專利名稱：白介素－11融合蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于治療或預(yù)防血小板減少癥、馮維勒布蘭德氏病(vWD)或炎性疾病諸如炎性腸病(IBD)的新型組合物。
背景技術(shù)：
白介素11(IL-11)的生理學(xué)功能白介素-11(IL-11)是促進巨核細胞生成及血小板生成的造血細胞因子，其作用途徑是通過刺激原始干細胞、多能及定向祖細胞增殖(與其它造血生長因子像IL-3、IL-6、GM-CSF協(xié)同作用)導(dǎo)致巨核細胞成熟和血小板生成增加。由于上述活性，它具有刺激紅細胞生成的副作用，但對嗜中性粒細胞增殖幾乎沒有影響。它還對腸粘膜細胞具有營養(yǎng)作用。另外，IL-11通過肝細胞誘導(dǎo)急性期蛋白(鐵蛋白、觸珠蛋白、CRP、纖維蛋白原)分泌。它還通過抑制巨噬細胞及T細胞效應(yīng)物功能表現(xiàn)出抗炎特性。它抑制體外活化的巨噬細胞產(chǎn)生TNFα、IL-1β、IL-12、IL-6及NO。在生理學(xué)上，IL-11由多種基質(zhì)細胞產(chǎn)生，像成纖維細胞、上皮細胞、軟骨細胞及成骨細胞。在正常個體中，通常在血漿中無法檢測到IL-11。IL-11的降解和清除還不太清楚。
IL-11的生物化學(xué)性質(zhì)IL-11是由178個氨基酸(AA)組成的19kDa的多肽，加上21個氨基酸的分泌前導(dǎo)序列，不含潛在的糖基化殘基、二硫鍵或其它翻譯后修飾，與IL-6相近似。它與含有IL-11特異的α受體亞基及混雜的(promiscuous)β亞基的多亞基受體復(fù)合體(gp130)結(jié)合。
重組人IL-11(Genetics Institute/Wyeth的Oprelvekin，Neumega_)是在大腸桿菌中產(chǎn)生的缺少氨基末端脯氨酸的2-178位氨基酸的IL-11。這可能是從宿主細胞完成分泌所必需的，但據(jù)報道不會影響細胞因子的活性。
化學(xué)療法誘導(dǎo)的血小板減少癥血小板減少癥是因為惡性腫瘤接受長期或攻擊性化學(xué)療法的患者的一個嚴重問題。有些化學(xué)治療劑諸如碳鉑(Carboplatin)，表現(xiàn)出顯著的、劑量限制性的毒性，并累積作用。
目前，輸注血小板是血小板減少癥的標準治療方法。然而，輸注血小板是昂貴的，并具有同種異體免疫及血源性疾病傳播的嚴重危險。大約5％-30％的輸注血小板通常與發(fā)熱性、非溶血性反應(yīng)有關(guān)。另外，血小板是有限的資源，且保質(zhì)期僅為5天。因此，為了預(yù)防或治療血小板減少癥，促進血小板生成的試劑是輸注血小板的誘人替代方法。重組人IL-11(Oprelvekin，Neumega_)于1997年在美國批準用于化學(xué)療法誘導(dǎo)的血小板減少癥的次級預(yù)防。其它潛在適應(yīng)癥包括炎性腸病(IBD)、克羅恩氏病(Crohn’s disease)、潰瘍性結(jié)腸炎、銀屑病(牛皮癬)及馮維勒布蘭德氏病(von Willebrand’s disease)。
IL-11與清蛋白融合的預(yù)期優(yōu)點血小板減少癥的安全且有效治療仍是未得到滿足的醫(yī)學(xué)需要。重組人IL-11(Oprelvekin，Neumega_)的人體半衰期非常短，為6.9小時，同時治療窗狹窄。
通過融合清蛋白來延長血漿半衰期及提高生物利用度，預(yù)期可導(dǎo)致安全性與功效模式得到改進。這意味著可以通過較低劑量和/或較長服藥間隔達到并維持治療性血漿水平，同時避免了毒性閾值以上的峰水平。
目前，Neumega_是用于治療化學(xué)療法誘導(dǎo)的血小板減少癥唯一獲得批準的藥物，這表明此領(lǐng)域具有很大的未滿足的醫(yī)學(xué)需要。Neumegad_顯示出高發(fā)生率的毒性作用，諸如水腫及心血管功能紊亂，連同低效能，尤其是在血小板減少癥的嚴重病例中。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及包含與清蛋白或其片段或變體融合的IL-11的蛋白質(zhì)。所述融合蛋白在本發(fā)明中統(tǒng)稱為“本發(fā)明清蛋白融合蛋白”。與未融合的IL-11相比，這些本發(fā)明融合蛋白表現(xiàn)出延長的體內(nèi)半衰期和/或延長的治療活性。
本發(fā)明包括治療性清蛋白融合蛋白、組合物、藥物組合物、制劑及試劑盒。本發(fā)明還包括編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的核酸分子，以及包含這些核酸的載體，經(jīng)這些核酸和載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞，及使用這些核酸、載體和/或宿主細胞制備清蛋白融合蛋白的方法。
本發(fā)明還涉及用于治療和預(yù)防血小板減少癥的組合物和方法。本發(fā)明還涉及抗炎治療及預(yù)防的組合物和方法。另外，本發(fā)明涉及用于治療和預(yù)防馮維勒布蘭德氏病的組合物和方法。
附圖簡要說明

圖1將rhIL-11或C末端IL-11-清蛋白融合蛋白靜脈內(nèi)施用于兔后的IL-11血漿濃度。
圖2將rhIL-11或C末端IL-11-清蛋白融合蛋白皮下施用于兔后的IL-11血漿濃度。
圖3將rhIL-11或N末端IL-11-清蛋白融合蛋白靜脈內(nèi)施用于大鼠后的IL-11血漿濃度。
圖4將rhIL-11或N末端IL-11-清蛋白融合蛋白皮下施用于大鼠后的IL-11血漿濃度。
圖5用IL-11處理首次進行實驗的大鼠后的血小板水平變化過程。
圖6用IL-11處理接受化療的大鼠后的血小板水平變化過程。
圖7小鼠IBD模型應(yīng)用IL-11后的體重變化(按基線的％)。
圖8小鼠IBD模型應(yīng)用IL-11后的目測評分(腹瀉及顯著直腸出血)。
圖9小鼠IBD模型應(yīng)用IL-11后的結(jié)腸長度。
圖10小鼠IBD模型應(yīng)用IL-11后的組織學(xué)疾病評分。
圖11本發(fā)明的各種化合物的SDS凝膠及Western印跡。
本發(fā)明的詳細說明本發(fā)明涉及包含與IL-11偶聯(lián)的清蛋白的融合蛋白。這樣的肽包括但不限于與gp130受體復(fù)合體結(jié)合的肽。這些肽包括具有血小板生成或抗炎特性的IL-11或其片段或變體。
本發(fā)明使用的術(shù)語“蛋白質(zhì)”及“肽”為非限制性的，包括蛋白質(zhì)和多肽以及肽。
另外，可以將化學(xué)實體與本發(fā)明的融合蛋白共價附著或融合或者聯(lián)合使用，用于增強生物學(xué)活性或調(diào)節(jié)生物學(xué)活性。
本發(fā)明清蛋白融合蛋白預(yù)期可延長IL-11的體內(nèi)半衰期。所述融合了清蛋白的肽/蛋白質(zhì)的體外或體內(nèi)半衰期較未連接清蛋白的肽/蛋白質(zhì)的半衰期延長了2倍，或5倍，或更多。另外，預(yù)期本發(fā)明清蛋白融合蛋白可降低治療性肽的服藥頻率。與未連接清蛋白的治療性肽的服藥頻率相比，服藥頻率降低了至少1/4，或至少1/2，或更多。
預(yù)期本發(fā)明清蛋白融合蛋白可在體外和/或體內(nèi)延長肽的保質(zhì)期，和/或穩(wěn)定肽和/或其在溶液中(或于藥物組合物中)的活性。這些清蛋白-融合蛋白，可以為治療劑，預(yù)期可減少這樣一種需要，即為預(yù)防諸如非特異性結(jié)合等因素引起的蛋白質(zhì)損失而使用大大過量的載體蛋白(諸如未融合的清蛋白)來配制蛋白質(zhì)溶液。半衰期延長定義為根據(jù)下述實施例4在6月齡雄性Wistar大鼠皮下注射后的第一個24小時測量到的半衰期較未融合IL-11化合物至少高2倍(優(yōu)選至少高5倍、10倍、20倍或30倍)。
本發(fā)明還包括編碼清蛋白融合蛋白的核酸分子，以及包含這些核酸的載體，經(jīng)這些核酸和載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞，及使用這些核酸、載體和/或宿主細胞制備清蛋白融合蛋白的方法。本發(fā)明還包括轉(zhuǎn)基因生物體，該轉(zhuǎn)基因生物體經(jīng)修飾后含有本發(fā)明的核酸分子，該核酸分子任選經(jīng)修飾后表達由該核酸分子編碼的清蛋白融合蛋白。
本發(fā)明還包括包含本發(fā)明清蛋白融合蛋白及藥學(xué)可接受稀釋劑或載體的制藥學(xué)制劑。這樣的制劑可以存放在試劑盒或容器中。這樣的試劑盒或容器可以與關(guān)于保質(zhì)期延長的蛋白質(zhì)的說明書一起包裝。這樣的制劑可用于預(yù)防、治療、改善患者諸如哺乳動物或人的血小板減少癥或炎性疾病諸如炎性腸病、銀屑病、類風濕性關(guān)節(jié)炎、馮維勒布蘭德氏病等或是相關(guān)紊亂的方法，包括將制藥學(xué)制劑施用于患者的步驟。
本發(fā)明還包括用于潛在將與使用中等較高濃度的細胞因子的治療相關(guān)的副作用(如注射部位反應(yīng)、血漿容量增加、心律不齊、頭痛、惡心、發(fā)熱、皮疹、虛弱、腹瀉、頭暈、過敏反應(yīng))降至最低的方法，包括將本發(fā)明清蛋白融合細胞因子施用于所述哺乳動物。
本發(fā)明包括預(yù)防、治療或改善血小板減少癥或炎癥疾病諸如炎性腸病、銀屑病、類風濕性關(guān)節(jié)炎等的方法，包括將本發(fā)明的包含IL-11肽/蛋白質(zhì)(或其片段或變體)的清蛋白融合蛋白以有效治療、預(yù)防或改善疾病或紊亂的量施用于需要這樣的預(yù)防、治療或改善的哺乳動物。在本發(fā)明中，IL-11還稱為“治療性蛋白質(zhì)”。
本發(fā)明包括包含與清蛋白或多拷貝清蛋白(包括其片段及變體)融合的IL-11(包括其片段及變體)的清蛋白融合蛋白。
本發(fā)明還包括用于延長IL-11在哺乳動物中的半衰期的方法。該方法將IL-11與清蛋白連接而形成清蛋白融合IL-11，并將清蛋白融合IL-11施用于哺乳動物。通常，清蛋白融合IL-11的半衰期較未連接清蛋白的IL-11的半衰期可延長至少2倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍或至少50倍。
本發(fā)明例示的是包含與IL-11融合的清蛋白的融合蛋白。本發(fā)明還包括與本技術(shù)領(lǐng)域現(xiàn)有方法相比有所改進的制備治療性產(chǎn)品的方法。例如，本發(fā)明提供了制備具有活性IL-11部分的蛋白質(zhì)的改進方法。下文進一步詳細描述了本發(fā)明的各個方面。
清蛋白術(shù)語“人血清清蛋白(HSA)”和“人清蛋白(HA)”在本發(fā)明可互換使用。術(shù)語“清蛋白”及“血清清蛋白”意義更廣，包括人血清清蛋白(及其片段和變體)以及來自其它物種的清蛋白(及其片段和變體)。
如本發(fā)明所使用，“清蛋白”統(tǒng)稱具有清蛋白的一種或多種功能活性(如生物學(xué)活性)的清蛋白蛋白質(zhì)或氨基酸序列，或清蛋白片段或變體。具體而言，“清蛋白”是指人清蛋白或其片段(參見EP 201 239、EP 322 094及WO 97/24445)，尤其是WO 03/066824和WO 01/79480的表1和序列SEQ IDNO18中顯示的成熟形式人清蛋白，或本發(fā)明序列SEQ ID NO17的202-762位殘基，或來自其它脊椎動物的清蛋白或其片段，或這些分子的類似物或變體或其片段(例如WO 95/23857的經(jīng)修飾清蛋白)。
用于本發(fā)明清蛋白融合蛋白的人血清清蛋白可含有參照序列SEQ IDNO18的下述兩組點突變中的其中之一或二者兼之亮氨酸-407突變?yōu)楸彼?、亮氨?408突變?yōu)槔i氨酸、纈氨酸-409突變?yōu)楸彼帷⒓熬彼?410突變?yōu)楸彼?；或精氨?410突變?yōu)楸彼?、賴氨?413突變?yōu)楣劝滨０?、及賴氨?414突變?yōu)楣劝滨０?參見如國際公開號WO95/23857，將其完整并入本發(fā)明作為參考)。在其它實施方案中，含有上述兩組點突變中的其中之一或二者兼之的本發(fā)明清蛋白融合蛋白對酵母Yap3p蛋白水解裂解具有改進的穩(wěn)定性/抗性，使得酵母宿主細胞中表達的重組清蛋白融合蛋白產(chǎn)量提高。
如本發(fā)明所使用，足以延長治療性蛋白質(zhì)的體內(nèi)半衰期、治療活性或保質(zhì)期的清蛋白部分是指與未融合狀態(tài)的治療性蛋白質(zhì)的體內(nèi)半衰期、治療活性或保質(zhì)期相比在長度或結(jié)構(gòu)上足以穩(wěn)定、延長清蛋白融合蛋白中治療性蛋白質(zhì)部分的體內(nèi)半衰期、治療活性或保質(zhì)期的清蛋白部分。清蛋白融合蛋白中的清蛋白部分可包含上述全長HA序列，或者可包含其能夠穩(wěn)定或延長治療活性的一種或多種片段。這樣的片段的長度可為10個或更多氨基酸，或者可包含HA序列的約15、20、25、30、50、100、150或更多連續(xù)氨基酸，或者可包含HA特定結(jié)構(gòu)域的部分或全部。
本發(fā)明清蛋白融合蛋白中的清蛋白部分可為正常HA的變體。本發(fā)明清蛋白融合蛋白中的治療性蛋白質(zhì)部分也可為本發(fā)明描述的治療性蛋白質(zhì)的變體。術(shù)語“變體”包括插入、刪除及替代，無論是保守的還是非保守的，這樣的變化基本上不改變清蛋白的滲透、有用配體結(jié)合及非免疫原性特性中的一項或多項，或活性位點，或給予治療性蛋白質(zhì)以治療活性的活性結(jié)構(gòu)域。
具體而言，本發(fā)明清蛋白融合蛋白可以包含人清蛋白的天然存在多態(tài)變體及人清蛋白片段，例如EP 322 094中公開的那些片段(即HA(1-n)，其中n為369至419)。清蛋白可衍生自任何脊椎動物，尤其是任何哺乳動物，例如人、牛、綿羊或豬。非哺乳動物清蛋白包括但不限于雞和鮭魚。清蛋白融合蛋白中的清蛋白部分相對于治療性蛋白質(zhì)部分可來自不同的動物。
一般來說，HA片段或變體的長度至少為100個氨基酸，任選至少150個氨基酸。HA變體可包含或由HA的至少一個完整結(jié)構(gòu)域組成，例如結(jié)構(gòu)域1(SEQ ID NO18的1-194位氨基酸)，結(jié)構(gòu)域2(SEQ ID NO18的195-387位氨基酸)，結(jié)構(gòu)域3(SEQ ID NO18的388-585位氨基酸)，結(jié)構(gòu)域1+2(SEQ ID NO18的1-387位氨基酸)，結(jié)構(gòu)域2+3(SEQ IDNO18的195-585位氨基酸)，或結(jié)構(gòu)域1+3(SEQ ID NO18的1-194位氨基酸+SEQ ID NO18的388-585位氨基酸)。每一個結(jié)構(gòu)域本身由兩個同源亞結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，即1-105、120-194、195-291、316-387、388-491及512-585，柔性亞結(jié)構(gòu)域間接頭區(qū)包含殘基Lys106至Glu119，Glu292至Val315及Glu492至Ala511。
本發(fā)明清蛋白融合蛋白中的清蛋白部分可包含HA的至少一個亞結(jié)構(gòu)域或結(jié)構(gòu)域或其保守修飾體。如果融合蛋白以亞結(jié)構(gòu)域為基礎(chǔ)，那么有些或所有鄰近接頭可任選用于連接治療性蛋白質(zhì)部分。
清蛋白融合蛋白一般而言，本發(fā)明涉及清蛋白融合蛋白及治療、預(yù)防或改善疾病或紊亂的方法。如本發(fā)明所使用，“清蛋白融合蛋白”指通過至少一個分子的清蛋白(或其片段或變體)與至少一個分子的治療性蛋白質(zhì)(或其片段或變體)融合而形成的蛋白質(zhì)。本發(fā)明清蛋白融合蛋白包含至少治療性蛋白質(zhì)的片段或變體和至少人血清清蛋白的片段或變體，它們通過諸如基因融合(即清蛋白融合蛋白是由其中編碼完整或部分治療性蛋白質(zhì)的多核苷酸以相同讀碼框與編碼完整或部分清蛋白的多核苷酸連接的核酸翻譯生成的)彼此相互連接。治療性蛋白質(zhì)和清蛋白，一旦成為清蛋白融合蛋白的一部分，可稱為清蛋白融合蛋白的“部份”、“區(qū)域”或“模塊(moiety)”。
在一個實施方案中，本發(fā)明提供了包含或由治療性蛋白質(zhì)和血清清蛋白蛋白質(zhì)組成的清蛋白融合蛋白。在其它實施方案中，本發(fā)明提供了包含或由治療性蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性和/或治療活性片段和血清清蛋白蛋白質(zhì)組成的清蛋白融合蛋白。在其它實施方案中，本發(fā)明提供了包含由治療性蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性和/或治療活性變體和血清清蛋白蛋白質(zhì)組成的清蛋白融合蛋白。在其它實施方案中，清蛋白融合蛋白的血清清蛋白蛋白質(zhì)成分是血清清蛋白的成熟部分。
在其它實施方案中，本發(fā)明提供了包含或由治療性蛋白質(zhì)和血清清蛋白的生物學(xué)活性和/或治療活性片段組成的清蛋白融合蛋白。在其它實施方案中，本發(fā)明提供了包含或由治療性蛋白質(zhì)和血清清蛋白的生物學(xué)活性和/或治療活性變體組成的清蛋白融合蛋白。在有些實施方案中，清蛋白融合蛋白的治療性蛋白質(zhì)部分是治療性蛋白質(zhì)的成熟部分。
在其它實施方案中，本發(fā)明提供了包含或由治療性蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性和/或治療活性片段或變體和血清清蛋白的生物學(xué)活性和/或治療活性片段或變體組成的清蛋白融合蛋白。在有些實施方案中，本發(fā)明提供了包含或由治療性蛋白質(zhì)的成熟部分和血清清蛋白的成熟部分組成的清蛋白融合蛋白。
在一個實施方案中，清蛋白融合蛋白包含HA作為N端部分，且包含治療性蛋白質(zhì)作為C端部分?；蛘?，也可使用包含HA作為C端部分且包含治療性蛋白質(zhì)作為N端部分的清蛋白融合蛋白。
在其它實施方案中，清蛋白融合蛋白在清蛋白的N末端和C末端都融合有治療性蛋白質(zhì)。在一個實施方案中，在N末端和C末端融合的治療性蛋白質(zhì)為相同的治療性蛋白質(zhì)。在另一個實施方案中，在N末端和C末端融合的治療性蛋白質(zhì)為不同的治療性蛋白質(zhì)。在另一個實施方案中，在N末端和C末端融合的治療性蛋白質(zhì)為可用于治療或預(yù)防相同疾病、紊亂或狀況的不同治療性蛋白質(zhì)。在另一個實施方案中，在N末端和C末端融合的治療性蛋白質(zhì)為可用于治療或預(yù)防本領(lǐng)域共知的通常在病人中同時存在的疾病或紊亂的不同治療性蛋白質(zhì)。
除了清蛋白部分融合在治療性蛋白質(zhì)部分的N末端和/或C末端的清蛋白融合蛋白以外，本發(fā)明清蛋白融合蛋白還可通過將感興趣的治療性蛋白質(zhì)或肽插入HA的內(nèi)部區(qū)域產(chǎn)生。例如，在HA分子的蛋白質(zhì)序列中，α-螺旋的終點及起點之間存在許多環(huán)狀結(jié)構(gòu)或轉(zhuǎn)角，它們通過二硫鍵得以穩(wěn)定。根據(jù)HA的晶體結(jié)構(gòu)(PDB標識符1AO6、1BJ5、1BKE、1BMO、1E7E至1E7I及1UOR)，環(huán)狀結(jié)構(gòu)的大部分由分子主體向外延伸。這些環(huán)狀結(jié)構(gòu)可用于插入或內(nèi)部融合治療活性肽特別是需要二級結(jié)構(gòu)以具有功能的治療活性肽或治療性蛋白質(zhì)，本質(zhì)上產(chǎn)生具有特定生物學(xué)活性的清蛋白分子。
人清蛋白結(jié)構(gòu)中可插入肽或多肽以產(chǎn)生本發(fā)明清蛋白融合蛋白的環(huán)狀結(jié)構(gòu)包括纈氨酸54-天冬酰胺61、蘇氨酸76-天冬氨酸89、丙氨酸92-谷氨酸100、谷氨酰胺170-丙氨酸176、組氨酸247-谷氨酸252、谷氨酸266-谷氨酸277、谷氨酸280-組氨酸288、丙氨酸362-谷氨酸368、賴氨酸439-脯氨酸447、纈氨酸462-賴氨酸475、蘇氨酸478-脯氨酸486、及賴氨酸560-蘇氨酸566。在其它實施方案中，將肽或多肽插入成熟人清蛋白(SEQ IDNO18)的纈氨酸54-天冬酰胺61、谷氨酰胺170-丙氨酸176、和/或賴氨酸560-蘇氨酸566環(huán)狀結(jié)構(gòu)。
待插入的肽可來自篩選特定生物學(xué)活性的噬菌體展示或合成肽文庫，或來自具有所需功能的分子的活性部分。另外，可在特殊環(huán)狀結(jié)構(gòu)中產(chǎn)生隨機肽文庫，或通過將隨機肽插入HA分子的特定環(huán)狀結(jié)構(gòu)中，并在其中展現(xiàn)所有可能的氨基酸組合。
這樣的文庫可通過下列方法之一在HA或HA結(jié)構(gòu)域片段上產(chǎn)生(a)將HA或HA結(jié)構(gòu)域片段的一個或多個肽環(huán)中的氨基酸進行隨機突變。可以這種方式突變環(huán)狀結(jié)構(gòu)內(nèi)的一個、多個或所有殘基；
(b)在HA或HA結(jié)構(gòu)域片段(即內(nèi)部融合)的一個或多個環(huán)狀結(jié)構(gòu)中進行長度為Xn(其中X是氨基酸，n是殘基數(shù)目)的隨機肽的置換或插入；(c)除(a)和/或(b)以外的N末端、C末端、或N末端和C末端肽/蛋白質(zhì)融合蛋白。
還可以通過將針對不同靶篩選得到的肽移植到相同的HA或HA結(jié)構(gòu)域片段中，使HA或HA結(jié)構(gòu)域片段成為多功能的。
插入人血清清蛋白環(huán)狀結(jié)構(gòu)中的肽的實例為治療性蛋白質(zhì)肽或其肽片段或肽變體。例如，插入人血清清蛋白環(huán)狀結(jié)構(gòu)的肽可包括T-20和/或T-1249肽或其肽片段或肽變體。更具體的說，本發(fā)明包括在人血清清蛋白的環(huán)狀結(jié)構(gòu)中插入了長度為至少7個、至少8個、至少9個、至少10個、至少11個、至少12個、至少13個、至少14個、至少15個、至少20個、至少25個、至少30個、至少35個、或至少40個氨基酸的肽片段或肽變體的清蛋白融合蛋白。本發(fā)明還包括在人血清清蛋白N末端融合了長度為至少7個、至少8個、至少9個、至少10個、至少11個、至少12個、至少13個、至少14個、至少15個、至少20個、至少25個、至少30個、至少35個、或至少40個氨基酸的肽片段或肽變體的清蛋白融合蛋白。本發(fā)明還包括在人血清清蛋白C末端融合了長度為至少7個、至少8個、至少9個、至少10個、至少11個、至少12個、至少13個、至少14個、至少15個、至少20個、至少25個、至少30個、至少35個、或至少40個氨基酸的肽片段或肽變體的清蛋白融合蛋白。
一般而言，本發(fā)明清蛋白融合蛋白可有一個HA衍生區(qū)域和一個治療性蛋白質(zhì)衍生區(qū)域。然而，各種蛋白質(zhì)的多個區(qū)域可用于構(gòu)建本發(fā)明清蛋白融合蛋白。相似地，超過一種治療性蛋白質(zhì)可用于構(gòu)建本發(fā)明清蛋白融合蛋白。例如，可將治療性蛋白質(zhì)融合到HA的N末端及C末端兩個末端。在這樣一種構(gòu)造中，治療性蛋白質(zhì)部分可為相同或不同的治療性蛋白質(zhì)分子。雙功能清蛋白融合蛋白的結(jié)構(gòu)可表示為X-HA-Y或Y-HA-X或X-Y-HA或HA-X-Y或HA-Y-X-HA或HA-X-X-HA或HA-Y-Y-HA或HA-X-HA-Y或X-HA-Y-HA或多重組合和/或?qū)和/或Y插入HA序列內(nèi)任何位置。
雙功能或多功能清蛋白融合蛋白可根據(jù)功能、半衰期等以各種比率制備。雙功能或多功能清蛋白融合蛋白還可以制備成經(jīng)由HA相對末端的蛋白質(zhì)或肽將融合蛋白的治療性蛋白質(zhì)部分靶向靶器官或細胞類型。
作為已知治療分子的融合體的替代方法，可通過篩選作為HA或HA結(jié)構(gòu)域片段N末端、C末端、或N末端和C末端融合體而構(gòu)建的文庫來獲得肽，它們通常為6個、8個、12個、20個或25個或Xn個(其中X是氨基酸(aa)，n是殘基數(shù)目)隨機氨基酸，表現(xiàn)了所有可能的氨基酸組合。這種方法的特殊優(yōu)點是可在HA分子上的原位選擇肽，因此肽的特性就像選擇的那樣，而不會像由任何其它方法衍生肽然后附著到HA上的情況那樣發(fā)生潛在改變。
另外，本發(fā)明清蛋白融合蛋白可在融合部分之間包含接頭肽，在模塊之間提供更大物理間隔，并由此使治療性蛋白質(zhì)部分的可達性最大化，例如與其相關(guān)受體結(jié)合。接頭肽可由氨基酸組成，使其具柔性或更具剛性。
因此，如上所述，本發(fā)明清蛋白融合蛋白可有以下通式R2-R1、R1-R2、R2-R1-R2、R2-L-R1-L-R2、R1-L-R2、R2-L-R1、或R1-L-R2-L-R1，其中R1是至少一種治療性蛋白質(zhì)、肽或多肽序列(包括其片段或變體)，并且不必是相同的治療性蛋白質(zhì)，L是接頭，R2是血清清蛋白序列(包括其片段或變體)。例示性接頭包括(GGGGS)N(SEQ ID NO8)或(GGGS)N(SEQID NO9)或(GGS)N，其中N是大于或等于1的整數(shù)，G表示甘氨酸，S表示絲氨酸。當R1是二個或多個治療性蛋白質(zhì)、肽或多肽序列時，這些序列可任選由接頭連接。
在其它實施方案中，包含治療性蛋白質(zhì)的本發(fā)明清蛋白融合蛋白具有與未與清蛋白融合的相同治療性蛋白質(zhì)的保質(zhì)期或體內(nèi)半衰期或治療活性相比延長的保質(zhì)期或體內(nèi)半衰期或治療活性。保質(zhì)期通常指溶液中的或有些其它貯存制劑中的治療性蛋白質(zhì)的治療活性保持穩(wěn)定而無治療活性過度喪失的時間期限。許多治療性蛋白質(zhì)在其未融合狀態(tài)下高度易變。如下所述，這些治療性蛋白質(zhì)在引入本發(fā)明清蛋白融合蛋白后其典型的保質(zhì)期顯著延長。
保質(zhì)期“延長的”的本發(fā)明清蛋白融合蛋白相對于接受相同貯存和處理條件的標準品表現(xiàn)出更大的治療活性。標準品可為未融合的全長治療性蛋白質(zhì)。當清蛋白融合蛋白的治療性蛋白質(zhì)部分是該蛋白質(zhì)的類似物、變體、或有其它改變或不包含完整序列時，治療活性的延長或者可與該類似物、變體、改變的肽或不完整序列的未融合等同物相當。作為實例，在給定時間點進行比較時，本發(fā)明清蛋白融合蛋白可保留接受相同貯存及處理條件的標準品的治療活性的100％或大于其治療活性的105％、110％、120％、130％、150％或200％。然而，應(yīng)注意到，治療活性取決于治療性蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，并且可低于100％。
保質(zhì)期也可根據(jù)貯存后殘余的治療活性來評估，針對貯存開始時的治療活性進行標準化。保質(zhì)期延長的本發(fā)明清蛋白融合蛋白表現(xiàn)出治療活性延長，可保留接受相同條件的等價未融合治療性蛋白質(zhì)的治療活性的大于約50％、治療活性的約60％、70％、80％、或90％或更多。
治療性蛋白質(zhì)如上所述，本發(fā)明清蛋白融合蛋白包含至少治療性蛋白質(zhì)的片段或變體及至少人血清清蛋白的片段或變體，它們通過基因融合相互結(jié)合。
如本發(fā)明使用，“治療性蛋白質(zhì)”指具有一種或多種治療和/或生物學(xué)活性的IL-11或其片段或變體。因此，本發(fā)明清蛋白融合蛋白可含有至少治療性蛋白質(zhì)的片段或變體。另外，術(shù)語“治療性蛋白質(zhì)”可指治療性蛋白質(zhì)的內(nèi)源性或天然存在的相關(guān)物。變體包括突變體、類似物、模擬物及同系物，包括治療性蛋白質(zhì)的內(nèi)源性或天然存在的相關(guān)物。
表現(xiàn)出“治療活性”的多肽或“治療活性”蛋白質(zhì)指具有與治療性蛋白質(zhì)諸如本發(fā)明描述的或本領(lǐng)域已知的一種或多種治療性蛋白質(zhì)相關(guān)的一種或多種已知的生物學(xué)活性和/或治療活性的多肽。作為非限制性實例，“治療性蛋白質(zhì)”是可用于治療、預(yù)防或改善疾病、狀況或紊亂的蛋白質(zhì)。
如本發(fā)明所使用，“治療活性”或“活性”可指其效果與在人中的期望治療結(jié)果、或與非人哺乳動物或其它物種或生物體中的期望效果一致的活性。治療活性可在體內(nèi)或體外測量。例如，期望效果可在細胞培養(yǎng)中分析。如本領(lǐng)域所述，許多治療性蛋白質(zhì)通?？色@得這樣的體外或細胞培養(yǎng)測定法。
與本發(fā)明清蛋白融合蛋白的治療性蛋白質(zhì)部分對應(yīng)的治療性蛋白質(zhì)可通過附著一個或多個寡糖基團而進行修飾。稱作糖基化的修飾可顯著影響蛋白質(zhì)的物理性質(zhì)，而且在蛋白質(zhì)穩(wěn)定性、分泌和局部化方面是重要的。這樣的修飾在WO 03/066824和WO 01/79480中有詳細描述，將其引入本發(fā)明作為參考。
與本發(fā)明清蛋白融合蛋白的治療性蛋白質(zhì)部分對應(yīng)的治療性蛋白質(zhì)及其類似物和變體可以進行修飾，由于對其核酸序列的操作或其表達的其它條件使得由表達該蛋白的宿主細胞在一個或多個位點進行糖基化發(fā)生改變。例如，可通過清除或引入糖基化位點而產(chǎn)生糖基化異構(gòu)體，例如通過氨基酸殘基替代或刪除，諸如以谷氨酰胺替代天冬酰胺，或者可通過在不會使其糖基化的宿主細胞如大腸桿菌或糖基化缺陷的酵母中表達蛋白質(zhì)而產(chǎn)生非糖基化重組蛋白。這些方法的實例在WO 03/066824和WO 01/79480中有更為詳細的描述，將其引入本發(fā)明作為參考，并且是本領(lǐng)域已知的。
在各個實施方案中，本發(fā)明清蛋白融合蛋白具有與清蛋白融合蛋白的治療性蛋白質(zhì)部分對應(yīng)的治療性蛋白質(zhì)的治療活性和/或生物學(xué)活性對應(yīng)的治療活性和/或生物學(xué)活性。在其它實施方案中，本發(fā)明清蛋白融合蛋白的治療活性蛋白質(zhì)部分是參考序列的片段或變體，并具有相應(yīng)治療性蛋白質(zhì)的治療活性和/或生物學(xué)活性。
多肽和多核苷酸片段及變體片段本發(fā)明還涉及本發(fā)明的治療性蛋白質(zhì)、清蛋白、和/或清蛋白融合蛋白的片段。即使由蛋白質(zhì)的N末端刪除一個或多個氨基酸導(dǎo)致治療性蛋白質(zhì)、清蛋白、和/或清蛋白融合蛋白的一種或多種生物學(xué)功能改變或喪失，但其它治療活性和/或功能活性(如生物學(xué)活性、多聚能力、結(jié)合配體的能力)可仍然保留。例如，在由N末端消除完整多肽的少于多數(shù)殘基時，具有N末端刪除的多肽誘導(dǎo)和/或結(jié)合識別完整或成熟形式多肽的抗體的能力將保留。缺乏完整多肽N末端殘基的特定多肽是否保留這樣的免疫學(xué)活性可容易地通過本發(fā)明描述的及本技術(shù)領(lǐng)域其它途徑已知的常規(guī)方法確定。刪除了大量N末端氨基酸殘基的突變蛋白質(zhì)不大可能保留有些生物學(xué)或免疫學(xué)活性。實際上，由少至6個氨基酸殘基構(gòu)成的肽?？梢l(fā)免疫反應(yīng)。
因此，與本發(fā)明清蛋白融合蛋白的治療性蛋白質(zhì)部分對應(yīng)的治療性蛋白質(zhì)片段包括全長蛋白質(zhì)以及由參考多肽的氨基酸序列的氨基末端刪除了一個或多個殘基的多肽。編碼這些多肽的多核苷酸也包括在本發(fā)明內(nèi)。
另外，與本發(fā)明清蛋白融合蛋白的清蛋白蛋白質(zhì)部分對應(yīng)的血清清蛋白多肽片段包括全長蛋白質(zhì)以及由參考多肽(即血清清蛋白)的氨基酸序列的氨基末端刪除了一個或多個殘基的多肽。編碼這些多肽的多核苷酸的也包括在本發(fā)明內(nèi)。
另外，本發(fā)明清蛋白融合蛋白的片段包括全長清蛋白融合蛋白以及由清蛋白融合蛋白的氨基末端刪除了一個或多個殘基的多肽。編碼這些多肽的多核苷酸也包括在本發(fā)明內(nèi)。
本發(fā)明還提供了由與本發(fā)明清蛋白融合蛋白的治療性蛋白質(zhì)部分對應(yīng)的治療性蛋白質(zhì)的氨基酸序列的羧基末端刪除了一個或多個殘基的多肽。編碼這些多肽的多核苷酸也包括在本發(fā)明內(nèi)。
另外，本發(fā)明提供了由與本發(fā)明清蛋白融合蛋白的清蛋白蛋白質(zhì)部分(即血清清蛋白)對應(yīng)的清蛋白蛋白質(zhì)的氨基酸序列的羧基末端刪除了一個或多個殘基的多肽。編碼這些多肽的多核苷酸也包括在本發(fā)明內(nèi)。
另外，本發(fā)明提供了由本發(fā)明清蛋白融合蛋白的羧基末端刪除了一個或多個殘基的多肽。編碼這些多肽的多核苷酸也包括在本發(fā)明內(nèi)。
另外，任何上述N末端或C末端刪除可結(jié)合產(chǎn)生N末端和C末端刪除的參考蛋白(如表1中提及的治療性蛋白質(zhì)，或血清清蛋白(如SEQ ID NO18)，或本發(fā)明清蛋白融合蛋白)。本發(fā)明還提供了由氨基和羧基兩個末端刪除了一個或多個氨基酸的多肽。編碼這些多肽的多核苷酸也包括在本發(fā)明內(nèi)。
本申請還涉及包含與本發(fā)明所列參考多肽序列(如治療性蛋白質(zhì)、血清清蛋白蛋白質(zhì)或本發(fā)明清蛋白融合蛋白)至少60％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一的多肽的蛋白質(zhì)或其片段。在有些實施方案中，本申請涉及包含與上述具有N末端和C末端刪除的氨基酸序列的參考多肽至少60％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一的多肽的蛋白質(zhì)。編碼這些多肽的多核苷酸也包括在本發(fā)明內(nèi)。
本發(fā)明的其它多肽片段為包含或由表現(xiàn)出治療性蛋白質(zhì)或血清清蛋白清蛋白的多肽序列的治療活性和/或功能活性(如生物學(xué)活性)的氨基酸序列組成的片段，其中氨基酸序列為片段。
其它多肽片段為生物學(xué)活性片段。生物學(xué)活性片段為表現(xiàn)出與本發(fā)明多肽的活性相似但不必相同的活性的片段。片段的生物學(xué)活性可包括改進的期望活性，或降低的非期望活性。
變體“變體”指與參考核酸或多肽不同但保留其本質(zhì)特性的核酸或多肽。通常，變體總體上非常相似，并在許多區(qū)域與參考核酸或多肽相同。
如本發(fā)明所使用，“變體”指在序列上分別與治療性蛋白質(zhì)、清蛋白、和/或本發(fā)明清蛋白融合蛋白不同但保留本發(fā)明其它地方描述的或本領(lǐng)域其它途徑已知的至少一種其功能和/或治療特性的本發(fā)明清蛋白融合蛋白的治療性蛋白質(zhì)部分、本發(fā)明清蛋白融合蛋白的清蛋白部分、或清蛋白融合蛋白。通常，變體總體上非常相似，并在許多區(qū)域與本發(fā)明清蛋白融合蛋白的治療性蛋白質(zhì)部分對應(yīng)的治療性蛋白質(zhì)、本發(fā)明清蛋白融合蛋白的清蛋白蛋白質(zhì)部分對應(yīng)的清蛋白蛋白質(zhì)、和/或本發(fā)明清蛋白融合蛋白的氨基酸序列相同。編碼這些變體的核酸也包括在本發(fā)明內(nèi)。
本發(fā)明還涉及包含或由與例如本發(fā)明清蛋白融合蛋白的治療性蛋白質(zhì)部分對應(yīng)的治療性蛋白質(zhì)、本發(fā)明清蛋白融合蛋白的清蛋白蛋白質(zhì)部分對應(yīng)的清蛋白蛋白質(zhì)(如SEQ ID NO18或其片段或變體)、和/或本發(fā)明清蛋白融合蛋白的氨基酸序列等氨基酸序列至少60％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)。還提供了這些多肽的片段(如本發(fā)明所述的那些片段)。本發(fā)明包括的其它多肽為由在嚴謹雜交條件下(如于約45℃在6x氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中與濾膜結(jié)合的DNA進行雜交，然后于約50-65℃在0.2xSSC、0.1％SDS中洗滌一次或多次)、在高度嚴謹條件下(如于約45℃在6x氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)與濾膜結(jié)合的DNA進行雜交，然后于約68℃在0.1xSSC、0.2％SDS洗滌一次或多次)、與編碼本發(fā)明氨基酸序列的核酸分子的互補鏈發(fā)生雜交的多核苷酸編碼的多肽；；或在本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的其它嚴謹雜交條件下(參見例如Ausubel，F(xiàn).M.等人編，1989，《Current protocol in Molecular Biology》，Greenpublishing associates公司及John Wiley & Sons公司，New York，第6.3.1-6.3.6頁和第2.10.3頁)。編碼這些多肽的多核苷酸也包括在本發(fā)明內(nèi)。
具有與本發(fā)明查詢氨基酸序列至少例如95％“同一”的氨基酸序列的多肽意指主題多肽的氨基酸序列與查詢序列相同，只是查詢氨基酸序列的每100個氨基酸主題多肽序列可包含多達5個氨基酸的改變。換言之，為了獲得具有與查詢氨基酸序列至少95％同一的氨基酸序列的多肽，可以在主題序列中插入、刪除、或用另一種氨基酸替代多達5％的氨基酸殘基。參考序列的這些改變可發(fā)生在參考氨基酸序列的氨基或羧基末端位置或是那些末端位置之間的任何位置，各自分散于參考序列的殘基之間或參考序列內(nèi)一個或多個鄰近群組中。
作為實踐，任何特定多肽是否與例如本發(fā)明清蛋白融合蛋白或其片段(諸如清蛋白融合蛋白的治療性蛋白質(zhì)部分或清蛋白融合蛋白的清蛋白部分)的氨基酸序列至少60％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一，可以使用已知的計算機程序常規(guī)確定。這樣的程序及其使用方法在如WO 03/066824及WO 01/79480(第41-43頁)中有描述，將其引入本發(fā)明作為參考。
本發(fā)明的多核苷酸變體可在編碼區(qū)、非編碼區(qū)、或二者兼之中包含改變。多核苷酸變體包括包含產(chǎn)生沉默替代、添加、或刪除但不改變所編碼多肽的特性或活性的改變的那些變體。這樣的核苷酸變體可因遺傳密碼子的簡并性由沉默替代產(chǎn)生。多肽變體包括其中少于50個、少于40個、少于30個、少于20個、少于10個、或5-50個、5-25個、5-10個、1-5個、或1-2個氨基酸以任意組合遭到替代、刪除或添加的變體?？梢詾榱硕喾N原因而產(chǎn)生多核苷酸變體，如為了特定宿主優(yōu)化密碼子表達(將人mRNA的密碼子改變成微生物宿主諸如酵母或大腸桿菌優(yōu)選的密碼子)。
在另一個實施方案中，為了在酵母或哺乳動物中進行表達而優(yōu)化編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的清蛋白部分的多核苷酸。在另一個實施方案中，為了在酵母或哺乳動物細胞中進行表達而優(yōu)化編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的治療性蛋白質(zhì)部分的多核苷酸。在又一個實施方案中，為了在酵母或哺乳動物細胞中進行表達而優(yōu)化編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸。
在一個備選實施方案中，經(jīng)過密碼子優(yōu)化的編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的治療性蛋白質(zhì)部分的多核苷酸在本發(fā)明所述嚴謹雜交條件下不與編碼治療性蛋白質(zhì)的野生型多核苷酸發(fā)生雜交。在另一個實施方案中，經(jīng)過密碼子優(yōu)化的編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的清蛋白部分的多核苷酸在本發(fā)明所述嚴謹雜交條件下不與編碼清蛋白蛋白質(zhì)的野生型多核苷酸發(fā)生雜交。在另一個實施方案中，經(jīng)過密碼子優(yōu)化的編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸在本發(fā)明所述嚴謹雜交條件下不與編碼治療性蛋白質(zhì)部分或清蛋白蛋白質(zhì)部分的野生型多核苷酸發(fā)生雜交。
在另一個實施方案中，編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的治療性蛋白質(zhì)部分的多核苷酸不包含或由治療性蛋白質(zhì)的天然存在序列組成。在另一個實施方案中，編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的清蛋白蛋白質(zhì)部分的多核苷酸不包含或由清蛋白蛋白質(zhì)的天然存在序列組成。在一個備選實施方案中，編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸不包含或由治療性蛋白質(zhì)部分或清蛋白蛋白質(zhì)部分的天然存在序列組成。
在另一個實施方案中，由于天然存在的野生型多核苷酸，治療性蛋白質(zhì)可以通過生物淘洗從隨機肽文庫選出。
天然存在的變體稱為“等位基因變體”，指占據(jù)生物體染色體上指定基因座的基因幾種備選形式中的一種。(《Genes II》，Lewin，B.編，John Wiley &Sons，New York，1985)。這些等位基因變體可在多核苷酸和/或多肽水平有所不同，并包括在本發(fā)明內(nèi)。另外，非天然存在的變體可通過誘變技術(shù)或通過直接合成而產(chǎn)生。
使用蛋白質(zhì)工程及重組DNA技術(shù)的已知方法，可以產(chǎn)生變體以改進或改變本發(fā)明多肽的特征。例如，可從本發(fā)明多肽的N末端或C末端刪除一個或多個氨基酸而無生物學(xué)功能的實質(zhì)性喪失。參見Ron等人，J.Biol.Chem.2682984-2988，1993(KGF變體)及Dobeli等人，J.Biotechnology7199-216，1988(干擾素γ變體)。
另外，充足的證據(jù)表明變體常保留與天然存在蛋白質(zhì)相似的生物學(xué)活性(如Gayle及其同事，J.Biol.Chem.26822105-22111，1993)(IL-1a變體)。
另外，即使從多肽的N末端或C末端刪除一個或多個氨基酸導(dǎo)致一種或多種生物學(xué)功能的改變或喪失，但其它生物學(xué)活性仍可保留。例如，在從N末端或C末端消除少于分泌形式的大多數(shù)殘基時，刪除變體誘導(dǎo)和/或結(jié)合識別分泌形式的抗體的能力仍可能保留。缺乏蛋白質(zhì)的N末端或C末端殘基的特定多肽是否保留這樣的免疫原性活性可通過本發(fā)明描述的或本領(lǐng)域其它途徑已知的常規(guī)方法容易地確定。
由此，本發(fā)明還包括具有功能活性(如生物學(xué)活性和/或治療活性)的多肽變體。在其它實施方案中，本發(fā)明提供了具有與清蛋白融合蛋白的治療性蛋白質(zhì)部分對應(yīng)的治療性蛋白質(zhì)的一種或多種生物學(xué)活性和/或治療活性對應(yīng)的功能活性(如生物學(xué)活性和/或治療活性，諸如表1中“生物學(xué)活性”欄中所公開的)的清蛋白融合蛋白變體。這樣的變體包括根據(jù)本領(lǐng)域已知的一般規(guī)則選出的刪除、插入、倒置、重復(fù)及替代，從而對活性幾乎無影響。
在其它實施方案中，本發(fā)明的變體具有保守替代?！氨Ｊ靥娲敝溉航M內(nèi)交換，諸如脂肪族或疏水性氨基酸丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸及異亮氨酸的置換，羥基殘基絲氨酸及蘇氨酸的置換，酸性殘基天冬氨酸及谷氨酸的置換，酰胺殘基天冬酰胺及谷氨酰胺的置換，堿性殘基賴氨酸、精氨酸及組氨酸的置換，芳香族殘基苯丙氨酸、酪氨酸及色氨酸的置換，小型氨基酸丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、甲硫氨酸及甘氨酸的置換。
例如Bowie等人，“Deciphering the Message in Protein SequencesTolerance to Amino Acid Substitutions”，Science2471306-1310，1990中提供了關(guān)于如何進行表型沉默的氨基酸替代的指導(dǎo)，其中作者指出有兩種主要策略用于研究氨基酸序列對改變的耐受。
如作者所述，蛋白質(zhì)驚人地耐受氨基酸替代。作者還指出哪些氨基酸變化可能在蛋白質(zhì)中的某些氨基酸位置是允許的。例如，大多數(shù)埋入(在蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)中)的氨基酸殘基需要非極性側(cè)鏈，而表面?zhèn)孺湹奶厣ǔ：苌偈潜Ｊ氐?。另外，耐受的保守氨基酸替代涉及脂肪族或疏水性氨基酸丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸及異亮氨酸的置換，羥基殘基絲氨酸及蘇氨酸的置換，酸性殘基天冬氨酸及谷氨酸的置換，酰胺殘基天冬酰胺及谷氨酰胺的置換，堿性殘基賴氨酸、精氨酸及組氨酸的置換，芳香族殘基苯丙氨酸、酪氨酸及色氨酸的置換，小型氨基酸丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、甲硫氨酸及甘氨酸的置換。
除保守氨基酸替代外，本發(fā)明的變體還包括(i)包含一個或多個非保守氨基酸殘基的替代的多肽，其中遭到替代的氨基酸殘基可以是或不是由遺傳密碼編碼的殘基，或(ii)包含一個或多個具有取代基的氨基酸殘基的替代的多肽，或(iii)與另一種化合物諸如提高多肽穩(wěn)定性和/或溶解性的化合物(例如聚乙二醇)融合或化學(xué)綴合的多肽，(iv)包含額外氨基酸諸如例如IgG Fc融合區(qū)肽的多肽。根據(jù)本發(fā)明的教授，認為這樣的變體多肽屬于本領(lǐng)域技術(shù)人員的范圍內(nèi)。
例如，包含用其它帶電荷或中性氨基酸替代帶電荷氨基酸的氨基酸替代的多肽變體可以產(chǎn)生具有改良特征諸如較少聚集的蛋白質(zhì)。制藥學(xué)制劑的聚集既降低活性，又因聚集物的免疫原性活性提高清除率。參見Pinckard等人，Clin.Exp.Immunol.2331-340，1967；Robbins等人，Diabetes36838-845，1987；Cleland等人，Crit.Rev.Therapeutic Drug Carrier Systems10307-377，1993。
在具體實施方案中，本發(fā)明的多肽包含或由本發(fā)明所述治療性蛋白質(zhì)和/或人血清清蛋白、和/或本發(fā)明清蛋白融合蛋白的氨基酸序列的片段或變體組成，其中與參考氨基酸序列相比，所述片段或變體具有1-5個、5-10個、5-25個、10-50個或50-150個氨基酸殘基添加、替代、和/或刪除。在某些實施方案中，氨基酸替代是保守的。編碼這些多肽的核酸也包括在本發(fā)明中。
本發(fā)明的多肽可以由通過肽鍵或修飾肽鍵(即肽電子等排體)彼此連接的氨基酸構(gòu)成，可含有20種基因編碼的氨基酸以外的氨基酸。多肽可通過天然過程諸如翻譯后加工，或通過本領(lǐng)域眾所周知的化學(xué)修飾技術(shù)進行修飾。這樣的修飾在基礎(chǔ)教科書及更為詳細的專題著作中以及在多卷的研究文獻中有詳細描述。修飾可發(fā)生在多肽中的任何位置，包括肽骨架、氨基酸側(cè)鏈及氨基或羧基末端。應(yīng)該知道相同類型的修飾可在指定多肽中在幾個位點以相同或不同程度存在。另外，指定多肽可含有許多類型的修飾。多肽例如因遍在蛋白化作用可為分支，并可為有分支或無分支的環(huán)狀。環(huán)狀、分支及分支環(huán)狀多肽可由翻譯后天然過程產(chǎn)生或通過合成方法制備。修飾包括乙?；饔?、?；饔?、ADP核糖基化、酰胺化、黃素的共價附著、亞鐵血紅素模塊的共價附著、核苷酸或核苷酸衍生物的共價附著、脂質(zhì)或脂質(zhì)衍生物的共價附著、磷脂酰肌醇的共價附著、交聯(lián)、環(huán)化、二硫鍵形成、脫甲基作用、共價交聯(lián)形成、胱氨酸的形成、焦谷氨酸的形成、甲酰化作用、γ-羧化作用、糖基化作用、GPI錨形成、羥基化作用、碘化作用、甲基化作用、肉豆蔻基化作用、氧化作用、PEG化作用、蛋白水解加工、磷酸化作用、異戊烯化作用、外消旋作用、硒化、硫酸化作用、轉(zhuǎn)運RNA介導(dǎo)的將氨基酸添加到蛋白質(zhì)中諸如精氨?；氨樵诨饔谩?br> 另外，可將化學(xué)實體共價附著至清蛋白融合蛋白以增加或調(diào)節(jié)特定的功能性或生物學(xué)活性，諸如通過Current Opinions in Biotechnology10324，1999中公開的方法。
本發(fā)明包括的其它翻譯后修飾包括例如由于原核宿主細胞表達引起的N-連接或O-連接糖鏈、N-末端或C-末端加工、將化學(xué)模塊附著至氨基酸骨架、N-連接或O-連接糖鏈的化學(xué)修飾、及N-末端甲硫氨酸殘基的添加或刪除。清蛋白融合蛋白還可用例如但不限于化學(xué)治療劑諸如藥物、和/或可檢測標記物諸如酶、熒光、同位素和/或親和標記物進行修飾，使蛋白質(zhì)得以檢測和分離。這樣的修飾的實例在例如WO 03/066824及WO 01/79480(第105-106頁)中給出，將其引入本發(fā)明作為參考。
功能活性“具有功能活性的多肽”指能夠表現(xiàn)出與治療性蛋白質(zhì)的全長、原蛋白、和/或成熟形式相關(guān)的一種或多種已知功能活性的多肽。這樣的功能活性包括但不限于生物學(xué)活性、抗原性(與抗多肽抗體結(jié)合(或與多肽競爭結(jié)合)的能力)、免疫原性(產(chǎn)生與本發(fā)明特定多肽結(jié)合的抗體的能力)、與本發(fā)明多肽形成多聚體的能力、以及與多肽的受體或配體結(jié)合的能力。
“具有生物學(xué)活性的多肽”指根據(jù)具有沒有劑量依賴性的特定生物學(xué)測定法的測量，表現(xiàn)出與本發(fā)明治療性蛋白質(zhì)包括成熟形式的活性相似但不必相同的活性的多肽。在劑量依賴性存在的情況中，不需要與多肽的相同，但指定活性的劑量依賴性與本發(fā)明多肽實質(zhì)性相似。
在其它實施方案中，本發(fā)明清蛋白融合蛋白具有與治療性蛋白質(zhì)(或其片段或變體)在未與清蛋白融合時相關(guān)的至少一種生物學(xué)活性和/或治療活性。
可以使用本領(lǐng)域已知的常規(guī)或修改的測定法及本發(fā)明描述的測定法來分析本發(fā)明清蛋白融合蛋白的功能活性(如生物學(xué)活性)。具體而言，可分析清蛋白融合蛋白的功能活性。另外，本領(lǐng)域技術(shù)人員可使用分析IL-11活性的測定法常規(guī)分析與本發(fā)明清蛋白融合蛋白的治療性蛋白質(zhì)部分對應(yīng)的治療性蛋白質(zhì)片段的活性。另外，本領(lǐng)域技術(shù)人員可使用本領(lǐng)域已知的和/或在WO 03/066824及WO 01/79480的實施例部分描述的測定法常規(guī)分析與本發(fā)明清蛋白融合蛋白的清蛋白蛋白質(zhì)部分對應(yīng)的清蛋白蛋白質(zhì)片段的活性。
另外，本發(fā)明描述的(參見實施例和表1)及本領(lǐng)域其它途徑已知的測定法可常規(guī)用于測量本發(fā)明清蛋白融合蛋白及其片段、變體及衍生物引發(fā)與本發(fā)明清蛋白融合蛋白的治療性蛋白質(zhì)部分和/或清蛋白部分相關(guān)的生物學(xué)活性和/或治療活性(體外或體內(nèi))的能力。其它方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知并屬于本發(fā)明范圍內(nèi)。
融合蛋白的表達本發(fā)明清蛋白融合蛋白可作為重組分子由酵母、微生物諸如細菌、或人或動物細胞系分泌而產(chǎn)生。任選地是，多肽由宿主細胞分泌。
對于本發(fā)明例示的清蛋白融合蛋白的表達，成功使用了WO 95/33833中例示的HSP150基因遭到破壞的酵母菌株、或WO 00/44772中例示的PMT1基因遭到破壞的酵母菌株(以降低/消除清蛋白融合蛋白的O-連接糖基化作用)、或WO 95/23857中例示的YAP3基因遭到破壞的酵母菌株，連同WO 90/01063中例示的酵母PRB1啟動子、HAS/MFα-1融合前導(dǎo)序列、US 5,637,504中例示的酵母ADH1終止子、LEU2選擇標記及非整合載體pSAC35。
預(yù)期可用于本發(fā)明的其它酵母菌株、啟動子、前導(dǎo)序列、終止子、標記及載體在WO 03/066824及WO 01/74980(第94-99頁)中有描述，將其引入本發(fā)明作為參考。
本發(fā)明還包括細胞，任選經(jīng)轉(zhuǎn)化表達本發(fā)明清蛋白融合蛋白的酵母細胞。除了經(jīng)轉(zhuǎn)化宿主細胞本身外，本發(fā)明還涉及那些細胞在營養(yǎng)培養(yǎng)基中的培養(yǎng)物，任選單克隆(克隆上同質(zhì)的)培養(yǎng)物或由單克隆培養(yǎng)物衍生的培養(yǎng)物。如果多肽是分泌的，則培養(yǎng)基將含有多肽，帶有細胞，或如果細胞已被過濾或離心去除則不帶有細胞。許多表達系統(tǒng)為已知的并可使用，包括細菌(例如大腸桿菌及枯草桿菌)、酵母(釀酒酵母、乳克魯維氏酵母及巴斯德畢赤氏酵母)、絲狀真菌(例如曲霉)、植物細胞、動物細胞及昆蟲細胞。
所需蛋白質(zhì)以常規(guī)方法產(chǎn)生，例如由插入宿主染色體或游離質(zhì)粒中的編碼序列產(chǎn)生。使用任何常用方法例如電穿孔以所需蛋白質(zhì)的編碼序列轉(zhuǎn)化酵母。通過電穿孔轉(zhuǎn)化酵母的方法在Becker和Guarente，Methods Enzymol.194182，1990中有描述。
成功轉(zhuǎn)化的細胞，即含有本發(fā)明DNA構(gòu)建體的細胞可通過眾所周知的技術(shù)進行鑒定。例如，可培養(yǎng)由導(dǎo)入表達構(gòu)建體產(chǎn)生的細胞以產(chǎn)生所需多肽。收獲細胞、裂解、并使用諸如Southern，J.Mol.Biol.98503，1975或Berent等人，Biotech.3208，1985描述的方法對DNA內(nèi)容物檢驗DNA的存在。或者，可以使用抗體來檢測上清液中蛋白質(zhì)的存在。
有用的酵母質(zhì)粒載體包括pRS403-406及pRS413-416，一般可從Stratagene Cloning Systems，La Jolla，CA92037，USA獲得。質(zhì)粒pRS403、pRS404、pRS405及pRS406為酵母整合質(zhì)粒(YIp)，摻入了酵母選擇標記HIS3、TRP1、LEU2及URA3。質(zhì)粒spRS413-416為酵母著絲粒質(zhì)粒(YCp)。
用于在酵母中表達以制備清蛋白融合蛋白的載體包括pPPC0005、pScCHSA、pScNHSA、及pC4HAS，它們于2001年4月11日保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心，10801 University Boulevard，Manassas，Virginia20110-2209，且在WO 03/066824及WO 01/79480中有描述，將其引入本發(fā)明作為參考。
期望可用于在酵母中表達清蛋白融合蛋白的另一種載體為pSAC35載體，它在Sleep等人，BioTechnology 842，1990中有描述，將其完整引入本發(fā)明作為參考。質(zhì)粒pSAC35為US 5,637,504中描述的非整合類載體。
已開發(fā)許多方法用于經(jīng)互補粘端將DNA與載體可操作連接。例如，可以將互補同聚物束添加至將要插入載體DNA中的DNA片段。然后，將載體及DNA片段通過互補同聚物尾之間氫鍵連接以形成重組DNA分子。
含有一種或多種限制性位點的合成接頭提供了另一種連接DNA片段和載體的方法。將通過限制性內(nèi)切核酸酶消化產(chǎn)生的DNA片段用噬菌體T4DNA聚合酶或大腸桿菌DNA聚合酶I進行處理，這些酶以其3′-5′外切核酸水解活性消除凸出的5′單鏈末端，并用聚合活性填平凹進的3′末端。因此，這些活性的結(jié)合產(chǎn)生末端補平的DNA片段。然后，在存在能夠催化平端DNA分子連接的酶諸如噬菌體T4 DNA連接酶的條件下將末端補平的DNA片段與摩爾數(shù)大大過量的接頭分子一起保溫。由此，反應(yīng)產(chǎn)物為在其末端攜帶多聚接頭序列的DNA片段。然后，用合適的限制酶切割這些DNA片段，并與已用產(chǎn)生與DNA片段末端匹配的末端的酶切割過的表達載體進行連接。
含有多種限制性內(nèi)切核酸酶位點的合成接頭可從許多商業(yè)來源購得。
如果例如要制備HA變體的話，根據(jù)本發(fā)明修飾DNA的一種理想方法為使用Sailci等人，Science239487-491，1988公開的聚合酶鏈式反應(yīng)。在此方法中，酶促擴增的DNA的側(cè)翼即兩種特異的寡核苷酸引物，它們本身摻入擴增的DNA中。特異引物可含有限制性內(nèi)切核酸酶識別位點，使用本領(lǐng)域已知的方法可用于克隆到表達載體中。
設(shè)想可作為表達清蛋白融合蛋白的宿主用于本發(fā)明實踐的酵母的例示屬有畢赤氏酵母屬(Pichia)(從前歸入漢遜酵母屬Hansenula)、糖酵母屬(Saccharomyces)、克魯維氏酵母屬(Kluyveromyces)、曲霉屬(Aspergillus)、假絲酵母屬(Candida)、球擬酵母屬(Torulopsis)、孢圓酵母屬(Torulaspora)、裂殖糖酵母屬(Schizosaccharomyces)、固囊酵母屬(Citeromyces)、囊酵母屬(Pachysolen)、接合糖酵母屬(Zygosaccharomyces)、德巴利氏酵母屬(Debaryomyces)、木霉屬(Trichoderma)、頭孢屬(Cephalosporium)、腐質(zhì)霉屬(Humicola)、毛霉屬(Mucor)、鏈孢霉屬(Neurospora)、亞羅氏酵母(Yarrowia)、梅奇酵母屬(Metschnikowia)、紅冬孢屬(Rhodosporidium)、白冬孢酵母(Leucosporidium)、Botryoascus、鎖擲酵母屬(Sporidiobolus)、擬內(nèi)孢霉屬(Endomycopsis)等等。屬包括選自下組的屬糖酵母屬、裂殖糖酵母屬、克魯維氏酵母屬、畢赤氏酵母屬、及Torulaspora。糖酵母屬的實例為啤酒糖酵母(S.cerevisiae)、意大利糖酵母(S.italicus)及魯式糖酵母(S.rouxii)。其它物種的實例及其轉(zhuǎn)化方法在WO 03/066824及WO 01/79480(第97-98頁)中有描述，將其引入本發(fā)明作為參考。
用于轉(zhuǎn)化釀酒酵母的方法在EP 251744、EP 258067及WO 90/01063中有概括教授，將它們都引入本發(fā)明作為參考。適用于釀酒酵母的啟動子包括與PGKI基因、GAL1或GAL10基因、CYCI、PH05、TRPI、ADHI、ADH2、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、己糖激酶、丙酮酸鹽脫羧酶、磷酸果糖激酶、磷酸丙糖異構(gòu)酶、磷酸葡糖異構(gòu)酶、葡糖激酶的基因、α-交配因子信息素(一種交配因子外激素)有關(guān)的啟動子、PRBI啟動子、GUT2啟動子、GPDI啟動子、及牽涉部分5’調(diào)控區(qū)與部分其它啟動子5’調(diào)控區(qū)或與上游激活位點(如EP-A-258067的啟動子)的雜合體的雜合啟動子。
用于粟酒裂殖糖酵母的便于調(diào)節(jié)的啟動子為如Maundrell，J.Biol.Chem.26510857-10864，1990描述的來自nmt基因的硫胺素可抑制啟動子，以及如Hoffman和Winston，Genetics124807-816，1990描述的葡萄糖可抑制jbp1基因啟動子。
轉(zhuǎn)化畢赤氏酵母以表達外源基因的方法在例如Cregg等人，1993及各種Phillips專利(如US 4 857 467，將其引入本發(fā)明作為參考)中有教授，畢赤氏酵母表達試劑盒可從Invitrogen BV，Leek，Netherlands及Invitrogen公司，San Diego，California購得。合適的啟動子包括AOX1及AOX2。Gleeson等人，J.Gen.Microbiol.1323459-3465，1986包括有關(guān)漢遜氏酵母載體及轉(zhuǎn)化的信息，合適的啟動子為MOX1及FMD1；而EP 361991，F(xiàn)leer等人，1991及Rhone-Poulenc Rorer的其它出版物教授如何在克魯維氏酵母中表達外源蛋白。
轉(zhuǎn)錄終止信號可為含有轉(zhuǎn)錄終止及多腺苷酸化的合適信號的真核基因3′側(cè)翼序列。合適的3′側(cè)翼序列可為例如基因中與所用表達控制序列天然連接的那些，即可與啟動子相對應(yīng)。或者，它們可以是不同的，在那種情況中，任選使用釀酒酵母ADH1基因的終止信號。
所需清蛋白融合蛋白可最初以分泌前導(dǎo)序列表達，它可為在所選擇的酵母中有效的任何前導(dǎo)序列。在釀酒酵母中有用的前導(dǎo)序列包括來自交配因子多肽(MFα1)的前導(dǎo)序列及EP-A-387319的雜合前導(dǎo)序列。這樣的前導(dǎo)序列(或信號)在成熟清蛋白釋放到周圍培養(yǎng)基中之前由酵母切除。另外，這樣的前導(dǎo)序列包括JP 62-096086(授權(quán)號為911036516)中公開的釀酒酵母轉(zhuǎn)化酶(SUC2)、酸性磷酸酶(PHO5)、MFα-1的前序列、β-葡聚糖酶(BGL2)及殺傷毒素、糖化糖酵母(S.dastaticus)葡萄糖淀粉酶II、卡爾斯伯糖酵母(S.carlsbergensis)α-半乳糖苷酶(MEL1)、乳克魯維氏酵母殺傷毒素、及假絲酵母葡萄糖淀粉酶的前導(dǎo)序列。
清蛋白融合蛋白的重組及合成生產(chǎn)的其它方法本發(fā)明包括編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸，以及含有這些多核苷酸的載體、宿主細胞及生物體。本發(fā)明還包括通過合成及重組技術(shù)生產(chǎn)本發(fā)明清蛋白融合蛋白的方法。多核苷酸、載體、宿主細胞及生物體可通過本領(lǐng)域已知的方法分離及純化。
可用于本發(fā)明的載體可為例如噬菌體、質(zhì)粒、粘粒、微型染色體、病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。可用于克隆和/或表達本發(fā)明多核苷酸的載體為能夠在期望復(fù)制和/或表達多核苷酸的宿主中復(fù)制和/或表達多核苷酸的載體。一般而言，多核苷酸和/或載體可用于任何細胞，無論真核或原核，包括哺乳動物細胞(如人(如HeLa)、猴(如Cos)、兔(如兔網(wǎng)織紅細胞)、大鼠、倉鼠(如CHO、NSO及幼倉鼠腎細胞)或小鼠(如L細胞)細胞、植物細胞、酵母細胞、昆蟲細胞或細菌細胞(如大腸桿菌)。各種類型宿主細胞的合適載體的例子參見如Ausubel，F(xiàn).等人，《Current Protocols in Molecular Biology》，Greene Publishing Associates及Wiley-Interscience，1992及Sambrook等人，1989。然而，應(yīng)該注意到在使用復(fù)制缺陷的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體時，病毒一般僅在互補的宿主細胞中增殖。
含有這些多核苷酸的宿主細胞可用于表達大量的蛋白質(zhì)，它們可用于如藥物、診斷劑、疫苗及治療劑?？赏ㄟ^本領(lǐng)域已知的或本發(fā)明描述的方法分離及純化蛋白質(zhì)。
可將編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸與含有用于在宿主中增殖的選擇標記的載體連接。通常，可將質(zhì)粒載體摻入沉淀物，諸如磷酸鈣沉淀物，或是與帶電荷脂質(zhì)的復(fù)合物。如果載體是病毒，可在體外用合適的包裝細胞系進行包裝，然后轉(zhuǎn)導(dǎo)到宿主細胞中。
應(yīng)將多核苷酸插入片段與待合適啟動子可操作連接，該啟動子與將要表達該多核苷酸的宿主細胞相容。啟動子可為強啟動子和/或可誘導(dǎo)啟動子。啟動子的實例包括λ噬菌體PL啟動子，大腸桿菌lac、trp、phoA及tac啟動子，SV40早期及晚期啟動子，及逆轉(zhuǎn)錄病毒LTR啟動子，僅列舉少數(shù)。其它合適啟動子為熟練技術(shù)人員已知。表達構(gòu)建體進一步包含轉(zhuǎn)錄起始、終止的位點及在轉(zhuǎn)錄區(qū)中用于翻譯的核糖體結(jié)合位點。由構(gòu)建體表達的轉(zhuǎn)錄本的編碼部分可在待翻譯多肽的起點包含翻譯起始密碼子并在終點的合適位置包含終止密碼子(UAA、UGA或UAG)。
如本發(fā)明所示，表達載體可包含至少一種選擇標記。這樣的標記包括用于真核細胞培養(yǎng)的二氫葉酸還原酶、G418、谷氨酰胺合成酶、或新霉素抗性，以及用于培養(yǎng)大腸桿菌及其它細菌的四環(huán)素、卡那霉素或氨芐青霉素抗性基因。合適宿主的代表性實例包括但不限于細菌細胞，諸如大腸桿菌、鏈霉菌屬及鼠傷寒沙門氏菌細胞；真菌細胞，諸如酵母細胞(如釀酒酵母細胞或巴斯德畢赤氏酵母(ATCC編號201178))；昆蟲細胞，諸如果蠅S2及Spodoptera Sf9細胞；動物細胞，諸如CHO、COS、NSO、293及Bowes黑素瘤細胞；及植物細胞。適用于上述宿主細胞的培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件為本領(lǐng)域已知。
在一個實施方案中，編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可與信號序列融合，該信號序列將指導(dǎo)本發(fā)明蛋白質(zhì)定位至原核或真核細胞的特定隔室，和/或指導(dǎo)本發(fā)明蛋白質(zhì)由原核或真核細胞分泌。例如，在大腸桿菌，希望指導(dǎo)蛋白質(zhì)表達至周質(zhì)空間。本發(fā)明清蛋白融合蛋白可與之融合以指導(dǎo)多肽表達至細菌周質(zhì)空間的信號序列或蛋白質(zhì)(或其片段)的實例包括但不限于pelB信號序列、麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)信號序列、MBP、ompA信號序列、周質(zhì)大腸桿菌熱不穩(wěn)定腸毒素B亞基的信號序列及堿性磷酸酶的信號序列。可用于構(gòu)建將指導(dǎo)蛋白質(zhì)定位的融合蛋白的數(shù)種載體可通過商業(yè)途徑獲得，諸如可從New England Biolabs獲得的pMAL系列載體(特別是pMAL-p系列)。在一個具體實施方案中，編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可與pelB果膠酸裂合酶信號序列融合以提高所述多肽在革蘭氏陰性細菌中的表達及純化效率。參見美國專利號5,576,195及美國專利號5,846,818，將其內(nèi)容完整引入本發(fā)明作為參考。
可用于與本發(fā)明清蛋白融合蛋白融合以指導(dǎo)其在哺乳動物細胞中分泌的信號肽的實例包括但不限于MPIF-1信號序列(如GenBank編號AAB51134的1-21位氨基酸)、斯鈣素(stanniocalcin)信號序列(MLQNSAVLLLLVISASA，SEQ ID NO10)及共有信號序列(MPTWAWWLFLVLLLALWAPARG，SEQ ID NO11)?？膳c桿狀病毒表達系統(tǒng)結(jié)合使用的合適信號序列是gp67信號序列(如GenBank編號AAA72759的1-19位氨基酸)。
使用谷氨酰胺合酶(GS)或DHFR作為選擇標記的載體可分別在存在藥物甲硫氨酸砜亞胺(methione sulphoximine)或甲氨喋呤的條件下進行擴增。基于谷氨酰胺合酶的載體的一個優(yōu)點是可使用谷氨酰胺合酶陰性的細胞系(如鼠骨髓瘤細胞系，NSO)。通過提供其它抑制物來阻止內(nèi)源基因發(fā)揮功能，谷氨酰胺合酶表達系統(tǒng)還可在谷氨酰胺合酶表達細胞(如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞)中起作用。谷氨酰胺合酶表達系統(tǒng)及其成分在如下PCT發(fā)表物中有詳細描述WO 87/04462、WO 86/05807、WO 89/01036、WO89/10404、及WO 91/06657，將其完整引入本發(fā)明作為參考。另外，谷氨酰胺合酶表達載體可從Lonza Biologics公司(Portsmouth，NH)獲得。
使用GS表達系統(tǒng)在鼠骨髓瘤細胞中表達及生產(chǎn)單克隆抗體在Bebbington等人，Bio/techhology10169，1992及Biblia和Robinson，Biotechnol.Prog.111，1995中有描述，將其引入本發(fā)明作為參考。
本發(fā)明還涉及含有載體構(gòu)建體的宿主細胞，諸如本發(fā)明所描述的，另外還包括含有通過本領(lǐng)域已知技術(shù)與一種或多種異源控制區(qū)(如啟動子和/或增強子)可操作連接的本發(fā)明核苷酸序列的宿主細胞。宿主細胞可為高等真核細胞，諸如哺乳動物細胞(如人衍生細胞)，或低等真核細胞，諸如酵母細胞，或者宿主細胞可為原核細胞，諸如細菌細胞?？蛇x擇調(diào)節(jié)所插入基因序列的表達并以所需特定方式加工基因產(chǎn)物的宿主菌株。由某些啟動子的表達可在存在某些誘導(dǎo)物的條件下提高，由此可控制基因工程多肽的表達。另外，不同的宿主細胞具有蛋白質(zhì)翻譯和翻譯后加工及修飾(如磷酸化、切割)的特征及特定機制?？蛇x擇合適的細胞系以確保所表達外源蛋白質(zhì)的所需修飾和加工。
將本發(fā)明核酸及核酸構(gòu)建體導(dǎo)入宿主細胞可通過磷酸鈣轉(zhuǎn)染、DEAE-右旋糖苷介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、陽離子脂質(zhì)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、電穿孔、轉(zhuǎn)導(dǎo)、感染或其它方法來實現(xiàn)。這樣的方法在許多標準實驗室手冊里有描述，諸如Davis等人，《Basic Methods In Molecular Biology》，1986。特別設(shè)想了，本發(fā)明的多肽實際上可由缺乏重組載體的宿主細胞表達。
除了包括本發(fā)明描述的含有載體構(gòu)建體的宿主細胞以外，本發(fā)明還包括脊椎動物起源的，特別是哺乳動物起源的原代、繼代、及永生化宿主細胞，它們經(jīng)改造以刪除或置換內(nèi)源遺傳物質(zhì)(如與治療性蛋白質(zhì)對應(yīng)的編碼序列可用與治療性蛋白質(zhì)對應(yīng)的清蛋白融合蛋白置換)，和/或包含遺傳物質(zhì)(如可包含異源多核苷酸序列，諸如例如與治療性蛋白質(zhì)對應(yīng)的本發(fā)明清蛋白融合蛋白)。與內(nèi)源多核苷酸可操作連接的遺傳物質(zhì)可激活、改變、和/或擴增內(nèi)源多核苷酸。
另外，本領(lǐng)域已知的技術(shù)可用于通過同源重組使異源多核苷酸(如編碼清蛋白蛋白質(zhì)或其片段或變體的多核苷酸)和/或異源控制區(qū)(如啟動子和/或增強子)與編碼治療性蛋白質(zhì)的內(nèi)源多核苷酸序列可操作連接(參見如US 5,641,670；WO 96/29411；WO 94/12650；Koller等人，Proc.Natl.Acad. Sci.USA868932-8935，1989；及Zijlstra等人，Nature342435-438，1989，將每一篇的公開書完整引入本發(fā)明作為參考)。
有利地，本發(fā)明清蛋白融合蛋白可通過眾所周知的方法從重組細胞培養(yǎng)物回收及純化，包括硫酸銨或乙醇沉淀、酸提取、陰離子或陽離子交換層析、磷酸纖維素層析、疏水相互作用層析、親合層析、羥磷灰石層析、疏水電荷相互作用層析及凝集素層析。在有些實施方案中，高效液相層析(“HPLC”)可用于純化。
在有些優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明清蛋白融合蛋白使用上文列出的一種或多種層析方法進行純化。在其它實施方案中，本發(fā)明清蛋白融合蛋白使用一種或多種下述層析柱進行純化，Q Sepharose FF柱、SP Sepharose FF柱、Q Sepharose高效柱、Blue Sepharose FF柱、Blue柱、苯基Sepharose FF柱、DEAE Sepharose FF或甲基柱?！癝epharose”是商標。
另外，本發(fā)明清蛋白融合蛋白可使用WO 00/44772中描述的方法進行純化，將其完整引入本發(fā)明作為參考。本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地修改其中描述的方法，以用于純化本發(fā)明清蛋白融合蛋白。
可以由通過重組技術(shù)從真核或原核宿主產(chǎn)生的產(chǎn)物中回收本發(fā)明清蛋白融合蛋白，包括例如細菌、酵母、高等植物、昆蟲及哺乳動物細胞。根據(jù)在重組生產(chǎn)過程采用的宿主，本發(fā)明的多肽可以是糖基化的或非糖基化的。另外，本發(fā)明清蛋白融合蛋白也可包含在某些情況下是由于宿主介導(dǎo)的過程產(chǎn)生的初始修飾甲硫氨酸殘基。由此，本領(lǐng)域眾所周知的是由翻譯起始密碼子編碼的N-末端甲硫氨酸通常在所有真核細胞中在翻譯后由任何蛋白質(zhì)高效消除。盡管在大多數(shù)原核生物中大多數(shù)蛋白質(zhì)上的N-末端甲硫氨酸也遭到有效消除，但對于有些蛋白質(zhì)來說，根據(jù)N-末端甲硫氨酸與之共價連接的氨基酸的本質(zhì)，原核生物中的消除過程是無效的。
可將本發(fā)明清蛋白融合蛋白及結(jié)合治療性蛋白質(zhì)或其片段或變體的抗體與標記序列諸如肽融合，以便于純化。在一個實施方案中，標記氨基酸序列是六組氨酸肽，諸如pQE載體(QIAGEN公司，9259 Eton Avenue，Chatsworth，CA，91311)中提供的標簽，等等，其中許多可通過商業(yè)途徑購得。如Gentz等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86821-824，1989中所述，例如六組氨酸為融合蛋白提供了方便的純化。其它可用于純化的肽標簽包括但不限于“HA”標簽，對應(yīng)于衍生自流感血凝素蛋白質(zhì)的表位(Wilson等人，Cell37767，1984)，及“FLAG”標簽。
另外，可將本發(fā)明清蛋白融合蛋白與治療性模塊諸如細胞毒素，如抑制細胞或殺死細胞的試劑、治療劑或放射性金屬離子，如α發(fā)射源諸如例如213Bi綴合。這樣的制劑的實例在WO 03/066824及WO 01/79480(第107頁)中有描述，將其引入本發(fā)明作為參考。
還可將清蛋白融合蛋白附著于固相支持物，特別可用于本發(fā)明清蛋白任何代表所結(jié)合的、與之結(jié)合的、或與之聯(lián)合的多肽的免疫分析或純化。這樣的固相支持物包括但不限于玻璃、纖維素、聚丙烯酰胺、尼龍、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。
本發(fā)明還提供了本發(fā)明清蛋白融合蛋白的化學(xué)修飾衍生物，它可提供其它優(yōu)點，諸如提高多肽的溶解性、穩(wěn)定性及循環(huán)時間增加，或降低免疫原性(參見美國專利號4,179,337)。有關(guān)聚乙二醇使用的實例在WO 01/79480(第109-111頁)中有描述，將其引入本發(fā)明作為參考。
本發(fā)明清蛋白融合蛋白的存在及數(shù)量可使用本領(lǐng)域眾所周知的免疫測定法ELISA來確定。
多肽的用途本發(fā)明鑒定的每一種多肽可以多種方式使用。下面的描述應(yīng)認為是例示性的，并采用已知技術(shù)。
本發(fā)明清蛋白融合蛋白可用于哺乳動物，優(yōu)選人中的各種紊亂的治療、預(yù)防和/或診斷。這樣的紊亂包括但不限于血小板減少癥、馮維勒布蘭德氏病(vWD)及炎性疾病，諸如炎性腸病(IBD)。
另外，本發(fā)明清蛋白融合蛋白可用于治療或預(yù)防疾病或狀況。另外，本發(fā)明清蛋白融合蛋白可用作預(yù)防措施。清蛋白融合蛋白可用于測定生物學(xué)樣品中的多肽水平。本發(fā)明清蛋白融合蛋白還可用于引發(fā)抗體，后者可用于測量來自重組細胞的治療性蛋白質(zhì)、清蛋白蛋白質(zhì)、和/或本發(fā)明清蛋白融合蛋白的蛋白質(zhì)表達，作為評估宿主細胞轉(zhuǎn)化的方法，或用于測量生物學(xué)樣品中的蛋白質(zhì)表達。另外，本發(fā)明清蛋白融合蛋白可用于測試本發(fā)明描述的生物學(xué)活性。
轉(zhuǎn)基因生物體表達本發(fā)明清蛋白融合蛋白的轉(zhuǎn)基因生物體也包括在本發(fā)明中。轉(zhuǎn)基因生物體為經(jīng)重組、外源或克隆遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)染的遺傳修飾生物體。這樣的遺傳物質(zhì)常稱為轉(zhuǎn)基因。轉(zhuǎn)基因的核酸序列可包含一種或多種轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列及其它核酸序列諸如內(nèi)含子，它們可能是所編碼蛋白質(zhì)的最佳表達和分泌所必需的。轉(zhuǎn)基因可設(shè)計成指導(dǎo)所編碼蛋白質(zhì)以這樣的方式表達，即有利于由生物體或由生物體產(chǎn)生的產(chǎn)物如生物體的乳汁、血液、尿液、卵、毛發(fā)或種子中回收該蛋白質(zhì)。轉(zhuǎn)基因可由自與靶動物物種相同的物種或不同的物種的基因組衍生的核酸序列組成。轉(zhuǎn)基因可整合至基因組中該特定核酸序列在其它情況下通常未發(fā)現(xiàn)的基因座或該轉(zhuǎn)基因的正?；蜃?。
術(shù)語“種系細胞系轉(zhuǎn)基因生物體”是指這樣的轉(zhuǎn)基因生物，其中將遺傳改變或遺傳信息導(dǎo)入種系細胞，從而賦予轉(zhuǎn)基因生物體將遺傳信息傳遞給后代的能力。如果這樣的后代實際上具有一些或所有該改變或遺傳信息，那么它們也是轉(zhuǎn)基因生物體。該改變或遺傳信息對于受者所述的生物體物種可以是外源的，外源僅就特定個體受者而言，或者可為受者已具有的遺傳信息。在后一種情況中，改變的或引入的基因的表達可與天然基因有所不同。
轉(zhuǎn)基因生物體可為轉(zhuǎn)基因人、動物或植物。轉(zhuǎn)基因體可通過多種不同方法產(chǎn)生，包括轉(zhuǎn)染、電穿孔、顯微注射、胚胎干細胞中的基因打靶及重組病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒感染(參見如美國專利號4,736,866；美國專利號5,602,307；Mullins等人，Hypertension 22(4)630-633，1993；Brenin等人，Surg.Oncol.6(2)99-110，1997；Tuan編，Recombinant Gene Expression Protocols，《Methods in Molecular Biology》，No.62，Humana Press，1997)。將核酸片段導(dǎo)入重組的勝任的哺乳動物細胞的方法可為有利于多種核酸分子共轉(zhuǎn)化的任何方法。本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易獲得用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物的詳細流程，包括美國專利號5,489,743及美國專利號5,602,307中公開的方法。WO 03/066824及WO 01/79480(第151-162頁)描述了其它信息，將其引入本發(fā)明作為參考。
基因療法編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的構(gòu)建體可用作基因治療方案的一部分，以投遞治療有效劑量的清蛋白融合蛋白。用于在體內(nèi)將核酸導(dǎo)入細胞的一種方法是通過使用含有編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的核酸的病毒載體。用病毒載體感染細胞具有的優(yōu)點是大部分靶細胞可接受核酸。另外，在病毒載體內(nèi)編碼的分子，如病毒載體中含有的cDNA在接納了病毒載體核酸的細胞中高效表達。所述清蛋白融合蛋白延長的質(zhì)粒半衰期甚至可補償潛在的低表達水平。
逆轉(zhuǎn)錄病毒載體及腺伴隨病毒載體可用作在體內(nèi)轉(zhuǎn)移編碼清蛋白融合蛋白的外源核酸分子的重組基因投遞系統(tǒng)。這些載體提供使核酸進入細胞的高效投遞，且所轉(zhuǎn)移的核酸穩(wěn)定整合到宿主的染色體DNA中。這樣的載體的實例、使用它們的方法、及其優(yōu)點以及非病毒投遞方法在WO 03/066824及WO 01/79480(第151-153頁)中有詳細描述，將其引入本發(fā)明作為參考。
編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的基因的基因投遞系統(tǒng)可通過多種方法中的任何一種導(dǎo)入患者體內(nèi)。例如，基因投遞系統(tǒng)的藥學(xué)制劑可通過例如靜脈內(nèi)注射而系統(tǒng)導(dǎo)入，而蛋白質(zhì)在靶細胞中的特異轉(zhuǎn)導(dǎo)主要因由基因投遞載體提供的轉(zhuǎn)染特異性、由于控制報告基因表達的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列引起的細胞類型或組織類型表達、或其組合而發(fā)生。在其它實施方案中，重組基因的最初投遞更多的因?qū)雱游锞哂邢喈斁窒扌远艿较拗啤＠?，基因投遞載體可通過導(dǎo)管(見美國專利號5,328,470)或通過定向注射(如Chen等人，PNAS 913054-3057，1994)導(dǎo)入?；虔煼?gòu)建體的藥學(xué)制劑可本質(zhì)上由可接受稀釋劑中的基因投遞系統(tǒng)組成，或者可含有基因投遞載體埋入其中的緩釋基質(zhì)。在清蛋白融合蛋白可從重組細胞，如逆轉(zhuǎn)錄病毒載體完整產(chǎn)生的情況中，藥學(xué)制劑可含有產(chǎn)生清蛋白融合蛋白的一種或多種細胞。其它基因治療方法在WO 03/066824及WO 01/79480(第153-162頁)中有描述，將其引入本發(fā)明作為參考。
藥物組合物或治療性組合物本發(fā)明清蛋白融合蛋白或其配制劑可通過任何常規(guī)方法施用，包括腸胃外(如皮下或肌肉內(nèi))注射或靜脈內(nèi)輸液。治療可以由單次服藥或一段時間的多次服藥組成。另外，單次服藥或多次服藥以低于未與清蛋白融合的治療性蛋白質(zhì)的頻率施用。
盡管有可能單獨施用本發(fā)明清蛋白融合蛋白，但是期望它連同一種或多種可接受載體以制藥學(xué)配制劑存在。載體就與清蛋白融合蛋白相容且對其受者無害而言必須是“可接受的”。通常，載體為無菌且無熱原的水或鹽水。本發(fā)明清蛋白融合蛋白因為其在溶液中延長的保質(zhì)期特別適于在水性載體諸如無菌無熱原的水、鹽水或其它等滲溶液中進行配制。例如，本發(fā)明的藥物組合物可事先以水性形式很好地進行配制，例如在配藥前數(shù)周或數(shù)月或更長時間。
考慮到清蛋白融合蛋白在水性配制劑中延長的保質(zhì)期，可制備含有清蛋白融合蛋白的配制劑。如上所述，許多這些治療性蛋白質(zhì)在與HA融合后其保質(zhì)期顯著增加或延長。
在氣霧劑施用是合適的情況中，本發(fā)明清蛋白融合蛋白可使用標準流程配制成氣霧劑。術(shù)語“氣霧劑”包括本發(fā)明清蛋白融合蛋白的任何氣生懸浮相，它能夠吸入細支氣管或鼻道。具體而言，氣霧劑包括本發(fā)明清蛋白融合蛋白的氣生懸浮液小滴，可在計量服藥吸入器或霧化器或在噴霧器中生成。氣霧劑還包括本發(fā)明化合物懸浮在空氣或其它載體氣體中的干粉組合物，它可使用例如吸入器裝置通過吸入而投遞。
配制劑可方便地以單位劑量形式呈現(xiàn)，并可通過藥學(xué)領(lǐng)域眾所周知的任何方法進行制備。所述方法包括使清蛋白融合蛋白與構(gòu)成一種或多種助劑的載體結(jié)合。一般而言，配制劑通過使活性成分與液體載體或精細分裂的固體載體或二者兼之均勻及密切結(jié)合而制備，然后，如果需要的話，使產(chǎn)物成型。
適于腸胃外施用的配制劑包括水性及非水性無菌注射溶液，它可含有抗氧化劑、緩沖劑、抑菌劑及使得配制劑適于預(yù)期受者的溶質(zhì)；以及水性及非水性無菌懸浮液，它可含有懸浮劑及增稠劑。這些配制劑可以存在于單位劑量或多劑量容器中，例如密封的安瓿瓶、小藥瓶或注射器，并可貯存在冷凍-干燥(凍干)條件下，僅在臨使用前需要添加無菌液體載體，例如注射用水?，F(xiàn)配注射溶液及懸浮液可從無菌粉劑制備。因為許多本發(fā)明清蛋白融合蛋白表現(xiàn)出延長的血清半衰期，劑量配制劑可含有與指定治療性蛋白質(zhì)的未融合標準配制劑相比較低摩爾濃度或較低劑量的治療性蛋白質(zhì)部分。
作為一個實例，當本發(fā)明清蛋白融合蛋白包含一個或多個治療性蛋白質(zhì)區(qū)時，劑量形式可在清蛋白融合蛋白的功效相對于治療性蛋白質(zhì)的功效之比率的基礎(chǔ)上進行計算，同時考慮與天然治療性蛋白質(zhì)相比清蛋白融合蛋白延長的血清半衰期及保質(zhì)期。例如，在由全長HA與全長治療性蛋白質(zhì)融合而組成的清蛋白融合蛋白中，單位形式的等價劑量將表現(xiàn)出更大重量的試劑，但服藥頻率可降低。
本發(fā)明的配制劑或組合物可與關(guān)于保質(zhì)期延長的清蛋白融合蛋白成分的說明書或包裝插頁一起包裝，或一起包括在試劑盒中。例如，所述說明書或包裝插頁可給出考慮到本發(fā)明清蛋白融合蛋白延長的保質(zhì)期而推薦的貯存條件，諸如時間、溫度和光線。所述說明書或包裝插頁還可給出本發(fā)明清蛋白融合蛋白的具體優(yōu)點，諸如易于貯存可能需要在野外、受控醫(yī)院以外、臨床或診所條件下的配制劑。如上所述，本發(fā)明的配制劑可為水性形式，并可在差于理想環(huán)境的條件下貯存而無活性的明顯喪失。
本發(fā)明還提供了通過在制藥學(xué)可接受載體中對患者施用有效量的本發(fā)明清蛋白融合蛋白或編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的多核苷酸(“清蛋白融合蛋白多核苷酸”)來治療和/或預(yù)防疾病或紊亂(諸如例如本發(fā)明公開的任何一種或多種疾病或紊亂)的方法。
將要施用的本發(fā)明清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸的有效劑量可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的流程來測定，它們使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法給出了諸如生物學(xué)半衰期、生物利用度、及毒性等參數(shù)，包括使用來自常規(guī)體外及體內(nèi)研究的數(shù)據(jù)。
考慮到個體患者的臨床狀況(尤其是單獨使用清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸進行治療的副作用)、投遞部位、施藥方法、施藥方案、及從業(yè)人員知道的其它因素，按照與優(yōu)良醫(yī)療實踐一致的方式配制并施用清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸。本發(fā)明中使用的“有效量”由此通過此類考慮因素而確定。
例如，確定將投遞物質(zhì)的有效量可取決于許多因素，包括例如物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)及生物學(xué)活性、患者的年齡和體重、需要治療的確切狀況及其嚴重性、以及施藥路徑。治療頻率取決于許多因素，諸如每次服藥施用的清蛋白融合蛋白或多核苷酸構(gòu)建體的數(shù)量，以及受試者的健康情況和病史。確切數(shù)量、服藥次數(shù)、及服藥時間將由主治醫(yī)師或獸醫(yī)來確定。
本發(fā)明清蛋白融合蛋白及多核苷酸可施用于任何動物，優(yōu)選哺乳動物及鳥類。優(yōu)選的哺乳動物包括人、犬、貓、小鼠、大鼠、兔、綿羊、牛、馬及豬，特別優(yōu)選人。
作為一般性建議，本發(fā)明清蛋白融合蛋白與未融合治療性蛋白質(zhì)相比將以較低劑量(以未融合治療性蛋白質(zhì)的摩爾數(shù)為基礎(chǔ))服藥或以較低頻率施藥。本發(fā)明清蛋白融合蛋白是有益的，因為它們可模擬“經(jīng)典藥物”的持續(xù)輸液，即對于相同的抑制活性需要較少的蛋白質(zhì)當量。
清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸可通過口服、直腸、腸胃外、腦池內(nèi)、陰道內(nèi)、腹膜內(nèi)、局部(如通過粉劑、軟膏、凝膠劑、滴劑或透皮貼劑)、口含、或口或鼻噴霧來施用?！爸扑帉W(xué)可接受載體”指任何無毒固體、半固體或液體充填劑、稀釋劑、包囊材料或配制劑輔助材料。本發(fā)明使用的術(shù)語“腸胃外”指包括靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、胸骨內(nèi)、皮下及關(guān)節(jié)內(nèi)注射及輸液在內(nèi)的施藥模式。
本發(fā)明清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸還適于通過持續(xù)釋放系統(tǒng)來施用，諸如WO 03/066824及WO 01/79480(第129-130頁)中所描述的，將其引入本發(fā)明作為參考。
對于腸胃外給藥，在一個實施方案中，清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸通常這樣配制，即在所需純度以單位劑量可注射形式(溶液、懸浮液或乳狀液)與制藥學(xué)可接受載體混合，制藥學(xué)可接受載體即在采用的劑量和濃度對受者無毒并與配制劑其它成分相容的載體。例如，配制劑任選不含氧化劑及已知對治療劑有害的其它化合物。
本發(fā)明清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸可單獨施用或聯(lián)合其它治療劑?？膳c本發(fā)明清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸聯(lián)合施用的治療劑包括但不限于如WO 03/066824及WO 01/79480(第132-151頁)中描述的抗逆轉(zhuǎn)錄病毒劑如蛋白酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、整合酶及組裝抑制劑、化學(xué)治療劑、抗生素、甾體及非甾體抗炎劑、常規(guī)免疫治療劑、和/或治療性處理，將其引入本發(fā)明作為參考。聯(lián)合施藥可作為混合物伴隨施用，分開但同時施用，或順序施用。這包括聯(lián)合的試劑作為治療性混合物一起施用，還包括聯(lián)合的試劑分開但同時施用的流程，如通過分開的靜脈內(nèi)路徑進入同一個體。“聯(lián)合”施用還包括首先施用指定化合物或試劑中的一種然后施用第二種的分開施用。
適用于本發(fā)明的藥物組合物包括其中含有效量的活性成分以達到其預(yù)期目的的組合物。在某些實施方案中，本發(fā)明清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸與抗逆轉(zhuǎn)錄病毒劑、核苷/核苷酸逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(NRTI)、非核苷逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(NNRTI)、和/或蛋白酶抑制劑(PI)聯(lián)合施用。
本發(fā)明還提供了制藥學(xué)包裝或試劑盒，內(nèi)有充填了含本發(fā)明清蛋白融合蛋白的藥物組合物的一種或多種成分的一種或多種容器。任選與這樣的容器有關(guān)的可為由管制藥品或生物制品生產(chǎn)、使用或銷售的政府機構(gòu)規(guī)定的形式的通告，該通告反映了由該機構(gòu)批準進行對人施藥的生產(chǎn)、使用或銷售。
已經(jīng)概括的描述了本發(fā)明，參照下列實施例可更容易的理解本發(fā)明，下列實施例是作為示例提供的，并非作為限制。
在沒有進一步說明的情況下，應(yīng)該認為，通過使用前述說明和下述例示性實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可制備或利用本發(fā)明檢測出的改變，并可實踐所主張的方法。因此，下述指導(dǎo)性實施例具體指出了本發(fā)明的某些實施方案，而且不應(yīng)解釋為以任何方式限制公開的剩余內(nèi)容。
實施例1清蛋白融合IL-11的制備重組清蛋白表達載體pAYE645和pAYE646在WO 2004/009819中已有描述。含有HSA/MFα-1融合前導(dǎo)序列以及提供合適轉(zhuǎn)錄啟動子及轉(zhuǎn)錄終止子序列的酵母PRBI啟動子及酵母ADH1終止子的質(zhì)粒pAYE645在WO2004/009819中有描述。將質(zhì)粒pAYE645用限制酶AflII完全消化并用限制酶HindIII部分消化，分離含有酵母PRB1啟動子3′端及清蛋白編碼序列的DNA片段。用AflII/HindIII消化專利申請書WO 00/44772中描述的質(zhì)粒pBD2241，并分離含有酵母PRB1啟動子5′端及酵母ADHI終止子的DNA片段。然后將來自pAYE645的AflII/HindIIIDNA片段克隆到AflII/HindIIIpDB2241載體DNA片段中，產(chǎn)生質(zhì)粒pDB2302。用PacI/XhoI完全消化質(zhì)粒pDB2302，分離6.19kb片段，用T4 DNA聚合酶及dNTP將凹進的末端補平，并重新連接，產(chǎn)生質(zhì)粒pDB2465。用ClaI使質(zhì)粒pDB2465線性化，用T4 DNA聚合酶及dNTP將凹進的末端補平，并重新連接，產(chǎn)生質(zhì)粒pDB2533。用BlnI使質(zhì)粒pDB2533線性化，用T4 DNA聚合酶及dNTP將凹進的末端補平，并重新連接，產(chǎn)生質(zhì)粒pDB2534。用BmgBI/BglII完全消化質(zhì)粒pDB2534，分離6.96kb DNA片段，并與兩種雙鏈寡核苷酸接頭其中其一連接，即VC053/VC054和VC057/VC058，產(chǎn)生質(zhì)粒pDB2540，或與VC055/VC056和VC057/VC058連接，產(chǎn)生質(zhì)粒pDB2541。
VC0535’-GATCTTTGGATAAGAGAGACGCTCACAAGTCCGAAGTCGCT-CACCGGT-3’(SEQ ID NO1)VC0545’-pCCTTGAACCGGTGAGCGACTTCGGACTTGTGAGCGTCTCT-CTTATCCAAA-3’(SEQ ID NO2)VC0555’-GATCTTTGGATAAGAGAGACGCTCACAAGTCCGAAGTCG-CTCATCGAT-3’(SEQ ID NO3)VC0565’-pCCTTGAATCGATGAGCGACTTCGGACTTGTGAGCGTCTCTCT-TATCCAAA-3’(SEQ ID NO4)VC0575’-pTCAAGGACCTAGGTGAGGAAAACTTCAAGGCTTTGGTCT-TGATCGCTTTCGCTCAATACTTGCAACAATGTCCATTCGAAGATCAC-3’(SEQ ID NO5)
VC058 5’-GTGATCTTCGAATGGACATTGTTGCAAGTATTGAGCGAAAGCGA-TCAAGACCAAAGCCTTGAAGTTTTCCTCACCTAGGT-3’(SEQ ID NO6)將人IL-11cDNA樣品從100ng.mL-1至10pg.mL-1系列稀釋(10倍增量)。設(shè)計PCR引物CF59(SEQ ID No7)及CF60(SEQ ID No12)，使得將IL-11cDNA作為N末端清蛋白融合蛋白克隆到用BglII及ClaI線性化的pDB2541中，同時由IL-11編碼區(qū)刪除編碼N末端脯氨酸的密碼子。每一種引物的DNA序列如下CF59HSA/MFα-1BalII融合前導(dǎo)序列 IL-115’-CGATAGATCTTTGGATAAGAGAGGGCCACCACCTGGCCCCC-CTCGAGTTTCCCC-3’CF60ClaI清蛋白 IL-115’-GGCCATCGATGAGCGACTTCGGACTTGTGAGCGTCCAGCCGAGT-CTTCAGCAGCAGCAGTCCCCTC-3’混合物原液制備如下2mM MgCl2PCR緩沖液，10μM PCR dNTP，0.2μM CF59，0.2μM CF60，2U FastStart Taq.DNA聚合酶。將1μl IL-11cDNA(10pg、100pg、1ng、10ng、100ng)添加到49ul反應(yīng)混合液中?？偡磻?yīng)體積為50μl。Perkin-Elmer Thermal Cycler 9600編程如下95℃變性4分鐘[保持]，然后[循環(huán)]95℃變性30秒，45℃退火30秒，72℃延伸60秒，20個循環(huán)，然后[保持]72℃600秒，然后[保持]4℃。通過凝膠電泳分析PCR擴增產(chǎn)物，觀察到預(yù)期大小(0.59kb)的一條帶。使用Gene Clean III試劑盒(BI0101公司)從1％(w/v)瓊脂糖TAE凝膠分離0.59kb DNA片段。
用限制性內(nèi)切核酸酶BglII/ClaI完全消化PCR DNA片段，將0.58kb片段連接到6.15kb pDB2541BglII/ClaI載體DNA片段中，產(chǎn)生質(zhì)粒pDB2567。
合適的酵母載體序列由“非整合”質(zhì)粒pSAC35提供，該質(zhì)粒公開于EP-A-286424中并描述于Sleep，D.等人，1991，Bio/Technology9，183-187中。從pDB2567分離3.52kb NotI N末端(des-pro)IL-11-清蛋白表達盒，純化，并連接到用小牛小腸磷酸酶處理過的NotI消化的pSAC35中，產(chǎn)生與LEU2選擇性標記方向相同含有NotI表達盒的質(zhì)粒pDB2569及與LEU2選擇標記方向相反含有NotI表達盒的質(zhì)粒pDB2570。
設(shè)計PCR引物CF61及CF62，使得將IL-11cDNA作為C末端清蛋白融合蛋白克隆到用Bsu36I線性化并用HindIII部分消化的pDB2243中，同時在IL-11開放讀碼框3′末端添加兩個“TAA”翻譯終止密碼子。在專利申請書WO 00/44772中描述的、含有酵母PRB1啟動子和酵母ADH1終止子的質(zhì)粒pDB2243提供了合適的轉(zhuǎn)錄啟動子和轉(zhuǎn)錄終止子序列。CF61(SEQ IDNo13)及CF62(SEQ ID No14)引物的DNA序列如下CF61Bsu36I清蛋白IL-115’-CCGGCCTTAGGCTTACCTGGGCCACCACCTGGCCCCCCTCG-AGTTTCCCC-3’CF62HindIII IL-115’-GGCCAAGCTTATTACAGCCGAGTCTTCAGCAGCAGCAGTCCCCTC-3’終止 終止混合物原液制備如下2mM MgCl2PCR緩沖液，10μM PCR dNTP，0.2μM CF62，0.2μM CF60，2U FastStart Taq.DNA聚合酶。將1μl IL-11 cDNA(10pg、100pg、1ng、10ng、100ng)添加到49μl反應(yīng)混合液中?？偡磻?yīng)體積為50μl。Perkin-Elmer Thermal Cycler 9600編程如下95℃變性4分鐘[保持]，然后[循環(huán)]95℃變性30秒，45℃退火30秒，72℃延伸60秒，20個循環(huán)，然后[保持]72℃600秒，然后[保持]4℃。通過凝膠電泳分析PCR擴增產(chǎn)物，觀察到預(yù)期大小(0.55kb)的一條帶。使用Gene Clean III試劑盒(BI0101公司)從1％(w/v)瓊脂糖TAE凝膠分離0.55kb DNA片段。
用限制性內(nèi)切核酸酶Bsu36I/HindIII完全消化PCR DNA片段，將0.55kb片段連接到6.19kb pDB2243 Bsu36I，HindIII部分消化的載體DNA片段連接以制備質(zhì)粒pDB2568。
合適的酵母載體序列由“非整合”質(zhì)粒pSAC35提供，該質(zhì)粒公開于EP-A-286424中并描述于Sleep，D.等人，1991，Bio/Technology9，183-187中。從pDB2568分離3.53kb NotI C末端清蛋白-IL-11表達盒，純化，并連接到用小牛小腸磷酸酶處理過的NotI消化的pSAC35中，產(chǎn)生與LEU2選擇性標記方向相同含有NotI表達盒的質(zhì)粒pDB2571及與LEU2選擇標記方向相反含有NotI表達盒的質(zhì)粒pDB2572。如Sleep，D.等人，2001，Yeast18，403-421所述，將WO 95/23857、WO95/33833及WO 94/04687中公開的酵母菌株轉(zhuǎn)化成亮氨酸原養(yǎng)型。將轉(zhuǎn)化子點種到緩沖極限培養(yǎng)基(BMM，見Kerry-Williams，S.M.等人，1998，Yeast14，161-169)上，并于30℃培育至充分生長以備進一步分析。
N末端IL-11-清蛋白融合蛋白開放讀碼框的DNA序列形成SEQ ID No15。
N末端IL-11-清蛋白融合蛋白的氨基酸序列見序列SEQ ID No16。
成熟N末端IL-11-清蛋白融合蛋白的氨基酸序列見序列SEQ ID No17。
GPPPGPPRVSPDPRAELDSTVLLTRSLLADTRQLAAQLRDKFPADGDHNLDSLPTLAMSAGALGALQLPGVLTRLRADLLSYLRHVQWLRRAGGSSLKTLEPELGTLQARLDRLLRRLQLLMSRLALPQPPPDPPAPPLAPPSSAWGGIRAAHAILGGLHLTLDWAVRGLLLLKTRLDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGLC末端清蛋白-IL-11融合蛋白開放讀碼框的DNA序列形成SEQ ID No18。
C末端清蛋白-IL-11融合蛋白的氨基酸序列見序列SEQ ID No19。
成熟C末端清蛋白-IL-11融合蛋白的氨基酸序列見序列SEQ ID No20。
實施例2純化C末端IL-11純化
C末端IL-11融合蛋白含有高水平的修剪(即非全長)物質(zhì)。使用WO00/44772中描述的標準rHA SP-FF條件進行純化，但采用反相模式(negativemode)，由此融合蛋白位于流出液中。將流出液調(diào)至pH8及2.5mS.cm-1，并上樣到用15mM四硼酸鉀平衡的標準rHA DE-FF上。這是在反相模式下操作的。將DE-FF流動液的電導(dǎo)率提高至15mS.cm-1，并通過標準rHA DBA層析純化物質(zhì)，額外用溶于平衡緩沖液的50mM辛酸鹽進行洗脫。然后濃縮物質(zhì)，并用300mM甘氨酸，10mM磷酸鹽pH7滲濾。
N末端IL-11純化(A型)N末端IL-11含有一些修剪物質(zhì)。使用WO 00/44772中描述的標準rHASP-FF條件進行純化。大部分位于流出液中，但結(jié)合的足夠用含有200mMNaCl的標準洗脫緩沖液洗脫是必要的。然后將洗脫液調(diào)至pH8及2.5mS.cm-1，并使用用15mM四硼酸鉀平衡的標準rHADE-FF進行純化。用標準rHA洗脫緩沖液對DE-EF進行洗脫。然后，將純化的物質(zhì)濃縮，并用300mM甘氨酸，10mM磷酸鹽pH7滲濾。
N末端IL-11純化(B型)N末端IL-11含有一些修剪物質(zhì)。根據(jù)標準rHA SP-FF條件使用S-Sepharose-FF柱分離該物質(zhì)。游離rHA保留在柱上。然后，將流出液中的融合蛋白吸附到清蛋白特異的單克隆抗體Sepharose上。用高鹽洗柱，并于pH2.5洗脫。將洗脫液調(diào)至中性pH，濃縮，并用300mM甘氨酸，10mM磷酸鹽pH7滲濾。
純化后的蛋白質(zhì)鑒定表1IL-11清蛋白融合蛋白的鑒定

12％梯度SDS非還原性凝膠及Western印跡顯示于圖11。
實施例3兔單次靜脈內(nèi)或皮下施藥后的清蛋白融合IL-11與重組人 IL-11的藥物動力學(xué)對比每組三只雄兔及三只雌兔于第0天通過單次靜脈內(nèi)或皮下注射接受Neumega_IL-11(100μg/kg)或C末端清蛋白融合IL-11(440μg/kg)。在基線、靜脈內(nèi)施用各測試物質(zhì)后5分鐘、10分鐘、20分鐘、30分鐘、45分鐘、1小時、2小時、4小時、8小時、24小時(1天)、48小時(2天)、72小時(3天)、5天、7天、9天、11天及14天以及在基線、皮下注射后30分鐘、1小時、2小時、4小時、8小時、24小時(1天)、48小時(2天)、72小時(3天)、5天、7天、9天、11天及14天采集血液樣品，用于測定各抗原水平。Neumega_IL-11及C末端清蛋白融合IL-11的劑量是在等摩爾的基礎(chǔ)上計算的。
IL-11血漿水平的測量人IL-11血漿水平是通過Quantikine_人IL-11免疫測定法(R&DSystems，產(chǎn)品目錄編號D1100)測量的。該測定法采用定量三明治酶免疫測定技術(shù)。將IL-11特異的鼠單克隆抗體包被到微量滴定板上。用移液器將標準品和樣品加到孔中，任何存在的IL-11被固定化抗體所結(jié)合。洗去未結(jié)合物質(zhì)后，將IL-11特異的酶聯(lián)多克隆抗體加到孔中。在洗去任何未結(jié)合抗體-酶試劑后，將底物溶液加到孔中，顯色程度與起始步驟中結(jié)合的IL-11數(shù)量成正比。終止顯色，并測量顏色強度。
融合蛋白與未融合蛋白在兔中的血漿半衰期比較在每一個時間點的IL-11濃度的平均值及標準偏差顯示于圖1(靜脈內(nèi)處理組)及圖2(皮下處理組)。
在靜脈內(nèi)處理的動物中，在Neumega_IL-11組注射后1天和清蛋白融合IL-11組注射后9天可發(fā)現(xiàn)高于100pg/ml的水平。
在皮下處理的動物中，Neumega_IL-11組的水平在注射后6小時左右達到其峰值，并在略短于2天的時間里維持在高于100pg/ml的水平(圖2)。清蛋白融合IL-11組在注射后24小時達到其峰值，并在恰好7天之內(nèi)維持在高于100pg/ml的水平。
藥物動力學(xué)結(jié)果見表2(靜脈內(nèi)處理組)和表3(皮下處理組)。
表2靜脈內(nèi)施藥后的藥物動力學(xué)結(jié)果

表3皮下施藥后的藥物動力學(xué)結(jié)果

*分散因子＝exp[標準偏差(log-變換值)]兔皮下施藥與靜脈內(nèi)施藥的比較靜脈內(nèi)應(yīng)用后C末端清蛋白融合IL-11顯示的平均清除半衰期比Neumega_IL-11長8倍(表4)。曲線下面積大35倍。皮下注射后，C末端清蛋白融合IL-11的平均清除半衰期比Neumega_IL-11長4倍(表4)。曲線下面積大14倍。
表4不同物質(zhì)間生物利用度的比較

皮下較靜脈內(nèi)的Neumega_生物利用度比值為78％(表5)，而對于C末端清蛋白融合蛋白計算值是31％。
表5應(yīng)用路徑間生物利用度的比較

實施例4大鼠靜脈內(nèi)或皮下施藥后的清蛋白融合IL-11與重組人 IL-11的藥物動力學(xué)比較每組3只大鼠于第0天通過單次靜脈內(nèi)或皮下注射接受Neumega_IL-11(100μg/kg)或N末端清蛋白融合IL-11(A型)(440μg/kg)。在如下時間點采集血液樣品，用于測定各抗原水平注射前、注射后2分鐘、5分鐘、10分鐘、15分鐘、30分鐘、45分鐘、1小時、2小時、8小時、24小時、48小時、72小時(3天)、5天、7天。Neumega_IL-11及N末端清蛋白融合IL-11的劑量是在等摩爾的基礎(chǔ)上計算的。
研究設(shè)計IL-11血漿水平的測量第1組和第3組的血漿水平(Neumega_IL-11)是如上文實施例3所述通過Quantikine_人IL-11免疫測定法(R&D Systems，產(chǎn)品目錄編號D1100)的抗人IL-11 ELISA測量的。第2組和第4組的血漿水平(IL-11-AFP)是通過抗人清蛋白ELISA測量的。此測定法的標準品為IL-11-AFP。
融合蛋白和未融合蛋白在大鼠中的血漿半衰期比較在靜脈內(nèi)處理的動物中(圖3)，在Neumega_組注射后的6至12小時及在清蛋白融合IL-11組注射后的3天發(fā)現(xiàn)高于0.1ng/ml的水平。在皮下處理的動物中(圖4)，Neumega_IL-11組的水平在注射后1小時內(nèi)達到其峰值，并在約9個小時的時間里維持在高于0.1ng/ml的水平。清蛋白融合IL-11組的水平在注射后2至8小時之間達到其峰值，并在至少44個小時的時間里維持在高于0.1ng/ml的水平。
靜脈內(nèi)處理組的藥物動力學(xué)結(jié)果顯示于表6，皮下處理組的藥物動力學(xué)結(jié)果顯示于表7。
表6靜脈內(nèi)施藥后的藥物動力學(xué)結(jié)果

*分散因子＝exp[標準偏差(log-變換值)]**在10分鐘時測量，PSR 04/02研究中最早的注射后測量值。
表7皮下施藥后的藥物動力學(xué)結(jié)果

*分散因子＝exp[標準偏差(log-變換值)]在PSR 01/03研究中測量的最大IL-11濃度顯示于表8。
表8注射后1小時內(nèi)獲得的最大值

大鼠皮下施藥與靜脈內(nèi)施藥的比較表9顯示了關(guān)于相對生物利用度的方差分析。兩種產(chǎn)品之間關(guān)于清除半衰期、AUC及Cmax的差異是顯著的。

表10顯示了關(guān)于絕對生物利用度的方差分析。對于Neumega_IL-11，兩種應(yīng)用路徑之間關(guān)于清除半衰期及AUC沒有統(tǒng)計學(xué)顯著差異。Cmax的差異是高度顯著的。對于清蛋白融合IL-11，兩種應(yīng)用路徑之間關(guān)于清除半衰期的差異是不顯著的。AUC及Cmax的差異是高度顯著的。
表10應(yīng)用路徑之間生物利用度的比較

a來自PSR 01/03研究的靜脈內(nèi)路徑的Cmax值是在注射后2分鐘測量的。
在大鼠中，靜脈內(nèi)應(yīng)用后N末端清蛋白融合IL-11顯示的平均清除半衰期比Neumega_長17倍。曲線下面積大318倍。皮下注射后，N末端清蛋白融合IL-11的平均清除半衰期比Neumega_IL-11長6倍。曲線下面積大40倍。
實施例5IL-11融合蛋白在首次實驗大鼠中對血小板生成的刺激根據(jù)如下方案用Neumega_IL-11、C末端或N末端融合IL-11(B型)或安慰劑處理首次實驗CD大鼠(每組10只)。
表11處理方案

在基線、第5天、第7天、第9天、第13天和第16天采集血液樣品，并測量血液學(xué)參數(shù)(PLT、WBC、RBC、HCT、HGB)及體重。融合蛋白的劑量是在與Neumega_IL-11比較等摩爾的基礎(chǔ)上計算的，并根據(jù)SDS-PAGE結(jié)果以因數(shù)(factor)1.5校正。
結(jié)果所有組在第7天獲得最大血小板計數(shù)(圖5)。N末端融合蛋白每天施藥獲得1528×103/μl(第6組)的最高平均水平，每3天施藥(第4組)則為1304×103/μl。C末端融合蛋白還顯示出服藥間隔相關(guān)的影響，每天施藥的最大平均水平為1238×103/μl，而每3天施藥則為977×103/μl。Neumega_IL-11達到1032×103/μl的峰值，而對照組動物維持在864×103/μl。
所有組的紅細胞參數(shù)(RBC、HGB、HCT)保持不變。白細胞計數(shù)顯示出輕度原始增加之后有不一致的波動。這可能是由于頻繁注射及采集血樣引起的輕傷造成的。所有動物在觀察期間顯示出體重輕度增加。
總之，在5天、7天及9天，每天施用的N末端及C末端兩種融合蛋白以及間隔3天施用的N末端融合蛋白明顯優(yōu)于對照及Neumega_IL-11。然而，N末端融合蛋白似乎達到比C末端融合蛋白更高的水平。
盡管持續(xù)治療至第9天但在第7天之后可發(fā)生血小板計數(shù)減少，這是由于產(chǎn)生了針對異源人蛋白質(zhì)的中和性抗體。
實施例6IL-11融合蛋白在大鼠中對化學(xué)療法誘導(dǎo)的血小板減少癥的治療每組10只雌性CD大鼠于第0天以35mg/kg靜脈內(nèi)接受碳鉑。根據(jù)如下方案于第5天開始用Neumega_IL-11、C末端或N末端融合IL-11(B型)或安慰劑處理大鼠。
表12處理方案

在基線、第5天、第7天、第9天、第13天及第16天采集血液樣品，并測量血液學(xué)參數(shù)(PLT、WBC、RBC、HCT、HGB)及體重。融合蛋白的劑量是在與Neumega_IL-11比較等摩爾的基礎(chǔ)上計算的，并根據(jù)SDS-PAGE結(jié)果以因數(shù)1.5校正。
結(jié)果所有組在第5天和第9天之間觀察到血小板最低點(nadir)(表13)。之后，血小板水平在第16天恢復(fù)至高于基線。平均血小板水平顯示于下表。
表13平均血小板水平(×103/μl)

對于每天注射Neumega_IL-11、C末端及N端融合蛋白的情況，在第5天即處理的第一天觀察到血小板最低點(圖6)。之后，在每天接受N末端融合蛋白的組中，血小板水平穩(wěn)定且顯著增加，而每天施用C末端融合蛋白與Neumega_IL-11相比誘導(dǎo)血小板水平增加。
為第5天血小板水平調(diào)整的協(xié)方差分析顯示出在第9天、第13天及第16天每天注射N末端融合蛋白的血小板計數(shù)顯著高于對照，以及在第13天顯著優(yōu)于Neumega_IL-11。同樣的分析在第7天、第13天、第16天顯示出總體處理結(jié)果，p≤0.004。
就血小板水平低于500×103/μl的持續(xù)時間而言，N末端融合蛋白再次顯示出最佳效果，即每天注射時的平均5.87天或每3天注射的平均6.27天，與之相比，Neumega_IL-11為平均8.08天，對照為平均6.03天。C末端融合蛋白在該方面顯示出較小功效，即每天施藥的持續(xù)時間為7.16天而每3天施藥為6.69天。
所有組的紅細胞參數(shù)(RBC、HGB、HCT)在研究期間顯示出輕度降低，這可反映了由頻繁采集血樣引起的失血。白細胞計數(shù)顯示出輕度增加，這可能是由于頻繁注射及采集血樣引起的輕傷造成的。然而，這種效果在每天接受N末端融合IL-11的動物中尤其顯著，因此在該組中對WBC水平的處理相關(guān)影響不能排除。所有動物在觀察期間顯示出體重正常、輕度增加。
總之，在IL-11的N末端清蛋白融合蛋白中可觀察到最顯著的結(jié)果，而C末端融合蛋白表現(xiàn)得與Neumega_IL-11可比。即使最低點的絕對水平不受顯著影響，N末端融合蛋白能夠縮短水平低于500×103/μl的持續(xù)時間，導(dǎo)致與Neumega_IL-11相比更為顯著的恢復(fù)。
實施例7IL-11融合蛋白在小鼠炎性腸病(IBD)模型中的應(yīng)用在此模型中，在小鼠中通過口服施用溶于自來水的3％硫酸右旋糖酐二鈉鹽(DSS)誘導(dǎo)結(jié)腸炎。每組10只小鼠按如下處理組進行分配。
表14處理方案

在誘導(dǎo)前及第3天、第6天、和第9天評估體重、直腸出血/腹瀉及糞便中的潛隱血。第10天終止實驗，對動物進行尸檢，測量結(jié)腸長度，并保留大腸樣品用于組織學(xué)評估。
結(jié)果接受安慰劑、柳氮磺吡啶或Neumega_IL-11的動物在結(jié)腸炎發(fā)病后體重減輕，而用N末端或C末端融合蛋白處理的動物體重反而增加(圖7)。這是事先未曾預(yù)料到的驚人結(jié)果。
評估腹瀉及直腸出血的目測觀察評分也顯示出與安慰劑、柳氮磺吡啶或Neumega_IL-11相比，融合蛋白具有驚人、顯著、有益的結(jié)果(圖8)。結(jié)腸長度(圖9)及組織學(xué)評分(圖10)也具有同樣的結(jié)果。
總之，這些數(shù)據(jù)顯示間隔3天給予的這兩種清蛋白融合蛋白能夠顯著改善小鼠中DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎的癥狀，甚至優(yōu)于Neumega_IL-11或目前的標準治療藥柳氮磺吡啶。
實施例8保質(zhì)期根據(jù)下述方法測定清蛋白融合IL-11產(chǎn)物的保質(zhì)期。將總共25mg的清蛋白融合IL-11產(chǎn)物在玻璃小瓶中在無菌注射用水中配制成終體積5ml，甘氨酸、七水合磷酸氫二鈉及磷酸二氫鈉作為賦形劑。將個瓶產(chǎn)物于25℃培育1個月。如實施例1中所述在一個月結(jié)束時通過ESMS、N末端序列、非還原性SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳及western印跡分析樣品的翻譯后修飾。在上述任一項測試中，如果化合物在此貯存之后表現(xiàn)出比未融合IL-11化合物具有較少的變化，則認為保質(zhì)期被延長了。
實施例9對人施藥至少在癌癥治療的情況中，清蛋白融合IL-11產(chǎn)物可通過單次皮下注射每四天施用一次，劑量方案為每kg體重25-1000μg，優(yōu)選每kg體重25-50μg。
參考本發(fā)明不限于所述具體實施方案的范圍內(nèi)，它們旨在作為本發(fā)明各個方面的單獨示例，而且功能上等價的方法和成分屬于本發(fā)明的范圍內(nèi)。實際上，除了本發(fā)明顯示和描述的內(nèi)容以外的本發(fā)明各種改變根據(jù)前述描述和附圖來看對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的。這些改變旨在落入所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。將上文引用的每一篇參考文獻完整引入本發(fā)明作為參考。
序列表<110>達爾塔生物技術(shù)有限公司<120>白介素-11融合蛋白<130>DELF P29719EP<140>03027770.1<141>13/12/03<160>20<170>SeqWin99<210>1<211>48<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸接頭VC053<400>1gatctttgga taagagagac gctcacaagt ccgaagtcgc tcaccggt 48<210>2<211>50<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸接頭VC054<400>2ccttgaaccg gtgagcgact tcggacttgt gagcgtctct cttatccaaa50<210>3<211>48<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸接頭VC055<400>3gatctttgga taagagagac gctcacaagt ccgaagtcgc tcatcgat 48<210>4<211>50<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸接頭VC056<400>4ccttgaatcg atgagcgact tcggacttgt gagcgtctct cttatccaaa50<210>5<211>86<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸接頭VC057<400>5tcaaggacct aggtgaggaa aacttcaagg ctttggtctt gatcgctttc gctcaatact 60tgcaacaatg tccattcgaa gatcac 86<210>6<211>80<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸接頭VC058<400>6gtgatcttcg aatggacatt gttgcaagta ttgagcgaaa gcgatcaaga ccaaagcctt 60gaagttttcc tcacctaggt 80<210>7<211>54<212>DNA<213>寡核苷酸引物CF59<400>7cgatagatct ttggataaga gagggccacc acctggcccc cctcgagttt cccc54<210>8<211>5<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>多肽接頭SEQ ID 8<400>8Gly Gly Gly Gly Ser1 5<210>9<211>4<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>多肽接頭SEQ ID 9<400>9Gly Gly Gly Ser1<210>10<211>17<212>PRT<213>Stanniocalcin信號肽序列<400>10Met Leu Gln Asn Ser Ala Val Leu Leu Leu Leu Val Ile Ser Ala Ser1 5 10 15A1a
<210>11<211>22<212>PRT<213>共有信號序列<400>11Met Pro Thr Trp Ala Trp Trp Leu Phe Leu Val Leu Leu Leu Ala Leu1 5 10 15Trp Ala Pro Ala Arg Gly20<210>12<211>66<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸引物CF60<400>12ggccatcgat gagcgacttc ggacttgtga gcgtccagcc gagtcttcag cagcagcagt 60cccctc 66<210>13<211>50<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸引物CF61<400>13ccggccttag gcttacctgg gccaccacct ggcccccctc gagtttcccc 50<210>14<211>45<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸引物CF62<400>14ggccaagctt attacagccg agtcttcagc agcagcagtc ccctc 45<210>15<211>2358<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>N-末端IL11-清蛋白融合體<400>15atgaagtggg ttttcatcgt ctccattttg ttcttgttct cctctgctta ctctagatct 60ttggataaga gagggccacc acctggcccc cctcgagttt ccccagaccc tcgggccgag 120ctggacagca ccgtgctcct gacccgctct ctcctggcgg acacgcggca gctggctgca 180cagctgaggg acaaattccc agctgacggg gaccacaacc tggattccct gcccaccctg 240gccatgagtg cgggggcact gggagctcta cagctcccag gtgtgctgac aaggctgcga 300gcggacctac tgtcctacct gcggcacgtg cagtggctgc gccgggcagg tggctcttcc 360
ctgaagaccc tggagcccga gctgggcacc ctgcaggccc gactggaccg gctgctgcgc 420cggctgcagc tcctgatgtc ccgcctggcc ctgccccagc cacccccgga cccgccggcg 480cccccgctgg cgcccccctc ctcagcctgg gggggcatca gggccgccca cgccatcctg 540ggggggctgc acctgacact tgactgggcc gtgaggggac tgctgctgct gaagactcgg 600ctggacgctc acaagtccga agtcgctcat cgattcaagg acctaggtga ggaaaacttc 660aaggctttgg tcttgatcgc tttcgctcaa tacttgcaac aatgtccatt cgaagatcac 720gtcaagttgg tcaacgaagt taccgaattc gctaagactt gtgttgctga cgaatctgct 780gaaaactgtg acaagtcctt gcacaccttg ttcggtgata agttgtgtac tgttgctacc 840ttgagagaaa cctacggtga aatggctgac tgttgtgcta agcaagaacc agaaagaaac 900gaatgtttct tgcaacacaa ggacgacaac ccaaacttgc caagattggt tagaccagaa 960gttgacgtca tgtgtactgc tttccacgac aacgaagaaa ccttcttgaa gaagtacttg 1020tacgaaattg ctagaagaca cccatacttc tacgctccag aattgttgtt cttcgctaag 1080agatacaagg ctgctttcac cgaatgttgt caagctgctg ataaggctgc ttgtttgttg 1140ccaaagttgg atgaattgag agacgaaggt aaggcttctt ccgctaagca aagattgaag 1200tgtgcttcct tgcaaaagtt cggtgaaaga gctttcaagg cttgggctgt cgctagattg 1260tctcaaagat tcccaaaggc tgaattcgct gaagtttcta agttggttac tgacttgact 1320aaggttcaca ctgaatgttg tcacggtgac ttgttggaat gtgctgatga cagagctgac 1380ttggctaagt acatctgtga aaaccaagac tctatctctt ccaagttgaa ggaatgttgt 1440gaaaagccat tgttggaaaa gtctcactgt attgctgaag ttgaaaacga tgaaatgcca 1500gctgacttgc catctttggc tgctgacttc gttgaatcta aggacgtttg taagaactac 1560gctgaagcta aggacgtctt cttgggtatg ttcttgtacg aatacgctag aagacaccca 1620gactactccg ttgtcttgtt gttgagattg gctaagacct acgaaactac cttggaaaag 1680tgttgtgctg ctgctgaccc acacgaatgt tacgctaagg ttttcgatga attcaagcca 1740ttggtcgaag aaccacaaaa cttgatcaag caaaactgtg aattgttcga acaattgggt 1800gaatacaagt tccaaaacgc tttgttggtt agatacacta agaaggtccc acaagtctcc 1860accccaactt tggttgaagt ctctagaaac ttgggtaagg tcggttctaa gtgttgtaag 1920cacccagaag ctaagagaat gccatgtgct gaagattact tgtccgtcgt tttgaaccaa 1980ttgtgtgttt tgcacgaaaa gaccccagtc tctgatagag tcaccaagtg ttgtactgaa 2040tctttggtta acagaagacc atgtttctct gctttggaag tcgacgaaac ttacgttcca 2100aaggaattca acgctgaaac tttcaccttc cacgctgata tctgtacctt gtccgaaaag 2160gaaagacaaa ttaagaagca aactgctttg gttgaattgg tcaagcacaa gccaaaggct 2220actaaggaac aattgaaggc tgtcatggat gatttcgctg ctttcgttga aaagtgttgt 2280aaggctgatg ataaggaaac ttgtttcgct gaagaaggta agaagttggt cgctgcttcc 2340caagctgctt tgggtttg2358<210>16<211>786<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>N-末端IL11-清蛋白融合體<400>16Met Lys Trp Val Phe Ile Val Ser Ile Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala1 5 10 15Tyr Ser Arg Ser Leu Asp Lys Arg Gly Pro Pro Pro Gly Pro Pro Arg20 25 30Val Ser Pro Asp Pro Arg Ala Glu Leu Asp Ser Thr Val Leu Leu Thr35 40 45Arg Ser Leu Leu Ala Asp Thr Arg Gln Leu Ala Ala Gln Leu Arg Asp50 55 60Lys Phe Pro Ala Asp Gly Asp His Asn Leu Asp Ser Leu Pro Thr Leu65 70 75 80Ala Met Ser Ala Gly Ala Leu Gly Ala Leu Gln Leu Pro Gly Val Leu85 90 95Thr Arg Leu Arg Ala Asp Leu Leu Ser Tyr Leu Arg His Val Gln Trp
100 105 110Leu Arg Arg Ala Gly Gly Ser Ser Leu Lys Thr Leu Glu Pro Glu Leu115 120 125Gly Thr Leu Gln Ala Arg Leu Asp Arg Leu Leu Arg Arg Leu Gln Leu130 135 140Leu Met Ser Arg Leu Ala Leu Pro Gln Pro Pro Pro Asp Pro Pro Ala145 150 155 160Pro Pro Leu Ala Pro Pro Ser Ser Ala Trp Gly Gly Ile Arg Ala Ala165 170 175His Ala Ile Leu Gly Gly Leu His Leu Thr Leu Asp Trp Ala Val Arg180 185 190Gly Leu Leu Leu Leu Lys Thr Arg Leu Asp Ala His Lys Ser Glu Val195 200 205Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val210 215 220Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His225 230 235 240Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala245 250 255Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly260 265 270Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met275 280 285Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu290 295 300Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu305 310 315 320Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu325 330 335Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala340 345 350Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu355 360 365Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp370 375 380Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys385 390 395 400Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala405 410 415Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val420 425 430Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Thr Glu Cys Cys His
435 440 445Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr450 455 460Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys465 470 475 480Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn485 490 495Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu500 505 510Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu515 520 525Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val530 535 540Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys545 550 555 560Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp565 570 575Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn580 585 590Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu595 600 605Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu610 615 620Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys625 630 635 640His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val645 650 655Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp660 665 670Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys675 680 685Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn690 695 700Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys705 710 715 720Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His725 730 735Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe740 745 750Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys755 760 765Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu
770 775780Gly Leu785<210>17<211>762<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>成熟的N-末端IL11-清蛋白融合體<400>17Gly Pro Pro Pro Gly Pro Pro Arg Val Ser Pro Asp Pro Arg Ala Glu1 5 10 15Leu Asp Ser Thr Val Leu Leu Thr Arg Ser Leu Leu Ala Asp Thr Arg20 25 30Gln Leu Ala Ala Gln Leu Arg Asp Lys Phe Pro Ala Asp Gly Asp His35 40 45Asn Leu Asp Ser Leu Pro Thr Leu Ala Met Ser Ala Gly Ala Leu Gly50 55 60Ala Leu Gln Leu Pro Gly Val Leu Thr Arg Leu Arg Ala Asp Leu Leu65 70 75 80Ser Tyr Leu Arg His Val Gln Trp Leu Arg Arg Ala Gly Gly Ser Ser85 90 95Leu Lys Thr Leu Glu Pro Glu Leu Gly Thr Leu Gln Ala Arg Leu Asp100 105 110Arg Leu Leu Arg Arg Leu Gln Leu Leu Met Ser Arg Leu Ala Leu Pro115 120 125Gln Pro Pro Pro Asp Pro Pro Ala Pro Pro Leu Ala Pro Pro Ser Ser130 135 140Ala Trp Gly Gly Ile Arg Ala Ala His Ala Ile Leu Gly Gly Leu His145 150 155 160Leu Thr Leu Asp Trp Ala Val Arg Gly Leu Leu Leu Leu Lys Thr Arg165 170 175Leu Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly180 185 190Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu195 200 205Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr210 215 220Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp225 230 235 240Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr245 250 255Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu
260 265 270Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn275 280 285Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe290 295 300His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala305 310 315 320Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys325 330 335Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala340 345 350Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala355 360 365Ser Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly370 375 380Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe385 390 395 400Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr405 410 415Lys Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp420 425 430Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile435 440 445Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser450 455 460His Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro465 470 475 480Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr485 490 495Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala500 505 510Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys515 520 525Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His530 535 540Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu545 550 555 560Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly565 570 575Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val580 585 590Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly
595 600 605Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro610 615 620Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu625 630 635 640His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu645 650 655Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu660 665 670Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala675 680 685Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr690 695 700Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln705 710 715 720Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys725 730 735Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu740 745 750Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu755 760<210>18<211>2361<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>C-末端清蛋白-IL11融合體<400>18atgaagtggg taagctttat ttcccttctt tttctcttta gctcggctta ttccaggagc 60ttggataaaa gagatgcaca caagagtgag gttgctcatc ggtttaaaga tttgggagaa 120gaaaatttca aagccttggt gttgattgcc tttgctcagt atcttcagca gtgtccattt 180gaagatcatg taaaattagt gaatgaagta actgaatttg caaaaacatg tgttgctgat 240gagtcagctg aaaattgtga caaatcactt catacccttt ttggagacaa attatgcaca 300gttgcaactc ttcgtgaaac ctatggtgaa atggctgact gctgtgcaaa acaagaacct 360gagagaaatg aatgcttctt gcaacacaaa gatgacaacc caaacctccc ccgattggtg 420agaccagagg ttgatgtgat gtgcactgct tttcatgaca atgaagagac atttttgaaa 480aaatacttat atgaaattgc cagaagacat ccttactttt atgccccgga actccttttc 540tttgctaaaa ggtataaagc tgcttttaca gaatgttgcc aagctgctga taaagctgcc 600tgcctgttgc caaagctcga tgaacttcgg gatgaaggga aggcttcgtc tgccaaacag 660agactcaagt gtgccagtct ccaaaaattt ggagaaagag ctttcaaagc atgggcagta 720gctcgcctga gccagagatt tcccaaagct gagtttgcag aagtttccaa gttagtgaca 780gatcttacca aagtccacac ggaatgctgc catggagatc tgcttgaatg tgctgatgac 840agggcggacc ttgccaagta tatctgtgaa aatcaagatt cgatctccag taaactgaag 900gaatgctgtg aaaaacctct gttggaaaaa tcccactgca ttgccgaagt ggaaaatgat 960gagatgcctg ctgacttgcc ttcattagct gctgattttg ttgaaagtaa ggatgtttgc 1020aaaaactatg ctgaggcaaa ggatgtcttc ctgggcatgt ttttgtatga atatgcaaga 1080aggcatcctg attactctgt cgtgctgctg ctgagacttg ccaagacata tgaaaccact 1140ctagagaagt gctgtgccgc tgcagatcct catgaatgct atgccaaagt gttcgatgaa 1200tttaaacctc ttgtggaaga gcctcagaat ttaatcaaac aaaattgtga gctttttgag 1260cagcttggag agtacaaatt ccagaatgcg ctattagttc gttacaccaa gaaagtaccc 1320
caagtgtcaa ctccaactct tgtagaggtc tcaagaaacc taggaaaagt gggcagcaaa 1380tgttgtaaac atcctgaagc aaaaagaatg ccctgtgcag aagactatct atccgtggtc 1440ctgaaccagt tatgtgtgtt gcatgagaaa acgccagtaa gtgacagagt caccaaatgc 1500tgcacagaat ccttggtgaa caggcgacca tgcttttcag ctctggaagt cgatgaaaca 1560tacgttccca aagagtttaa tgctgaaaca ttcaccttcc atgcagatat atgcacactt 1620tctgagaagg agagacaaat caagaaacaa actgcacttg ttgagctcgt gaaacacaag 1680cccaaggcaa caaaagagca actgaaagct gttatggatg atttcgcagc ttttgtagag 1740aagtgctgca aggctgacga taaggagacc tgctttgccg aggagggtaa aaaacttgtt 1800gctgcaagtc aagctgcctt aggcttacct gggccaccac ctggcccccc tcgagtttcc 1860ccagaccctc gggccgagct ggacagcacc gtgctcctga cccgctctct cctggcggac 1920acgcggcagc tggctgcaca gctgagggac aaattcccag ctgacgggga ccacaacctg 1980gattccctgc ccaccctggc catgagtgcg ggggcactgg gagctctaca gctcccaggt 2040gtgctgacaa ggctgcgagc ggacctactg tcctacctgc ggcacgtgca gtggctgcgc 2100cgggcaggtg gctcttccct gaagaccctg gagcccgagc tgggcaccct gcaggcccga 2160ctggaccggc tgctgcgccg gctgcagctc ctgatgtccc gcctggccct gccccagcca 2220cccccggacc cgccggcgcc cccgctggcg cccccctcct cagcctgggg gggcatcagg 2280gccgcccacg ccatcctggg ggggctgcac ctgacacttg actgggccgt gaggggactg 2340ctgctgctga agactcggct g2361<210>19<211>787<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>C-末端清蛋白-IL11融合體<400>19Met Lys Trp Val Ser Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala1 5 10 15Tyr Ser Arg Ser Leu Asp Lys Arg Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala20 25 30His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu35 40 45Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val50 55 60Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp65 70 75 80Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp85 90 95Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala100 105 110Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln115 120 125His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val130 135 140Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys145 150 155 160Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro165 170 175Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys180 185 190
Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu195 200 205Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys210 215 220Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val225 230 235 240Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser245 250 255Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Thr Glu Cys Cys His Gly260 265 270Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile275 280 285Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu290 295 300Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp305 310 315 320Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser325 330 335Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly340 345 350Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val355 360 365Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys370 375 380Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu385 390 395 400Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys405 410 415Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu420 425 430Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val435 440 445Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His450 455 460Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val465 470 475 480Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg485 490 495Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe500 505 510Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala515 520 525
Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu530 535 540Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys545 550 555 560Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala565 570 575Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe580 585 590Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly595 600 605Leu Pro Gly Pro Pro Pro Gly Pro Pro Arg Val Ser Pro Asp Pro Arg610 615 620Ala Glu Leu Asp Ser Thr Val Leu Leu Thr Arg Ser Leu Leu Ala Asp625 630 635 640Thr Arg Gln Leu Ala Ala Gln Leu Arg Asp Lys Phe Pro Ala Asp Gly645 650 655Asp His Asn Leu Asp Ser Leu Pro Thr Leu Ala Met Ser Ala Gly Ala660 665 670Leu Gly Ala Leu Gln Leu Pro Gly Val Leu Thr Arg Leu Arg Ala Asp675 680 685Leu Leu Ser Tyr Leu Arg His Val Gln Trp Leu Arg Arg Ala Gly Gly690 695 700Ser Ser Leu Lys Thr Leu Glu Pro Glu Leu Gly Thr Leu Gln Ala Arg705 710 715 720Leu Asp Arg Leu Leu Arg Arg Leu Gln Leu Leu Met Ser Arg Leu Ala725 730 735Leu Pro Gln Pro Pro Pro Asp Pro Pro Ala Pro Pro Leu Ala Pro Pro740 745 750Ser Ser Ala Trp Gly Gly Ile Arg Ala Ala His Ala Ile Leu Gly Gly755 760 765Leu His Leu Thr Leu Asp Trp Ala Val Arg Gly Leu Leu Leu Leu Lys770 775 780Thr Arg Leu785<210>20<211>763<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>成熟的C-末端IL11-清蛋白融合體<400>20Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu1 5 10 15
Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln20 25 30Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu35 40 45Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys50 55 60Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu65 70 75 80Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro85 90 95Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu100 105 110Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His115 120 125Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg130 135 140Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg145 150 155 160Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala165 170 175Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser180 185 190Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu195 200 205Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro210 215 220Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys225 230 235 240Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp245 250 255Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser260 265 270Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His275 280 285Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser290 295 300Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala305 310 315 320Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg325 330 335Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr340 345 350
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權(quán)利要求
1.包含IL-11或其片段或變體和清蛋白或其片段或變體的清蛋白融合蛋白。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的清蛋白融合蛋白，其中所述IL-11為人IL-11。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的清蛋白融合蛋白，包含與IL-11融合的清蛋白。
4.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項的清蛋白融合蛋白，其中所述IL-11為人IL-11。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的清蛋白融合蛋白，其中與未融合狀態(tài)的IL-11或其片段或變體的體內(nèi)半衰期相比所述清蛋白具有延長IL-11或其片段或變體的體內(nèi)半衰期的能力。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的蛋白質(zhì)，所述清蛋白融合的IL-11的半衰期較未連接清蛋白的IL-11的半衰期延長了至少5倍。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的蛋白質(zhì)，所述清蛋白融合的IL-11的半衰期較未連接清蛋白的IL-11的半衰期延長了至少10倍。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的蛋白質(zhì)，所述清蛋白融合的IL-11的半衰期較未連接清蛋白的IL-11的半衰期延長了至少50倍。
9.根據(jù)權(quán)利要求1的清蛋白融合蛋白，其中所述IL-11或其片段或變體融合至清蛋白的N末端或清蛋白片段或變體的N末端。
10.根據(jù)權(quán)利要求1的清蛋白融合蛋白，其中所述IL-11或其片段或變體融合至清蛋白的C末端或清蛋白片段或變體的C末端。
11.根據(jù)權(quán)利要求1的清蛋白融合蛋白，其中所述IL-11或其片段或變體融合至清蛋白的內(nèi)部區(qū)域或清蛋白片段或變體的內(nèi)部區(qū)域。
12.根據(jù)權(quán)利要求1的清蛋白融合蛋白，其中所述IL-11或其片段或變體經(jīng)接頭與清蛋白或其片段或變體分隔。
13.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項的清蛋白融合蛋白，其中與清蛋白或其片段或變體融合的IL-11或其片段或變體的體外生物學(xué)活性比未融合狀態(tài)的IL-11或其片段或變體的體外生物學(xué)活性大。
14.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項的清蛋白融合蛋白，其中與清蛋白或其片段或變體融合的IL-11或其片段或變體的體內(nèi)生物學(xué)活性比未融合狀態(tài)的IL-11或其片段或變體的體內(nèi)生物學(xué)活性大。
15.包含編碼前述權(quán)利要求任一項的清蛋白融合蛋白的多核苷酸序列的核酸分子。
16.包含權(quán)利要求15的核酸分子的載體。
17.包含權(quán)利要求15的核酸分子的宿主細胞。
18.用于制備根據(jù)權(quán)利要求1-14任一項的清蛋白融合蛋白的方法，該方法包括(a)提供可在細胞或生物體中表達的包含編碼清蛋白融合蛋白的核苷酸序列的核酸；(b)在細胞或生物體中表達核酸以形成清蛋白融合蛋白；并(c)純化清蛋白融合蛋白。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其中所述清蛋白融合蛋白在酵母中表達。
20.權(quán)利要求19的方法，其中所述酵母是糖基化缺陷型。
21.權(quán)利要求19的方法，其中所述酵母具有糖基化能力。
22.權(quán)利要求18的方法，其中所述清蛋白融合蛋白在細胞培養(yǎng)中的哺乳動物細胞中表達。
23.包含權(quán)利要求1-14任一項的清蛋白融合蛋白和載體的組合物。
24.包含有效量的權(quán)利要求1-14任一項的清蛋白融合蛋白和藥學(xué)可接受載體或賦形劑的藥物組合物。
25.用于將與用IL-11治療哺乳動物相關(guān)的副作用降至最低的方法，所述治療包括將清蛋白融合IL-11施用于所述哺乳動物。
26.根據(jù)權(quán)利要求25的方法，其中所述哺乳動物患有腸紊亂且副作用為體重減輕、直腸出血或腹瀉。
27.增加患有引起體重減輕的腸疾病的哺乳動物體重的方法，所述方法包括將清蛋白融合IL-11施用于所述哺乳動物。
28.治療患者的疾病或紊亂的方法，包括施用有效量的權(quán)利要求1-14任一項的清蛋白融合蛋白的步驟。
29.治療患者的方法，包括施用有效量的權(quán)利要求1-14任一項的清蛋白融合蛋白的步驟。
30.延長IL-11或其片段或變體的體內(nèi)半衰期的方法，包括將IL-11或其片段或變體與清蛋白或其片段或變體融合的步驟，與未融合狀態(tài)的IL-11或其片段或變體的體內(nèi)半衰期相比，所述清蛋白或其片段或變體足以延長IL-11或其片段或變體的體內(nèi)半衰期。
31.延長IL-11在哺乳動物中的半衰期的方法，該方法包括將所述IL-11與清蛋白連接形成清蛋白融合IL-11，并將所述清蛋白融合IL-11施用于所述哺乳動物，由此所述清蛋白融合的IL-11的半衰期較未結(jié)合清蛋白的IL-11的半衰期相比延長了至少2倍。
32.用于預(yù)防或治療哺乳動物的血小板減少癥的方法，該方法包括將清蛋白融合IL-11施用于所述哺乳動物。
33.用于將與用IL-11治療哺乳動物相關(guān)的副作用降至最低的方法，該方法包括將清蛋白融合IL-11施用于所述哺乳動物。
全文摘要
本發(fā)明涉及包含與清蛋白(包括但不限于清蛋白片段或變體)融合的、表現(xiàn)血小板生成或抗炎特性的白介素11(IL－11)(包括但不限于其片段及變體)的蛋白質(zhì)。這些融合蛋白在本發(fā)明中統(tǒng)稱為“本發(fā)明清蛋白融合蛋白”。這些融合蛋白表現(xiàn)出延長的保質(zhì)期和/或藥物動力學(xué)特性和/或延長的治療活性。本發(fā)明包括治療性清蛋白融合蛋白、組合物、藥學(xué)組合物、制劑和試劑盒。本發(fā)明還包括編碼本發(fā)明清蛋白融合蛋白的核酸分子，以及含有這些核酸的載體，經(jīng)這些核酸和載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞，及使用這些核酸、載體和/或宿主細胞制備清蛋白融合蛋白的方法。本發(fā)明還涉及用于治療或預(yù)防血小板減少癥或炎性疾病的組合物和方法。
文檔編號C07K14/765GK1938333SQ200480041355
公開日2007年3月28日 申請日期2004年12月3日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月3日
發(fā)明者M·克羅茲, G·迪克尼特, 漢斯-彼得·豪澤, T·韋默, 達雷爾·斯利普 申請人:達爾塔生物技術(shù)有限公司