菌用胰蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl、pH7.0)中，在36℃培養(yǎng)7小時，向該培養(yǎng)液中加入200mMIPTG溶液0.3ml，進一步在36℃培養(yǎng)3小時。培養(yǎng)結束后，通過離心分離收集菌體，用生理鹽水將其洗滌1次。進而將洗滌菌體懸浮在0.6％Triton-X100溶液3ml中，在4℃利用超聲波將菌破碎。離心分離該溶液，取出上清的酶液2.8ml，向上清加入1.2g硫酸銨，在4℃使蛋白質鹽析。通過離心分離收集鹽析了的蛋白質，去除上清，使該沉淀物溶解于2.5ml的20mM Tris緩沖液(pH7.0)中，再度進行離心分離，將上清應用到用20mM Tris緩沖液(pH7.0)平衡化的Shephadex G-25柱(Pharmacia K.K14ml)中，用20mM Tris緩沖液(pH7.0)洗脫，進行了脫鹽。通過該操作，得到了各自的基因產(chǎn)物的粗酶液3.5ml。
鯊肌醇脫氫酶的活性測定如下述混合反應液(200mM Tris緩沖液pH8.0、2％NADPH、1％青蟹肌糖)5μl、和5μl酶液，在36℃反應30min后，立即加入500μl的水，測定340nm的吸光度，測定用水代替酶液的試驗液的空白值在340nm的吸光度的減少量。根據(jù)將酶液進行稀釋。
另外，酶反應產(chǎn)物的測定如下述在含有青蟹肌糖10mg、NADPH40mg、1.0ml 10U相當?shù)拿傅?00mM Tris緩沖液(pH8.0)中在36℃反應4小時后，進行80℃×10min的加熱處理，冷卻后，加入強堿性陽離子交換樹脂100μl、強酸性陰離子交換樹脂100μl、活性炭10mg并攪拌，離心分離后，將上清稀釋2倍，采用HPLC(Shodex AsahipakNH2P-50 4E Φ4.6×250mmShodex公司制)，在柱溫度40℃、流動相流速1.5ml(80％乙腈)的條件下用RI檢測器測定。其結果，來源于根癌土壤桿菌C58的Atu4375基因產(chǎn)物和Atu3234的基因產(chǎn)物、枯草芽孢桿菌168的BG14057基因產(chǎn)物，野油菜黃單胞菌野油菜致病變種的Xcc3438基因產(chǎn)物以及AB10121的Atu4375基因和Atu3234的基因產(chǎn)物顯示高酶活性，其產(chǎn)物100％是還原反應獲得的鯊肌醇，未檢測到肌醇異構體。結果發(fā)現(xiàn)，源于上述基因的重組酶具有高鯊肌醇脫氫酶活性，基因產(chǎn)物是鯊肌醇脫氫酶。青蟹肌糖還原反應產(chǎn)物只檢測到鯊肌醇，檢測到所述的酶將青蟹肌糖立體異構地還原成鯊肌醇。
來源于根癌土壤桿菌C58的Atu4375基因序列如SEQ.ID.NO3所示，相應的氨基酸序列如SEQ.ID.NO4號所示，Atu3234基因序列如SEQ.ID.NO5所示，相應的氨基酸序列如SEQ.ID.NO6上。另外，來源于枯草芽孢桿菌168的BG14057基因序列如SEQ.ID.NO7所示，相應的氨基酸序列如SEQ.ID.NO8號所示，來源于AB10121的Atu4375基因序列如SEQ.ID.NO9所示，相應的氨基酸序列如在SEQ.ID.NO10所示，Atu3234基因序列如SEQ.ID.NO11所示，相應的氨基酸序列如SEQ.ID.NO12號所示，來源于野油菜黃單胞菌野油菜致病變種的Xcc3438基因序列如SEQ.ID.NO13所示，相應的氨基酸序列如SEQ.ID.NO14號上。另外，包含AB10121的Atu4375基因、和Atu3234基因的質粒的堿基序列(北海道系統(tǒng)科學公司)分析的結果，根癌土壤桿菌C58的Atu4375基因、和AB10121的Atu4375基因，其堿基序列上的同源性為89％，氨基酸序列上的同源性為96％，根癌土壤桿菌C58的Atu3234基因、和AB10121的Atu3234基因的堿基序列上的同源性為87％，氨基酸序列上的同源性為95％。
實施例13<編碼醋酸桿菌AB10281FERM BP-10119產(chǎn)生的SIDH1的DNA的分離>
所純化的酶之中，使含有SIDH1的酶液通過PVDF膜(ImmobilonPSQMillipore公司制)，吸附于PVDF膜上。取出該PVDF膜，用考馬斯亮藍染色液(Rapid CBB KANTO關東化學公司制)染色后脫色，干燥后，利用N末端氨基酸分析裝置(hewlett Packard)進行了分析。其結果，從N末端檢測出Met-Lys-Arg-Lys-Leu-Arg-Ile-Gly-Leu-Ile-Gly-Ser-Gly-Phe-Met-Gly-Arg-Thr-His-Ala-Phe-Gly-Tyr-Ser序列，設想編碼該氨基酸序列的DNA序列，制備了以下2種的引物。
序列號29SIDH1-F1 atgaarcgnaarytncgiatyggyytiatygg序列號30SIDH1-F2 ggyttyatgggycgnacicaygcittyggyta其次，以在實施例10-12中得到的各種鯊肌醇脫氫酶的堿基序列為基礎，制備了包含序列內(nèi)部的高度保守的區(qū)域的下述2種引物。
序列號31SIDH1-B1 ggyttrtcrmmgayracrtgrstrcc序列號32SIDH1-B2 artgwrirtgrttgggigt另外，作為模板的AB10281的基因組DNA，以在實施例9中制備的菌體片(濕重量約400mg)為對象，采用與在實施例12中記載的DNA制備方法同樣的方法制備了AB10281的基因組DNA溶液。
PCR反應使用寶酒造公司的Ex taq反應液，該溶液的組成為Takara ExTaq Buffer×10倍液5μl、dNTP混合物4μl、模板DNA30ng、10μM引物溶液 1μl(SIDH1-F1、和SIDH1-B1)、Takara ExTaq0.5μl，加入水達到50μl，并覆蓋30μl的礦物油。反應條件，使用PCR擴增裝置(ASTEC公司制PC-700)，變性(94℃，30秒)、退火(50℃，30秒)、延伸(72℃，1min)這3步的反應重復進行了35次。證實了通過上述的PCR反應，在電泳后，擴增了約0.3kbp大小的DNA片段。進而從凝膠切取該0.3kbp的條帶，將凝膠破碎溶液的一部分作為模板(2μl)，使引物的組合為SIDH1-F2和SIDH1-B2，除此以外以同樣的PCR反應液組成制備反應液，反應條件，使用PCR擴增裝置(ASTEC公司制PC-700)，變性(94℃，30秒)、退火(46℃，30秒)、延伸(72℃，1min)這3步的反應重復進行了35次。證實了通過上述的PCR反應，在電泳后，擴增了約0.25kbp大小的DNA片段。
約0.25kbp大小的DNA片段，從凝膠切取該部分，使用GENECLEAN(Bio101公司制)純化了PCR片段。即，除了使凝膠溶解于NaI溶液以外，采用與在實施例12中記載的純化方法同樣的方法得到了DNA片段溶液12μl。
其次，使純化的DNA片段與pT7Blue載體連接。即，向DNA片段溶液10μl中加入pT7Blue載體0.5μg、Takara Ligation kit-I溶液(寶酒造公司制)10μl，在16℃反應1小時。用該溶液轉化感受態(tài)細胞(寶酒造公司DH5α)。轉化操作、和來自轉化的質粒的分離采用與實施例12同樣的方法進行。
將得到的質粒使用通用引物(R-20mer和U-19mer)進行堿基序列分析(北海道系統(tǒng)科學公司)，結果，編碼該酶的基因的堿基序列的前半部分約1/3得以明確。
而且，為了確定完全長的堿基序列，用限制酶BamHI完全消化AB10281的基因組DNA，將得到的DNA片段溶液使用GENECLEAN(Bio101公司制)純化，然后使片段自連，將10μl寶生物公司Ligationkit-I溶液加入10μlDNA片段溶液中，使混合物在16℃反應1小時，反應后用GENECLEAN(Bio101公司制)純化該DNA，形成用于反向PCR的模板DNA溶液。
接著，以明確了的前半部分約1/3的堿基序列為基礎，制備下述3種引物，進行了反向PCR反應。
序列號33SIDH1-INV-F gctcgtcaacgatcctgaaattgat序列號34SIDH1-INV-B ttcgctgcagcttcatcggaaatat序列號35SIDH1-INVF3 cccttcaatttccgggcgggt反向PCR反應使用寶酒造公司的Ex taq反應液，該溶液的組成為Takara ExTaq Buffer×10倍液5μl、dNTP混合物4μl、模板DNA30ng、10μM引物溶液 1μl(SIDH1-INV-F和SIDH1-INV-B的組合、SIDH1-INV-F和SIDH1-INV3的組合)、Takara ExTaq 0.5μl，加入水達到50μl，并覆蓋30μl的礦物油。反應條件，使用PCR擴增裝置(ASTEC公司制PC-700)，變性(94℃，30秒)、退火(50℃，1min)、延伸(72℃，2min)這3步的反應重復進行了35次。通過上述的PCR反應，在電泳后，擴增了約2.7kbp、和約1.8kbp大小的DNA片段。從凝膠切取該約2.7kbp、和約1.8kbp的條帶，使用GENECLEAN(Bio101公司制)純化了PCR片段，得到DNA片段溶液10μl。對于得到的2種DNA片段，使用在PCR中使用的引物進行堿基序列分析(北海道系統(tǒng)科學公司)，確定了編碼該酶的基因的全部堿基序列。
接著，為了克隆包含RBS位點的AB10281的SIDH1基因、作為重組酶而表達，使用具有以下序列的引物進行了PCR反應。
序列號36281SIDH1-F gctggatcccgcccttattgtgaata序列號37281SIDH1-R tatgaattcgttatgccttctcatgctgtcgPCR反應使用寶酒造公司的Ex taq反應液，該溶液的組成為Takara ExTaq Buffer×10倍液5μl、dNTP混合物4μl、模板DNA30ng、10μM引物溶液 1μl、Takara ExTaq 0.5μl，加入水達到50μl，并覆蓋30μl的礦物油.反應條件，使用PCR擴增裝置(ASTEC公司制PC-700)，變性(94℃，30秒)、退火(55℃，1min)、延伸(72℃，1min)這3步的反應重復進行了35次。通過上述的PCR反應，擴增了約1.2kbp大小的DNA片段。
約1.2kbp大小的DNA片段，使用GENECLEAN(Bio101公司制)純化，得到了DNA片段溶液12μl。將該DNA片段導入表達載體中的操作如下述向DNA片段溶液10μl中加入表達用質粒0.5μg(pUC119)、寶酒造公司的限制酶(BamHI和EcoRI)各1μl、寶酒造公司的限制酶用緩沖液K buffer×10倍液2μl，加入滅菌水以便達到20μl并混合。將該反應液在36℃反應2小時。
采用與實施例12同樣的方法進行從反應溶液回收、純化DNA片段、連接反應、以及向感受態(tài)細胞(寶酒造公司DH5α)轉化。而且，用于確認鯊肌醇脫氫酶活性的、酶的表達、和活性測定方法也采用與實施例12同樣的方法進行，證實了該基因產(chǎn)物是鯊肌醇脫氫酶。
作為結果，編碼AB10281FERM BP-10119產(chǎn)出的SIDH1的基因的堿基序列如SEQ.ID.NO27所示，另外，其氨基酸序列如SEQ.ID.NO28所示。
實施例14<作為本發(fā)明酶的各種鯊肌醇脫氫酶的各種性質的研討>
用以下所示的方法研討通過實施例9的純化而得到的來源于AB10281的SIDH1、SIDH2、SIDH3、和作為實施例11的重組酶而得到的來源于大腸桿菌的ydgJ基因產(chǎn)物、和作為實施例12的重組酶而得到的根癌土壤桿菌C58的Atu4375基因產(chǎn)物、野油菜黃單胞菌野油菜致病變種的Xcc3438基因產(chǎn)物、以及AB10121的Atu4375基因產(chǎn)物、Atu3234基因產(chǎn)物的作為酶的各種性質，表5記載了其結果。
另外，表6是表示氨基酸序列的同源性的表，在全部序列中只有共同的氨基酸的同源性為低(約5％)，但表明當連具有相似性質的氨基酸，特別是N末端的前半部分約30％的NAD或NADP結合范圍，其同源性高。而且，與NAD或NADP的氧化還原部位即煙酰胺的鍵有關的靠序列中央前半的賴氨酸-脯氨酸序列高度保守。從賴氨酸-脯氨酸序列到C末端側第27位的天冬酰胺、和在序列中央附近的天冬氨酸-(3-氨基酸)-組氨酸序列也高度保守，由推定三維結構認為是與底物結合有關的重要的序列。表中，共通的序列用“*”號表示，性質相似的氨基酸用“”或“.”號表示，而且，賴氨酸-脯氨酸序列、從賴氨酸-脯氨酸序列到C末端側第27位的天冬酰胺、在序列中央附近的天冬氨酸-(3-氨基酸)-組氨酸序列用陰影線標識出。
在分子量的比較中，來源于AB10281的本發(fā)明酶，從以分子量標記(預先染色·標本(寬圍類型)Bio-Rad公司制)為指標的SDS-PAGE的結果算出分子量，其他的本發(fā)明酶的分子量，從基因的全長算出推定的酶分子量。其結果，由酶純化而得到的來源于AB10281的本發(fā)明酶SIDH1、SIDH2、SIDH3的分子量，分別是46k道爾頓、42k道爾頓、40k道爾頓。另外，作為實施例11的重組酶而得到的源于來源于大腸桿菌K-12的ydgJ基因的本發(fā)明酶的分子量是38.2道爾頓，作為實施例12的重組酶而得到的源于來源于根癌土壤桿菌C58的Atu4375基因、Atu3234基因的本發(fā)明酶的分子量分別是41.3道爾頓、42.4道爾頓，來源于枯草芽孢桿菌168的BG14057基因、野油菜黃單胞菌野油菜致病變種的Xcc3438基因、以及AB10121的Atu4375基因、Atu3234基因的本發(fā)明酶的分子量分別是40.1道爾頓、38.5道爾頓、41.4道爾頓、42.5道爾頓。也就是說，表明了作為本發(fā)明酶的各種鯊肌醇脫氫酶，顯示出38-46k道爾頓的分子量。
本發(fā)明酶的締合特性，如下述那樣測定測定用凝膠過濾柱(2000SWXL；Tosoh公司制)分餾的級分的活性，由相應的分子量級分計算分子量，將計算出的分子量除以酶的分子量得到的值取整數(shù)。其結果，作為本發(fā)明酶的各種鯊肌醇脫氫酶，顯示出80-110k道爾頓的分子量，在未變性狀態(tài)下，形成著2聚體或3聚體。
本發(fā)明酶的輔酶的選擇性如下述那樣測定混合5μl反應液(200mM Tris緩沖液pH8.0、2％NADPH或NADH、1％青蟹肌糖)、和5μl酶液，在36℃反應30min后，立即加入500μl的水，測定340nm的吸光度，測定用水代替酶液的試驗液的空白值在340nm的吸光度的減少量。根據(jù)將酶液進行稀釋。其結果，作為本發(fā)明酶的各種鯊肌醇脫氫酶，NADPH或NADH都可作為輔酶使用，顯示出表5所示的輔酶相對活性。表明對NADPH良好地作用的酶較多。
本發(fā)明酶的最適pH如下述那樣測定混合反應液(200mM Tris緩沖液pH5.0-9.0、2％NADPH、1％青蟹肌糖)5μl、和5μl酶液，在36℃反應30min后，立即加入500μl的水，測定340nm的吸光度，測定用水代替酶液的試驗液的空白值在340nm的吸光度的減少量。根據(jù)將酶液進行稀釋。其結果，作為本發(fā)明酶的各種鯊肌醇脫氫酶，顯示出表5所示的最適pH。也就是表明了本發(fā)明酶在pH5-9的寬范圍內(nèi)作用。另外也知道了有最大活性在酸性側的pH6附近的酶、在中性區(qū)pH6.5-7.5附近的酶、在堿性側的pH7.5-9附近的酶。
本發(fā)明酶的熱穩(wěn)定性如下述那樣測定將酶液在所規(guī)定的溫度處理10min后，冷卻，混合該酶液和5μl反應液(200mM Tris緩沖液pH5.0-9.0、2％NADPH、1％青蟹肌糖)，在36℃反應30min后，立即加入500μl的水，測定340nm的吸光度，測定用水代替酶液的試驗液的空白值在340nm的吸光度的減少量。根據(jù)將酶液進行稀釋。將20℃×10min處理區(qū)的活性記為100％，比較了相對活性。其結果作為本發(fā)明酶的各種鯊肌醇脫氫酶的熱穩(wěn)定性，如表5所示，根據(jù)各酶不同而不同，表明根據(jù)酶，其穩(wěn)定性也不同，處在40-60℃的范圍。
本發(fā)明酶的重金屬效應如下述那樣測定混合5μl反應液(200mMTris緩沖液pH8.0、2％NADPH、1％青蟹肌糖、2mM金屬鹽)、和5μl酶液，在36℃反應30min后，立即加入500μl的水，測定340nm的吸光度，測定用水代替酶液的試驗液的空白值在340nm的吸光度的減少量。根據(jù)將酶液進行稀釋。金屬鹽的種類，使用CaCl2、CoCl2、ZnSO4、MgSO4、SnCl2、NiCl2、MnSO4，將未添加區(qū)的活性記為100％，比較了相對活性。其結果，作為本發(fā)明酶的各種鯊肌醇脫氫酶，如表5所示，至少在Co2+離子的存在下被活化，在Sn2+離子的存在下被抑制。大部分的酶在Zn2+離子的存在下被抑制，但來源于枯草芽孢桿菌168的酶反倒在Zn2+離子的存在下被活化。
本發(fā)明酶對于青蟹肌糖的Km值，如下述那樣測定混合反應液(200mM Tris緩沖液pH8.0、2％NADPH、0.001-2.5％青蟹肌糖)5μl、和5μl酶液，在36℃反應30min后，立即加入500μl的水，測定340nm的吸光度，測定用水代替酶液的試驗液的空白值在340nm的吸光度的減少量。根據(jù)將酶液進行稀釋。測定值被倒數(shù)作圖，算出了Km值。其結果，作為本發(fā)明酶的各種鯊肌醇脫氫酶的Km值，如表5所示，顯示出2.6-12.6mM的范圍。
本發(fā)明酶的底物特異性，以氧化活性為指標，測定相對于對肌醇的反應性的相對活性。使用的肌醇異構體，是鯊肌醇(SI)、肌醇(MI)、D-chiro-肌醇(DCI)、L-chiro-肌醇(LCI)、epi-肌醇(EI)、muco-肌醇(MuI)、allo-肌醇(AI)、neo-肌醇(NI)。在表5中用相對活性為70％以上的區(qū)、小于70％但為20％以上的區(qū)、小于20％的區(qū)標識出。
底物特異性的測定方法如下述混合反應液(各種肌醇異構體1％(只有neo-肌醇為0.4％)、200mM Tris緩沖液pH8.0、0.002％NADP+、0.002％黃遞酶、0.01％硝基四唑藍)50μl、和50μl酶液，在25℃每隔3min用微量培養(yǎng)板讀出裝置測定545nm的吸光度的增加。由在各個相應的時間時的吸光度的增量算出反應速度，結果酶的種類不同，底物特異性有少許不同，由與肌醇異構體的相關性也表明了這些酶至少具有著鯊肌醇脫氫酶活性、和肌醇5-脫氫酶活性。
2磅/100加侖3Hunter Pro-3光澤度計4Hunter UltraScan XE
光澤度用Hunter Pro-3光澤度計測量。ASTM-E-313白和黃是用Hunter UltraScan XE儀器對不透明涂膜的白度和接近白色的黃度進行的標準測量。
由表VI可見，由本發(fā)明變高嶺土顏料所制配方獲得的漆膜，與含市購變高嶺土的漆膜相比，具有出色的白度和亮度性能。
在63％PVC漆中，加入當量為100加侖漆比11磅Phthalo Blue分散體，制成著色膜。表VII羅列了由63％PVC配方制成的著色干漆膜的性能。
表VII藍色1漆膜性能總結-63％PVC

1每100加侖11磅Phthalo Blue分散體。
2磅/100加侖3Hunter UltraScan XE
參數(shù)ΔE是色強度的量度并由下式計算ΔE＝(ΔL2+Δa2+Δb2)1/2。由表VII可見，本發(fā)明的變高嶺土具有出色的全面著色強度。
實施例4
表2.對于基因評分和臨床病理學參數(shù)的無病生存和總體生存單變量分析

a對于每個變量，患者被分類為兩組。腫瘤大小的截止點為5cm。P＞0.05的非顯著性變量，包括性別、年齡(截止點在60歲)、HBV感染史、血清AFP水平(截止點在20ng/ml)、肝硬化、腫瘤包囊形成和Edmondson分級沒有列入此表。
通過基因評分和pTNM分期的預后。
適于復發(fā)和死亡預測的最佳截止值是不同的。因此，對于全部患者的結果的估價，我們推薦使用預后性基因評分將患者分類為3組具有良好預后的基因評分A(＜0.416)的患者，其大多數(shù)為無病的并在3年內(nèi)存活，有1/21(4.8％)的復發(fā)和死亡；具有中等的預后的基因評分B(0.416-0.600)的患者，其大多數(shù)發(fā)展為晚期復發(fā)，但仍在3年內(nèi)存活，有9/10(90％)的復發(fā)(中位無病期為16.1個月)和2/10(20％)的死亡；具有不良預后的基因評分C(＞0.600)的患者，其大多數(shù)發(fā)展為早期復發(fā)并和在3年內(nèi)死亡，有17/17(100％)的復發(fā)(中位無病期為2.5個月)和14/17(82.4％)的死亡(中位總體生存期為13.7個月)。
通過此兩個因素的向前逐步選擇(forward stepwise selectionprocedure)程序的Cox回歸分析，將預后性基因評分(3類評分A、<p>表6各種鯊肌醇脫氫酶的氨基酸序列同源性E.coli.ydgJ(序列號2) —————MSDNIRVGLIGYGYASKTFHAPLI——AGTPGQELAVIS—SSDETKVX.camp.Xcc3438 —————MPKPFNLAVVGYGYVGRTFHAPLI——ASTPGLQLHSVV—SSKPQQP(序列號14)B.sub.BG14057 -MITLLKGRRKVDTIKVGILGYGLSGSVFHGPLL——DVLDEYQISKIM—TSRTEEV(序列號8)A.tume.Atu4375 —MSSATKKFDSRRIRLGMVGGGQGAFIGAVHRI——AARLDDRYELVAGALSSDPARA(序列號4)AB10121Atu4375 —MSSAPKKFDSRRIRLGMVGGGQGAFIGAVHRI——AARLDDRYELVAGALSSDPARA(序列號10)A.tume.Atu3234 MAIEGKTTDVNNKRIRLGMVGGGSGAFIGGVHRM——AARLDNRFDLVAGALSSTPEKS(序列號6)AB10121Atu3234 MAIEGKTTDKANKRIRLGMVGGGSGAFIGGVHRM——AARLDNRFDLVAGALSSTPEKS(序列號12)AB10281SIDH1————-MTKRKLRIGLIGSG—-FMGRTHAFGYSTASRVFDLPFQPELTCLADISDE(序列號28)::::::* * : . . .
E.coli.ydgJ KADWPTVTVVSE—————PKHLFNDPNIDLIVIPTPNDTHFPLAKAALEAGKHVVVX.camp.Xcc3438 QADFREVRVLPD—————LEAALADPALDAVVIATPNQTHAPNALQALAAGKHVLVB.sub.BG14057 KRDFPDAEVVHE—————LEEITNDPAIELVIVTTPSGLHYEHTMACIQAGKHVVNA.tume.Atu4375 AASATLLGIAPERSYASFEDNAATEAGREDQIEAVAIVTPNHLHFAPSKAFLEAGIHVICAB10121Atu4375 AASATLLGIAPERSYASFEENAAAEAGRDDGIEAVAIVTPNHLHFAPSKAFLEAGIHVICA.tume.Atu3234 LASGRELGLDSERCYGSFEENAEKEALREDGIEAVAIVTPNHVHYPAAKAFLERGIHVICAB10121Atu3234 LASGRELGLDPERCYGSFEENAEKEALREDGIEAVAIVTPNHVHYPAAKAFLERGIHVICAB10281S1DH1AAAKAADALGFARSTSDWRTLV——-NDPEIDVVNITAPNAFHKEMALAAIAAGKHVYC: : :: : : :*. * : : :. * **:
E coli.ydgJ DKPFTVTLSOARELDALAKSLGRVLSVFHNRRWDSDFLTLKGLLAEQVLGEVAYFESHFDX.camp.Xcc3438 DKPFALDAAOAPTVVDAAAEAGKIVSVFQNRRWDADFLTVRRLIEDGQLGEVVEFHSHFDB.sub.BG14057 EKPMTATAEEGETLKRAADEKGVLLSVVHHRRWDNDFLTIKKLISEGSLEDINTYQVSYNA.tume.Atu4375 DKPVTATLEEAKALAGIVRASDSLFVLTHNYTGYAMLRQMREMIAEGAIGKLRHVQAEYAAB10121Atu4375 DKPVTATLEEAKALAEIVRASDSLFVLTHNYTGYAMLRQMRQMVADGAIGKLRHVQAEYAA.tume.Atu3234 DKPLTSNLEDAKKLKDVADKADALFILTHNYTGYPMVRHARELVEAGALGNIRLVQMEYPAB10121Atu3234 DKPLTSNLEDAKKLKDVADKADALFILTHNYTGYPMVRHARELVESGALGTIRLVQMEYPAB10281SIDH1EKPLAPLAADAREMAEAAEAKGVKTQVGFNYLCNPMLALARDMIAAGELGEIRGYRGLHA:**.: . .:.. : . . . : * . : :: * : .: .
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表6-2E.coli.ydgJ AQLRPGA—————QSTDYFHAILSYPQR————RVILHGTMLAAAESARYIVHX.camp.Xcc3438 QRQRTQA—————RSDDYFNVVLRYPRL————RVILHAGSLVADGSLRFAVHB.sub.BG14057MAQRENA—————ETVDYFHLTLDYGKL————QAILYGGSIVPANGPRYQIHA.tume.Atu4375 TSFVPGR—————QLDDSANILLRYDSG——-AKGMLWASQIAVGNENALSLRVYAB10121AAtu4375 TSFVPGR—————QLDDSANILLRYESG——-AKGMLWASQIAVGNENALSLRVYA.tume.Atu3234 HTFVEGR—————RLDDNAHVNNRFKPKGGKQPARGNLWCSQVAVGHENGLKIRLYAB10121Atu3234 HTFVEGR—————RLDDNAHVMLRFKPKGGKQPAKGLLWCSQVAVGHENGLKVRVYAB10281SIDH1 VTVIKTRPDGKGGTRAVEVDDIGRALLRFENG——-ATGSVEGNWIATGRTMQHDFEVY. . * : : : : .::
E.coli.ydgJ GSRGSYVKYGLDPQEERL—KNGERLP——-QEDWGYDMRD—GVLTRVEGEERVEETLX.camp.Xcc3438 GTRGSYLKHGADTQEDQL—RAGRRPG——-TAGWGNDPLP—GTLTRVDDEGRVHTHQB.sub.BG14057GKDSSFIKYGIDG0EDAL—RAGRKPE——-DDSWGADVPEFYGKLTTIRGSDKKTETIA.tume.Atu4375 GDKGGLEWHGRVPDELWF—TPYGEPKRLITRNGAGAGAAANRVSRVPSGHPEGYLEGFAAB10121Atu4375 GEKGGLEWHHRVPDELWF—TPYGEPKRLITRNGAGAGAAANRVSRVPSGHPEGYLEGFAA.tume.Atu3234 GDKAGLEWTQADPNYLWF—TKLGEPKQLITRGGAGAGAAAARVTRIPSGHPEGYLEAFAAB10121Atu3234 GDKAGIEWTQADPNYLWF—TKLGELKQLITRGGAGAGAAAARVTRIPSGHPEGYLEAFAAB10281SIDH1 GTKGALAFTQQRFNELHFFSSTDARGRKGFRRIEAGPEHAPYGLFCVAPGHQLGFND—-*. ...... :. . .
E.coli.ydgJ LT-VPGNYPAYYAAIRDALNGDGENPV-PASQAIQVMELIELGIESAKHRATLCLA——X.camp.Xcc34 PDGVPGDYRHCYAAFRDAMAGTAPPPV-SAADAVRLMELLELAQRGAALGQVLWLEGNSSB.aub.BG14057PS-VNGSYLTYYRKIAESIREGAALPV-TAEEGINVIRIIEAANESSKEKRTINLEH—-A.tume.Atu4375 TI-YREAADAIIAKREGETAAGEVIYP-GMEDGLAGLAFIDAAVRSSQ-TSTWVGIDI—AB10121Atu4375 TI-YREAADAIIAKREGKAAAGEVIYP-GMEDGLAGLAFIDAAVRSSQ-TSTWINIDI—A.tume.Atu3234 TI-YTEAAHAIEARRTGSALDKAVIYP-TVDDGVKGVAFVTACIESGKKNGGWVKL——AB10121Atu3234 TI-YTEAAHAIEARRTGSVLDKAVIYP-TVDDGVKGVAFVTACIESGKKNGVWVKL——AB10281SIDH1 ———-LKAIEVARYLEALAGHHPEPFNFRAGLRIQTLVETIHASS-KSAAWRDVPTDK.::: . ∷ ..:. .: :: : :
E.coli.ydgJ ———X.camp.Xcc3438 D—-—B.sub.BG14057———A.tume.Atu4375 ———AB10121Atu4375 ———A.tume.Atu3234 ———AB10121Atu3234 ———AB10281SIDH1 LQAKSRQHEKA
實施例15&lt;使用本發(fā)明酶的鯊肌醇的制備&gt;
在本制備方法中使用的酶，需要肌醇2-脫氫酶、和本發(fā)明酶這2種。在此，示出使用作為來源于枯草芽孢桿菌168 ATCC23857的BG10669基因產(chǎn)物的肌醇2-脫氫酶、和由本發(fā)明DNA編碼(來源于大腸桿菌K12株的ydgJ基因SEQ.ID.NO1)的本發(fā)明酶的重組酶的實施例。
首先，為了得到作為來源于枯草芽孢桿菌168 ATCC23857的BG10669基因產(chǎn)物的肌醇2-脫氫酶的重組酶，進行了以下的實驗。為了來源于枯草芽孢桿菌168 ATCC23857的BG10669基因的克隆、且為了作為重組酶而表達，使用具有下述序列的引物進行了PCR反應。
序列號25BG10669-F 5’-ttgggatccgatgagtttacgtattggcgtaattg-3’序列號26BG10669-R 5’-aaactgcagttagttttgaactgttgtaaaagattgata-3’PCR反應使用寶酒造公司的Ex taq反應液，該溶液的組成為Takara ExTaq Buffer×10倍液5μl、dNTP混合物4μl、模板DNA30ng、10μM引物溶液 1μl、Takara ExTaq 0.5μl，加入水達到50μl，并覆蓋30μl的礦物油。反應條件，使用PCR擴增裝置(ASTEC公司制PC-700)，變性(94℃，30秒)、退火(53℃，1min)、延伸(72℃，1min)這3步的反應重復進行了35次。通過上述的PCR反應，擴增了約1.0kb大小的DNA片段。反應后，重復3次用0.3ml己烷提取覆蓋的礦物油，并去除己烷層的操作，通過減壓1min，去除了礦物油。使用GENECLEAN(Bio101公司制)從所得的反應液50μl純化了PCR片段。即，加入300μl試劑盒中的NaI溶液并混合，加入10μl玻璃珠溶液并混合，在4℃靜置15min后，離心分離，使吸附DNA片段的玻璃珠沉淀，去除上清液。進一步地加入試劑盒中的New wash溶液500μl，使玻璃珠懸浮，離心分離，去除上清液。采用該New wash溶液進行的洗滌操作重復了3次。接著，在減壓下干燥玻璃珠，干燥后，加入15μl滅菌水懸浮，在55℃加溫15min后進行離心分離，得到含有DNA片段的上清液12μl。
將純化的DNA片段導入表達載體中的操作如以下所示地進行。即，向DNA片段溶液10μl中加入表達用質粒(pUC118寶酒造公司制)0.5μg、寶酒造公司的限制酶BamHI、PstI各1μl、寶酒造公司的限制酶用緩沖液K buffer×10倍液2μl，加入滅菌水以便達到20μl并混合。將該反應液在36℃反應2小時。限制酶反應后，使用GENECLEAN分離DNA片段和表達載體，使它們連接。即，向限制酶反應液20μl中加入試劑盒中的NaI溶液300μl并混合，加入10μl玻璃珠溶液并混合，在4℃靜置15min后，離心分離，使吸附DNA片段和表達載體的玻璃珠沉淀，去除上清液。進一步地加入試劑盒中的New wash溶液500μl，使玻璃珠懸浮，離心分離，去除上清液。采用該New wash溶液進行的洗滌操作重復了3次。接著，在減壓下干燥玻璃珠，干燥后，加入15μl滅菌水懸浮，在55℃加溫15min后進行離心分離，得到含有DNA片段和表達載體的上清液12μl。通過該操作，由限制酶產(chǎn)生的約50bp以下的小的DNA片段被去除，得到了目的的DNA片段、和表達載體。
向這樣制備的溶液10μl中加入Takara Ligation kit-I溶液(寶酒造公司制)10μl，使混合物在16℃反應1小時。用該溶液轉化感受態(tài)細胞(寶酒造公司DH5α)。即，向在4℃解凍的感受態(tài)細胞溶液60μl中加入連接反應溶液5μl并混合，進行0℃×30min的處理后，進行42℃×45秒和0℃×2min的處理，向其中加入500μl SOC溶液(2％細菌用胰蛋白胨、0.5％酵母提取物、10mM NaCl、20mM葡萄糖、10mMMgSO4、10mM MgCl2)，在36℃恢復培養(yǎng)1小時，將該培養(yǎng)液100μl涂布在含有50μg/ml氨芐青霉素、40μg/ml X-gal、1mM IPTG的LB瓊脂培養(yǎng)基(1％細菌用胰蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl、pH7.0、1.5％瓊脂)上。進而在37℃培養(yǎng)16小時。通過該培養(yǎng)，篩選白色的集落得到通過上述的質粒的引入而轉化的大腸桿菌，因此將其選擇。在含有氨芐青霉素(50μg/ml)的Lb液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)這樣分離的轉化大腸桿菌集落。從增殖的轉化大腸桿菌的菌體利用質粒純化試劑盒(QiA filter Plasmid Midi Kit，QIAGEN公司)分離和純化質粒DNA。證實了所得的質粒DNA分別具有與目的BG10669基因相當?shù)募s1.0kbp的DNA片段。
其次，為了確認肌醇2-脫氫酶活性，將作為集落而分離的菌株移植到30個含有50μg/ml氨芐青霉素的100ml LB培養(yǎng)基(1％細菌用胰蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl、pH7.0)中，在36℃培養(yǎng)7小時，向每個這種培養(yǎng)液100ml中加入200mM IPTG溶液0.3ml，進一步在36℃培養(yǎng)3小時。培養(yǎng)結束后，通過離心分離收集菌體，用生理鹽水將其洗滌1次。進而將洗滌菌體懸浮在0.6％Triton-X100溶液3ml中，在4℃利用超聲波將菌破碎。離心分離該溶液，取出上清的酶溶液84ml，向上清加入36g硫酸銨，在4℃使蛋白質鹽析。通過離心分離收集鹽析了的蛋白質，去除上清，使該沉淀物溶解于75ml的20mM Tris緩沖液(pH7.0)中，再度進行離心分離，將上清應用到用20mM Tris緩沖液(pH7.0)平衡化的Shephadex G-25柱(Pharmacia制)(400ml)中，用20mM Tris緩沖液(pH7.0)洗脫，進行了脫鹽。通過該操作，得到了作為BG10669基因產(chǎn)物的粗酶液105ml。
肌醇2-脫氫酶還原活性如以下所示測定混合反應液(200mM Tris緩沖液pH8.0、2％NADH、1％青蟹肌糖)5μl、和5μl酶液，在36℃反應30min后，立即加入500μl的水，測定340nm的吸光度，由代替酶液使用水的試驗 的 測定340nm的吸光度的減少量。根據(jù)將酶液進行稀釋，證實了該酶具有還原青蟹肌糖的活性。另一方面，氧化活性的測定方法如下進行混合反應液(肌醇或鯊肌醇1％、200mMTris緩沖液pH8.0、0.002％NAD+、0.002％黃遞酶、0.01％硝基四唑藍)50μl、和50μl酶液，在25℃每隔3min用微量培養(yǎng)板讀出裝置測定545nm的吸光度的增加。由在各個相應的時間時的吸光度的增量算出反應速度，所制備的酶的氧化活性，證實了對肌醇顯示活性，對鯊肌醇不顯示活性。
使用這樣制備的肌醇2-脫氫酶酶溶液、和在實施例11中制備的鯊肌醇脫氫酶粗酶溶液(用30倍規(guī)模的3L培養(yǎng)液制備的酶液105ml)，進行了從肌醇向鯊肌醇的轉化反應。為制備反應溶液，加入肌醇200g、5％青蟹肌糖70ml、CoCl2130mg、MgSO4·7H2O 250mg、和水，使之達到750ml，加熱至50℃，使肌醇溶解。將該溶液冷卻到36℃，用1N的NaOH調pH至8.0，加水使體積達790ml，在36℃加入肌醇2-脫氫酶的粗酶液105ml、鯊肌醇脫氫酶粗酶溶液105ml、NADP+70mg，將達到約1L的溶液在36℃保溫，邊緩慢攪拌邊使之反應。因為反應液的pH慢慢變成酸性，因此用1N NaOH調整以便達到pH8.0。42小時后，在反應液中產(chǎn)生鯊肌醇的晶體，得到白濁的反應液。用濾紙過濾該溶液，回收了結晶性鯊肌醇(濕重量73g)。向該固體加入3L水，在50℃使之溶解，加入水以便達到4.5L，冷卻到室溫，將得到的溶液離心分離(8,000rpm 20min)，使去除了微量的不溶物的上清液順序在強堿性陽離子交換樹脂100ml柱、強酸性陰離子交換樹脂100ml柱、活性炭50ml柱中通過，得到洗脫了的洗脫液之后，將洗脫液與為了洗滌柱而使500ml水按上述順序在柱中通過并使之洗脫的洗滌液一起濃縮。
作為濃縮的結果，在溶液的量變少時，開始析出鯊肌醇的微晶，濃縮到內(nèi)容物變?yōu)?30g為止，將其冷卻到4℃后，放置一夜。放置后，過濾變成漿狀的物質，用少量的水洗滌濾紙上的鯊肌醇晶體后，在105℃使之干燥3小時。得到的鯊肌醇為白色的晶體(61g)，在NMR分析及HPLC分析中，晶體未發(fā)現(xiàn)雜質，是純度99％以上的晶體。來自肌醇的收得率為31％。另外，過濾出的反應液還能使用，當使之溶解64g肌醇時，結晶性鯊肌醇進一步析出了。
實施例16&lt;鯊肌醇·硼酸復合體的形成、及形成條件的研討&gt;
將粉末的青蟹肌糖100g溶解于500ml熱水中，冷卻到室溫后，加入水，使之達到900ml。使用5當量NaOH水溶液將該溶液調至pH7.5，進一步加入水，使之達到1升。
邊攪拌邊用15min向該溶液緩慢加入粉末的NaBH45.9g，進行了還原反應。反應溶液的溫度因反應熱而上升到38℃。30min后冷卻到32℃，使硼酸67.5g和NaCl 72.2g溶解于反應液中，制備了復合體形成用溶液。該溶液的pH為5.9。
接著，將使用8當量NaOH水溶液調至pH6.0的復合體形成用溶液100ml裝進200ml容積的帶蓋的塑料容器中，而且，將使用8當量NaOH水溶液調至pH7.0的復合體形成用溶液100ml以同樣的操作裝進另一同樣的容器中，還有，調整達到pH8.0、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、12.0及12.8的復合體形成用溶液各100ml也順次分裝到各自的容器中。
這樣進行了pH調整的溶液開始緩慢地形成了沉淀。每隔1天濾選出沉淀，濾液使用8當量NaOH水溶液將pH調至所規(guī)定的pH之后返回到原來的容器中，得到的沉淀干燥后，測定了重量。本來通過還原生成的鯊肌醇全部變成鯊肌醇·硼酸復合體，而且全部以沉淀形式得到時，沉淀的重量達到61.8g，因此每隔1天累計從各進行了pH調整的溶液得到的沉淀的重量，將累計值除以理論收獲量61.8g所得到的值作為鯊肌醇·硼酸復合體沉淀的回收率。
所得的數(shù)值匯總于表中，如以下所示。
表中的灰色部分表示回收率超過了90％的試驗區(qū)。
表7 如表7所示，表明處理pH9.5的試驗區(qū)最適于形成鯊肌醇·硼酸復合體沉淀。另外，pH9.0、pH9.5、pH10.0的試驗區(qū)在第4天之前顯示出90％以上的回收率，表明即使日期延長，回收率也達到94％的定值。
從pH9.5的試驗區(qū)的第7天的濾液的NMR分析表明，在溶液中殘留著5.9％(w/v)的肌醇、約0.2％(w/v)的鯊肌醇。也就是表明0.2％(w/v)以上濃度的鯊肌醇·硼酸復合體可根據(jù)本方法以沉淀形式取得。
實施例17&lt;用青蟹肌糖還原混合液形成鯊肌醇·硼酸復合體，使復合體溶解后，使用離子交換樹脂將鯊肌醇游離、脫鹽的方法&gt;
將粉末的青蟹肌糖10g(56mmol)溶解于50ml熱水中，冷卻到室溫后，加入水，使之達到90ml。使用5當量NaOH水溶液將該溶液調至pH7.5，進一步加入水，使之達到100ml。
邊攪拌邊用15min向該溶液緩慢加入粉末的NaBH40.59g，進行了還原反應。反應溶液的溫度因反應熱而上升到36℃。30min后冷卻到31℃，使硼酸6.75g和NaCl 7.22g溶解于反應液中，制備了復合體形成用溶液。接著，使用5當量NaOH水溶液將該復合體形成用溶液調至pH9.5，邊攪拌邊裝進pH stat裝置，使用5當量NaOH水溶液使之維持pH9.5。3天后過濾在復合體形成用溶液中析出的沉淀，用少量的水洗滌，干燥后，得到5.71g(20.5mmol)的鯊肌醇·硼酸復合體。
向得到的鯊肌醇·硼酸復合體5.71g中加入1.05當量的鹽酸溶液230ml，溶解鯊肌醇·硼酸復合體，得到溶解液。該溶解液為0.2當量的酸性溶液。接著，以每分鐘2ml的流度使溶解液在用200ml強酸性離子交換樹脂(Duolite C20、H+類型，住友化學制)裝滿的柱中通過，使得到的洗脫液在用400ml強堿性離子交換樹脂(Duolite A116、OH+類型，住友化學制)裝滿的柱中通過，濃縮得到的洗脫液，得到白色粉末3.52g(19.5mmol)。通過NMR分析，表明是鯊肌醇。另外，來自青蟹肌糖的收得率是35％。
實施例18&lt;用青蟹肌糖還原混合液形成鯊肌醇·硼酸復合體，將復合體溶解后，采用有機溶劑沉淀將鯊肌醇游離、結晶化的方法&gt;
將用粉末的青蟹肌糖10g(56mmol)采用與實施例17所示的方法同樣的方法制備的5.71g(20.5mmol)的鯊肌醇·硼酸復合體作為原料。
將鯊肌醇·硼酸復合體5.71g與攪拌器一起放入100ml容積的帶蓋錐形燒瓶中，加入22.8ml的1.83當量的鹽酸溶液，制備了懸浮液。攪拌1小時后，加入23ml甲醇，進一步攪拌。5小時后過濾懸浮液，用少量的甲醇洗滌固體，使之干燥，得到粗鯊肌醇3.58g(20.0mmol)。
進一步地，將得到的粗鯊肌醇3.58g溶解于230ml水中，加入20ml強酸性離子交換樹脂(Duolite C20、H+類型)、40ml強堿性離子交換樹脂(Duolite A116、OH+類型)并攪拌。攪拌30min后，過濾出離子交換樹脂，濃縮得到的濾液，得到白色粉末3.41g(18.9mmol)。該白色粉末通過NMR分析，表明是鯊肌醇。另外，來自青蟹肌糖的收得率是34％。
實施例19&lt;還原青蟹肌糖后，直接使鯊肌醇游離、結晶化的方法&gt;
將粉末的青蟹肌糖5g(28mmol)溶解于40ml熱水中，冷卻到室溫之后，使用5當量NaOH水溶液將該溶液調至pH7.5，加入水使之達到45ml。
邊攪拌邊用15min向該溶液緩慢加入粉末的NaBH40.29g，進行了還原反應。反應溶液的溫度因反應熱而上升到37℃。30min后冷卻到30℃，使用5當量鹽酸將反應液調至pH1.0。然后，加入水使之達到50ml，形成0.1當量的酸性溶液。接著，邊攪拌邊向該溶液加入甲醇25ml，溶液10min后就開始緩慢地混濁，進一步攪拌該懸浮液24小時。24小時后，過濾懸浮液，用少量的甲醇洗滌，干燥后，得到1.55g(8.6mmol)的粗鯊肌醇。
進而，將得到的粗鯊肌醇1.55g溶解于120ml水中，加入10ml強酸性離子交換樹脂(Duolite C20、H+類型)、20ml強堿性離子交換樹脂(Duolite A116、OH+類型)并攪拌。攪拌30min后，過濾出離子交換樹脂，濃縮得到的濾液，得到白色粉末1.51g(8.3mmol)。該白色粉末通過NMR分析，表明是鯊肌醇。另外，來自青蟹肌糖的收得率是30％。
工業(yè)實用性根據(jù)本發(fā)明，用廉價的肌醇只通過微生物轉化或酶反應，就能夠直接制備作為醫(yī)藥品有利用價值的鯊肌醇，能夠高效率地制備鯊肌醇。另外，本發(fā)明的制備方法也有難產(chǎn)生異構體的優(yōu)點。
通過使用本發(fā)明的NAD+非依賴型肌醇2-脫氫酶，不向反應液中添加NAD+就能夠制備青蟹肌糖。而且，通過還原所得到的青蟹肌糖，能夠簡便且高效率地得到高純度的鯊肌醇。
根據(jù)本發(fā)明，能夠用含有鯊肌醇和鯊肌醇以外的中性糖的混合液高效率地形成鯊肌醇·硼酸復合體，能夠采用高效而簡便的操作從所得到的鯊肌醇·硼酸復合體得到高純度的鯊肌醇。
序列表&lt;110&gt;Hokko CHEMICAL INDUSTRY CO.，LTD.
&lt;120&gt;鯊肌醇的制造方法&lt;130&gt;OP-C4204&lt;150&gt;JP2003-353490&lt;151&gt;2003-10-14&lt;150&gt;JP2003-353491&lt;151&gt;2003-10-14&lt;150&gt;JP2004-18128&lt;151&gt;2004-1-27&lt;150&gt;JP2004-194088&lt;151&gt;2004-6-30&lt;160&gt;37&lt;170&gt;PatentIn version 3.1&lt;210&gt;1&lt;211&gt;1041&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;大腸桿菌&lt;220&gt;
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195 200 205gac gat tac ttc aac gtg gtg ctg cgc tat ccc cgc ttg cgg gtg atc672Asp Asp Tyr Phe Asn Val Val Leu Arg Tyr Pro Arg Leu Arg Val Ile210 215 220ctg cac gcc ggc tcg ctg gtg gcc gac ggc agc ctg cgc ttc gcc gtg720Leu His Ala Gly Ser Leu Val Ala Asp Gly Ser Leu Arg Phe Ala Val225 230 235 240cac ggc acg cgc ggc agc tat ctc aag cat ggc gcc gat acg cag gaa768His Gly Thr Arg Gly Ser Tyr Leu Lys His Gly Ala Asp Thr Gln Glu245 250 255gac cag ttg cgt gcc ggc cgc cgg ccc ggc acc gcc ggc tgg ggc atg816Asp Gln Leu Arg Ala Gly Arg Arg Pro Gly Thr Ala Gly Trp Gly Met260 265 270gac cca ttg ccc ggc acg ctc acc cgc gtg gac gac gaa ggc cgt gtg864Asp Pro Leu Pro Gly Thr Leu Thr Arg Val Asp Asp Glu Gly Arg Val275 280 285cac acg cat cag ccc gat ggc gta ccc ggc gac tac cgc cat tgc tat912His Thr His Gln Pro Asp Gly Val Pro Gly Asp Tyr Arg His Cys Tyr290 295 300gcg gcc ttc cgc gac gca atg gcc ggc acc gca ccg cca ccg gtc agt960Ala Ala Phe Arg Asp Ala Met Ala Gly Thr Ala Pro Pro Pro Val Ser305 310 315 320gct gcc gac gcg gtg cgg ctg atg gag ctg ctg gag ctg gcg caa cgc1008Ala Ala Asp Ala Val Arg Leu Met Glu Leu Leu Glu Leu Ala Gln Arg325 330 335ggt gct gcg ctg ggc cag gtg ctc tgg ctg gaa ggc aac agc agc gac1056Gly Ala Ala Leu Gly Gln Val Leu Trp Leu Glu Gly Asn Ser Ser Asp340 345 350tga1059&lt;210&gt;14&lt;211&gt;352&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;野油菜黃單胞菌.野油菜致病變種&lt;400&gt;14Met Pro Lys Pro Phe Asn Leu Ala Val Val Gly Tyr Gly Tyr Val Gly1 5 10 15Arg Thr Phe His Ala Pro Leu Ile Ala Ser Thr Pro Gly Leu Gln Leu20 25 30His Ser Val Val Ser Ser Lys Pro Gln Gln Pro Gln Ala Asp Phe Arg35 40 45
Glu Val Arg Val Leu Pro Asp Leu Glu Ala Ala Leu Ala Asp Pro Ala50 55 60Leu Asp Ala Val Val Ile Ala Thr Pro Asn Gln Thr His Ala Pro Met65 70 75 80Ala Leu Gln Ala Leu Ala Ala Gly Lys His Val Leu Val Asp Lys Pro85 90 95Phe Ala Leu Asp Ala Ala Gln Ala Arg Thr Val Val Asp Ala Ala Ala100 105 110Glu Ala Gly Lys Ile Val Ser Val Phe Gln Asn Arg Arg Trp Asp Ala115 120 125Asp Phe Leu Thr Val Arg Arg Leu Ile Glu Asp Gly Gln Leu Gly Glu130 135 140Val Val Glu Phe His Ser His Phe Asp Arg Tyr Arg Pro Gln Val Arg145 150 155 160Asp Arg Trp Arg Glu Ser Asp Ile Pro Gly Ala Gly Leu Trp Tyr Asp165 170 175Leu Gly Pro His Leu Leu Asp Gln Ala Leu Gln Leu Phe Gly Met Pro180 185 190Gln Ala Ile Ser Ala Asp Leu Gln Arg Gln Arg Thr Gln Ala Arg Ser195 200 205Asp Asp Tyr Phe Asn Val Val Leu Arg Tyr Pro Arg Leu Arg Val Ile210 215 220Leu His Ala Gly Ser Leu Val Ala Asp Gly Ser Leu Arg Phe Ala Val225 230 235 240His Gly Thr Arg Gly Ser Tyr Leu Lys His Gly Ala Asp Thr Gln Glu245 250 255Asp Gln Leu Arg Ala Gly Arg Arg Pro Gly Thr Ala Gly Trp Gly Met260 265 270Asp Pro Leu Pro Gly Thr Leu Thr Arg Val Asp Asp Glu Gly Arg Val275 280 285His Thr His Gln Pro Asp Gly Val Pro Gly Asp Tyr Arg His Cys Tyr290 295 300Ala Ala Phe Arg Asp Ala Met Ala Gly Thr Ala Pro Pro Pro Val Ser305 310 315 320Ala Ala Asp Ala Val Arg Leu Met Glu Leu Leu Glu Leu Ala Gln Arg325 330 335Gly Ala Ala Leu Gly Gln Val Leu Trp Leu Glu Gly Asn Ser Ser Asp340 345 350&lt;210&gt;15&lt;211&gt;34&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工的
&lt;220&gt;
&lt;223&gt;引物&lt;400&gt;15cattcaagct taatgagagg caatgacatg agcg 34&lt;210&gt;16&lt;211&gt;31&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工的&lt;220&gt;
&lt;223&gt;引物&lt;400&gt;16tcggaattct tcatgcaagg cacaaagtcg c31&lt;210&gt;17&lt;211&gt;32&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工的&lt;220&gt;
&lt;223&gt;引物&lt;400&gt;17ggcggatcct ttgaaaggga tagtcatgtc ct 32&lt;210&gt;18&lt;211&gt;29&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工的&lt;220&gt;
&lt;223&gt;引物&lt;400&gt;18attggaagct tcgattggct gcgacctag 29
&lt;210&gt;19&lt;211&gt;30&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工的&lt;220&gt;
&lt;223&gt;引物&lt;400&gt;19ttgggatcct ttcaggggaa atattatggc 30&lt;210&gt;20&lt;211&gt;26&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工的&lt;220&gt;
&lt;223&gt;引物&lt;400&gt;20gccgcaagct tgttttacag cttcac 26&lt;210&gt;21&lt;211&gt;34&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工的&lt;220&gt;
&lt;223&gt;引物&lt;400&gt;21aggaattcga tgataacgct tttaaagggg agaa 34&lt;210&gt;22&lt;211&gt;34&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工的&lt;220&gt;
&lt;223&gt;引物
&lt;400&gt;22tttctgcagt ttagtgctcc agcataatgg ttcg 34&lt;210&gt;23&lt;211&gt;34&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工的&lt;220&gt;
&lt;223&gt;引物&lt;400&gt;23tcggaattcg cgttgcggtg aatcgttttc aatg 34&lt;210&gt;24&lt;211&gt;34&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工的&lt;220&gt;
&lt;223&gt;引物&lt;400&gt;24ataagaagct tgctcagtcg ctgctgttgc cttc 34&lt;210&gt;25&lt;211&gt;35&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工的&lt;220&gt;
&lt;223&gt;引物&lt;400&gt;25ttgggatccg atgagtttac gtattggcgt aattg35&lt;210&gt;26&lt;211&gt;39&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工的
&lt;220&gt;
&lt;223&gt;引物&lt;400&gt;26aaactgcagt tagttttgaa ctgttgtaaa agattgata39&lt;210&gt;27&lt;211&gt;1179&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;醋酸桿菌&lt;220&gt;
&lt;221&gt;CDS&lt;222&gt;(1)..(1179)&lt;223&gt;
&lt;400&gt;27atg acc aaa cgt aaa ttg cgc att ggc ctg att ggc agt ggg ttc atg48Met Thr Lys Arg Lys Leu Arg Ile Gly Leu Ile Gly Ser Gly Phe Met1 5 10 15ggg cgc acc cac gcc ttt ggc tat tca acc gcg tcc cgt gtg ttt gat96Gly Arg Thr His Ala Phe Gly Tyr Ser Thr Ala Ser Arg Val Phe Asp20 25 30ctt ccg ttt cag ccg gag ctg acg tgc ctg gct gat att tcc gat gaa144Leu Pro Phe Gln Pro Glu Leu Thr Cys Leu Ala Asp Ile Ser Asp Glu35 40 45gct gca gcg aag gcg gcg gat gct ctg gga ttt gcc cgt tcc acc agt192Ala Ala Ala Lys Ala Ala Asp Ala Leu Gly Phe Ala Arg Ser Thr Ser50 55 60gac tgg cgt acg ctc gtc aac gat cct gaa att gat gtg gtg aat atc240Asp Trp Arg Thr Leu Val Asn Asp Pro Glu Ile Asp Val Val Asn Ile65 70 75 80acg gcg cct aat gcc ttt cat aaa gaa atg gcg tta gca gcg att gct288Thr Ala Pro Ash Ala Phe His Lys Glu Met Ala Leu Ala Ala Ile Ala85 90 95gcg ggc aag cat gtc tat tgt gaa aag ccc ctt gcg cca ctt gca gcc336Ala Gly Lys His Val Tyr Cys Glu Lys Pro Leu Ala Pro Leu Ala Ala100 105 110gat gct cgc gaa atg gca gaa gcg gct gag gca aag ggc gta aaa aca384Asp Ala Arg Glu Met Ala Glu Ala Ala Glu Ala Lys Gly Val Lys Thr115 120 125cag gtt ggc ttc aac tac ctg tgc aac ccc atg ctg gca ctg gcc cga432
Gln Val Gly Phe Asn Tyr Leu Cys Asn Pro Met Leu Ala Leu Ala Arg130 135 140gat atg att gca gca ggg gag ctg ggg gaa atc aga ggg tac cgt ggc480Asp Met Ile Ala Ala Gly Glu Leu Gly Glu Ile Arg Gly Tyr Arg Gly145 150 155 160ctg cat gcg gaa gat tat atg gcg gac gcc tcg tct ccc ttt acg ttc528Leu His Ala Glu Asp Tyr Met Ala Asp Ala Ser Ser Pro Phe Thr Phe165 170 175cgt ctt gac cca gcg gga ggc ggc gca ctt gct gat att ggg agt cac576Arg Leu Asp Pro Ala Gly Gly Gly Ala Leu Ala Asp Ile Gly Ser His180 185 190gcc ctt gca acg gct gaa ttt ctt atg ggg cct gcc gca ggc gct atc624Ala Leu Ala Thr Ala Glu Phe Leu Met Gly Pro Ala Ala Gly Ala Ile195 200 205acg cag gtg atg ggg gat tgt gtg acg gtc atc aag acg cgg ccg gat672Thr Gln Val Met Gly Asp Cys Val Thr Val Ile Lys Thr Arg Pro Asp210 215 220ggt aag ggg gga acg cgg gct gta gaa gtg gac gat att ggc cgc gcg720Gly Lys Gly Gly Thr Arg Ala Val Glu Val Asp Asp Ile Gly Arg Ala225 230 235 240ctt ctg cgc ttt gag aat ggg gcg acg gga tcg gtt gag gga aac tgg768Leu Leu Arg Phe Glu Asn Gly Ala Thr Gly Ser Val Glu Gly Asn Trp245 250 255att gct acc ggc cgc acc atg cag cat gac ttt gag gta tac ggc aca816Ile Ala Thr Gly Arg Thr Met Gln His Asp Phe Glu Val Tyr Gly Thr260 265 270aaa ggt gca ctt gcc ttt act cag caa cga ttt aac gag ttg cat ttc864Lys Gly Ala Leu Ala Phe Thr Gln Gln Arg Phe Asn Glu Leu His Phe275 280 285ttc tca agc acc gat gca cgc ggc cgc aaa ggg ttc cgg cgt att gaa912Phe Ser Ser Thr Asp Ala Arg Gly Arg Lys Gly Phe Arg Arg Ile Glu290 295 300gcg gga cca gag cat gcg ccc tat ggc ctg ttc tgc gtg gca ccg ggg960Ala Gly Pro Glu His Ala Pro Tyr Gly Leu Phe Cys Val Ala Pro Gly305 310 315 320cac cag ctg ggt ttt aat gac ctc aag gcg ata gaa gtt gca cgg tat1008His Gln Leu Gly Phe Asn Asp Leu Lys Ala Ile Glu Val Ala Arg Tyr325 330 335ctg gag gcg ctg gct ggc cat cac cct gaa ccc ttc aat ttc cgg gcg1056Leu Glu Ala Leu Ala Gly His His Pro Glu Pro Phe Asn Phe Arg Ala340 345 350ggt ctg cgt atc cag aca ctg gtg gaa act att cac gct tca agc aag1104Gly Leu Arg Ile Gln Thr Leu Val Glu Thr Ile His Ala Ser Ser Lys355 360 365
tcg gct gcc tgg cgg gat gtg ccg acg gac aaa gtg aag ctt cag gcg1152Ser Ala Ala Trp Arg Asp Val Pro Thr Asp Lys Val Lys Leu Gln Ala370 375 380aaa tcc cga cag cat gag aag gca taa1179Lys Ser Arg Gln His Glu Lys Ala385 390&lt;210&gt;28&lt;211&gt;392&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;醋酸桿菌&lt;400&gt;28Met Thr Lys Arg Lys Leu Arg Ile Gly Leu Ile Gly Ser Gly Phe Met1 5 10 15Gly Arg Thr His Ala Phe Gly Tyr Ser Thr Ala Ser Arg Val Phe Asp20 25 30Leu Pro Phe Gln Pro Glu Leu Thr Cys Leu Ala Asp Ile Ser Asp Glu35 40 45Ala Ala Ala Lys Ala Ala Asp Ala Leu Gly Phe Ala Arg Ser Thr Ser50 55 60Asp Trp Arg Thr Leu Val Asn Asp Pro Glu Ile Asp Val Val Asn Ile65 70 75 80Thr Ala Pro Asn Ala Phe His Lys Glu Met Ala Leu Ala Ala Ile Ala85 90 95Ala Gly Lys His Val Tyr Cys Glu Lys Pro Leu Ala Pro Leu Ala Ala100 105 110Asp Ala Arg Glu Met Ala Glu Ala Ala Glu Ala Lys Gly Val Lys Thr115 120 125Gln Val Gly Phe Asn Tyr Leu Cys Asn Pro Met Leu Ala Leu Ala Arg130 135 140Asp Met Ile Ala Ala Gly Glu Leu Gly Glu Ile Arg Gly Tyr Arg Gly145 150 155 160Leu His Ala Glu Asp Tyr Met Ala Asp Ala Ser Ser Pro Phe Thr Phe165 170 175Arg Leu Asp Pro Ala Gly Gly Gly Ala Leu Ala Asp Ile Gly Ser His180 185 190Ala Leu Ala Thr Ala Glu Phe Leu Met Gly Pro Ala Ala Gly Ala Ile195 200 205Thr Gln Val Met Gly Asp Cys Val Thr Val Ile Lys Thr Arg Pro Asp210 215 220Gly Lys Gly Gly Thr Arg Ala Val Glu Val Asp Asp Ile Gly Arg Ala225 230 235 240
Leu Leu Arg Phe Glu Asn Gly Ala Thr Gly Ser Val Glu Gly Asn Trp245 250 255Ile Ala Thr Gly Arg Thr Met Gln His Asp Phe Glu Val Tyr Gly Thr260 265 270Lys Gly Ala Leu Ala Phe Thr Gln Gln Arg Phe Asn Glu Leu His Phe275 280 285Phe Ser Ser Thr Asp Ala Arg Gly Arg Lys Gly Phe Arg Arg Ile Glu290 295 300Ala Gly Pro Glu His Ala Pro Tyr Gly Leu Phe Cys Val Ala Pro Gly305 310 315 320His Gln Leu Gly Phe Asn Asp Leu Lys Ala Ile Glu Val Ala Arg Tyr325 330 335Leu Glu Ala Leu Ala Gly His His Pro Glu Pro Phe Asn Phe Arg Ala340 345 350Gly Leu Arg Ile Gln Thr Leu Val Glu Thr Ile His Ala Ser Ser Lys355 360 365Ser Ala Ala Trp Arg Asp Val Pro Thr Asp Lys Val Lys Leu Gln Ala370 375 380Lys Ser Arg Gln His Glu Lys Ala385 390&lt;210&gt;29&lt;211&gt;32&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工的&lt;220&gt;
&lt;223&gt;引物&lt;220&gt;
&lt;221&gt;misc_feature&lt;222&gt;(9)，(15)&lt;223&gt;n＝a，t，g或c&lt;220&gt;
&lt;221&gt;misc_feature&lt;222&gt;(18)，(27)&lt;223&gt;n＝肌苷&lt;400&gt;29atgaarcgna arytncgnat yggyytnaty gg 32
&lt;210&gt;30&lt;211&gt;32&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工的&lt;220&gt;
&lt;223&gt;引物&lt;220&gt;
&lt;221&gt;misc_feature&lt;222&gt;(15)&lt;223&gt;n＝a，t，g或c&lt;220&gt;
&lt;221&gt;misc_feature&lt;222&gt;(18)，(24)&lt;223&gt;n＝肌苷&lt;400&gt;30ggyttyatgg gycgnacnca ygcnttyggy ta 32&lt;210&gt;31&lt;211&gt;26&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工的&lt;220&gt;
&lt;223&gt;引物&lt;400&gt;31ggyttrtcrm mgayracrtg rstrcc 26&lt;210&gt;32&lt;211&gt;19&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工的&lt;220&gt;
&lt;223&gt;引物
&lt;220&gt;
&lt;221&gt;misc_feature&lt;222&gt;(7)，(17)&lt;223&gt;n＝肌苷&lt;400&gt;32artgwrnrtg rttgggngt 19&lt;210&gt;33&lt;211&gt;25&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工的&lt;220&gt;
&lt;223&gt;引物&lt;400&gt;33gctcgtcaac gatcctgaaa ttgat 25&lt;210&gt;34&lt;211&gt;25&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工的&lt;220&gt;
&lt;223&gt;引物&lt;400&gt;34ttcgctgcag cttcatcgga aatat 25&lt;210&gt;35&lt;211&gt;21&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工的&lt;220&gt;
&lt;223&gt;引物&lt;400&gt;35cccttcaatt tccgggcggg t 21
&lt;210&gt;36&lt;211&gt;26&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工的&lt;220&gt;
&lt;223&gt;引物&lt;400&gt;36gctggatccc gcccttattg tgaata 26&lt;210&gt;37&lt;211&gt;31&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工的&lt;220&gt;
&lt;223&gt;引物&lt;400&gt;37tatgaattcg ttatgccttc tcatgctgtc g3權利要求
1.一種鯊肌醇的制備方法，其特征在于，通過使屬于醋酸桿菌屬或伯克霍爾德氏菌屬(Burkholderia)的、具有將肌醇轉化成鯊肌醇的能力的微生物在含有肌醇的溶液中與肌醇作用，從而使上述溶液中生成、積累鯊肌醇，然后從該溶液中收集鯊肌醇。
2.根據(jù)權利要求1所述的制備方法，其特征在于，上述含有肌醇的溶液是含有肌醇的液體培養(yǎng)基，通過在該液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)上述微生物，從而使之與肌醇作用。
3.根據(jù)權利要求1所述的制備方法，其特征在于，使通過培養(yǎng)得到的上述微生物菌體在上述溶液中與肌醇作用。
4.根據(jù)權利要求1-3的任1項所述的制備方法，其中，上述微生物是屬于啤酒醋酸桿菌(Acetobacter cerevisiae)、Acetobactermalorum、或須芒草伯克霍爾德氏菌(Burkholderia andropogonis)的微生物。
5.根據(jù)權利要求1-3的任1項所述的制備方法，其中，上述微生物是醋酸桿菌AB10281FERM BP-10119或其突變株。
6.一種具有將肌醇轉化成鯊肌醇的能力的、醋酸桿菌AB10281FERM BP-10119或其突變株。
7.一種至少具有下述理化性質的NAD+非依賴型肌醇2-脫氫酶，(a)作用在電子受容物的存在下，催化從肌醇奪取電子，生成青蟹肌糖的反應；(b)最適pH在pH4.5-5.5下活性顯示出最大值；(c)輔因子每1摩爾的酶中含有1摩爾的血紅素鐵；(d)抑制劑酶活性被1mM的Sn2+離子抑制在1％以下；(e)亞單位結構是至少含有分子量76k道爾頓和46k道爾頓的蛋白質的異聚體；(f)底物特異性與D-chiro-肌醇、muco-肌醇、肌醇反應，分別轉化成D-chiro-1-肌糖、L-chiro-2-肌糖、青蟹肌糖，不與allo-肌醇、鯊肌醇、L-chiro-肌醇、葡萄糖反應。
8.一種NAD+非依賴型肌醇2-脫氫酶的制備方法，其特征在于，培養(yǎng)具有生產(chǎn)NAD+非依賴型肌醇2-脫氫酶能力的屬于醋酸桿菌屬的微生物，從所培養(yǎng)的微生物菌體分離純化NAD+非依賴型肌醇2-脫氫酶。
9.根據(jù)權利要求8所述的制備方法，其中，上述微生物是醋酸桿菌AB10253FERM BP-10136。
10.一種青蟹肌糖的制備方法，其特征在于，在含有肌醇和電子受體的溶液中使NAD+非依賴型肌醇2-脫氫酶與肌醇作用，生成青蟹肌糖，從溶液中分離純化生成的青蟹肌糖。
11.一種鯊肌醇的制備方法，包括在含有肌醇和電子受體的溶液中使NAD+非依賴型肌醇2-脫氫酶與肌醇作用，生成青蟹肌糖的步驟；使還原劑與上述青蟹肌糖作用，生成鯊肌醇的步驟；以及，分離純化上述鯊肌醇的步驟。
12.一種制備青蟹肌糖用微生物的篩選方法，其特征在于，誘變處理醋酸桿菌AB10253，以NAD+非依賴型肌醇2-脫氫酶活性為指標，從得到的突變株篩選。
13.一種制備青蟹肌糖用微生物的篩選方法，其特征在于，從含有微生物的天然試樣之中分離微生物，以NAD+非依賴型肌醇2-脫氫酶活性為指標，從經(jīng)分離的微生物篩選。
14.一種青蟹肌糖的制備方法，其特征在于，通過在含有肌醇的培養(yǎng)基中培養(yǎng)由權利要求12或13所述的篩選方法得到的制備青蟹肌糖用微生物，由肌醇生成青蟹肌糖，從培養(yǎng)基分離純化生成的青蟹肌糖。
15.一種鯊肌醇的制備方法，包括通過在含有肌醇的培養(yǎng)基中培養(yǎng)由權利要求12或13所述的篩選方法得到的制備青蟹肌糖用微生物，由肌醇生成青蟹肌糖的步驟；使還原劑與上述青蟹肌糖作用，生成鯊肌醇的步驟；以及，分離純化上述鯊肌醇的步驟。
16.一種具有下述理化性質的鯊肌醇脫氫酶，反應如下述反應式所示，催化鯊肌醇與青蟹肌糖間的氧化還原反應、在NADH或NADPH存在下將青蟹肌糖立體特異地還原成鯊肌醇。[化1] 青蟹肌糖 鯊肌醇
17.根據(jù)權利要求16所述的鯊肌醇脫氫酶，其中，還進一步具有下述的理化性質，(a)分子量及締合特性38-46k道爾頓，形成2聚體或3聚體；(b)輔酶將NAD+或NADP+或者NADH或NADPH作為輔酶；(c)活化重金屬在Co2+離子的存在下被活化；(d)抑制重金屬在Sn2+離子的存在下被抑制；(e)最適pH在pH5-9下具有活性。
18.下述(A)或(B)的蛋白質，(A)包含SEQ.ID.NO28所示的氨基酸序列的蛋白質；(B)包含在SEQ.ID.NO28所示的氨基酸序列中有1個或多個氨基酸發(fā)生取代、缺失、插入、和/或附加的氨基酸序列，并具有催化鯊肌醇與青蟹肌糖間的氧化還原反應、在NADH或NADPH存在下將青蟹肌糖立體特異地還原成鯊肌醇的酶活性的蛋白質。
19.編碼下述(A)或(B)的蛋白質的DNA，(A)包含SEQ.ID.NO28所示的氨基酸序列構成的蛋白質；(B)包含在SEQ.ID.NO28所示的氨基酸序列中有1個或多個氨基酸發(fā)生取代、缺失、插入、和/或附加的氨基酸序列，并具有催化鯊肌醇與青蟹肌糖間的氧化還原反應、在NADH或NADPH存在下將青蟹肌糖立體特異地還原成鯊肌醇的酶活性的蛋白質。
20.下述(a)或(b)的DNA，(a)包含SEQ.ID.NO27所示的堿基序列的編碼區(qū)的DNA；(b)與具有SEQ.ID.NO27所示的堿基序列或與該堿基序列互補的堿基序列的DNA在嚴格條件下雜交，并編碼具有催化鯊肌醇與青蟹肌糖間的氧化還原反應、在NADH或NADPH存在下將青蟹肌糖立體特異地還原成鯊肌醇的酶活性的蛋白質的DNA。
21.一種包含權利要求19或20所述的DNA的載體。
22.一種保留權利要求19或20所述的DNA、或者權利要求21所述的載體的轉化微生物。
23.根據(jù)權利要求22所述的轉化微生物，轉化的宿主是大腸桿菌。
24.一種鯊肌醇脫氫酶的制備方法，其特征在于，培養(yǎng)權利要求22或23所述的轉化微生物，從培養(yǎng)物收集鯊肌醇脫氫酶。
25.一種鯊肌醇的制備方法，其特征在于，使權利要求16所述的鯊肌醇脫氫酶、和催化在NAD+或NADP+存在下氧化肌醇生成青蟹肌糖的反應的肌醇2-脫氫酶(EC1.1.1.18)共存的溶液中，在pH6.0-8.5下且在NAD+或NADP+存在下，將肌醇作為底物，使之發(fā)生酶轉化反應成為鯊肌醇。
26.根據(jù)權利要求25所述的鯊肌醇的制備方法，其特征在于，在溶液中添加青蟹肌糖并使之達到0.01-3％。
27.根據(jù)權利要求25所述的鯊肌醇的制備方法，其特征在于，在溶液中添加青蟹肌糖并使之達到0.2-0.5％。
28.根據(jù)權利要求25所述的鯊肌醇的制備方法，其特征在于，在溶液中添加Co鹽和/或Mg鹽，并使之達到0.01-5.0mM。
29.根據(jù)權利要求25所述的鯊肌醇的制備方法，其特征在于，在溶液中添加Co鹽和/或Mg鹽，并使之達到0.2-2.0mM。
30.根據(jù)權利要求25所述的鯊肌醇的制備方法，其特征在于，進行制備使得溶液中的肌醇濃度達到5-22％，使經(jīng)酶反應生成的鯊肌醇在反應溶液中結晶化，將鯊肌醇以晶體形式篩選到體系外。
31.根據(jù)權利要求25所述的制備方法，其中，鯊肌醇脫氫酶是下述(A)或(B)的蛋白質，(A)包含SEQ.ID.NO28所示的氨基酸序列的蛋白質；(B)包含在SEQ.ID.NO28所示的氨基酸序列中有1個或多個氨基酸發(fā)生取代、缺失、插入、和/或附加的氨基酸序列，并具有催化鯊肌醇與青蟹肌糖間的氧化還原反應、在NADH或NADPH存在下將青蟹肌糖立體特異地還原成鯊肌醇的酶活性的蛋白質。
32.根據(jù)權利要求25所述的制備方法，其中，鯊肌醇脫氫酶是由下述(a)或(b)的DNA編碼的蛋白質，(a)包含SEQ.ID.NO27所示的堿基序列的編碼區(qū)的DNA；(b)與具有SEQ.ID.NO27所示的堿基序列或與該堿基序列互補的堿基序列的DNA在嚴格條件下雜交，并編碼具有催化鯊肌醇與青蟹肌糖間的氧化還原反應、在NADH或NADPH存在下將青蟹肌糖立體特異地還原成鯊肌醇的酶活性的蛋白質的DNA。
33.根據(jù)權利要求25所述的制備方法，其中，鯊肌醇脫氫酶是下述(C)或(D)的蛋白質，(C)包含SEQ.ID.NO2、4、6、8、10、12或14所示的氨基酸序列的蛋白質；(D)包含在SEQ.ID.NO2、4、6、8、10、12或14所示的氨基酸序列中有1個或多個氨基酸發(fā)生取代、缺失、插入、和/或附加的氨基酸序列，并具有催化鯊肌醇與青蟹肌糖間的氧化還原反應、在NADH或NADPH存在下將青蟹肌糖立體特異地還原成鯊肌醇的酶活性的蛋白質。
34.根據(jù)權利要求25所述的制備方法，其中，鯊肌醇脫氫酶是由下述(c)或(d)的DNA編碼的蛋白質，(c)包含在SEQ.ID.NO1、3、5、7、9、11或13所示的堿基序列的編碼區(qū)的DNA；(d)與具有SEQ.ID.NO1、3、5、7、9、11或13所示的堿基序列或與該堿基序列互補的堿基序列的DNA在嚴格條件下雜交，并編碼具有催化鯊肌醇與青蟹肌糖間的氧化還原反應、在NADH或NADPH存在下將青蟹肌糖立體特異地還原成鯊肌醇的酶活性的蛋白質的DNA。
35.一種鯊肌醇的制備方法，包括，在含有鯊肌醇及鯊肌醇以外的中性糖的混合液中，加入溶解于該混合液中的鯊肌醇的2倍摩爾以上的量的硼酸和金屬鹽，且將該混合液的pH調至8.0-11.0，形成鯊肌醇·硼酸復合體的第1步驟；從混合液分離上述復合體的第2步驟；使經(jīng)分離的復合體溶解于酸中，從而使之分解為鯊肌醇和硼酸的第3步驟；由在第3步驟中得到的酸性溶液或酸性懸浮液分離純化鯊肌醇的第4步驟。
36.根據(jù)權利要求35所述的制備方法，其特征在于，在上述第1步驟中，加入的硼酸和金屬鹽的量是在上述溶解于混合液中的鯊肌醇的2倍摩爾以上、且3倍摩爾以下。
37.根據(jù)權利要求35所述的制備方法，其特征在于，在上述第1步驟中，將上述混合液的pH調整為9.0-10.0。
38.根據(jù)權利要求35所述的制備方法，其中，上述金屬鹽是選自NaCl、NaHCO3、Na2CO3、Na2SO4、NaHSO4、NaH2PO4、Na2HPO4、Na3PO4、硼砂、KCl、KHCO3、K2CO3、K2SO4、KHSO4、KH2PO4、K2HPO4、K3PO4、MgCl2、MgCO3、及MgSO4的1種或2種以上的金屬鹽。
39.根據(jù)權利要求35所述的制備方法，其中，上述含有鯊肌醇及鯊肌醇以外的中性糖的混合液，是通過在含有青蟹肌糖的溶液中還原青蟹肌糖而得到的含有肌醇和鯊肌醇的混合液。
40.根據(jù)權利要求35所述的制備方法，其特征在于，在上述第3步驟中，將使上述復合體溶解于酸而得到的溶液調至0.1當量以上的酸性，并且，在上述第4步驟中，使上述酸性溶液與強酸性離子交換樹脂、及強堿性離子交換樹脂或硼酸選擇性吸附樹脂接觸后，從該酸性溶液析出鯊肌醇。
41.根據(jù)權利要求35所述的制備方法，其特征在于，在上述第4步驟中，向上述酸性溶液或酸性懸浮液中加入水溶性有機溶劑，使鯊肌醇析出。
42.根據(jù)權利要求41所述的制備方法，其特征在于，上述水溶性有機溶劑是乙醇或甲醇，相對于上述酸性溶液或酸性懸浮液，加入0.3-3倍容積的乙醇、或者0.3-5倍容積的甲醇。
43.根據(jù)權利要求41所述的制備方法，其特征在于，上述水溶性有機溶劑是乙醇或甲醇，相對于上述酸性溶液或酸性懸浮液，加入0.6-1.5倍容積的乙醇、或者0.9-2倍容積的甲醇。
44.一種鯊肌醇的制備方法，包括在含有青蟹肌糖的溶液中，使用硼氫化金屬鹽還原青蟹肌糖，得到含有肌醇和鯊肌醇的混合液的第1步驟；向上述混合液中加入酸，使混合液中的鯊肌醇·硼酸復合體溶解，并且將溶液調至0.01當量以上的酸性溶液的第2步驟；以及，以肌醇不析出的量向上述酸性溶液中加入水溶性有機溶劑，從而只使鯊肌醇析出的第3步驟。
45.根據(jù)權利要求44所述的制備方法，其特征在于，在上述第3步驟中，加入的水溶性有機溶劑是乙醇、甲醇或者1-丙醇，相對于上述酸性溶液，加入0.2-0.4倍容積的乙醇、0.2-0.8倍容積的甲醇、或者0.2-0.4倍容積的1-丙醇。
46.根據(jù)權利要求44所述的制備方法，其特征在于，在上述第3步驟中，加入的水溶性有機溶劑是乙醇、甲醇或者1-丙醇，相對于上述酸性溶液，加入0.35-0.45倍容積的乙醇、0.45-0.55倍容積的甲醇、或者0.35-0.45倍容積的1-丙醇。
全文摘要
本發(fā)明提供在NAD
文檔編號C07C35/00GK1867676SQ200480030178
公開日2006年11月22日 申請日期2004年10月14日 優(yōu)先權日2003年10月14日
發(fā)明者山口將憲, 北雄一, 森哲也, 神邊健司, 友田明宏, 高橋篤, 市川稚子 申請人:北興化學工業(yè)株式會社