專利名稱：一種制備丹參酚酸b的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種丹參酚酸B的制備方法。
背景技術(shù)：
丹參Salviamiltiorrhiza是具有活血化瘀功效的傳統(tǒng)中藥，對(duì)心腦血管疾病具有顯著療效，自古以來(lái)就廣泛應(yīng)用于臨床。藥理研究表明水溶性的酚酸成分是丹參活血化瘀的有效成分，具有顯著的抗脂質(zhì)過(guò)氧化，清除自由基和抗血栓作用。
隨著人口老齡化進(jìn)程的加速以及生活方式的改變，心腦血管病已成為一個(gè)全球性的健康問(wèn)題，冠心病、卒中的死亡率在世界范圍分別居第1、3位。新型有效的防治心腦血管病藥物的開發(fā)已刻不容緩。隨著中藥現(xiàn)代化進(jìn)程的日益深入，具有顯著抗脂質(zhì)過(guò)氧化、清除自由基和抗血栓作用的丹參酚酸類成分越來(lái)越引起人們的注意。目前已有不少以丹參酚酸為主要藥效成分的藥物制劑，如丹參注射液、香丹注射液等。
研究表明，在丹參的干燥根中，酚酸B含量在5％左右，個(gè)別產(chǎn)地所產(chǎn)丹參中酚酸B的含量高達(dá)8％-10％。丹參酚酸B是丹參中主要的酚酸類成分，也是丹參具有活血化瘀功效的主要活性成分。但在目前的丹參藥物制劑中，其酚酸類成分主要由丹參素和原兒茶醛組成，丹參酚酸B的含量很低。這是由于丹參酚酸B是二分子丹參素與一分子原紫草酸縮合而成的四聚咖啡酸類化合物，其化學(xué)結(jié)構(gòu)中存在的酚羥基和羧基很不穩(wěn)定，低濃度的丹參酚酸B水溶液在常溫下經(jīng)24小時(shí)后酚酸B即損失30％左右?，F(xiàn)有的丹參提取過(guò)程中往往經(jīng)過(guò)多次加熱處理，使大部分丹參酚酸B降解為丹參素和寡聚咖啡酸的脫水、脫羧產(chǎn)物或進(jìn)一步氧化成原兒茶醛、原兒茶酸。丹參素雖然也是丹參具有活血化瘀作用的有效成分之一，但在加熱條件下同樣易氧化分解?？偠灾⒆鳛橐环N療效顯著的傳統(tǒng)中藥，在目前的制劑工藝中，其利用度是很低的。
現(xiàn)有的丹參注射液的的制備方法是取丹參藥材，加10倍量的注射用水煎煮2小時(shí)，過(guò)濾，保留第一次煎液；藥渣再用8倍量的注射用水煎煮2小時(shí)，過(guò)濾，保留第二次煎液；藥渣再加5倍量的注射用水煎煮1小時(shí)，過(guò)濾，保留第三次煎液；藥渣再加5倍量的注射用水煎煮1小時(shí)，過(guò)濾，保留第四次煎液，去除藥渣。然后合并四次煎煮液，蒸發(fā)濃縮至含丹參為2克/毫升的濃縮液。濃縮液中加入乙醇至含醇量為70％-80％，于0℃-5℃條件下放置12-36小時(shí)，過(guò)濾去除沉淀；濾液蒸餾濃縮至含丹參為3克/毫升的濃縮液，再加入乙醇至含醇量為80％-90％，于0℃-5℃條件下放置48-72小時(shí)，過(guò)濾去除沉淀；濾液蒸餾濃縮至含丹參為3克/毫升的濃縮液，再加入4倍量的注射用水，于0℃-5℃條件下放置12-36小時(shí)，過(guò)濾去除沉淀；濾液加熱濃縮至含丹參為5克/毫升的濃縮液，再加入4倍量的注射用水，于0℃-5℃條件下放置48-72小時(shí)，過(guò)濾去除沉淀，濾液加熱濃縮至含丹參為5克/毫升的濃縮液，加入活性碳，加熱煮沸，制得丹參精制液。在這一工藝中，經(jīng)過(guò)多次加熱處理，丹參酚酸B損失90％以上，由丹參酚酸B降解產(chǎn)生的丹參素也損失巨大。
如何在提取工藝中保持丹參酚酸B的穩(wěn)定性，最大限度地利用丹參中的有效成分，是藥物研究工作者努力的方向。目前已有以丹參酚酸B提取對(duì)象的工藝和方法。如專利公開號(hào)為CN 1425659A的國(guó)家發(fā)明專利中公開了一種丹參酚酸B的制備方法。其工藝步驟為1.水提取；2.用鹽酸或硫酸酸化提取液；3.采用非極性或弱極性的大孔樹脂或MCIGEL-CHP-20P、SephadexLH-20凝膠、C18鍵合相或C18鍵合相色譜柱填料通過(guò)柱層析法分離純化丹參酚酸B；4.冷凍干燥。通過(guò)該方法可獲得純度在90％以上的丹參酚酸B制品。但我們?cè)谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)，采用酸化處理丹參水提液時(shí)，丹參酚酸B的損失達(dá)20％，采用60％-85％乙醇沉淀處理時(shí)丹參酚酸B損失達(dá)30％以上；由于丹參酚酸B具有較大的極性，丹參水提、酸化后上非極性或弱極性的大孔樹脂，直接以不同濃度醇(或其它有機(jī)溶劑)洗脫時(shí)層析柱的處理能力較低，按該專利說(shuō)明書中所述大孔樹脂處理丹參水提液中上柱樣品(以原藥材干重計(jì)算)與樹脂量之比僅為1∶4(W∶W)，以丹參酚酸B計(jì)僅約5.5mg/ml大孔樹脂；如果采用MCIGEL-CHP-20P、SephadexLH-20凝膠、C18鍵合相或C18鍵合相色譜柱填料，則生產(chǎn)成本將大幅度提高。
本發(fā)明提供了一種新的丹參酚酸B的制備方法，該方法在處理過(guò)程中盡可能地保持了丹參酚酸B的穩(wěn)定性，并在保證產(chǎn)品質(zhì)量的同時(shí)使單位體積大孔樹脂對(duì)丹參酚酸B的處理能力提高了4倍以上，非常適于大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種丹參酚酸B的制備方法。
本發(fā)明提供的制備方法為丹參水提液上非極性或弱極性大孔樹脂，其特征為，丹參水提液中加入抗氧劑，抗氧劑用量為提取液體積的0.001％-10％，洗脫液酸化至PH＝1～4。具體為1.水提丹參中的酚酸類成分時(shí)加入抗氧劑。
所用水可為常水、純水、注射用水等，優(yōu)選為純水；水溫應(yīng)保持0-50℃，優(yōu)選為室溫。提取方法可以是浸漬、滲漉或超聲萃取。上述浸漬法是取粉碎后可過(guò)三號(hào)篩的丹參加水一次性浸漬提取或多次浸漬提取。每次浸漬用5-20倍量水，浸漬時(shí)間為2-8小時(shí)。推薦方案為第一次浸漬用20倍量水，浸漬時(shí)間為2小時(shí)，第二次浸漬用10倍量水，浸漬時(shí)間為4小時(shí)。合并兩次提取液，過(guò)濾、離心或自然沉降初步去除提取液中的固體雜質(zhì)。上述滲漉法是取粉碎后可過(guò)三號(hào)篩的丹參裝于一有機(jī)玻璃制成的滲漉柱或桶中，邊裝邊適當(dāng)壓實(shí)，滲漉柱或桶上端留出約1/5體積，加水至所有藥材浸沒(méi)，靜止浸泡4小時(shí)。打開滲漉柱下端閥門，使?jié)B漉液緩緩流出，每小時(shí)流出滲漉液約為丹參干重的一倍，同時(shí)不斷注入水至滲漉柱上端。以HPLC跟蹤檢測(cè)滲漉液中丹參酚酸B的含量，確定用12-16倍量水滲漉可比較完全地提取出丹參酚酸B。上述超聲法是取粉碎后可過(guò)三號(hào)篩的丹參，加水一次性提取或多次提取。每次提取用5-20倍量水，提取時(shí)間為0.5-2小時(shí)。推薦方案為第一次用20倍量水，提取時(shí)間為0.5小時(shí)，第二次浸漬用10倍量水，浸漬時(shí)間為1.5小時(shí)。合并兩次提取液，過(guò)濾、離心或自然沉降初步去除提取液中的固體雜質(zhì)。
將上述水提液中加入抗氧劑，靜置4-24小時(shí)，溶液變混濁并逐漸析出沉淀，采用過(guò)濾、離心或自然沉降法去除沉淀?？寡鮿┛梢允莵喠蛩釟溻c、亞硫酸鈉、抗壞血酸、焦亞硫酸鈉。優(yōu)選為亞硫酸氫鈉和抗壞血酸。抗氧劑的用量為提取液體積的0.001％-10％，優(yōu)選為0.005％-1％，再優(yōu)選為0.005％-0.01％。加入抗氧劑的目的是延緩溶液中的溶解氧對(duì)丹參酚酸B的氧化作用。丹參酚酸B分子結(jié)構(gòu)中的酚羥基和羧基很不穩(wěn)定，尤其是在低濃度條件下極易氧化降解成丹參素和寡聚咖啡酸的脫水、脫羧產(chǎn)物或進(jìn)一步氧化成原兒茶醛、原兒茶酸；并且水提液中含有大量的膠質(zhì)成分，加入抗氧劑后，可產(chǎn)生鹽析效果而去除這部分雜質(zhì)。
本發(fā)明人設(shè)計(jì)了以下對(duì)比實(shí)驗(yàn)來(lái)考察抗氧劑對(duì)丹參水提液中丹參酚酸B的保護(hù)作用并比較了醇沉、酸化去除雜質(zhì)的效果取上述丹參水提液5份，其中四份分別加入0.01％的亞硫酸氫鈉、0.01％的抗壞血酸、以鹽酸調(diào)至pH2、以95％乙醇調(diào)至醇濃度為75％，另外一份不做任何處理。5份溶液在用HPLC檢測(cè)其中的丹參酚酸B含量后除菌、密封，室溫下放置兩天，觀察溶液狀態(tài)，HPLC檢測(cè)溶液中的丹參酚酸B含量并與兩天前比較。結(jié)果表明，處理過(guò)的丹參水提液均出現(xiàn)沉淀，目測(cè)沉淀的量基本相同，而加入抗氧劑的水提液中丹參酚酸B含量明顯比其它三種溶液穩(wěn)定。
表一 不同方法處理丹參水提液后丹參酚酸B的變化

2.采用大孔樹脂作層析介質(zhì)，以酸性溶劑作洗脫用溶劑。
選用弱極性或非極性的大孔樹脂，如AB-8、DM-130等，洗脫用溶劑均用酸調(diào)至酸性。由于丹參酚酸B具有較大的極性，采用非極性或弱極性的大孔樹脂，層析介質(zhì)與丹參酚酸B的結(jié)合較弱，單位體積樹脂對(duì)丹參酚酸B的處理量較低。若強(qiáng)制增大上柱樣品量，則用低濃度洗脫劑即可洗出丹參酚酸B，選擇性不高，并且由于丹參酚酸B在洗脫流出液中分布較為分散，導(dǎo)致洗脫劑用量過(guò)大，增大了后續(xù)濃縮工序的工作量。本發(fā)明中的洗脫液均用酸調(diào)至酸性，增大了丹參酚酸B與樹脂的結(jié)合能力，大大提高了單位體積樹脂對(duì)丹參酚酸B的處理量，正常上柱樣品量(以料液中丹參酚酸B量計(jì)算)達(dá)到25mg/ml大孔樹脂。具體方法如下將上述加入抗氧劑靜置4-24小時(shí)后的丹參水提物上清液加至大孔樹脂柱上；上樣量(以料液中丹參酚酸B量計(jì)算)10-40mg/ml大孔樹脂，優(yōu)選為20-30mg/ml大孔樹脂。上樣完成后，用酸水(用酸調(diào)pH＝1-4的純水)沖洗柱子3-8個(gè)柱體積，至HPLC檢測(cè)流出液中雜質(zhì)峰接近基線為止；先用低濃度的有機(jī)溶劑水溶液(用酸調(diào)pH＝1-4)洗去大部分雜質(zhì)，再換用中等濃度的有機(jī)溶劑水溶液洗脫得到高純度的丹參酚酸B溶液，最后用高濃度的有機(jī)溶劑水溶液洗去層析柱上殘留雜質(zhì)并對(duì)大孔樹脂進(jìn)行再生處理。
所用有機(jī)溶劑為醇類、丙酮、乙腈等，優(yōu)選為乙醇。
調(diào)節(jié)洗脫溶劑所用酸為鹽酸、硫酸、磷酸、甲酸、乙酸等，也可以是亞硫酸氫鈉、抗壞血酸等具有酸功能的抗氧劑。優(yōu)選為鹽酸。
上述洗脫溶劑調(diào)至pH＝1-4，優(yōu)選至pH＝2-3。
上述所用低濃度的有機(jī)溶劑水溶液，有機(jī)溶劑濃度為15％-45％，優(yōu)選20％-25％，洗脫體積為3-15個(gè)柱體積，優(yōu)選為5-10個(gè)柱體積。
上述所用中等濃度的有機(jī)溶劑水溶液，有機(jī)溶劑濃度為35％-85％，優(yōu)選40％，洗脫體積為3-15個(gè)柱體積，優(yōu)選為3-5個(gè)柱體積。
上述所用高濃度有機(jī)溶劑水溶液，有機(jī)溶劑濃度為85％-100％，優(yōu)選95％，洗脫體積為3-5個(gè)柱體積，最后用純水洗10-20個(gè)柱體積，至流出液中無(wú)有機(jī)溶劑的味道為止。
3.干燥收集上述通過(guò)大孔樹脂層析所得高純度的丹參酚酸B溶液，在70℃、真空度-0.1Mpa的條件下減壓脫醇濃縮至含藥量5％左右，冷凍干燥，制品中丹參酚酸B含量在90％以上。通過(guò)HPLC跟蹤檢測(cè)各操作單元中丹參酚酸B的回收率，結(jié)果見(jiàn)表二。
表二 不同操作單元中丹參酚酸B的回收率*

*取干燥丹參，粉碎過(guò)三號(hào)篩，加50倍量水超聲提取30min，HPLC檢測(cè)上清液中丹參酚酸B的含量。以此確定丹參中酚酸B的量，定為100％。
在本發(fā)明所涉及的丹參酚酸B制備方法中，水提丹參時(shí)采用常溫或低溫，避免了丹參酚酸B的降解；水提液加入抗氧劑，不但有利于保持酚酸B的穩(wěn)定性，同時(shí)產(chǎn)生的鹽析效果可有效去除膠質(zhì)等雜質(zhì)；洗脫過(guò)程采用酸性洗脫溶劑，增大了上柱丹參酚酸B與樹脂的結(jié)合能力，不但顯著提高了單位體積的大孔樹脂對(duì)丹參酚酸B的處理能力，還提高了洗脫條件的選擇空間。因此，本發(fā)明所涉及的丹參酚酸B制備方法不但可以得到高質(zhì)量的丹參酚酸B制品，而且丹參酚酸B的收率和處理能力也大為提高，對(duì)降低生產(chǎn)成本，提高丹參的利用度，充分利用中藥材資源具有重要意義，極其有利于工業(yè)化大生產(chǎn)。


圖1為實(shí)施例1制備的丹參酚酸B制品色譜圖，各成分在色譜分析中保留時(shí)間、面積百分比等數(shù)值見(jiàn)表三。
表三 實(shí)施例1制備的各成分保留時(shí)間、面積百分比

圖2為丹參酚酸B對(duì)照品色譜圖，各成分在色譜分析中保留時(shí)間、面積百分比等數(shù)值見(jiàn)表四。
表四 對(duì)照品制備的各成分保留時(shí)間、面積百分比

具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，但并不意味著本發(fā)明僅限與此。
實(shí)施例1丹參酚酸B的制備水提取(浸漬法)取丹參粉碎可過(guò)三號(hào)篩，稱50Kg，按其重量的20倍量加純水，室溫浸泡4小時(shí)并適當(dāng)攪拌，分離提取液，殘?jiān)丛⒅亓康?0倍加水，室溫浸泡6小時(shí)并適當(dāng)攪拌，分離提取液。合并兩次提取液，用過(guò)濾方法去除其中的固體雜質(zhì)。
在上述提取液中加入抗氧劑亞硫酸氫鈉，亞硫酸氫鈉的用量為提取液體積的0.005％。靜置6小時(shí)，溶液變混濁并逐漸出現(xiàn)沉淀，過(guò)濾去除沉淀，經(jīng)HPLC測(cè)定，濾液中丹參酚酸B量為2.632Kg。
將上述濾液加至處理好的AB-8型大孔樹脂柱，先用5個(gè)柱體積的酸水(用鹽酸調(diào)pH＝2的純水)洗柱，去除大部分未與大孔樹脂結(jié)合的雜質(zhì)，再用25％的乙醇水溶液洗5個(gè)柱體積，然后用40％乙醇洗脫5個(gè)柱體積，基本可將丹參酚酸B收集完全。最后用95％乙醇洗脫3個(gè)柱體積后用去離子水洗10-20個(gè)柱體積，再生柱子。
收集上述用40％乙醇洗脫時(shí)的流出液，在70℃、真空度-0.1Mpa的條件下減壓脫醇濃縮至含藥量5％左右，冷凍干燥，制得丹參酚酸B含量為95.45％的樣品2.461Kg，丹參酚酸B回收率為89.25％。
實(shí)施例2丹參酚酸B的制備與實(shí)施例1基本相同，所不同的是，水提過(guò)程采用滲漉法。具體方法如下取粉碎后可過(guò)三號(hào)篩的丹參50Kg裝于一有機(jī)玻璃制成的滲漉柱或桶中，邊裝邊適當(dāng)壓實(shí)，滲漉柱或桶上端留出約1/5體積。加純水至所有藥材浸沒(méi)，靜止浸泡4小時(shí)。打開滲漉柱下端閥門，使?jié)B漉液緩緩流出，每小時(shí)流出滲漉液約為丹參干重的一倍，同時(shí)不斷注入水至滲漉柱上端。滲漉13倍水量后以HPLC檢測(cè)滲漉液中丹參酚酸B的含量已降至很低，停止?jié)B漉。合并滲漉液加入抗氧劑亞硫酸氫鈉，亞硫酸氫鈉的用量為提取液體積的0.01％。最終制得丹參酚酸B含量為93.38％的樣品2.455Kg，丹參酚酸B回收率為87.10％。
實(shí)施例3丹參酚酸B的制備與實(shí)施例1基本相同，所不同的是，水提液中加入提取液體積0.005％的抗壞血酸代替亞硫酸氫鈉。處理丹參藥材50Kg，最終得到丹參酚酸B含量為94.12％的樣品2.471Kg，丹參酚酸B回收率為88.40％。
實(shí)施例4丹參酚酸B的制備與實(shí)施例1基本相同，所不同的是，在大孔樹脂層析分離純化丹參酚酸B的單元操作中采用低濃度洗脫劑為20％的甲醇-水溶液洗5個(gè)柱體積，中濃度洗脫劑為40％的甲醇-水溶液洗4個(gè)柱體積。處理丹參藥材50Kg，最終得到丹參酚酸B含量為94.38％的樣品2.446Kg，丹參酚酸B回收率為87.74％。
實(shí)施例5丹參酚酸B的制備與實(shí)施例1基本相同，所不同的是，在大孔樹脂層析分離純化丹參酚酸B的單元操作中采用低濃度洗脫劑為20％的丙酮-水溶液洗5個(gè)柱體積，中濃度洗脫劑為40％的丙酮-水溶液洗3個(gè)柱體積。處理丹參藥材50Kg，最終得到丹參酚酸B含量為92.38％的樣品2.479Kg，丹參酚酸B回收率為87.04％。
實(shí)施例6丹參酚酸B的制備與實(shí)施例1基本相同，所不同的是，在大孔樹脂層析分離純化丹參酚酸B的單元操作中采用低濃度洗脫劑為15％的乙腈-水溶液洗5個(gè)柱體積，中濃度洗脫劑為40％的乙腈-水溶液洗3個(gè)柱體積。處理丹參藥材50Kg，最終得到丹參酚酸B含量為93.46％的樣品2.511Kg，丹參酚酸B回收率為89.20％。
權(quán)利要求
1.一種丹參酚酸B的制備方法，丹參水提液上非極性或弱極性大孔樹脂，其特征為，丹參水提液中加入抗氧劑，抗氧劑用量為提取液體積的0.001％-10％，洗脫液酸化至PH＝1～4。
2.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，抗氧劑的加入量為提取液體積的0.005％-0.01％。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的制備方法，抗氧劑為亞硫酸氫鈉、亞硫酸鈉、抗壞血酸、焦亞硫酸鈉。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，抗氧劑優(yōu)選為亞硫酸氫鈉或抗壞血酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2的制備方法，優(yōu)選為洗脫液酸化至PH＝2～3。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2的制備方法，其特征是，酸化所用溶劑為鹽酸、硫酸、磷酸、甲酸、乙酸，或具有酸功能的抗氧劑如亞硫酸氫鈉、抗壞血酸。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，酸化所用溶劑優(yōu)選為鹽酸。
8.根據(jù)權(quán)利要求1或2的制備方法，其特征是，洗脫液為醇類、丙酮、乙腈、氯仿中的一種或幾種。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的制備方法，洗脫液優(yōu)選為乙醇。
10.根據(jù)上述任一權(quán)利要求的制備方法，優(yōu)選為丹參水提液加入抗氧劑亞硫酸氫鈉或抗壞血酸，抗氧劑用量為提取液體積的0.005％-0.01％，靜置4-6小時(shí)，溶液變渾濁并逐漸析出沉淀，采用過(guò)濾、離心或自然沉降法去除沉淀，將濾液加至處理好的AB-8或DM-130型大孔樹脂柱，先用鹽酸調(diào)PH＝2-3的純水洗脫5個(gè)柱體積，再用25％的乙醇水溶液洗5個(gè)柱體積，然后用40％乙醇洗脫5個(gè)柱體積，收集流出液，冷凍干燥即得。
全文摘要
本發(fā)明提供一種從丹參中提取丹參酚酸B的制備方法，該方法為丹參水提液中加入抗氧劑，抗氧劑用量為提取液體積的0.001％－10％，采用過(guò)濾、離心或自然沉降法去除沉淀，濾液上非極性或弱極性大孔樹脂，洗脫液酸化至pH＝1～4。
文檔編號(hào)C07D307/00GK1955171SQ20051010441
公開日2007年5月2日 申請(qǐng)日期2005年10月28日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月28日
發(fā)明者曲桂武, 岳喜典 申請(qǐng)人:山東綠葉天然藥物研究開發(fā)有限公司