專利名稱：注射用重組人白介素11制劑及制備工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基因工程新藥——注射用重組人白介素11的配方和制備工藝。
背景技術(shù)：
白介素11(IL-11)是一種直接刺激造血干細胞和巨核細胞增生并誘導(dǎo)巨核細胞成熟而促進血小板生成的細胞因子。1990年，Yang等發(fā)現(xiàn)，靈長類動物細胞PU-34(基質(zhì)細胞來源)的培養(yǎng)上清中含有一種新的細胞因子可促使血小板升高，經(jīng)鑒定與以往報道的其他細胞因子基因序列均不相同，命名為白介素11(IL-11)；隨后，他們又克隆了人IL-11基因序列(GenBank Accession NoM81890)[1，2]。人IL-11分子有178個氨基酸，富含堿性氨基酸(等電點為11.7)，分子內(nèi)或分子間無二硫鍵，亦無糖基化位點，原核細胞表達的IL-11具有與天然IL-11同樣的生物活性。
化療是目前治療惡性腫瘤的主要手段之一，在許多類型腫瘤的治療中取得了明顯的治療效果；但化療藥物普遍有明顯的毒、副作用，尤其對造血、腸胃道等系統(tǒng)特別突出，嚴重限制了化療藥物的使用劑量及治療效果，許多化療方案在已經(jīng)取得一定效果的時候也多因病人出現(xiàn)的造血功能障礙而中斷。采用輸血的途徑一方面效果有限，另一方面又因日益增多的血源性疾病所困擾。血小板生成因子(TPO)和IL-11的出現(xiàn)使人們看到了治療血小板減少癥的希望。TPO同IL-11相比，在應(yīng)用上存在兩條明顯的缺陷一是TPO升高血小板的作用過強，難以控制，容易發(fā)生血栓的形成，而IL-11提高血小板的作用較慢，不易引起血栓的形成；另外TPO必須經(jīng)真核細胞表達才具有活性，其制備成本昂貴，而IL-11經(jīng)原核細胞(細菌)表達就具備活性。因此，IL-11在生產(chǎn)工藝和臨床應(yīng)用方面更有優(yōu)勢。
重組人白介素-11用于預(yù)防骨髓抑制性化療藥物治療非骨髓惡性腫瘤所造成的嚴重血小板減少癥，并降低此類病人對血小板回輸?shù)男枰?。國?nèi)已有研究機構(gòu)利用細菌表達系統(tǒng)以天然形式表達重組人白介素11，但其表達量極低，不能滿足生產(chǎn)的要求。為滿足我國廣大腫瘤化療病人的迫切臨床需要，迫切要求有一種能提供大量的、高比活性的、價格合理的重組人白介素-11生產(chǎn)工藝。
技術(shù)內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種產(chǎn)品活性高、表達量高和純化工藝簡單的重組人白介素11制備工藝；以及一種不含任何保護劑和防腐劑、有效期長達24個月的注射用重組人白介素11制劑配方。
注射用重組人白介素11的處方為每支含a.1～7mg的重組人白介素11的凍干粉；b.23mg甘氨酸；c.1.6mg磷酸氫二鈉Na2HPO4.7H2O；d.0.55mg磷酸二氫鈉Na2HPO4.1H2O。
所述的注射用重組人白介素11，其優(yōu)選方案為每支含a.3±0.5mg的重組人白介素11的凍干粉；b.23mg甘氨酸；c.1.6mg磷酸氫二鈉Na2HPO4.7H2O；d.0.55mg磷酸二氫鈉Na2HPO4.1H2O。
上述的注射用重組人白介素11的制備工藝包括菌種庫→種子液制備→發(fā)酵→收菌→碎菌→制備融合蛋白粗制品→制備融合蛋白精制品→制備重組IL-11粗制品→制備重組IL-11粗制品→稀釋、分裝和凍干→成品檢定，其特征在于種子菌液的制備取一支生產(chǎn)菌種，接種于含有氨芐青霉素100mg/LLB培養(yǎng)基平板，37℃培養(yǎng)16小時，挑取單個菌落接種到LB液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)基使其OD600值在0.4～0.8之間，即可供發(fā)酵罐接種用。
發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基溶液為(1升)Na2HPO4.12H2O 7.00gKH2PO42.00gK2HPO44.00gNH4Cl0.02g(NH4)2SO4.7H2O 0.30gTyptone 5.00g
Yeast 5.00gGlycerol 10.00g補料為(1升)MgSO4.7H2O5.00gTyphone83.33gYeast 41.67gGlycerol 416.67g發(fā)酵溫度和時間37℃培養(yǎng)，以200ml/小時的速度補料，當OD600為7～8時調(diào)整溫度至37℃，加入誘導(dǎo)劑IPTG，當濃度0.2mM時誘導(dǎo)4小時，然后終止發(fā)酵；碎菌取一定量的菌體，懸浮于適量的0.01M PBS(pH7.0)緩沖液中(菌體與懸浮液的體積比為1∶10)，冰浴下使用高壓均質(zhì)機進行碎菌，共三個循環(huán)；取樣進行染色涂片，顯微鏡下檢查，基本無完整細胞，離心(20000rpm)20分鐘，4℃，收集上清即為粗制IL11的融合蛋白；融合蛋白精制品的制備將“融合蛋白粗制品”經(jīng)連接了Ni2+的金屬螯合柱純化，獲得以Trx-IL-11融合蛋白為主(純度大于70％)的蛋白溶液，為“融合蛋白精制品”。其平衡、洗脫條件為不同pH的Tris-HCl緩沖液，融合蛋白精制品用0.1mol/L NaOH調(diào)整pH至7.2～7.5，在4℃可保存72小時；重組IL-11粗制品的制備“融合蛋白精制品”經(jīng)SDS-PAGE電泳證實純度后，加入一定劑量的重組牛腸激酶(rEK)，2mmol/L CaCL2，放21℃孵育，20小時后取小樣進行SDS-PAGE電泳并染色，用IL-11標準品作對照，應(yīng)出現(xiàn)相同分子量的明顯條帶，根據(jù)融合蛋白的殘留量可將酶切時間適當延長，但不可超過40小時；重組IL-11精制品的制備“IL-11粗制品”經(jīng)0.8m過濾后用水稀釋至電導(dǎo)率7～8ms/cm，用SP-Sepharose FF陽離子交換柱純化，上樣后平衡條件為10×柱床體積(CV)的20mmol/L磷酸鹽緩沖液(PB)pH7.5～8，再用3個柱床體積pH9.0，40mmol/L磷酸鹽緩沖液繼續(xù)洗滌層析柱后，用含200mmol/LNaCl的上述pH9.0磷酸鹽緩沖液洗脫，收集主要洗脫峰，進行SDS-PAGE電泳并充分染色，此為半成品；加甘氨酸半成品的制備用無熱原超純水及藥用級磷酸鹽、甘氨酸配置5mMPB，11.5g/L甘氨酸，pH7.0的緩沖液，平衡Superdex75層析柱，將“重組IL-11精制品”上該柱純化并完成緩沖液轉(zhuǎn)換，收集洗脫峰。收集的富含IL-11的溶液保存于4℃，并于24hrs內(nèi)合并，用0.22μm濾器過濾除菌，合格后進行凍干。
稀釋、分裝和凍干檢定合格的“加甘氨酸半成品”，根據(jù)其蛋白濃度，用5mMPB，11.5g/L甘氨酸，pH7.0的緩沖液稀釋至1.6mg/ml，并及時分裝和凍干將上述除菌過濾的“加甘氨酸半成品”分裝于西林瓶中，每小瓶含2ml液體，隨后進行凍干處理，整個凍干過程加溫不可超過30℃。凍干后按配比加入甘氨酸、磷酸氫二鈉Na2HPO4.7H2O、磷酸二氫鈉Na2HPO4.1H2O，然后壓瓶蓋、封口。
本發(fā)明的特點和優(yōu)點有1)得到純度＞95％的重組人IL-11；2)產(chǎn)物重組人IL-11的比活性高，比活性大于5×106U/mg；3)生產(chǎn)工藝簡單，產(chǎn)物收率高，生產(chǎn)成本低。
處方選擇的依據(jù)每一劑量所含重組人白介素11為3mg左右，是因為臨床最佳用量是50μg/kg，甘氨酸是賦形劑，能增加重組人白介素11對熱的穩(wěn)定性。
具體實施例方式
重組人白介素11的制備方法菌種庫→種子液制備→發(fā)酵→收菌→碎菌→制備融合蛋白粗制品→制備融合蛋白精制品→制備重組IL-11粗制品→制備重組IL-11粗制品→稀釋、分裝和凍干→成品檢定。
具體過程如下1、制造用菌種庫的建立原始菌種涂布Amp+的LB平板，挑取單菌落接入Amp+的LB培養(yǎng)液，37℃振蕩培養(yǎng)12小時，然后加入無菌甘油，振蕩使甘油均勻分布，終濃度至15％，分裝菌種管，作為制造用菌種庫保存于-70℃，但每次只限傳3代。每批制造用菌種庫均應(yīng)進行下列鑒定，合格后方可投產(chǎn)。
1)形態(tài)觀察將上述菌種接種LB平板，37℃培養(yǎng)后，菌種具有典型大腸桿菌的形態(tài)特征，且無雜菌生長。
2)格蘭氏染色涂片鏡檢該菌為格蘭氏陰性桿菌。
3)對抗生素的抗性與原始菌種一樣具備Amp抗性。
4)IL11表達量搖床中培養(yǎng)，在IPTG誘導(dǎo)下，SDS-PAGE電泳顯示Trx-IL11表達量始終穩(wěn)定在占菌體總蛋白20％左右。質(zhì)粒檢查表達載體質(zhì)粒DNA酶切圖譜與原始表達載體酶切圖譜完全一致2.種子菌液的制備取一支生產(chǎn)菌種，接種于含有氨芐青霉素Amp(100mg/L)LB(培養(yǎng)基)平板，37℃培養(yǎng)16小時，挑取單個菌落接種到LB液體培養(yǎng)基中(含Amp 100mg/L)，振蕩培養(yǎng)基使其OD600值在0.4～0.8之間，即可供發(fā)酵罐接種用。種子液每次均進行質(zhì)粒穩(wěn)定性檢查。
3.發(fā)酵3.1發(fā)酵用培養(yǎng)基成分3.1.1基礎(chǔ)培養(yǎng)基溶液(1升)Na2HPO4.12H2O 7.00gKH2PO42.00gK2HPO44.00gNH4Cl0.02g(NH4)2SO4.7H2O 0.30gTyptone 5.00gYeast 5.00gGlycerol 10.00g3.1.210×補料(1升)MgSO4.7H2O 5.00gTyphone 83.33gYeast 41.67gGlycerol416.67g3.2發(fā)酵罐滅菌及種子液的接種往B.Braun 30升發(fā)酵罐中加入20升基礎(chǔ)培養(yǎng)基，蒸發(fā)滅菌(121℃20分鐘)，待發(fā)酵罐冷卻后，再接入種子菌液(接種比例是以將種子菌液OD600＝0.8時的種子菌液與發(fā)酵培養(yǎng)基體積比1∶50定為標準即向20升發(fā)酵培養(yǎng)基中加入OD600＝0.8的400ml種子菌液)；這一過程不加抗生素。
3.3發(fā)酵條件3.3.1溫度和時間37℃培養(yǎng)，以200ml/小時的速度補料，當OD600為7～8時調(diào)整溫度至37℃，加入誘導(dǎo)劑IPTG(當濃度0.2mM)誘導(dǎo)4小時，然后終止發(fā)酵。
3.3.2培養(yǎng)基總裝量約22L。
3.3.3通氣量保持發(fā)酵液中溶解氧濃度為40％。
3.3.4攪拌速度294rpm。
3.3.5酸堿度6.5～7.0。
3.4發(fā)酵要求發(fā)酵過程必須無菌操作，發(fā)酵車間不得同時進行其他細菌的發(fā)酵。發(fā)酵完畢，必須沖洗干凈并將發(fā)酵罐滅菌處理。
3.5收菌發(fā)酵終止后，取出菌液，低速離心(5000rpm，20分鐘，4℃)，收集菌體，用生理鹽水洗滌一次，所有上清液待滅菌后棄取。將濕菌體稱量，于-20℃保存。
3.6碎菌取一定量的菌體，懸浮于適量的0.01M PBS(pH7.0)緩沖液中(菌體與懸浮液的體積比為1∶10)，冰浴下使用高壓均質(zhì)機進行碎菌，共三個循環(huán)；取樣進行染色涂片，顯微鏡下檢查，基本無完整細胞，離心(20000rpm)20分鐘，4℃，收集上清即為粗制IL11的融合蛋白(Trx-IL11)。
4.rHuIL-11的分離純化4.1融合蛋白粗制品的制備菌體裂解后，經(jīng)高速離心(20000rpm，20min)，收集上清，為“融合蛋白粗制品”。融合蛋白粗制品應(yīng)盡快進入下一步純化，如無法立即處理，可保存于4℃48h。
4.2融合蛋白精制品的制備將“融合蛋白粗制品”經(jīng)連接了Ni2+的金屬螯合柱純化，獲得以Trx-IL-11融合蛋白為主(純度大于70％)的蛋白溶液，為“融合蛋白精制品”。其平衡、洗脫條件為不同pH的Tris-HCl緩沖液，不加入任何對人體有害的物質(zhì)。融合蛋白精制品用0.1mol/L NaOH調(diào)整pH至7.2～7.5，在4℃可保存72小時。
4.3重組IL-11粗制品的制備“融合蛋白精制品”經(jīng)SDS-PAGE電泳證實純度后，加入一定劑量的重組牛腸激酶(rEK)，2mmol/L CaCL2，放21℃孵育，20小時后取小樣進行SDS-PAGE電泳并染色，用IL-11標準品作對照，應(yīng)出現(xiàn)相同分子量的明顯條帶，根據(jù)融合蛋白的殘留量可將酶切時間適當延長，但不可超過40小時。酶切結(jié)束后，將該酶切產(chǎn)物放置4℃，為“IL-11粗制品”，可在4℃可保存48小時。
4.4重組IL-11精制品的制備從這一步開始所有操作必須在一萬級層流環(huán)境中進行。配置緩沖液所用的水及無機鹽(磷酸鹽)，及容器均需為醫(yī)用級或無熱原?！癐L-11粗制品”經(jīng)0.8m過濾后用水稀釋至電導(dǎo)率7～8ms/cm，用SP-Sepharose FF(Pharmacia產(chǎn)品)陽離子交換柱純化。上樣后平衡條件為10×柱床體積(CV)的20mmol/L磷酸鹽緩沖液(PB)，pH7.5～8，再用3個柱床體積pH9.0，40mmol/L磷酸鹽緩沖液繼續(xù)洗滌層析柱后，用含200mmol/L NaCl的上述pH9.0磷酸鹽緩沖液洗脫，收集主要洗脫峰，進行SDS-PAGE電泳并充分染色，為“IL-11精制品”。如4天內(nèi)進行下一步處理，則放4℃保存；如超過4天則放-80℃保存。此為半成品。
4.5加甘氨酸半成品的制備用無熱原超純水及藥用級磷酸鹽、甘氨酸配置5mmMPB，11.5g/L甘氨酸，pH7.0的緩沖液，平衡Superdex75層析柱，將“重組IL-11精制品”上該柱純化并完成緩沖液轉(zhuǎn)換，收集洗脫峰。收集的富含IL-11的溶液保存于4℃，并于24hrs內(nèi)合并，用0.22μm濾器過濾除菌，為“加甘氨酸半成品”。取樣做無菌實驗和熱原實驗，合格后進行凍干?！凹痈拾彼岚氤善贰笨稍?℃保純7天。如7天內(nèi)不能及時處理，應(yīng)保存在-30℃。在酶切后的純化步驟中，特別注意去除熱原質(zhì)，所有容器均經(jīng)過干熱滅菌，用于分子篩層析的溶液，在配置后也立即進行了去除熱原質(zhì)的處理。整個分離純化過程中，沒有加入任何對人體有害的物質(zhì)。
5.稀釋、分裝和凍干檢定合格的“加甘氨酸半成品”，根據(jù)其蛋白濃度，用5mMPB，11.5g/L甘氨酸，pH7.0的緩沖液稀釋至1.6mg/ml，并及時分裝和凍干將上述除菌過濾的“加甘氨酸半成品”分裝于西林瓶中，每小瓶含2ml液體，隨后進行凍干處理，整個凍干過程加溫不可超過30℃。凍干后按配比加入甘氨酸、磷酸氫二鈉Na2HPO4.7H2O、磷酸二氫鈉Na2HPO4.1H2O。然后壓瓶蓋、封口，于4℃保存。最終使每支針劑含3mgIL-11的凍干粉，其余成分由23mg甘氨酸、1.6mg磷酸氫二鈉(7H2O)、0.55mg磷酸二氫鈉(1H2O)組成，使用前用1ml注射用水溶解，溶解液pH值為7.0。凍干的全過程(進箱、出箱、抽真空等)必須在嚴格的無菌條件下進行，凍干后的制品水分含量低于3％，同機一次凍干的制品作為一批。
權(quán)利要求
1.一種注射用重組人白介素11制劑，該制劑組分以每支計算包括a.1～7mg的重組人白介素11的凍干粉；b.23mg甘氨酸；c.1.6mg磷酸氫二鈉Na2HPO4.7H2O；d.0.55mg磷酸二氫鈉Na2HPO4.1H2O。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的注射用重組人白介素11，其特征在于該制劑組分以每支計算包括a.3±0.5mg的重組人白介素11的凍干粉；b.23mg甘氨酸；c.1.6mg磷酸氫二鈉Na2HPO4.7H2O；d.0.55mg磷酸二氫鈉Na2HPO4.1H2O。
3.一種制備上述的注射用重組人白介素11的工藝，包括菌種庫→種子液制備→發(fā)酵→收菌→碎菌→備融合蛋白粗制品→制備融合蛋白精制品→制備重IL-11粗制品→制備重組IL-11粗制品→稀釋、分裝和凍干→成品檢定，其特征在于種子菌液的制備取一支生產(chǎn)菌種，接種于含有氨芐青霉素100mg/LLB培養(yǎng)基平板，37℃培養(yǎng)16小時，挑取單個菌落接種到LB液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)基使其OD600值在0.4～0.8之間，即可供發(fā)酵罐接種用。發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基溶液為(1升)Na2HPO4.12H2O7.00gKH2PO42.00gK2HPO44.00gNH4Cl 0.02g(NH4)2SO4.7H2O 0.30gTyptone 5.00gYeast 5.00gGlycerol10.00g補料為(1升)MgSO4.7H2O5.00gTyphone83.33gYeast 41.67gGlycerol 416.67g發(fā)酵條件溫度和時間37℃培養(yǎng)，以200ml/小時的速度補料，當OD600為7～8時調(diào)整溫度至37℃，加入誘導(dǎo)劑IPTG，當濃度0.2mM時誘導(dǎo)4小時，然后終止發(fā)酵；碎菌取一定量的菌體，懸浮于適量的0.01M PBS(pH7.0)緩沖液中(菌體與懸浮液的體積比為1∶10)，冰浴下使用高壓均質(zhì)機進行碎菌，共三個循環(huán)；取樣進行染色涂片，顯微鏡下檢查，基本無完整細胞，離心(20000rpm)20分鐘，4℃，收集上清即為粗制IL11的融合蛋白；融合蛋白精制品的制備將“融合蛋白粗制品”經(jīng)連接了Ni2+的金屬螯合柱純化，獲得以Trx-IL-11融合蛋白為主(純度大于70％)的蛋白溶液，為“融合蛋白精制品”。其平衡、洗脫條件為不同pH的Tris-HCl緩沖液，融合蛋白精制品用0.1mol/LNaOH調(diào)整pH至7.2～7.5，在4℃可保存72小時；重組IL-11粗制品的制備“融合蛋白精制品”經(jīng)SDS-PAGE電泳證實純度后，加入一定劑量的重組牛腸激酶(rEK)，2mmol/L CaCL2，放21℃孵育，20小時后取小樣進行SDS-PAGE電泳并染色，用IL-11標準品作對照，應(yīng)出現(xiàn)相同分子量的明顯條帶，根據(jù)融合蛋白的殘留量可將酶切時間適當延長，但不可超過40小時；重組IL-11精制品的制備“IL-11粗制品”經(jīng)0.8m過濾后用水稀釋至電導(dǎo)率7～8ms/cm，用SP-Sepharose FF陽離子交換柱純化，上樣后平衡條件為10×柱床體積(CV)的20mmol/L磷酸鹽緩沖液(PB)，pH7.5～8，再用3個柱床體積pH9.0，40mmol/L磷酸鹽緩沖液繼續(xù)洗滌層析柱后，用含200mmol/LNaCl的上述pH9.0磷酸鹽緩沖液洗脫，收集主要洗脫峰，進行SDS-PAGE電泳并充分染色，此為半成品；加甘氨酸半成品的制備用無熱原超純水及藥用級磷酸鹽、甘氨酸配置5mMPB，11.5g/L甘氨酸，pH7.0的緩沖液，平衡Superdex75層析柱，將“重組IL-11精制品”上該柱純化并完成緩沖液轉(zhuǎn)換，收集洗脫峰。收集的富含IL-11的溶液保存于4℃，并于24hrs內(nèi)合并，用0.22μm濾器過濾除菌，合格后進行凍干。稀釋、分裝和凍干檢定合格的“加甘氨酸半成品”，根據(jù)其蛋白濃度，用5mMPB，11.5g/L甘氨酸，pH7.0的緩沖液稀釋至1.6mg/ml，并及時分裝和凍干將上述除菌過濾的“加甘氨酸半成品”分裝于西林瓶中，每小瓶含2ml液體，隨后進行凍干處理，整個凍干過程加溫不可超過30℃。凍干后按配比加入甘氨酸、磷酸氫二鈉Na2HPO4.7H2O、磷酸二氫鈉Na2HPO4.1H2O，然后壓瓶蓋、封口。
全文摘要
本發(fā)明提供一種注射用重組人白介素11制劑及制備工藝，每支含a.1～7mg的重組人白介素11的凍干粉；b.23mg甘氨酸；c.1.6mg磷酸氫二鈉Na
文檔編號C12P21/02GK1421245SQ01133699
公開日2003年6月4日 申請日期2001年11月22日 優(yōu)先權(quán)日2001年11月22日
發(fā)明者徐進 申請人:武漢春天生物工程股份有限公司