專利名稱：新型螯合劑和螯合物及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一組新型螯合劑、新型螯合物、用所述螯合物或螯合劑標(biāo)記的生物分子以及與所述螯合物、螯合劑或標(biāo)記的生物分子綴合的固體載體。
背景技術(shù)：
本文使用的用于說明發(fā)明背景的出版物和其他材料，特別是用于詳細(xì)說明本發(fā)明的那些出版物和其他材料通過引用結(jié)合到本文中來。
由于鑭系(III)螯合物獨(dú)特的發(fā)光性能，通常作為非放射性標(biāo)記物廣泛用于各種日常和研究應(yīng)用。由于鑭系(III)螯合物發(fā)光強(qiáng)、發(fā)光衰變時(shí)間長，因此為需要高靈敏度試驗(yàn)的理想標(biāo)記物?；阼|系螯合物的時(shí)間分辨熒光試驗(yàn)越來越多地用于診斷、研究和高通量篩選。多相DELFIA技術(shù)用于需要特殊的靈敏度、強(qiáng)度和多標(biāo)記方法的試驗(yàn)[Hemmil等，Anal.Biochem.1984，137，335-343]?；跓晒夤舱衲芰哭D(zhuǎn)化(TR-FRET)、熒光猝滅(TR-FQA)或改變結(jié)合反應(yīng)過程中的發(fā)光性能，開發(fā)了發(fā)光高度穩(wěn)定的螯合物，將時(shí)間分辨的應(yīng)用延伸至均相試驗(yàn)[Hemmil，I.；Mukkala，V.-M.Crit.Rev.Clin.Lab.Sci.2001，38，441-519]。
在大多數(shù)情況下綴合反應(yīng)在溶液中進(jìn)行，生物活性分子(例如蛋白質(zhì)、肽、核酸、低聚核苷酸或半抗原)的氨基或巰基與鑭系(III)螯合物的異硫氰酸基、鹵代乙?；?、3，5-二氯-2，4，6-三嗪基衍生物以及其他報(bào)道基團(tuán)反應(yīng)。
由于在所有的情況下均使用過量的活性標(biāo)記物進(jìn)行標(biāo)記反應(yīng)，因此繁復(fù)的純化過程是不可避免的。更具體地講，當(dāng)存在幾個(gè)相似反應(yīng)活性的官能團(tuán)需要連接幾個(gè)標(biāo)記分子或?qū)μ囟ú课粯?biāo)記時(shí)，所需的生物分子綴合物的分離和表征鑒定是非常困難的，通常在實(shí)際應(yīng)用中不能實(shí)現(xiàn)。當(dāng)然，不能避免大生物分子(例如蛋白質(zhì))的溶液相標(biāo)記。在這些情況下，標(biāo)記反應(yīng)必須盡可能地有選擇性和有效。
已努力開發(fā)適用于時(shí)間分辨熒光應(yīng)用的新型高度發(fā)光螯合物標(biāo)記物。這些標(biāo)記物的實(shí)例有由作為能量傳遞(mediating)基團(tuán)的以下物質(zhì)的衍生物和作為螯合部分的多元羧酸組成的穩(wěn)定的螯合物各種吡啶[US 4,920,195、US 4,801,722、US 4,761,481、PCT/FI91/00373、US 4,459,186、EP A-0770610、Remuinan等，J.Chem.Soc.Perkin Trans2，1993，1099]、各種聯(lián)吡啶[US 5,216,134]、各種三聯(lián)吡啶[US4,859,777、US 5,202,423、US 5,324,825]或各種酚類化合物[US4,670,572、US 4,794,191、意大利專利42508 A789]。此外，還公開了各種二羧酸酯衍生物[US 5,032,677、US 5,055,578、US 4,772,563]、大環(huán)穴狀化合物[US 4,927,923、WO 93/5049、EP-A-493745]和大環(huán)席夫堿類[EP-A-369-000]。還公開了使用固相合成法，用發(fā)光標(biāo)記物標(biāo)記生物特異性結(jié)合反應(yīng)物(例如半抗原、肽、受體配體、藥物或PNA低聚物)的方法[US 6,080,839]。還開發(fā)了在固相上多標(biāo)記低聚核苷酸的類似方法[EP A 1152010、EP A 1308452]。
但是，以前未描述過在其發(fā)色部分具有呋喃基取代的吡啶基且具有能與生物分子或固相結(jié)合的活性基團(tuán)的螯合物或螯合劑。
發(fā)明目標(biāo)和概述本發(fā)明的主要目標(biāo)為提供螯合劑及其金屬螯合物，所述螯合劑及其金屬螯合物用于標(biāo)記生物分子用作時(shí)間分辨熒光光譜、磁共振成象(MRI)或正子發(fā)射斷層攝影(PET)的探頭。
本發(fā)明的一個(gè)具體的目標(biāo)為提供一種螯合劑，所述螯合劑與不同的螯合的鑭系離子，特別是銪(III)、釤(III)、鋱(III)和鏑(III)一起有很強(qiáng)的熒光。這些鑭系螯合物特別用于多參數(shù)生物親和力試驗(yàn)和候選藥物的高通量篩選。
本發(fā)明的另一個(gè)目標(biāo)為提供使金屬螯合物高度穩(wěn)定的螯合劑。具體目標(biāo)為要獲得有足夠的穩(wěn)定性以用于體內(nèi)應(yīng)用的螯合物，例如用于MRI或PET應(yīng)用。
本發(fā)明的另一個(gè)目標(biāo)為提供適用于在溶液中標(biāo)記生物分子的螯合物或螯合劑。
本發(fā)明的再一個(gè)目標(biāo)為提供適用于在固相上合成并同時(shí)標(biāo)記低聚肽或低聚核苷酸的螯合物或螯合劑。
本發(fā)明的再一個(gè)目標(biāo)為提供與本發(fā)明的螯合物、螯合劑或生物分子綴合的固體載體。
因此，本發(fā)明的一方面涉及一種螯合劑，所述螯合劑包含-發(fā)色部分，所述發(fā)色部分包含一個(gè)或多個(gè)芳族單元，其中至少一個(gè)所述芳族單元為呋喃基取代的吡啶基，-螯合部分，所述螯合部分包含至少兩個(gè)羧酸或膦酸基團(tuán)或所述酸的酯或鹽，所述螯合部分與所述發(fā)色部分的芳族單元或者直接相連或者通過含氮的烴鏈相連，和-活性基團(tuán)A，所述活性基團(tuán)通過連接基x連接于所述發(fā)色部分或所述螯合部分，所述活性基團(tuán)A能與固相上的生物分子或官能團(tuán)結(jié)合。
本發(fā)明的另一方面涉及一種螯合物，所述螯合物包含-金屬離子，-發(fā)色部分，所述發(fā)色部分包含一個(gè)或多個(gè)芳族單元，其中至少一個(gè)所述芳族單元為呋喃基取代的吡啶基，-螯合部分，所述螯合部分包含至少兩個(gè)羧酸或膦酸基團(tuán)或所述酸的酯或鹽，所述螯合部分與所述發(fā)色部分的芳族單元或者直接相連或者通過含氮的烴鏈相連，和-活性基團(tuán)A，所述活性基團(tuán)通過連接基x連接于所述發(fā)色部分或所述螯合部分，所述活性基團(tuán)A能與固相上的生物分子或官能團(tuán)結(jié)合。
本發(fā)明的第三方面涉及一種與本發(fā)明的螯合物綴合的生物分子。
本發(fā)明的第四方面涉及一種與本發(fā)明的螯合劑綴合的生物分子。
本發(fā)明的第五方面涉及一種與本發(fā)明的螯合物或標(biāo)記的生物分子綴合的固體載體。
本發(fā)明的第六方面涉及一種已標(biāo)記的低聚肽，所述已標(biāo)記的低聚肽通過在固相上合成的方法制得，所述方法為向低聚肽合成儀上的所述低聚肽結(jié)構(gòu)中引入適當(dāng)?shù)谋景l(fā)明的螯合劑，隨后脫保護(hù)并任選還引入金屬離子。
本發(fā)明的第七方面涉及一種已標(biāo)記的低聚核苷酸，所述已標(biāo)記的低聚核苷酸通過在固相上合成的方法制得，所述方法為向低聚核苷酸合成儀上的所述低聚核苷酸結(jié)構(gòu)中引入適當(dāng)?shù)谋景l(fā)明的螯合劑，隨后脫保護(hù)并任選還引入金屬離子。
本發(fā)明的第八方面涉及一種與權(quán)利要求1的螯合劑綴合的固體載體，所述固體載體適用于合成低聚核苷酸，其中所述活性基團(tuán)A為-Y-O-x′-其中x′為與所述固體載體相連的連接基，與所述連接基x相同或不同。
Y不存在或?yàn)猷堰驶蜞奏せ蛉魏纹渌m用于合成修飾的低聚核苷酸的修飾堿的基團(tuán)，所述堿通過i)或ii)與氧原子相連，i)被已保護(hù)的羥乙基取代的烴鏈，ii)呋喃環(huán)或吡喃環(huán)或適用于合成修飾的低聚核苷酸的任何修飾的呋喃環(huán)或吡喃環(huán)。
本發(fā)明的第十方面涉及一種螯合劑，所述螯合劑包含-發(fā)色部分，所述發(fā)色部分包含至少兩個(gè)芳族單元，其中至少一個(gè)所述芳族單元為呋喃基取代的吡啶基，和-螯合部分，所述螯合部分包含至少兩個(gè)羧酸或膦酸基團(tuán)或所述酸的酯或鹽，所述螯合部分與所述發(fā)色部分的芳族單元或者直接相連或者通過含氮的烴鏈相連，其中所述芳族單元通過含氮的烴鏈互相連接。
最后，本發(fā)明還涉及包含上述螯合劑和金屬離子的螯合物。
發(fā)明詳述螯合劑基于其中的發(fā)色部分最常見為包含一個(gè)或多個(gè)呋喃基取代的吡啶基的二價(jià)芳族結(jié)構(gòu)的螯合劑及金屬螯合物為新型物質(zhì)。所述呋喃基取代的吡啶基能吸收光或能量并將激發(fā)能轉(zhuǎn)移至螯合的鑭系離子，使得熒光性更強(qiáng)，而與使用的鑭系離子無關(guān)。除了一個(gè)或多個(gè)所述呋喃基取代的吡啶基，所述發(fā)色部分還可包含未取代的吡啶基、帶有其他取代基的吡啶基和/或其他芳基。
在合成策略中，使用3-(三丁基甲錫烷基)呋喃代替2-(三丁基甲錫烷基)呋喃作為試劑，可通過其C2原子或通過其C3原子使呋喃基與吡啶環(huán)相連。在本文具體實(shí)施例中說明的化合物中，吡啶基的4-位帶有呋喃取代基。雖然該位置是最優(yōu)選的取代基的位置，但吡啶環(huán)的其他位置也可被取代。
根據(jù)一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，所述發(fā)色部分包含兩個(gè)或三個(gè)吡啶基，其中至少一個(gè)吡啶基被呋喃基取代。這些吡啶基可直接互相連接，分別形成聯(lián)吡啶或三聯(lián)吡啶基。或者，更優(yōu)選這些吡啶基通過含氮的烴鏈互相連接。在這種情況下，可得到穩(wěn)定性非常好的螯合物。該結(jié)構(gòu)的螯合劑使得金屬螯合物足夠穩(wěn)定，可用于體內(nèi)MRI和/或PET應(yīng)用。
包含三個(gè)芳族單元(例如三個(gè)吡啶基，其中至少一個(gè)吡啶基被呋喃基取代)的化合物，例如基于氮雜冠醚(aza-crown)的化合物特別適用于基于能量轉(zhuǎn)移或猝滅的試驗(yàn)，這是因?yàn)樗鼈冊(cè)诩s615nm處的發(fā)射光譜峰更占優(yōu)勢(shì)，這對(duì)分析用的波長擾動(dòng)較小。
在螯合部分與發(fā)色部分的芳族單元相連的情況下，螯合部分可與吡啶環(huán)相連或與其上的取代基(例如呋喃基)相連。
為了使螯合劑或螯合物能與生物分子或固體載體共價(jià)結(jié)合，所述螯合劑或螯合物必須帶有活性基團(tuán)A。但是，也存在不需要這種共價(jià)結(jié)合的應(yīng)用情況。本發(fā)明的螯合化合物還可用于螯合物中不需要活性基團(tuán)的應(yīng)用。這種技術(shù)的一個(gè)實(shí)例例如描述于Blomberg等，J.Immunological Methods，1996，193，199。另一個(gè)不需要活性基團(tuán)A的實(shí)例為分離嗜曙紅細(xì)胞和嗜堿細(xì)胞。在這種應(yīng)用時(shí)，帶正電荷的螯合物和帶負(fù)電荷的螯合物分別與帶負(fù)電荷的細(xì)胞表面和帶正電荷的細(xì)胞表面結(jié)合。
雖然在許多應(yīng)用中活性基團(tuán)A原則上可與發(fā)色基團(tuán)或螯合部分直接相連，但是特別考慮到位阻的原因，還是非常希望活性基團(tuán)A與發(fā)色基團(tuán)或螯合部分之間分別具有連接基x。在螯合物用于固相合成低聚肽和低聚核苷酸的情況下，所述連接基是非常重要的，但再溶液中標(biāo)記生物分子也希望具有連接基。
根據(jù)一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，所述活性基團(tuán)A選自異硫氰酸酯、鹵代乙酰氨基、順丁烯二酰亞氨基、二氯三嗪基、二氯三嗪基氨基、吡啶基二硫基、硫代酯、氨基氧基、酰肼、氨基、聚合基團(tuán)和羧酸或其酰氯或活性酯。特別是在螯合物或螯合劑與微米微粒(micropaticle)或納米微粒相連的情況下，優(yōu)選活性基團(tuán)為聚合基團(tuán)。在這種情況下，可在形成顆粒的過程中將標(biāo)記引入顆粒中。
優(yōu)選所述連接基x由1-10個(gè)部分形成，每一個(gè)部分選自亞苯基、包含1-12個(gè)碳原子的亞烷基、亞乙炔基(-C≡C-)、1，2-亞乙烯基(-C＝C-)、醚基(-O-)、硫醚基(-S-)、酰氨基(-CO-NH-、-CO-NR′-、-NH-CO-和-NR′-CO-)、羰基(-CO-)、酯基(-COO-和-OOC-)、二硫基(-SS-)、重氮基(-N＝N-)和叔胺基，其中R′表示包含少于5個(gè)碳原子的烷基。
基團(tuán)A-x-可以不同的方式與分子相連?；鶊F(tuán)A-x-可與螯合部分相連，與將芳族單元結(jié)合在一起的含氮的鏈相連，或者與芳族單元相連。在最后一種情況下，優(yōu)選所述基團(tuán)A-x-與呋喃取代基相連。這種化合物易制備，并發(fā)現(xiàn)非常有效。
根據(jù)一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案，所述螯合劑為以下特定結(jié)構(gòu)中的一種
用于合成肽的螯合劑根據(jù)一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，本發(fā)明的螯合劑適用于合成低聚肽。在這種應(yīng)用中，所述活性基團(tuán)A通過連接基x與螯合劑相連，A為氨基酸殘基-CH(NHR1)R5，其中R1為臨時(shí)的保護(hù)基團(tuán)，R5為羧酸或其鹽、酰鹵或酯。特別優(yōu)選的螯合劑為以下結(jié)構(gòu) 其中x如上定義，所述保護(hù)基團(tuán)R1選自Fmoc(芴基甲氧基羰基)、Boc(叔丁氧基羰基)或Bsmoc(1，1-二氧代苯并[b]噻吩-2-基甲氧基羰基)，R″為烷基酯或烯丙基酯，R為烷基。
可使用肽合成儀將螯合劑引入生物分子中。可例如通過描述于Jones，J.，The Chemical Synthesis of Peptides，Oxford Univesity Press，Oxford，1994的碳二亞胺化學(xué)(即在活化劑存在下，標(biāo)記試劑的羧酸官能團(tuán)與固體載體或氨基酸的氨基反應(yīng))將螯合劑與和固體載體相連或固定的氨基酸的氨基偶聯(lián)。當(dāng)縮合步驟完成后，將標(biāo)記試劑的臨時(shí)的氨基保護(hù)基團(tuán)選擇性地除去，而材料仍與固體載體相連(例如在Fmoc-保護(hù)基團(tuán)的情況下，與哌啶相連)。隨后如上進(jìn)行螯合劑或其他試劑(氨基酸、半抗原)的二次偶聯(lián)。當(dāng)所需分子的合成完成后，材料從固體載體上移除并脫保護(hù)?？刹捎肏PLC技術(shù)進(jìn)行純化。最后，通過加入已知量的金屬離子將已純化的配體轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的金屬螯合物。
用于合成低聚核苷酸的螯合劑根據(jù)另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，本發(fā)明的螯合劑適用于合成低聚核苷酸。在這種情況下，所述活性基團(tuán)A通過連接基x與螯合劑相連，A為-Y-O-PZ-O-R4其中一個(gè)氧原子任選被硫置換，Z為氯或NR2R3，R4為保護(hù)基團(tuán)，R2和R3為烷基，Y不存在或?yàn)猷堰蕢A或嘧啶堿或任何其他適用于合成修飾的低聚核苷酸的修飾堿的基團(tuán)。所述堿通過i)或ii)與氧原子相連，其中i)為被已保護(hù)的羥乙基取代的烴鏈，ii)為適用于合成修飾的低聚核苷酸的呋喃環(huán)或吡喃環(huán)或任何修飾的呋喃環(huán)或吡喃環(huán)。
可使用低聚核苷酸合成儀將螯合劑引入低聚核苷酸中。一種基于Mitsonobu烷基化(J.Org.Chem.，1999，64，5083；Nucleosides，Nucleotides，1999，18，1339)的可用的方法公開于EP-A-1152010。所述專利公開的方法為在鏈裝配的過程中將所需數(shù)量的綴合基團(tuán)與低聚核苷酸結(jié)構(gòu)直接相連。因此避免了溶液相標(biāo)記和繁雜的純化過程。在合成核苷低聚核苷酸結(jié)構(gòu)單元的方法中，關(guān)鍵的反應(yīng)為上述的Mitsonobu烷基化反應(yīng)，該反應(yīng)將各種螯合劑引入核苷中，最后引入低聚核苷酸結(jié)構(gòu)中。在鏈裝配的過程中引入螯合劑。合成完成后，在脫保護(hù)步驟中轉(zhuǎn)化為鑭系螯合物。
由于活性細(xì)胞中的酶降解低聚核苷酸，因此通常未修飾的低聚核苷酸在生理?xiàng)l件下穩(wěn)定性差。因此，希望根據(jù)已知的方法制備修飾的低聚核苷酸，以增強(qiáng)其耐化學(xué)品和耐酶降解的穩(wěn)定性。在現(xiàn)有技術(shù)中廣泛公開了低聚核苷酸的修飾。參見US 5,612,215。已知從RNA鏈的核糖單元除去或置換2′-羥基可得到更好的穩(wěn)定性。WO 92/07065和US 5,672,695公開了用鹵素、氨基、疊氮基或巰基置換核糖的2′-羥基。US 5,334,711公開了用烷基或烯基，優(yōu)選甲基或烯丙基置換2′-羥基的氫。此外，例如可將核苷酸間的磷酸二酯鍵修飾，使得一個(gè)或多個(gè)氧被硫、氨基、烷基或烷氧基置換。優(yōu)選將核苷酸間的鍵修飾為硫代磷酸酯鍵。在核苷酸中的堿也可被修飾。
優(yōu)選Y為胸腺嘧啶、尿嘧啶、腺苷、鳥嘌呤或胞嘧啶中任一種堿的基團(tuán)，所述堿通過i)或ii)與氧原子相連，其中i)為被已保護(hù)的羥乙基取代的烴鏈，ii)為在其4-位上具有已保護(hù)的羥乙基并任選在其2-位上具有羥基、已保護(hù)的羥基或修飾的羥基的呋喃環(huán)。
優(yōu)選活性基團(tuán)-Y-O-P(NR2R3)-O-R4具有下式的結(jié)構(gòu)之一
其中-為連接基x的位置，DMTr為二甲氧基三苯甲基。
用于該用途的特別優(yōu)選的螯合劑選自以下公開的特定結(jié)構(gòu)中的一種 其中R″為烷基酯或烯丙基酯，R為烷基，其中x如上定義，A為如上定義的-Y-O-P(NR2R3)-O-R4。
螯合物所述螯合物包含上述的螯合劑和螯合的金屬離子。
在螯合物是用于生物親和力試驗(yàn)的情況下，所述螯合的金屬離子M優(yōu)選為鑭系元素，特別是銪(III)、釤(III)、鋱(III)或鏑(III)。所述螯合劑優(yōu)選為上述優(yōu)選的試劑之一。
特別優(yōu)選的鑭系螯合物為
其中M為金屬，z為2或3。
本發(fā)明的螯合物可用于體內(nèi)MRI或PET。用于MRI的優(yōu)選的金屬為釓。但是，用于MRI的還有鑭系元素，特別是銪(III)，還有其他鑭系元素例如釤(III)和鏑(III)。在PET應(yīng)用中，在恰好使用之前將放射性金屬同位素引入螯合劑中。特別合適的放射性同位素有Ga-66、Ga-67、Ga-68、Cr-51、In-111、Y-90、Ho-166、Sm-153、Lu-177、Er-169、Tb-161、Dy-165、Ho-166、Ce-134、Nd-140、Eu-157、Er-165、Ho-161、Eu-147、Tm-167和Co-57。為了得到非常穩(wěn)定的螯合物，優(yōu)選所述螯合物含有通過含氮烴鏈將幾個(gè)吡啶基相互連接在一起的發(fā)色部分。
生物分子與本發(fā)明的螯合劑或螯合物綴合的生物分子優(yōu)選為低聚肽、低聚核苷酸、DNA、RNA、修飾的低聚核苷酸或多核苷酸(例如單硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、氨基磷酸酯和/或糖修飾的或堿修飾的低聚核苷酸或多核苷酸)、蛋白質(zhì)、寡糖、多糖、磷脂、PNA、LNA、抗體、半抗原、藥物、受體結(jié)合配體和凝集素(lectine)。
固體載體綴合物本發(fā)明的螯合物、螯合劑和生物分子可在固體載體上綴合。所述固體載體優(yōu)選為顆粒(例如微米微粒或納米微粒)、載玻片(slide)或平板。
在所述螯合物或螯合劑含有聚合基團(tuán)作為活性基團(tuán)的情況下，則可在制備顆粒的同時(shí)將螯合物或螯合劑引入固體載體(例如顆粒)中。
與固體載體共價(jià)綴合或非共價(jià)綴合的生物分子優(yōu)選為已標(biāo)記的低聚肽，所述已標(biāo)記的低聚肽在固相上合成制得，在低聚肽合成儀上向所述低聚肽結(jié)構(gòu)中引入螯合劑，隨后脫保護(hù)并任選引入金屬離子。或者，與固體載體共價(jià)綴合或非共價(jià)綴合的生物分子優(yōu)選為已標(biāo)記的低聚核苷酸，所述已標(biāo)記的低聚核苷酸在固相上合成制得，在低聚核苷酸合成儀上向所述低聚核苷酸結(jié)構(gòu)中引入螯合劑，隨后脫保護(hù)并任選引入金屬離子。
與含有活性基團(tuán)A的螯合劑綴合的固體載體適用于合成低聚核苷酸，所述活性基團(tuán)A通過連接基x與所述螯合劑相連，A為如上定義的-Y-O-x′-。
用以下非限制性的實(shí)施例來說明本發(fā)明。
實(shí)施例用以下實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明。在實(shí)驗(yàn)部分使用的結(jié)構(gòu)和合成路線描述于流程1-11。流程(scheme)1說明螯合物3的合成。實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)見實(shí)施例1-3。流程2說明螯合物9的合成。實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)見實(shí)施例4-9。流程3說明標(biāo)記試劑13的合成。實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)見實(shí)施例10-13。流程4說明用于將鑭系螯合物引入固相上的低聚肽結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)單元18的合成。實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)見實(shí)施例14-18。流程5說明標(biāo)記試劑21-23的合成。實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)見實(shí)施例19-23。流程6A和B說明標(biāo)記試劑34的合成。實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)見實(shí)施例24-34。流程7說明用于將鑭系螯合物固相引入固相上的低聚核苷酸結(jié)構(gòu)的低聚核苷酸標(biāo)記試劑的制備。流程8說明呋喃部分通過C3與吡啶環(huán)相連的螯合物的合成。流程9說明用標(biāo)記試劑23標(biāo)記半抗原。實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)見實(shí)施例37。流程10說明用結(jié)構(gòu)單元18標(biāo)記固相上的低聚肽。實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)見實(shí)施例35。流程11說明用標(biāo)記反應(yīng)物34a標(biāo)記溶液中的低聚肽。實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)見實(shí)施例36。流程12A說明實(shí)施例38-45，流程12B說明實(shí)施例46-47，流程13說明實(shí)施例48-54。
實(shí)驗(yàn)方法機(jī)器輔助低聚肽合成的試劑購自Applied Biosystems(FosterCity，CA)。在填充硅膠60(Merck)的柱上進(jìn)行吸附柱層析。NMR光譜在Brucker 250或Jeol LA-400光譜儀上記錄，對(duì)于1H的工作頻率分別為250.13和399.8MHz。使用Me4Si作為內(nèi)標(biāo)。偶聯(lián)常數(shù)的單位是Hz。IR光譜在Perkin Elmer 2000 FT-IR分光光度計(jì)上記錄?？煸愚Z擊質(zhì)譜在VG ZabSpec-ao TOF儀器上記錄，使用正檢測模式。電噴霧質(zhì)譜在Applied Biosystems Mariner ESI-TOF儀器上記錄。按照介紹的方法，將低聚肽裝配在Applied Biosystems 433A合成儀上。熒光光譜在PerkinElmer LS 55儀器上記錄。
實(shí)施例1合成2，2′，2″，2-{[4-(2-呋喃基)吡啶-2，6-二基]雙(亞甲基次氨基)}四(乙酸)四(叔丁酯)1將2，2′，2″，2-{[4-溴吡啶-2，6-二基]雙(亞甲基次氨基)}四(乙酸)四(叔丁酯)(0.29g，0.43mmol)和2-(叔丁基甲錫烷基)呋喃(0.15g，0.43mmol)溶解于DMF(2.0ml)中，隨后用氬氣脫氣。加入四(三苯基膦)合鈀(0)(0.025g，0.020mmol)，隨后于100℃下將該混合物攪拌5小時(shí)。將該混合物冷卻至室溫，隨后真空濃縮。在硅膠柱上純化(洗脫液開始用石油醚，隨后用石油醚/乙酸乙酯＝5∶2(v/v))。產(chǎn)量0.14g(50％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)1.46(36H，s)；3.51(8H，s)；4.06(4H，s)；6.48-6.53(1H，m)；6.92-6.97(1H，m)；7.50-7.52(1H，m)；7.74-7.78(2H，m)；MS682(MH+)；.UVλmax/nm(H2O)290，227 IR(film)/cm-11782(C＝O)，1146(C-O).
實(shí)施例2合成2，2′，2″，2-{[4-(2-呋喃基)吡啶-2，6-二基]雙(亞甲基次氨基)}四(乙酸)2將化合物1(20mg，0.03mmol)溶解于三氟乙酸(0.5ml)中，隨后于室溫下攪拌3.5小時(shí)。真空除去所有的揮發(fā)性物質(zhì)，隨后用乙醚研磨殘余物。過濾收集沉淀并干燥。產(chǎn)量9.3mg(46％)。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)d3.60(8H，s)；4.19(4H，s)；6.79-6.82(1H，m)；7.42-7.48(1H，m)；7.95-7.99(1H，m)；8.03-8.06(1H，m)；).MS 436(M+).UVλmax/nm(H2O)301.IR(film)/cm-11735；1618(C＝O)，1195(C-O).
實(shí)施例3合成2，2′，2″2-{[4-(2-呋喃基)吡啶-2，6-二基]雙(亞甲基次氨基)}四(乙酸)鑭系元素(III)螯合物3如Takalo等，Bioconjugate Chem.，1994，5，278中所述，將化合物2轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的銪(III)螯合物3a和釤(III)螯合物(3b)。
實(shí)施例4合成4′-(2-呋喃基)-2，2′:6′，2″-三聯(lián)吡啶4將4′-(三氟甲磺酸基)-2，2′:6′，2″-三聯(lián)吡啶(2.0g，5.2mmol)溶解于干燥的DMF(10ml)中。加入干燥的TEA(2.3g，23mmol)和2-(叔丁基甲錫烷基)呋喃(2.6g，7.3mmol)，隨后用氬氣將該混合物脫氣。加入二氯·雙(三苯基膦)合鈀(II)(0.10g，0.15mmol)，隨后在氬氣氣氛下，于90℃下將該混合物加熱1小時(shí)。加入水(200ml)，于室溫下繼續(xù)攪拌1小時(shí)。過濾形成的沉淀，并用冷水(3×20ml)洗滌。將該沉淀懸浮于乙醚(120ml)中，過濾，用乙醚(3×30ml)洗滌。用硅膠柱純化(洗脫液氯仿∶甲醇∶氫氧化銨＝12∶1∶0.25，v/v/v)。產(chǎn)量1.4g(88％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ6.57(1H，dd，J2 and 4)；7.12(1H，d，J4)；7.36(2H，ddd，J1，5 and 8)；7.59(1H，d，J2)；7.87(2H，dt，J2 and 8)；8.65(2H，brd，J8)；8.72(2H，s)；8.74(2H，br d，J5)；MS 300[M+].UVλmax/nm(EtOH)268，251.
實(shí)施例5合成4′-(呋喃基)-2，2′:6′，2″-三聯(lián)吡啶-N，N″-二氧化物5將化合物4(0.15g，0.50mmol)溶解于二氯甲烷(5.0ml)中。分批加入3-氯過苯甲酸(0.33g，1.9mmol)，隨后于室溫下將該混合物攪拌6小時(shí)。真空蒸除溶劑，隨后用硅膠柱純化粗產(chǎn)物(洗脫液二氯甲烷∶甲醇＝95∶5(v/v))。產(chǎn)量83mg(50％)。
1H NMR(400MHz；CDCl3)δ6.55(1H，m)；7.10(1H，m)；7.32(2H，m)；7.41(1H，m)；7.58(1H，m)；8.22(2H，br d，J8)；8.40；2H，d，J6)；9.19(2H，s)；MS 332[M+].UVλmax/nm(EtOH)288，249，234.IR(film)1269cm-1(N-O).
實(shí)施例6合成4′-(2-呋喃基)-2，2′:6′，2″-三聯(lián)吡啶-6，6″-二甲腈6將化合物5(0.070g，0.21mmol)溶解于二氯甲烷(5.0ml)中。加入三甲基甲硅烷基甲腈(0.21g，2.1mmol)，隨后將該混合物攪拌5分鐘，隨后滴加苯甲酰氯(0.12g，0.84mmol)。于室溫下將該反應(yīng)進(jìn)行1.5小時(shí)。加入碳酸鉀(10％w/v的水溶液，5.0ml)，隨后于室溫下將該混合物攪拌1.5小時(shí)。過濾形成的沉淀并用水(2×10ml)和二氯甲烷(2×10ml)洗滌。產(chǎn)量0.024g(33％)。MS 530[M+]。IR(KBr)/cm-12286(C≡N)；1610(C-N)。
實(shí)施例7合成2，2′，2″，2-{[4′-(2-呋喃基)-2，2′:6′，2″-三聯(lián)吡啶-6，6′-二基]雙(亞甲基次氨基)}四(乙酸)四(叔丁酯)7將化合物6(22mg，0.063mmol)懸浮于干燥的THF(1.5ml)中，隨后用氬氣脫氣。在5分鐘內(nèi)滴加硼烷-THF絡(luò)合物(1M，23mg，0.27mmol)，隨后于室溫下將該混合物攪拌16小時(shí)。加入干燥的甲醇(4.0ml)猝滅該反應(yīng)。真空除去所有的揮發(fā)性物質(zhì)，隨后將殘余物溶解于HCl的甲醇溶液(10ml)中，隨后于室溫下攪拌1小時(shí)，濃縮。將殘余物懸浮于干燥的THF中，過濾，干燥。將殘余物溶解于干燥的DMF(3.0ml)中，隨后用氬氣脫氣。加入DIPEA(66mg，0.51mmol)、溴代乙酸叔丁酯(60mg，0.31mmol)和碘化鉀(7.0mg，0.043mmol)，隨后于室溫下將該混合物攪拌16小時(shí)。真空除去所有的揮發(fā)性物質(zhì)。在硅膠柱上純化(洗脫液石油醚∶乙酸乙酯∶TEA＝10∶1∶1，v/v/v)。產(chǎn)量15mg。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ1.49(36H，s)；4.19(4H，s)；6.57(1H，m)；7.12(1H，m)；7.57(1H，m)；7.70(2H，d，J7.59)；7.85(2H，t，J7.5)；8.51(2H，d，J7.5)；8.72(2H，s).MS 836[M+].UVγmax/nm(EtOH)289，253IR(膜)/cm-11733(C＝O)；1145(C-O-O).
實(shí)施例8合成2，2′，2″，2-{[4′-(2-呋喃基)-2，2′:6′，2″-三聯(lián)吡啶-6，6′-二基]雙(亞甲基次氨基)}四(乙酸)8將化合物7(4.1mg，0.0051mmol)溶解于TFA(1.0ml)中，隨后于室溫下將該混合物攪拌4小時(shí)，隨后濃縮。用乙醚研磨殘余物，過濾收集并干燥。產(chǎn)量3.6mg(86％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ3.59(8H，s)；4.14(4H，s)；6.76(1H，dd，J1.8 and 3.5)；7.42(1H，d，J3.5)；7.66(1H，d，J8.0)；7.98(1H，s)；8.02(2H，t，J8.0)；8.52(2H，d，J8.0)；8.67(2H，s).UVγmax/nm(EtOH)289，IR(膜)/cm-11685(C＝O)；1200(C-O-O).
實(shí)施例9合成2，2′，2″，2-{[4′-(2-呋喃基)-2，2′:6′，2″-三聯(lián)吡啶-6，6′-二基]雙(亞甲基次氨基)}四(乙酸)鑭系元素(III)螯合物9如實(shí)施例3所述，將化合物8轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的銪(III)螯合物9a和釤(III)螯合物9b。
實(shí)施例10合成2，2′，2″，2-{[2-(4-氨基苯基)乙基亞氨基]雙(亞甲基)雙[4-(2-呋喃基)吡啶-6，2-二基]雙(亞甲基次氨基)}四(乙酸)四(叔丁酯)10如實(shí)施例1所述，將2，2′，2″，2-{[2-(4-氨基苯基)乙基亞氨基]雙(亞甲基)雙(4-溴吡啶-6，2-二基)雙(亞甲基次氨基)}四(乙酸)四(叔丁酯)(0.30g、0.30mmol)與2-叔丁基甲錫烷基呋喃(0.22g，0.60mmol)反應(yīng)。產(chǎn)量0.22g(75％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ1.45(36H，s)；3.50(8H，s)；3.88(4H，s)；4.04(4H，s)；6.50(1H，s)；6.87(1H，s)；8.02(4H，s).MS 965[M+].UVγmax/nm(EtOH)287，226.IR(膜)/cm-11735(C＝O)，1149(C-O).
實(shí)施例11合成2，2′，2″，2-{[2-(4-氨基苯基)乙基亞氨基]雙(亞甲基)雙[4-(2-呋喃基)吡啶-6，2-二基]雙(亞甲基次氨基)}四(乙酸)11如實(shí)施例2所述，用TFA將化合物10脫保護(hù)，得到目標(biāo)化合物。收率70％。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ3.56(8H，s)；4.08(4H，s)；6.73(2H，m)；6.90(2H，m)；7.13(2H，m)；7.21(2H，m)；7.73(2H，s)；7.90(2H，s)；7.92(2H，s).MS 853[M+].UVγmax/nm(H2O)303.IP(膜)/cm-11674(C＝O)，1617(C＝O)，1200(C-O).
實(shí)施例12合成2，2′，2″，2-{[2-(4-氨基苯基)乙基亞氨基]雙(亞甲基)雙[4-(2-呋喃基)吡啶-6，2-二基]雙(亞甲基次氨基)}四(乙酸)鑭系元素(III)螯合物12如實(shí)施例3所述，將化合物11轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的銪(III)螯合物12a和釤(III)螯合物12b。
實(shí)施例13合成2，2′，2″，2-{[2-(4-異硫氰酸基苯基)乙基亞氨基]雙(亞甲基)雙[4-(2-呋喃基)吡啶-6，2-二基]雙(亞甲基次氨基)}四(乙酸)鑭系元素(III)螯合物13如Takalo等，Bioconjugate Chem.，1994，5，278中所述，將化合物12轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的異硫氰酸基衍生物。
實(shí)施例14
合成2，2′，2″，2-{[6-(4-甲氧基三苯甲基)己基亞氨基]雙(亞甲基)雙[(4-溴)吡啶-6，2-二基]雙(亞甲基次氨基)}四(乙酸)四(叔丁酯)14將[(4-溴-6-溴甲基-2-吡啶基)亞甲基次氨基]雙(乙酸)二(叔丁酯)(2.06g，6.0mmol)和6-(4-甲氧基三苯甲基)己二胺(1.15g，3.2mmol)溶解于干燥的DMF(100ml)中。加入DIPEA(5.2ml，30mmol)，隨后將于室溫下該混合物攪拌2小時(shí)，隨后濃縮。在硅膠柱上純化，得到1.30g化合物14。
實(shí)施例15合成2，2′，2″，2-{[6-(4-甲氧基)三苯甲基氨基己基]雙(亞甲基)雙[4-(2-呋喃基)吡啶-6，2-二基]雙(亞甲基次氨基)}四(乙酸)四(叔丁酯)15將化合物14(1.11g，0.91mmol)和2-(叔丁基甲錫烷基)呋喃(0.68g，1.9mmol)溶解于DMF(35ml)中，隨后用氬氣脫氣。加入四(三苯基膦)合鈀(0)(0.12g)，隨后于90℃下將該混合物攪拌2.5小時(shí)。將該混合物冷卻至室溫，隨后真空濃縮。在硅膠柱上純化(洗脫液石油醚/乙酸乙酯/TEA＝5∶1∶1(v/v/v)；隨后5∶3∶1(v/v/v))。產(chǎn)量0.83g(75％)。
實(shí)施例16合成2，2′，2″，2-{(6-氨基己基)雙(亞甲基)雙[4-(2-呋喃基)吡啶-6，2-二基]雙(亞甲基次氨基)}四(乙酸)四(叔丁酯)16將化合物15(0.95g，0.80mmol)溶解于TFA(0.25ml)和二氯甲烷(25ml)的混合物中，隨后于室溫下將該混合物攪拌2小時(shí)。用飽和NaHCO3洗滌該反應(yīng)混合物。有機(jī)相經(jīng)Na2CO3干燥，濃縮，隨后在硅膠柱上純化。產(chǎn)量0.61g(83％)。
實(shí)施例17合成被保護(hù)的低聚肽標(biāo)記反應(yīng)物17將化合物16(0.57g，0.62mmol)和Fmoc-Glu-Oall(0.3g，0.74mmol)溶解于二氯甲烷(25ml)中。加入DCC(0.15g，0.74mmol；預(yù)溶解于3mlDCM中)，隨后于室溫下將該反應(yīng)進(jìn)行6小時(shí)。濾除形成的沉淀，濃縮濾液，隨后在硅膠柱上純化。
實(shí)施例18合成低聚肽標(biāo)記反應(yīng)物18將化合物17(0.42g，0.32mmol)溶解于DCM(10ml)中，隨后用氬氣脫氣。加入Pd(PPh3)4(8mg，0.007mmol)和PhSiH3(69mg，0.64mmol)，隨后于室溫下將該反應(yīng)進(jìn)行30分鐘，用10％的檸檬酸洗滌。分離有機(jī)層，經(jīng)4分子篩干燥，隨后濃縮。
實(shí)施例19合成2，2′，2″，2-{(6-氨基己基)雙(亞甲基)雙[4-(2-呋喃基)吡啶-6，2-二基]雙(亞甲基次氨基)}四(乙酸)19如實(shí)施例2中合成化合物3所述進(jìn)行合成。收率81％。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ1.25-1.32(4H，m)；1.47-1.55(2H，m)；1.72-1.81(2H，m)；2.70-2.78(2H，m)；3.18-3.23(2H，m)；3.55(8H，s)；4.06(4H，s)；4.53(4H，s)；6.73(2H，dd，J1.6 and 3.6)7.20(2H，d，J3.6)；7.72(2H，s)；7.93(2H，d，J 1.6).MS 746(M+).UVγmax/nm(H2O)302.IR(KBr)/cm-11676；1618(C＝O)，1199(C-O).
實(shí)施例20合成2，2′，2″，2-{(6-氨基己基亞氨基)雙(亞甲基)雙[4-(2-呋喃基)吡啶-6，2-二基]雙(亞甲基次氨基)}四(乙酸)鑭系元素(III)螯合物20如實(shí)施例3所述，將化合物19(50mg，0.060mmol)轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的銪(III)螯合物20a和釤(III)螯合物20b。
實(shí)施例21合成2，2′，2″，2-{[6-碘代乙酰氨基己基亞氨基]雙(亞甲基)雙[4-(2-呋喃基)吡啶-6，2-二基]雙(亞甲基次氨基)}四(乙酸)鑭系元素(III)螯合物21如Takalo等，Bioconjugate Chem.，1994，5，278中所述，將化合物20轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的碘代乙酰氨衍生物21。
實(shí)施例22合成2，2′，2″，2-{[6-(異硫氰酸基己基硫脲基)己基亞氨基]雙(亞甲基)雙[4-(2-呋喃基)吡啶-6，2-二基]雙(亞甲基次氨基)}四(乙酸)鑭系元素(III)螯合物22將1，4-二異硫氰酸亞苯基酯(6.5mg，0.034mmol)溶解于吡啶∶水∶TEA(9∶1.5∶0.1，v/v/v，0.5ml)的混合物中。滴加化合物20(15mg，0.017mmol；預(yù)溶解于相同的溶液中；0.5ml)，隨后于室溫下將該反應(yīng)進(jìn)行1小時(shí)。加入丙酮(1.0ml)，隨后將沉淀離心分離。
實(shí)施例23合成2，2′，2″，2-{[6-異硫氰酸基己基亞氨基]雙(亞甲基)雙[4-(2-呋喃基)吡啶-6，2-二基]雙(亞甲基次氨基)}四(乙酸)鑭系元素(III)螯合物23如Takalo等，Bioconjugate Chem.，1994，5，278中所述，將化合物20(100mg)轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的異硫氰酸基衍生物。
實(shí)施例24合成4-(2-呋喃基)-吡啶-2，6-二乙酸二乙酯24如實(shí)施例1所述，將4-溴吡啶-2，6-二羧酸二乙酯(3.70g，12.3mmol)與2-(叔丁基甲錫烷基)呋喃(12.3mmol)反應(yīng)。產(chǎn)量3.49g(8.6％)。
1H NMR 1H-NMR(CDCl3)8.47(2H，s)，7.63(1H，d，J 1.6)，7.08(1H，d，J3.6Hz)，6.59(1H，dd，J1.9 and 3.5Hz)，4.51(4H，q，J7.1)，1.48(6H，t，J7.1).
對(duì)于C15H16NO5(M+H)+的ESI-TOF-MS質(zhì)譜計(jì)算值290.10；實(shí)測值290.12。
實(shí)施例25合成4-(呋喃-2-基)-6-(羥甲基)吡啶-2-羧酸乙酯25將化合物24(3.30g，11.4mmol)懸浮于乙醇(150ml)中。加熱至35℃，使該懸浮液溶解。隨后加入NaBH4(0.43g，11.4mmol)，隨后于室溫下將該混合物攪拌40分鐘。用6M的HCl水溶液將pH值調(diào)節(jié)至3，猝滅該反應(yīng)。蒸發(fā)溶劑，隨后將殘余物懸浮于水(100ml)中，隨后用NaHCO3將pH值調(diào)節(jié)至7。用CH2Cl2∶MeOH(1∶1，v/v)溶液將產(chǎn)物從水中萃取出來。CH2Cl2層用水洗滌兩次，并經(jīng)MgSO4干燥。在硅膠柱上純化(洗脫液石油醚(沸點(diǎn)40-60℃)∶乙酸乙酯∶三乙胺＝5∶2∶1，v/v/v)。產(chǎn)量1.76g(62.4％)。
1H NMR(CDCl3)δ1.46(3H，t，J7)；4.49(2H，q，J7)；4.88(2H，s)；6.57(1H，dd)；7.00(1H，d)；7.58(1H，m)；7.73(1H，m)；8.23(1H，d).
對(duì)于C13H14NO4(M+H)+的ESI-TOF-MS質(zhì)譜計(jì)算值248.09；實(shí)測值248.10。
實(shí)施例26合成6-(溴甲基)-4-(呋喃-2-基)吡啶-2-羧酸乙酯26將PBr3(0.65ml，6.9mmol)加至DMF(50ml)中，隨后冰浴冷卻該混合物直至形成白色沉淀。加入化合物25(1.70g，6.9mmol；預(yù)溶解于50ml DMF中)，隨后于室溫下將該混合物攪拌40分鐘。用飽和NaHCO3中和該混合物，隨后加入水(100ml)。用CH2Cl2萃取產(chǎn)物。二氯甲烷層經(jīng)MgSO4干燥，隨后蒸發(fā)至干。在硅膠柱上純化(洗脫液5％的MeOH/CH2Cl2)。產(chǎn)量2.13g(87％)。對(duì)于C13H13BrNO3(M+H)+的ESI-TOF-MS質(zhì)譜計(jì)算值310.01；實(shí)測值310.01。
實(shí)施例27
合成{2-{[4-(呋喃-2-基)-6-(羥甲基)吡啶-2-羰基]氨基}乙基}氨基甲酸4-硝基芐酯27將化合物25(0.42g，1.7mmol)溶解于乙二胺(10ml)中。于室溫下將該混合物攪拌3小時(shí)，隨后蒸發(fā)至干。將殘余物溶解于甲苯中，再度蒸發(fā)兩次，隨后溶解于THF(20ml)中。加入TEA(0.24ml，1.7mmol)，隨后滴加氯甲酸4-硝基芐酯(0.76g，3.4mmol)的10ml THF的溶液。于室溫下將該混合物攪拌2小時(shí)。濾除沉淀，隨后將濾液蒸發(fā)至干。將殘余物懸浮于CH2Cl2中，隨后過濾產(chǎn)物。在硅膠柱上純化(洗脫液3％的MeOH/CH2Cl2)。產(chǎn)量0.46g(61.3％)。
1H-NMR(CDCl3)8.21(2H，d，J8.8H)，8.13(1H，s)，7.94(1H，s)，7.87(1H，s)，7.60(2H，d，J8.8)，7.42(1H，d，J3.4)，6.72(1H，dd，J 1.7 and 3.4)，5.18(2H，s)，4.66(2H，d，J5.6Hz)，3.42(2H，m)，3.23(2H，m).
對(duì)于C21H21N4O7(M+H)+的ESI-TOF-MS質(zhì)譜計(jì)算值441.14；實(shí)測值441.14。
實(shí)施例28合成{2-{[6-(溴甲基)-4-(呋喃-2-基)吡啶-2-羰基]氨基}乙基}氨基甲酸4-硝基芐酯28將PBr3(0.10ml，1.0mmol)加至DMF(10ml)中，隨后冰浴冷卻該混合物直至形成白色沉淀。加入化合物27(0.45g，1.0mmol)的DMF溶液(10ml)，隨后于室溫下將該混合物攪拌1小時(shí)。用飽和NaHCO3中和該混合物，隨后加入20ml水。用CH2Cl2萃取產(chǎn)物。二氯甲烷層經(jīng)Na2SO4干燥，隨后蒸發(fā)至干。在硅膠柱上純化(洗脫液10％的MeOH/CH2Cl2)。產(chǎn)量0.39g(75.8％)1H-NMR(CDCl3)8.82(1H，t，J4.5)，8.20(2H，d，J 9.2)，8.03(1H，d，J 1.6)，7.90(1H，d，J 1.6)，7.59(2H，d，J 8.7)，7.46(1H，d，J3.2)，6.74(1H，dd，J 1.6 and 3.5)，5.18(2H，s)，4.76(2H，s)，3.43(2H，m)，3.25(2H，m).
對(duì)于C21H20BrN4O6(M+H)+的ESI-TOF-MS質(zhì)譜計(jì)算值503.06；實(shí)測值503.06。
實(shí)施例29合成7-{4-(呋喃-2-基)-6-[2-(4-硝基芐基氧基羰基氨基)乙基氨基甲酰基]吡啶-2-基甲基}-[1，4，7]三氮雜環(huán)壬烷-1，4-二羧酸二叔丁酯29將[1，4，7]三氮雜環(huán)壬烷-1，4-二羧酸二叔丁酯(0.75g，2.3mmol)和化合物28(1.15g，2.3mmol)溶解于干燥的DMF(60ml)中，加入2.0mlDIPEA(11.4mmol)，隨后于室溫下將該混合物攪拌過夜。將溶劑蒸發(fā)至干，隨后產(chǎn)物在硅膠柱上純化(洗脫液乙醚)。產(chǎn)量1.20g(80.5％)。對(duì)于C37H50N7O10(M+H)+的ESI-TOF-MS質(zhì)譜計(jì)算值752.36；實(shí)測值752.40。
實(shí)施例30合成{2-{[4-(呋喃-2-基)-6-([1，4，7]三氮雜環(huán)壬基-1-甲基)吡啶-2-羰基]氨基}乙基}氨基甲酸4-硝基芐酯30將化合物29(1.0g，1.3mmol)溶解于25ml TFA中，隨后于室溫下將該混合物攪拌30分鐘。將溶劑蒸發(fā)至干。對(duì)于C27H34N7O6(M+H)+的ESI-TOF-MS質(zhì)譜計(jì)算值552.26；實(shí)測值552.26。
實(shí)施例31合成{2-{{4-(呋喃-2-基)-6-{4，7-雙[2-乙氧基羰基-4-(呋喃-2-基)吡啶-2-基甲基]-[1，4，7]三氮雜環(huán)壬基-1-甲基吡啶-2-羰基}氨基}乙基}氨基甲酸4-硝基芐酯31將化合物30(0.39g，0.7mmol)和化合物26(0.43g，1.4mmol)溶解于20ml干燥的乙腈中。加入K2CO3(0.48g，3.5mmol)，隨后將該混合物回流3小時(shí)。濾除沉淀，隨后蒸發(fā)溶劑。在硅膠柱上純化產(chǎn)物(洗脫液石油醚(沸點(diǎn)40-60℃)∶乙酸乙酯∶三乙胺＝5∶1∶1，v/v/v；乙醚；10％的EtOH/CH2Cl2；20％的EtOH/10％的TEA/CH2Cl2)。對(duì)于C53H56N9O12(M+H)+的ESI-TOF-MS質(zhì)譜計(jì)算值1010.40；實(shí)測值1010.46。
實(shí)施例32合成2-{4-[6-(2-氨基乙基氨基羰基)-4-(呋喃-2-基)吡啶-2-甲基]-7-[2-羧基-4-(呋喃-2-基)吡啶-2-基甲基]-[1，4，7]三氮雜環(huán)壬基-1-甲基}-4-(呋喃-2-基)吡啶-2-羧酸32將化合物31(0.80g，8.0mmol)溶解于乙醇(30ml)中。加入10％的Pd/C(0.49g)，隨后在氫氣氣氛下，于室溫下將該混合物攪拌2小時(shí)。將該混合物過濾，蒸發(fā)溶劑。將殘余物溶解于0.5M的KOH/MeOH溶液中，于室溫下將該混合物攪拌3小時(shí)。蒸發(fā)溶劑。該化合物無需純化便可用于下一步驟。對(duì)于C41H42KN8O8(M+K)+的ESI-TOF-MS質(zhì)譜計(jì)算值813.28；實(shí)測值813.31。
實(shí)施例33合成2-{4-[6-(2-氨基乙基氨基甲?；?-4-(呋喃-2-基)吡啶-2-甲基]-7-[2-羧基-4-(呋喃-2-基)吡啶-2-基甲基]-[1，4，7]三氮雜環(huán)壬基-1-甲基}-4-(呋喃-2-基)吡啶-2-羧酸鑭系元素(III)螯合物33如實(shí)施例所述3，將化合物32轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的銪(III)螯合物(33a)和釤(III)螯合物(33b)。
實(shí)施例34合成2-{4-[4-(呋喃-2-基)-6-(2-碘代乙酰氨基乙基甲?；?吡啶-2-甲基]-7-[2-羧基-4-(呋喃-2-基)吡啶-2-基甲基]-[1，4，7]三氮雜環(huán)壬基-1-甲基}-4-(呋喃-2-基)吡啶-2-羧酸鑭系元素(III)螯合物34如Takalo等，Bioconjugate Chem.，1994，5，278中所述，將化合物33轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的碘代乙酰氨基衍生物。
實(shí)施例35使用標(biāo)記反應(yīng)物18標(biāo)記固相上的低聚肽如Peuralahti等，Bioconjugate Chem.，13，2002，870中所述的方法進(jìn)行鏈裝配、脫保護(hù)、引入鑭系(III)離子和純化。
實(shí)施例36使用螯合物34a標(biāo)記溶液中的低聚肽使用Takalo等，Bioconjugate Chem.，1994，5，278中所述的方法進(jìn)行標(biāo)記反應(yīng)。
實(shí)施例37使用螯合物23標(biāo)記8-ABA-cAMP將8-ABA-cAMP(2.5μmol)溶解于500μl包含吡啶、水和三乙胺(9.0∶1.5∶0.1，v/v/v)的緩沖液中。加入化合物23(3.0μmol，Ln＝Eu)，于室溫下將該混合物攪拌3小時(shí)。蒸發(fā)溶劑，隨后使用HPLC純化產(chǎn)物。ESI-TOF-MS1326.26。
實(shí)施例38合成1-(2-吡啶基)-3-(5-溴2-呋喃基)-E-丙烯酮35于0℃下，將5-溴呋喃-2-甲醛(5.0g)溶解KOH(1.5g)的水(10ml)和甲醇(50ml)的混合溶液中。在10分鐘內(nèi)加入2-乙?；拎?3.2g)，隨后于室溫下將該反應(yīng)進(jìn)行3小時(shí)。過濾分離形成的產(chǎn)物。產(chǎn)量7.3g。
實(shí)施例39合成4′-(5-溴-2-呋喃基)-2，2′:6′，2″-三聯(lián)吡啶36將化合物35(3.12g，11.3mmol)、N-[2-(吡啶-2′-基)-2-氧代乙基]吡啶鹽碘化物(3.69g，11.3mmol)和乙酸銨(21.8g，283mmol)溶解于干燥的甲醇(110ml)中，隨后將該混合物加熱回流過夜。冷卻至-18℃后，過濾分離形成的產(chǎn)物。產(chǎn)量2.5g。
實(shí)施例40
合成4′-(5-溴-2-呋喃基)-2，2′:6′，2″-三聯(lián)吡啶N，N″二氧化物37如實(shí)施例所述5進(jìn)行合成。收率78％。
1H NMR(CDCl3)δ8.38(2H，dd，J 1.5 and 6.3)；822(2H，dd，J2.2 and 6.3)；7.41(2H，dt，J1.5and 7.8)；7.33(2H，dt，J2.2 and 6.3)；7.03(1H，d，J3.7)；6.49(1H，d，J3.7).
對(duì)于C19H12BrN3O3(M+H)+的ESI-TOF-MS質(zhì)譜計(jì)算值410.01；實(shí)測值410.05。
實(shí)施例41合成4′-(5-溴-2-呋喃基)-2，2′:6′，2″-三聯(lián)吡啶-6，6′-二甲腈38如實(shí)施例6所述進(jìn)行合成?；衔?81H NMR(CDCl3)δ8.83(2H，d，J7.9)；8.72(2H，s)；8.03(2H，t，J7.9)；7.80(2H，d；J7.9)；7.17(1H，d，J3.6)；6.57(1H，d，J3.6).
實(shí)施例42合成2，2′，2″，2-{[4′-(5-溴-2-呋喃基)-2，2′:6′，2″-三聯(lián)吡啶-6，6′-二基]雙(亞甲基次氨基)}四(乙酸)四(叔丁酯)39如實(shí)施例7所述進(jìn)行合成?；衔?9的收率為54％。
1H NMR(CDCl3)δ8.66(2H，s)；8.51(2H，d，J 6.6)；7.86(2H，t，J 7.7)；7.73(2H，d，J 6.6)；7.09(1H，d，J 3.6)；6.51(1H，d，J 3.6)；4.20(4H，s)；3.56(8H，s)；1.49(36H，s).
實(shí)施例43合成2，2′，2″，2-{[4′-(5-(4-氨基苯基亞乙炔基)-2-呋喃基)-2，2′:6′，2″-三聯(lián)吡啶-6，6′-二基]雙(亞甲基次氨基)}四(乙酸)四(叔丁酯)40將化合物39(70mg，78μmol)溶解于干燥的THF(2ml)和TEA(3ml)的混合物中。加入Pd(Ph3P)2Cl2(1.1mg)和CuI(0.6mg)，隨后用氬氣將該混合物脫氣10分鐘。加入氨基苯基乙炔(11mg，94μmol)，隨后在氬氣氣氛下，于65℃下將該混合物加熱過夜。真空除去所有的揮發(fā)物。將殘余物溶解于二氯甲烷(3ml)中，用水(3×2ml)洗滌，經(jīng)Na2SO4干燥。在硅膠柱上純化(洗脫液PE∶EA∶TEA＝5∶3∶1，v/v/v)，得到39mg(53％)的化合物40。
1H NMR(CDCl3)δ8.73(2H，s)；8.52(2H，d，J7.5)；7.86(2H，t，J7.5)；7.73(2H，d，J7.5)；7.41(2H，d，J8.4)；7.14(1H，d，J3.6)；6.75(1H，d，J3.6)；6.68(2H，d，J 8.4)；4.19(4H，s)；3.56(8H，s)；1.49(36H，s).IR2270cm-1(-C≡C-).
實(shí)施例44合成2，2′，2″，2-{[4′-(5-(4-氨基苯基乙基)-2-呋喃基)-2，2′:6′，2″-三聯(lián)吡啶-6，6′-二基]雙(亞甲基次氨基)}四(乙酸)四(叔丁酯)41將化合物40(0.11g，0.12mmol)溶解于干燥的甲醇(50ml)中。加入10％的Pd/C(20mg)，隨后在氫氣氣氛下將該混合物攪拌過夜，通過Celite過濾。在制備TLC層析板上純化(洗脫液石油醚∶乙酸乙酯∶三乙胺＝5∶3∶1，v/v/v)。對(duì)于C53H69N6O9(M+H)+的ESI-TOF-MS質(zhì)譜計(jì)算值933.6；實(shí)測值933.6。
實(shí)施例45合成2，2′，2″，2-{[4′-(5-(4-氨基苯基乙基)-2-呋喃基)-2，2′:6′，2″-三聯(lián)吡啶-6，6′-二基]雙(亞甲基次氨基)}四(乙酸)42將化合物41(14mg，15μmol)溶解于TFA(1ml)中，隨后于室溫下攪拌1.5小時(shí)，隨后濃縮，用乙醚研磨，過濾。產(chǎn)量11mg。對(duì)于C37H36N6O9(M-H)-的ESI-TOF-MS質(zhì)譜計(jì)算值707.3；實(shí)測值707.3。
實(shí)施例46合成2，2′，2″，2-{[4′-(5-(4-氨基苯基乙基)-2-呋喃基)-2，2′:6′，2″-三聯(lián)吡啶-6，6′-二基]雙(亞甲基次氨基)}四(乙酸)銪(III)43將化合物42(8.5mg，9μmol)溶解于水(400μL)中，隨后用固體NaHCO3將pH值調(diào)節(jié)至6。分批加入氯化銪(III)(3.7mg，10μmol；預(yù)溶解于80μL水中)(用NaHCO3將pH值調(diào)節(jié)至5-7)，隨后于室溫下將該混合物攪拌1.5小時(shí)。用1M的NaOH將pH值調(diào)節(jié)至8.5，隨后離心分離除去形成的氫氧化銪(III)。用丙酮沉淀，得到目標(biāo)化合物。對(duì)于C37H32EuN6O9(M-H)-的ESI-TOF-MS質(zhì)譜計(jì)算值857.14；實(shí)測值857.20。
實(shí)施例47合成2，2′，2″，2-{[4′-(5-(4-異硫氰酸基苯基乙基)-2-呋喃基)-2，2′:6′，2″-三聯(lián)吡啶-6，6′-二基]雙(亞甲基次氨基)}四(乙酸)銪(III)44將化合物43(5.7mg，6.5μmol；預(yù)溶解170μL于170水中)分批加至硫光氣(2μL)、飽和NaHCO3(170μL)和氯仿(170μL)的混合物中。于室溫下將該混合物劇烈攪拌1.5小時(shí)，隨后各相分離。水相用氯仿(2×170μL)洗滌，用丙酮沉淀，得到化合物44.。對(duì)于C38H30EuN6O9S(M-H)-的ESI-TOF-MS質(zhì)譜計(jì)算值899.1；實(shí)測值899.2。
實(shí)施例48合成6-(溴甲基)-4-(5-溴呋喃-2-基)吡啶-2-羧酸乙酯45將化合物26(0.8g，2.58mmol)溶解于干燥的二烷(20ml)中。加入溴(0.62g，3.87mmol)，隨后于室溫下將該混合物攪拌過夜。真空除去所有的揮發(fā)物。使用二氯甲烷作為洗脫液在硅膠柱上純化，得到目標(biāo)化合物。
實(shí)施例49合成7-{4-(5-溴呋喃-2-基)-6-(乙基羰基)吡啶-2-基甲基}-[1，4，7]三氮雜環(huán)壬烷-1，4-二羧酸二(叔丁酯)46使用實(shí)施例29所述的方法合成化合物46。對(duì)于C29H42BrN4O7(M+H)+的ESI-TOF-MS質(zhì)譜計(jì)算值637.2；實(shí)測值637.2。
實(shí)施例50合成7-{4-(5-溴呋喃-2-基)-6-(乙氧基羰基)吡啶-2-基甲基}-[1，4，7]三氮雜環(huán)壬烷47使用實(shí)施例30所述的方法進(jìn)行合成。對(duì)于C19H26BrN4O3(M+H)+的ESI-TOF-MS質(zhì)譜計(jì)算值439.1；實(shí)測值439.1。
實(shí)施例51合成4，7-雙{6-[2-乙氧基羰基-4-(呋喃-2-基)吡啶-2-基]甲基}-1-{6-[2-乙氧基羰基]-4-(5-溴呋喃-2-基)吡啶-2-基)甲基}-[1，4，7]三氮雜環(huán)壬烷48使用實(shí)施例31所述的方法，將化合物46和化合物26進(jìn)行反應(yīng)，隨后用堿性氧化鋁純化，得到目標(biāo)化合物。對(duì)于C45H48BrN6O9(M+H)+的ESI-TOF-MS質(zhì)譜計(jì)算值895.3；實(shí)測值895.4。
實(shí)施例52合成4，7-雙{6-[2-乙氧基羰基-4-(呋喃-2-基)吡啶-2-基]甲基}-1-{6-(2-乙氧基羰基)-4-[5-(6-(羥基己炔-1-基-)-呋喃-2-基)吡啶-2-基]甲基}-[1，4，7]三氮雜環(huán)壬烷49使用實(shí)施例43所述的方法，將化合物47和己炔醇進(jìn)行反應(yīng)，得到目標(biāo)化合物。在中性氧化鋁柱上純化。對(duì)于C51H57N6O10(M+H)+的ESI-TOF-MS質(zhì)譜計(jì)算值913.4；實(shí)測值913.5。
實(shí)施例53合成低聚核苷酸標(biāo)記反應(yīng)物50將預(yù)干燥的化合物48(0.114g，0.125mmol)1和N，N，N′，N′-四異丙基二氨基次亞膦酸2-氰基乙酯(1.5當(dāng)量)溶解于干燥的乙腈中。加入1H-四唑(1當(dāng)量；0.45M的乙腈溶液)，隨后于室溫下將該混合物攪拌30分鐘，隨后倒入5％的NaHCO3中，隨后用二氯甲烷萃取，經(jīng)Na2SO4干燥。在堿性氧化鋁柱上純化，得到目標(biāo)化合物。31PNMR(CDCl3)δ151.2。
實(shí)施例54使用Hovinen和Hakala，Org.Lett.3，2001，2473所述的方法，使用化合物50向低聚核苷酸結(jié)構(gòu)中引入鑭系(III)螯合物。
用常規(guī)方法合成低聚核苷酸d(AAT CAG ACT GTT CAAGAC)，反應(yīng)物50與其5′-端位偶聯(lián)。如Org.Lett.3，2001，2473所述，脫保護(hù)，轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的鑭系(III)螯合物并純化。
流程1
流程2 流程3
流程4 流程5 流程6A
流程6B 流程7
流程8 流程9 流程10
流程11
流程12A
流程12B
流程13本發(fā)明的某些螯合物的光化學(xué)性能示于表1。
使用LS-55發(fā)光光譜儀(PerkinElmer Instuments，Connecticut，USA)，在TS緩沖液(50mM tris，150mM NaCl，pH7.75)中，測定激發(fā)光譜和發(fā)射光譜以及熒光壽命，確定各螯合物和肽-偶聯(lián)螯合物的光化學(xué)性能。根據(jù)預(yù)期的熒光強(qiáng)度，使用適當(dāng)?shù)臐舛冗M(jìn)行測定。
表1.合成的螯合物的光化學(xué)性能
t.d.＝待測定(to be determined)應(yīng)理解的是，本發(fā)明的方法可以多種實(shí)施方案的形式使用，本文僅公開了一小部分。對(duì)于本領(lǐng)域的資深技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明的精神的前提下，還存在其他實(shí)施方案。因此，所述的實(shí)施方案僅用于說明，而不是要限制本發(fā)明。
權(quán)利要求
1.一種螯合劑，所述螯合劑包含-發(fā)色部分，所述發(fā)色部分包含一個(gè)或多個(gè)芳族單元，其中至少一個(gè)所述芳族單元為呋喃基取代的吡啶基，-螯合部分，所述螯合部分包含至少兩個(gè)羧酸或膦酸基團(tuán)或所述酸的酯或鹽，所述螯合部分與所述發(fā)色部分的芳族單元或者直接相連或者通過含氮的烴鏈相連，和-活性基團(tuán)A，所述活性基團(tuán)通過連接基x連接于所述發(fā)色部分或所述螯合部分，所述活性基團(tuán)A能與固相上的生物分子或官能團(tuán)結(jié)合。
2.權(quán)利要求1的螯合劑，其中所述發(fā)色部分為單呋喃基取代的吡啶基或其中所述發(fā)色部分包含兩個(gè)或三個(gè)吡啶基，其中至少一個(gè)所述吡啶基被呋喃基取代，所述吡啶基按照方式i)或方式ii)連接，i)直接互相連接，分別形成聯(lián)吡啶或三聯(lián)吡啶基，ii)通過含氮的烴鏈互相連接。
3.權(quán)利要求1的螯合劑，其中所述基團(tuán)A-x-與呋喃基相連。
4.權(quán)利要求1的螯合劑，其中所述連接基x由1-10個(gè)部分形成，每一個(gè)部分選自亞苯基、包含1-12個(gè)碳原子的亞烷基、亞乙炔基(-C≡C-)、1，2-亞乙烯基(-C＝C-)、醚基(-O-)、硫醚基(-S-)、酰氨基(-CO-NH-、-CO-NR′-、-NH-CO-和-NR′-CO-)、羰基(-CO-)、酯基(-COO-和-OOC-)、二硫基(-SS-)、重氮基(-N＝N-)和叔胺基，其中R′表示包含少于5個(gè)碳原子的烷基。
5.權(quán)利要求1的螯合劑，其中所述活性基團(tuán)A選自以下基團(tuán)異硫氰酸酯、鹵代乙酰氨基、順丁烯二酰亞氨基、二氯三嗪基、二氯三嗪基氨基、吡啶基二硫基、硫代酯、氨基氧基、酰肼、氨基、聚合基團(tuán)和羧酸或其酰氯或活性酯。
6.權(quán)利要求1的螯合劑，所述螯合劑選自
7.權(quán)利要求1的螯合劑，所述螯合劑適用于合成低聚肽，其中所述活性基團(tuán)A通過連接基x與所述螯合劑相連，A為氨基酸殘基-CH(NHR1)R5，其中R1為臨時(shí)的保護(hù)基團(tuán)，R5為羧酸或其鹽、酰鹵或酯。
8.權(quán)利要求7的螯合劑，所述螯合劑選自 其中x如權(quán)利要求4所定義，所述保護(hù)基團(tuán)R1選自Fmoc、Boc或Bsmoc，R″為烷基酯或烯丙基酯，R為烷基。
9.權(quán)利要求1的螯合劑，所述螯合劑適用于合成低聚核苷酸，其中所述活性基團(tuán)A為-Y-O-PZ-O-R4其中一個(gè)氧原子任選被硫置換，Z為氯或NR2R3，R4為保護(hù)基團(tuán)，R2和R3為烷基，Y不存在或?yàn)猷堰蕢A或嘧啶堿或任何其他適用于合成修飾的低聚核苷酸的修飾堿的基團(tuán)，所述堿通過i)或ii)與氧原子相連，i)被已保護(hù)的羥乙基取代的烴鏈，ii)適用于合成修飾的低聚核苷酸的呋喃環(huán)或吡喃環(huán)或任何修飾的呋喃環(huán)或吡喃環(huán)。
10.權(quán)利要求9的螯合劑，其中Y為胸腺嘧啶、尿嘧啶、腺苷、鳥嘌呤或胞嘧啶中任一種堿的基團(tuán)，所述堿通過i)或ii)與氧原子相連，i)被已保護(hù)的羥乙基取代的烴鏈，ii)在其4-位上具有已保護(hù)的羥乙基并任選在其2-位上具有羥基、已保護(hù)的羥基或修飾的羥基的呋喃環(huán)。
11.權(quán)利要求9的螯合劑，其中-Y-O-P(NR2R3)-O-R4選自 其中-為連接基x的位置，DMTr為二甲氧基三苯甲基。
12.權(quán)利要求11的螯合劑，所述螯合劑選自 其中R″為烷基酯或烯丙基酯，R為烷基，x如權(quán)利要求4所定義，A為權(quán)利要求11所定義的-Y-O-P(NR2R3)-O-R4。
13.一種螯合物，所述螯合物包含-金屬離子，-發(fā)色部分，所述發(fā)色部分包含一個(gè)或多個(gè)芳族單元，其中至少一個(gè)所述芳族單元為呋喃基取代的吡啶基，-螯合部分，所述螯合部分包含至少兩個(gè)羧酸或膦酸基團(tuán)或所述酸的酯或鹽，所述螯合部分與所述發(fā)色部分的芳族單元或者直接相連或者通過含氮的烴鏈相連，和-活性基團(tuán)A，所述活性基團(tuán)通過連接基x連接于所述發(fā)色部分或所述螯合部分，所述活性基團(tuán)A能與固相上的生物分子或官能團(tuán)結(jié)合。
14.權(quán)利要求13的螯合物，其中所述發(fā)色部分為單呋喃基取代的吡啶基或其中所述發(fā)色部分包含兩個(gè)或三個(gè)吡啶基，其中至少一個(gè)所述吡啶基被呋喃基取代，所述吡啶基按照方式i)或方式ii)連接，i)直接互相連接，分別形成聯(lián)吡啶或三聯(lián)吡啶基，ii)通過含氮的烴鏈互相連接。
15.權(quán)利要求13的螯合物，其中所述基團(tuán)A-x-與呋喃基相連。
16.權(quán)利要求13的螯合物，其中A選自以下基團(tuán)異硫氰酸酯、鹵代乙酰氨基、順丁烯二酰亞氨基、二氯三嗪基、吡啶基二硫基、硫代酯、氨基氧基、酰肼、氨基、聚合基團(tuán)和羧酸或其酰氯或活性酯。
17.權(quán)利要求13的螯合物，其中所述連接基x由1-10個(gè)部分形成，每一個(gè)部分選自亞苯基、包含1-12個(gè)碳原子的亞烷基、亞乙炔基(-C≡C-)、1，2-亞乙烯基(-C＝C-)、醚基(-O-)、硫醚基(-S-)、酰氨基(-CO-NH-、-CO-NR′、-NH-CO-和-NR′-CO-)、羰基(-CO-)、酯基(-COO-和-OOC-)、二硫基(-SS-)、重氮基(-N＝N-)和叔胺基，其中R′表示包含少于5個(gè)碳原子的烷基。
18.權(quán)利要求13的螯合物，所述螯合物選自 其中M為金屬，z為2或3，x和A如上定義。
19.權(quán)利要求18的螯合物，其中所述金屬M(fèi)為鑭系元素或適用于正子發(fā)射斷層攝影或磁共振成象的金屬。
20.一種與上述權(quán)利要求13-19中任一項(xiàng)的螯合物綴合的生物分子。
21.一種與上述權(quán)利要求13-19中任一項(xiàng)的螯合物綴合的生物分子，其中所述生物分子選自低聚肽、低聚核苷酸、DNA、RNA、修飾的低聚核苷酸或多核苷酸、蛋白質(zhì)、寡糖、多糖、磷脂、PNA、LNA、抗體、半抗原、藥物、受體結(jié)合配體和凝集素。
22.權(quán)利要求21的生物分子，其中所述修飾的低聚核苷酸或多核苷酸為單硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、氨基磷酸酯和/或糖修飾的或堿修飾的低聚核苷酸或多核苷酸。
23.一種與上述權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)的螯合劑綴合的生物分子。
24.一種與上述權(quán)利要求13-19中任一項(xiàng)的螯合物綴合的固體載體。
25.一種與上述權(quán)利要求13-19中任一項(xiàng)的螯合物綴合的固體載體，其中所述固體載體選自納米微粒、微米微粒、載玻片或平板。
26.一種已標(biāo)記的低聚肽，所述已標(biāo)記的低聚肽通過在固相上合成的方法制得，所述方法為向低聚肽合成儀上的所述低聚肽結(jié)構(gòu)中引入權(quán)利要求7或8的螯合劑，隨后脫保護(hù)并任選還引入金屬離子。
27.一種已標(biāo)記的低聚核苷酸，所述已標(biāo)記的低聚核苷酸通過在固相上合成的方法制得，所述方法為向低聚核苷酸合成儀上的所述低聚核苷酸結(jié)構(gòu)中引入上述權(quán)利要求9-12中任一項(xiàng)的螯合劑，隨后脫保護(hù)并任選還引入金屬離子。
28.一種與權(quán)利要求26的已標(biāo)記的低聚肽或權(quán)利要求27的已標(biāo)記的低聚核苷酸綴合的固體載體，其中所述低聚肽或低聚核苷酸共價(jià)或非共價(jià)固定于所述固體載體上。
29.一種與權(quán)利要求26的已標(biāo)記的低聚肽或權(quán)利要求27的已標(biāo)記的低聚核苷酸綴合的固體載體，其中所述低聚肽或低聚核苷酸共價(jià)或非共價(jià)固定于所述固體載體上，所述固體載體選自納米微粒、微米微粒、載玻片或平板。
30.一種與權(quán)利要求1的螯合劑綴合的固體載體，所述固體載體適用于合成低聚核苷酸，其中所述活性基團(tuán)A為-Y-O-x′-其中x′為與所述固體載體相連的連接基，與所述連接基x可相同或不同，Y不存在或?yàn)猷堰驶蜞奏せ蛉魏纹渌m用于合成修飾的低聚核苷酸的修飾堿的基團(tuán)，所述堿通過i)或ii)與氧原子相連，i)被已保護(hù)的羥乙基取代的烴鏈，ii)呋喃環(huán)或吡喃環(huán)或任何適用于合成修飾的低聚核苷酸的修飾的呋喃環(huán)或吡喃環(huán)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一組新型螯合劑、新型螯合物、用所述螯合物或螯合劑標(biāo)記的生物分子以及與所述螯合物、螯合劑或標(biāo)記的生物分子綴合的固體載體。更具體地講，本發(fā)明涉及用于固相合成低聚核苷酸或低聚肽的新型螯合劑以及這樣得到的低聚核苷酸或低聚肽。
文檔編號(hào)C07F9/6558GK1871233SQ200480031525
公開日2006年11月29日 申請(qǐng)日期2004年8月27日 優(yōu)先權(quán)日2003年8月29日
發(fā)明者J·霍韋寧, V·-M·穆卡拉, H·哈卡拉, J·佩伊拉拉蒂 申請(qǐng)人:沃拉克有限公司