專利名稱：治療cd30陽性淋巴瘤的方法
背景技術(shù)：
CD30細(xì)胞表面分子是腫瘤壞死因子受體(TNF-R)超家族的一個成員。該分子家族在其成員中具有不定的同源性，且包括神經(jīng)生長因子受體(NGFR)、CD120(a)、CD120(b)、CD27、CD40、CD95、OX40、Fas、TNF-R1和TNF-R2，它們是從環(huán)境向調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)信號的關(guān)鍵調(diào)節(jié)分子(1，2)。這些分子一般特征在于在胞質(zhì)外區(qū)域中存在多個富含半胱氨酸的重復(fù)(de Bruin，P.C.等人，Leukemia1620-1627(1995))。據(jù)認(rèn)為該家族的成員對于調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞的增殖和分化是至關(guān)重要的。
CD30是具有6個(人類)或3個(鼠和大鼠)富含半胱氨酸的重復(fù)的I型跨膜糖蛋白，且具有1個中央鉸鏈序列。CD30以從90kDa的細(xì)胞間前體蛋白發(fā)展來的120kDa膜分子存在。它作為約90kDa的可溶性蛋白質(zhì)(sCD30)從細(xì)胞表面釋放。sCD30的釋放作為活CD30細(xì)胞的活性過程發(fā)生，且不僅僅由從垂死或死亡細(xì)胞中的釋放引起。已通過用單克隆抗體Ki-1和Ber-H2進(jìn)行免疫篩選而從HLTV-1人類T-細(xì)胞系HUT-102的表達(dá)文庫中克隆了編碼CD30蛋白質(zhì)的cDNA(Schwab，U.等人，Nature 29965(1982))。已發(fā)現(xiàn)小鼠和大鼠CD30 cDNA分別編碼498和493個氨基酸。人類CD30 cDNA編碼額外的90個氨基酸，其中部分是一個富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域的重復(fù)。CD30基因已定位于人類中的lp36和大鼠中的5q36.2。
CD30主要由活化的淋巴樣細(xì)胞表達(dá)。細(xì)胞表面受體最初通過單克隆抗體Ki-1進(jìn)行鑒定，該單克隆抗體與表達(dá)于何杰金氏病的何杰金氏和Reed-Sternberg細(xì)胞上的抗原反應(yīng)(Schwab等人，Nature29965(1982))。因此，CD30廣泛用作何杰金氏淋巴瘤和相關(guān)的血液惡性腫瘤的臨床標(biāo)記(Froese等人，J.Immunol.1392081(1987)；Carde等人，Eur.J.Cancer 26474(1990))。后來確定淋巴樣細(xì)胞中CD30的刺激誘導(dǎo)多效生物學(xué)效應(yīng)，包括增殖、激活、分化和細(xì)胞死亡，取決于細(xì)胞型、分化階段和其它刺激物的存在(Gruss，H.J.等人，Blood 832045-2056(1994))。據(jù)認(rèn)為，惡性細(xì)胞上CD30受體的過度表達(dá)對HD來源的細(xì)胞的NF-kB激活引起的存活率和凋亡抗性起作用(3-5)。
已經(jīng)顯示CD30表達(dá)于非何杰金氏淋巴瘤(NHL)的亞型上，包括伯基特淋巴瘤、間變性大細(xì)胞淋巴瘤(ALCL)、皮膚T細(xì)胞淋巴瘤、結(jié)節(jié)性小卵裂細(xì)胞淋巴瘤、淋巴細(xì)胞性淋巴瘤、外周T細(xì)胞淋巴瘤、倫納特氏淋巴瘤、免疫母細(xì)胞性淋巴瘤、T細(xì)胞白血病/淋巴瘤(ATLL)、成人T細(xì)胞白血病(T-ALL)和中心母細(xì)胞/中心細(xì)胞性(cb/cc)濾泡性淋巴瘤(Stein等人，Blood 66848(1985)；Miettinen，Arch.Pathol.Lab.Med.1161197(1992)；Piris等人，Histopathology 17211(1990)；Burns等人，Am.J.Clin.Pathol.93327(1990)；和Eckert等人，Am.J.Dermatopathol.11345(1989))，以及幾種病毒轉(zhuǎn)化的品系，如人類T細(xì)胞嗜淋巴細(xì)胞病毒I或II轉(zhuǎn)化的T細(xì)胞和EB病毒轉(zhuǎn)化的B細(xì)胞(Stein等人，Blood 66848(1985)；Andreesen等人，Blood 631299(1984))。此外，也在胚胎性癌、非胚胎性癌、惡性黑素瘤、間充質(zhì)腫瘤和骨髓細(xì)胞系和巨噬細(xì)胞中在分化晚期記錄到了CD30表達(dá)(Schwarting等人，Blood 741678(1989)；Pallesen等人，Am J.Pathol.133446(1988)；Mechtersheimer等人，Cancer 661732(1990)；Andreesen等人，Am.J.Pathol.134187(1989))。
大約20-30％的年齡較大或HD期的HD患者將在一線治療后復(fù)發(fā)。由高劑量藥物治療聯(lián)合自體干細(xì)胞移植組成的補(bǔ)救治療能夠治愈這些患者中另外的40-60％。大量單藥方案，例如口服依托泊苷、苯丁酸氮芥、長春堿、吉西他濱、長春瑞濱，能夠在幾個月或幾年的時間里緩解移植失敗或者不適合移植的患者(Devizzi等人，Annals ofOncology 5817-820，1994)。最近發(fā)展的補(bǔ)救治療，如蛋白酶體抑制劑、抗CD30抗體以及聯(lián)合方案，例如鹽酸多柔比星脂質(zhì)體(doxil)、諾維本和吉西他濱，除了幾個例外以外，仍然對治療CD30陽性淋巴瘤大部分無效。
由于正常個體中CD30陽性細(xì)胞的百分比相當(dāng)小，所以CD30在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)使其成為抗體介導(dǎo)的治療的重要目標(biāo)，以特異性地將治療劑導(dǎo)向CD30陽性的贅生性細(xì)胞(Chaiarle，R.等人，Clin.Inmunol.90(2)157-164(1999))。然而，盡管迄今獲得的結(jié)果清楚地確定CD30是免疫治療的有用目標(biāo)，但該結(jié)果也顯示目前可用的鼠和嵌合抗體未構(gòu)成理想的治療劑。已經(jīng)顯示全人抗CD30單克隆抗體5F11在體外和體內(nèi)對ALCL和各種HD來源的細(xì)胞系有效(17)。盡管全人抗體與鼠和嵌合抗CD30抗體相比有效性提高，但是觀察到CD30陽性靶細(xì)胞對5F11的敏感性的變化。抗體治療殺死導(dǎo)致CD30陽性淋巴瘤的表達(dá)CD30的細(xì)胞的能力的提高是期望的。
因此，存在對改進(jìn)的治療性抗CD30抗體的需要，該抗體對于治療和/或預(yù)防由CD30介導(dǎo)的疾病是有效的。
發(fā)明概述在本發(fā)明中，在各種HD來源的細(xì)胞系中研究了5F11對NF-kB激活的效果，以研究細(xì)胞凋亡抗性的機(jī)制。本發(fā)明證明5F11聯(lián)合硼替佐米(bortezomib)的效果提高，硼替佐米是一種蛋白酶體抑制劑，已知在體外和在皮下人何杰金腫瘤模型中都能夠抑制NF-kB激活。
因此，本發(fā)明提供治療CD30陽性淋巴瘤患者的方法，包括施用治療有效量的抗CD30單克隆抗體聯(lián)合NF-kB活性抑制劑，如蛋白酶體抑制劑。
在一個實(shí)施方案中，抗CD30抗體與蛋白酶體抑制劑同時給藥，或者至少在1天內(nèi)給藥，抗體劑量為1mg/kg至25mg/kg，蛋白酶體抑制劑劑量為0.1mg/kg至10mg/kg。
在另一個實(shí)施方案中，抗CD30抗體至少在蛋白酶體抑制劑給藥前1天給藥，抗體的劑量為1mg/kg至25mg/kg，蛋白酶體抑制劑的劑量為0.1mg/kg至10mg/kg。
在另一個實(shí)施方案中，抗CD30抗體至少在蛋白酶體抑制劑給藥前1周給藥。該實(shí)施方案的另一方面包括在蛋白酶體抑制劑給藥前最多12周每周至少一次給藥，抗體的劑量為1mg/kg至25mg/kg，蛋白酶體抑制劑的劑量為0.1mg/kg至10mg/kg。
在另一個實(shí)施方案中，抗CD30抗體以單次大劑量給藥，例如10至25mg/kg，然后在抗體給藥后最多1周施用蛋白酶體抑制劑至少一次；在抗體給藥后最多2周至少一次；在抗體給藥后最多3周至少一次；在抗體給藥后最多4周至少一次；在抗體給藥后最多1個月至少一次；在抗體給藥后最多2個月至少一次；或者在抗體給藥后最多3個月至少一次。
本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點(diǎn)通過下面的詳述和實(shí)施例將是顯而易見的，該詳述和實(shí)施例不應(yīng)理解為限制性的。貫穿本申請中引用的所有參考文獻(xiàn)、專利和公布的專利申請的內(nèi)容均在此處特別引入作為參考。


圖1用5F11和MG132處理后L540細(xì)胞中凋亡的誘導(dǎo)。L540細(xì)胞與PBS(對照)、交聯(lián)的5F11、MG132或5F11和MG132的組合一起培養(yǎng)16小時。凋亡細(xì)胞通過膜聯(lián)蛋白-FITC染色進(jìn)行標(biāo)記，通過FACS分析估計(jì)給出活細(xì)胞和凋亡細(xì)胞的百分比。示出了三個獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。
圖2交聯(lián)的5F11和MG132的組合降低了表達(dá)CD30的細(xì)胞系的細(xì)胞存活率。
XTT試驗(yàn)顯示在存在(菱形)或不存在(三角)5F11的情況下，何杰金細(xì)胞系L540(A)，L428(B)和ALCL系Karpas299(C)和CD30陰性細(xì)胞系REH(E)在暴露于含量漸增的硼替佐米后的存活率。亞毒性濃度的5F11和交聯(lián)GaH抗體與濃度逐漸增加的硼替佐米聯(lián)用。在加入硼替佐米之前，細(xì)胞與單克隆抗體預(yù)孵育30分鐘。孵育48小時后估計(jì)細(xì)胞存活率。在5F11存在下硼替佐米對于表達(dá)CD30的細(xì)胞的IC50降低。在加入5F11之前細(xì)胞與硼替佐米預(yù)孵育30分鐘不增加硼替佐米對L428細(xì)胞的細(xì)胞毒性(D)。示出了對照實(shí)驗(yàn)(5F11，菱形)和山羊抗人抗體(十字形)和5F11+GaH(圓形)的結(jié)果。該圖表示三個獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)。
圖35F11和硼替佐米對SCID小鼠中皮下L540Cy何杰金腫瘤的腫瘤生長的影響。當(dāng)L540來源的腫瘤達(dá)到大約100mm3的體積時，將小鼠隨機(jī)分為4組，接受PBS、5F11(100μg)、硼替佐米(10ng)或5F11和硼替佐米的組合。給出了每只小鼠的腫瘤體積。箭頭指示治療天數(shù)。在獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)中，分別在5F11和5F11+硼替佐米組中用4只動物重現(xiàn)這些結(jié)果(數(shù)據(jù)未示出)。
圖45F11和硼替佐米對NF-κB的亞細(xì)胞分布和轉(zhuǎn)錄活性的影響。
L428細(xì)胞用報道構(gòu)建體pCMV-luc(轉(zhuǎn)染對照)或pNF-κB-luc(第2-4條)或pNF-κB-luc以及表達(dá)載體IkB-M(第5-7條)轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染效率約為10％，DNA總量保持恒定。在過夜恢復(fù)后，轉(zhuǎn)染子用PBS(基礎(chǔ))、5F11或硼替佐米處理24小時。測定細(xì)胞的螢光素酶活性(RLU)，示出了NF-κB-依賴的啟動子活性的相對水平。
發(fā)明詳述為了使本發(fā)明更易于理解，首先定義了某些術(shù)語。額外的定義貫穿于詳述中提出。
術(shù)語“CD30”和“CD30抗原”在此處可互換應(yīng)用，且包括由細(xì)胞天然表達(dá)的人類CD30的任何變體、同種型和物種同系物。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體與CD30抗原的結(jié)合通過抑制或阻斷CD30配體與CD30的結(jié)合抑制了表達(dá)CD30的細(xì)胞(如腫瘤細(xì)胞)的生長。術(shù)語“CD30配體”包括CD30的所有(如生理學(xué))配體。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，CD30配體是CD30L、CD153、TRAF1、TRAF2、TRAF3或TRAF5。在另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體與CD30抗原的結(jié)合介導(dǎo)表達(dá)CD30的細(xì)胞的效應(yīng)細(xì)胞吞噬作用和/或殺傷。在另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體與CD30抗原的結(jié)合介導(dǎo)表達(dá)CD30的細(xì)胞的效應(yīng)細(xì)胞ADCC。
如在此處所用的，術(shù)語“抑制生長”(如涉及細(xì)胞)意欲包括與不接觸抗CD30抗體的相同細(xì)胞的生長相比，當(dāng)接觸抗CD30抗體時細(xì)胞生長中任何可測量的降低，如至少約10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、99％或100％的細(xì)胞生長抑制。
術(shù)語“免疫應(yīng)答”是指例如淋巴細(xì)胞、抗原呈遞細(xì)胞、吞噬細(xì)胞、粒細(xì)胞和上述細(xì)胞或肝臟產(chǎn)生的可溶性大分子(包括抗體、細(xì)胞因子和補(bǔ)體)的作用，導(dǎo)致選擇性損傷、破壞或從人體中清除侵入的病原體、被病原體感染的細(xì)胞或組織、癌細(xì)胞，或(在自身免疫或病理性炎癥的情況下)正常人細(xì)胞或組織。
如此處所用的“分離的抗體”是指基本不含具有不同抗原特異性的其他抗體的抗體(例如，特異性結(jié)合CD30的分離的抗體基本不含特異性結(jié)合除CD30以外的抗原的抗體)。但是，特異性結(jié)合CD30的分離的抗體與諸如來自其他物種的CD30分子等其他抗原可能具有交叉反應(yīng)性。而且，分離的抗體可基本不含其他細(xì)胞材料和/或化學(xué)物質(zhì)。
如此處所用的術(shù)語“單克隆抗體”或“單克隆抗體組合物”是指單一分子組成的抗體分子的制劑。單克隆抗體組合物表現(xiàn)出對特定表位的單一結(jié)合特異性和親和性。
如此處所用的術(shù)語“人抗體”包括具有如下可變區(qū)的抗體，在該可變區(qū)中，構(gòu)架區(qū)和CDR區(qū)都源自人種系免疫球蛋白序列。而且，如果該抗體含有恒定區(qū)，則該恒定區(qū)也源自人種系免疫球蛋白序列。本發(fā)明的人抗體可包含并非由人種系免疫球蛋白序列編碼的氨基酸殘基(例如，通過體外隨機(jī)或位點(diǎn)特異性誘變或通過體內(nèi)體細(xì)胞突變引入的突變)。但是，如此處所用的術(shù)語“人抗體”不包括其中源自另一哺乳動物種如小鼠的種系的CDR序列已被移植到人構(gòu)架序列上的抗體。
術(shù)語“人單克隆抗體”是指表現(xiàn)單一結(jié)合特異性的抗體，其具有其中構(gòu)架區(qū)和CDR區(qū)均源自人種系免疫球蛋白序列的可變區(qū)。在一個實(shí)施方案中，人單克隆抗體由雜交瘤產(chǎn)生，該雜交瘤包括與無限增殖化細(xì)胞融合的B細(xì)胞，該B細(xì)胞從具有含人重鏈轉(zhuǎn)基因和輕鏈轉(zhuǎn)基因的基因組的轉(zhuǎn)基因非人動物例如轉(zhuǎn)基因小鼠中獲得。
如此處所用的術(shù)語“重組人抗體”包括通過重組方法制備、表達(dá)、產(chǎn)生或分離的所有人抗體，例如(a)從對于人免疫球蛋白基因而言的轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)染色體動物(例如小鼠)或由其制備的雜交瘤(下文進(jìn)一步描述)中分離的抗體，(b)從經(jīng)轉(zhuǎn)化表達(dá)人抗體的宿主細(xì)胞如轉(zhuǎn)染瘤中分離的抗體，(c)從重組組合人抗體文庫中分離的抗體，和(d)通過包括將人免疫球蛋白基因序列向其他DNA序列剪接的任何其他方法制備、表達(dá)、產(chǎn)生或分離的抗體。這些重組人抗體具有其中構(gòu)架區(qū)和CDR區(qū)均源自人種系免疫球蛋白序列的可變區(qū)。但是在某些實(shí)施方案中，這些重組人抗體可以經(jīng)受體外誘變(或者，當(dāng)使用對于人Ig序列而言的轉(zhuǎn)基因動物時，經(jīng)歷體內(nèi)體細(xì)胞誘變)，因此重組抗體的VH和VL區(qū)的氨基酸序列盡管是源自人種系VH和VL序列并與之相關(guān)的序列，但可能并非在體內(nèi)天然存在于人抗體種系的所有組成成分(repertoire)中。
如此處所用的，術(shù)語“同種型”是指由重鏈恒定區(qū)基因編碼的抗體類別(例如IgM或IgG1)。
短語“識別抗原的抗體”和“抗原特異性抗體”在此與術(shù)語“特異性結(jié)合抗原的抗體”可互換使用。
術(shù)語“人抗體衍生物”是指人抗體的任何修飾形式，例如抗體和其它試劑或抗體的偶聯(lián)物。
術(shù)語“人源化抗體”是指其中來源于另外一種哺乳動物種如小鼠的種系的CDR序列已經(jīng)被移植到人構(gòu)架序列上的抗體。在人構(gòu)架序列內(nèi)也可以進(jìn)行其它的構(gòu)架區(qū)修飾。
術(shù)語“嵌合抗體”是指其中可變區(qū)序列來源于一個物種而恒定區(qū)序列來源于另一個物種的抗體，例如其中可變區(qū)序列來源于小鼠抗體而恒定區(qū)序列來源于人抗體的抗體。
如此處所用的，術(shù)語“特異性結(jié)合人CD30”的抗體是指以1×10-7M或更低、更優(yōu)選5×10-8M或更低、更優(yōu)選3×10-8M或更低、更優(yōu)選1×10-8M或更低、甚至更優(yōu)選1×10-9M或更低的KD與人CD30結(jié)合的抗體。
如此處所用的術(shù)語“Kassoc”或“Ka”是指特定抗體-抗原相互作用的結(jié)合速率，而如此處所用的術(shù)語“Kdis”或“Kd”是指特定抗體-抗原相互作用的解離速率。如此處所用的術(shù)語“KD”是指解離常數(shù)，它是由Kd與Ka的比值獲得的(即Kd/Ka)，并且表示為摩爾濃度(M)?？贵w的KD值可以用本領(lǐng)域建立的方法測定。測定抗體KD的一種優(yōu)選方法是使用表面等離振子共振法，優(yōu)選使用生物傳感器系統(tǒng)，如Biacore系統(tǒng)。
如此處所用的，術(shù)語IgG抗體的“高親和力”是指抗體對于靶抗原的KD為10-8M或更低、更優(yōu)選10-9M或更低、甚至更優(yōu)選10-10M或更低。但是對于其他抗體同種型來說，“高親和力”結(jié)合可能不同。例如，對于IgM同種型來說，“高親和力”結(jié)合是指抗體具有10-7M或更低、更優(yōu)選10-8M或更低、甚至更優(yōu)選10-9M或更低的KD。
如此處所用的，術(shù)語“受試者”和“患者”可互換使用并且包括任何人或非人類動物。術(shù)語“非人類動物”包括所有脊椎動物，例如哺乳動物和非哺乳動物，如非人靈長類動物、綿羊、狗、貓、馬、牛、雞、兩棲類動物、爬行類動物等。在本發(fā)明的特定實(shí)施方案中，患者是人。
這里提到的術(shù)語“抗體”包括完整抗體及其任何抗原結(jié)合片段(即“抗原結(jié)合部分”)或單鏈?！翱贵w”是指包含通過二硫鍵互相連接在一起的至少兩條重(H)鏈和兩條輕(L)鏈的糖蛋白，或其抗原結(jié)合部分。每條重鏈由重鏈可變區(qū)(在此縮寫為VH)和重鏈恒定區(qū)組成。重鏈恒定區(qū)由三個結(jié)構(gòu)域CH1、CH2和CH3組成。每條輕鏈由輕鏈可變區(qū)(在此縮寫為VL)和輕鏈恒定區(qū)組成。輕鏈恒定區(qū)由一個結(jié)構(gòu)域CL組成。VH和VL區(qū)可進(jìn)一步再分為高變區(qū)，稱為互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)，CDR散布在被稱為構(gòu)架區(qū)(FR)的更加保守的區(qū)域中。每個VH和VL由三個CDR和四個FR組成，它們從氨基端至羧基端以如下順序排列FR1，CDR1，F(xiàn)R2，CDR2，F(xiàn)R3，CDR3，F(xiàn)R4。重鏈和輕鏈的可變區(qū)含有可與抗原相互作用的結(jié)合結(jié)構(gòu)域?？贵w的恒定區(qū)可以介導(dǎo)免疫球蛋白與宿主組織或因子的結(jié)合，該宿主組織或因子包括免疫系統(tǒng)的各種細(xì)胞(例如效應(yīng)細(xì)胞)和經(jīng)典補(bǔ)體系統(tǒng)的第一成分(C1q)。
如此處所用的，術(shù)語抗體的“抗原結(jié)合部分”(或簡稱為“抗體部分”)是指保留特異性結(jié)合抗原(例如CD30)的能力的抗體的一個或多個片段。已證明抗體的抗原結(jié)合功能可由全長抗體的片段來行使。術(shù)語抗體的“抗原結(jié)合部分”中所包括的結(jié)合片段的例子包括(i)Fab片段，即由VL、VH、CL和CH1結(jié)構(gòu)域組成的單價片段；(ii)F(ab’)2片段，即包含在鉸鏈區(qū)處通過二硫鍵連接的兩個Fab片段的雙價片段；(iii)由VH和CH1結(jié)構(gòu)域組成的Fd片段；(iv)由抗體單臂的VL和VH結(jié)構(gòu)域組成的Fv片段；(v)由VH結(jié)構(gòu)域組成的dAb片段(Ward等(1989)Nature 341544-546)；和(vi)分離的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)。此外，盡管Fv片段的兩個結(jié)構(gòu)域VL和VH由單獨(dú)的基因編碼，但是它們可以利用重組方法通過能夠使它們形成一條蛋白質(zhì)鏈的合成接頭連接在一起，其中VL和VH區(qū)配對構(gòu)成單價分子(稱為單鏈Fv(scFv)；參見，例如Bird等(1988)Science 242423-426；和Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 855879-5883)。這種單鏈抗體也包括在術(shù)語抗體的“抗原結(jié)合部分”內(nèi)。這些抗體片段用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的常規(guī)技術(shù)獲得，并用與完整抗體相同的方法對這些片段的實(shí)用性進(jìn)行篩選。
術(shù)語“表位”指能夠與抗體特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)決定簇。表位通常由化學(xué)活性的分子表面基團(tuán)組成，如氨基酸或糖側(cè)鏈，且通常具有特定的三維結(jié)構(gòu)特征以及特定的帶電特征。構(gòu)象和非構(gòu)象表位的區(qū)別在于存在變性溶劑時與前者的結(jié)合喪失，而與后者的結(jié)合不喪失。
如在此處所用的，術(shù)語“抑制結(jié)合”和“阻斷結(jié)合”指抑制/阻斷CD30配體與CD30的結(jié)合。抑制/阻斷可互換應(yīng)用，且包括部分和完全的抑制/阻斷。CD30的抑制/阻斷優(yōu)選地降低或改變當(dāng)不存在抑制或膽斷發(fā)生CD30結(jié)合時發(fā)生的活性的正常水平或類型，如抑制CD30誘導(dǎo)的增殖。抑制和阻斷也意欲包括與不接觸抗CD30抗體的CD30相比，當(dāng)接觸抗CD30抗體時CD30的結(jié)合親和力的任何可測量的降低，如對CD30與其受體的至少約10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、99％或100％的阻斷。
術(shù)語“雙特異性分子”意欲包括任何具有兩種不同的結(jié)合特異性的試劑，如蛋白質(zhì)、肽或蛋白質(zhì)或肽復(fù)合物。例如，該分子可以與(a)細(xì)胞表面抗原和(b)效應(yīng)細(xì)胞表面的Fc受體結(jié)合或相互作用。術(shù)語“多特異性分子”或“異特異性分子”意欲包括任何具有超過兩種不同的結(jié)合特異性的試劑，如蛋白質(zhì)、肽或蛋白質(zhì)或肽復(fù)合物。例如，該分子可以與(a)細(xì)胞表面抗原、(b)效應(yīng)細(xì)胞表面的Fc受體和(c)至少一種其他成分結(jié)合或相互作用。因此，本發(fā)明包括，但不局限于雙特異性、三特異性、四特異性和其他多特異性分子，該分子導(dǎo)向于細(xì)胞表面抗原如CD30，或?qū)蛴谄渌繕?biāo)，如效應(yīng)細(xì)胞上的Fc受體。
術(shù)語“雙特異性抗體”也包括二價雙抗體(diabodies)。二價雙抗體是二價的雙特異性抗體，其中VH和VL結(jié)構(gòu)域表達(dá)于單個多肽鏈上，但應(yīng)用的連接體太短以至于在相同的鏈上的兩個結(jié)構(gòu)域之間不能配對，從而使得結(jié)構(gòu)域與另一個鏈的互補(bǔ)性結(jié)構(gòu)域配對并生成2個抗原結(jié)合位點(diǎn)(參見如Holliger，P.，等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA906444-6448；Poljak，R.J.，等人(1994)Structure21121-1123)。如在此處所用的，術(shù)語“異種抗體”指兩種或多種抗體、抗體結(jié)合片段(如Fab)、其衍生物或連接在一起的抗原結(jié)合區(qū)，其至少兩個具有不同的特異性。這些不同的特異性包括對效應(yīng)細(xì)胞上Fc受體的結(jié)合特異性和對目標(biāo)細(xì)胞如腫瘤細(xì)胞上抗原或表位的結(jié)合特異性。
如在此處所用的，“異源抗體”是相對于產(chǎn)生該抗體的轉(zhuǎn)基因非人類生物進(jìn)行定義的。該術(shù)語指具有如下氨基酸序列或編碼性核酸序列的抗體，該氨基酸序列或編碼性核酸序列相應(yīng)于在不由轉(zhuǎn)基因非人類動物組成的生物中發(fā)現(xiàn)的序列，且通常來自除轉(zhuǎn)基因非人類動物之外的物種。
如在此處所用的，“異源雜交抗體”指其有不同生物來源的輕鏈和重鏈的抗體。例如，具有與鼠的輕鏈結(jié)合的人類重鏈的抗體是異源雜交抗體。異源雜交抗體的例子包括上述嵌合和人源化的抗體。
如在此處所用的，“糖基化模式”定義為共價附著于蛋白質(zhì)，更具體地為免疫球蛋白上的糖單位的模式。異源抗體的糖基化模式特征在于基本與由非人類轉(zhuǎn)基因動物種產(chǎn)生的抗體上天然存在的糖基化模式相似，此時，本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到異源抗體的糖基化模式與轉(zhuǎn)基因的CH基因源自的物種相比更加類似于非人類轉(zhuǎn)基因動物中的該糖基化模式。
如在此處所用的，應(yīng)用于一個主題的術(shù)語“天然存在的”指該主題可在自然中發(fā)現(xiàn)。例如，存在于生物(包括病毒)中的可從天然來源分離且未由人類在實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行有目的的修飾的多肽或多核苷酸序列是天然存在的。
如在此處所用的，術(shù)語“重排的”指一種重鏈和輕鏈免疫球蛋白基因座的構(gòu)型，其中在分別編碼基本完整的VH或VL結(jié)構(gòu)域的構(gòu)象中，V區(qū)段的位置緊緊接近D-J或J區(qū)段。重排的免疫球蛋白基因座可通過與種系DNA的比較進(jìn)行鑒定；重排的基因座具有至少一個重組的七聚體/九聚體同源性元件。
如在此處所用的，關(guān)于V區(qū)段的術(shù)語“未重排的”或“種系構(gòu)型”指其中V區(qū)段未進(jìn)行重組從而緊緊接近D或J區(qū)段的構(gòu)型。
抗CD30抗體抗CD30抗體是本領(lǐng)域公知的，例如5F11，HeFi-1，C10，M44，AC10，Ber-H2，HRS-1，HRS-3，HRS-4，Ki-1，Ki-2，Ki-3，Ki-4，Ki-5，Ki-6，Ki-7，IRac和M67。優(yōu)選地，在本發(fā)明方法中使用的抗體是嵌合、人源化或人抗體。在一個特定實(shí)施方案中，抗體是全人抗體。用于本發(fā)明方法的優(yōu)選抗體的特征在于抗體的特定功能特征或特性。例如，這些抗體以高親和力與人CD30特異性結(jié)合，優(yōu)選地表現(xiàn)出以下一種或多種特性(a)與CD30的結(jié)合親和力的親和常數(shù)為至少約107M-1，優(yōu)選約108M-1，更優(yōu)選約109M-1至1010M-1或更高；b)與CD30的結(jié)合常數(shù)(Kassoc)至少約為103，更優(yōu)選約104，最優(yōu)選約105M-1S-1；c)與CD30的解離常數(shù)(Kdis)約為10-3s-1，優(yōu)選約10-4s-1，更優(yōu)選約10-5s-1，最優(yōu)選10-6s-1；d)調(diào)理表達(dá)CD30的細(xì)胞的能力；e)在人效應(yīng)細(xì)胞存在下，在約10μg/ml或更低(例如在體外)濃度時，抑制表達(dá)CD30的細(xì)胞(例如腫瘤細(xì)胞)的生長和/或介導(dǎo)其吞噬作用和殺傷的能力；或f)通過部分或完全阻斷CD30配體與CD30的結(jié)合(CD30配體的例子包括CD153，TRAF1，TRAF2，TRAF3和TRAF5)而與CD30結(jié)合和抑制CD30功能(例如CD30介導(dǎo)的效應(yīng))的能力。
優(yōu)選地，該抗體以5×10-9M或更低的KD與人CD30結(jié)合，以4×10-9M或更低的KD與人CD30結(jié)合，以3.5×10-9M或更低的KD與人CD30結(jié)合，以3×10-9M或更低的KD與人CD30結(jié)合，或以2.8×10-9M或更低的KD與人CD30結(jié)合。
評價抗體對CD30的結(jié)合能力的標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)在本領(lǐng)域中是公知的，包括，例如ELISA、Western印跡分析和RIA。合適的試驗(yàn)在實(shí)施例中詳細(xì)描述。抗體的結(jié)合動力學(xué)(例如結(jié)合親和力)也可以通過本領(lǐng)域公知的標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)如Biacore分析來評價。
單克隆抗體17G1、2H9和5F11用于本發(fā)明的優(yōu)選抗體包括人單克隆抗體17G1、2H9和5F11，它們在公開號為2004/0006215的美國專利申請中表征和描述，該申請?jiān)诖巳囊米鳛閰⒖肌?7G1、2H9和5F11的VH氨基酸序列分別在SEQ ID NO2、6和10中示出。17G1、2H9和5F11的VL氨基酸序列分別在SEQ ID NO4、8和12中示出。
假定這些抗體中的每一個都能夠與CD30結(jié)合，則VH和VL序列可以“混合并匹配”，產(chǎn)生供本發(fā)明方法使用的其他的抗-CD30結(jié)合分子。CD30與這些“混合并匹配的”抗體的結(jié)合可以用上文及實(shí)施例中所述的結(jié)合試驗(yàn)(例如ELISA)檢測。優(yōu)選地，當(dāng)VH和VL鏈混合并匹配時，來自特定VH/VL配對的VH序列被替換為結(jié)構(gòu)上相似的VH序列。同樣，優(yōu)選地，來自特定VH/VL配對的VL序列被替換為結(jié)構(gòu)上相似的VL序列。
因此，在一個方面，本發(fā)明的方法可以使用一種單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包括(a)包含選自SEQ ID NO2、6和10的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和(b)包含選自SEQ ID NO4、8和12的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；其中該抗體特異性結(jié)合CD30，優(yōu)選人CD30。
優(yōu)選的重鏈和輕鏈組合包括(a)包含SEQ ID NO2的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和(b)包含SEQ ID NO4的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；或(b)包含SEQ ID NO6的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和(b)包含SEQ ID NO8的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；或(c)包含SEQ ID NO10的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和(b)包含SEQ ID NO12的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。
在另一方面，本發(fā)明的方法中可以使用包含17G1、2H9和5F11的重鏈和輕鏈CDR1、CDR2和CDR3或其組合的抗體。17G1、2H9和5F11的VHCDR1的氨基酸序列示于SEQ ID NO16、28和40中。17G1、2H9和5F11的VHCDR2的氨基酸序列示于SEQ IDNO17、29和41中。17G1、2H9和5F11的VHCDR3的氨基酸序列示于SEQ ID NO18、30和42中。17G1、2H9和5F11的VKCDR1的氨基酸序列示于SEQ ID NO22、34和46中。17G1、2H9和5F11的VKCDR2的氨基酸序列示于SEQ ID NO23、35和47中。17G1、2H9和5F11的VKCDR3的氨基酸序列示于SEQ IDNO24、36和48中。CDR區(qū)用Kabat系統(tǒng)(Kabat，E.A.等(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interesr，第五版，U.S.Department of Health and Human Services，NIH出版號91-3242)勾畫出。
假如這些抗體均能與CD30結(jié)合，并且抗原結(jié)合特異性主要是由CDR1、CDR2和CDR3區(qū)提供的，則VHCDR1、CDR2和CDR3序列與VKCDR1、CDR2和CDR3序列可以“混合并匹配”(即來自不同抗體的CDR可以混合并匹配，但是每個抗體必須含有VHCDR1、CDR2和CDR3和VKCDR1、CDR2和CDR3)，產(chǎn)生本發(fā)明中使用的其他的抗-CD30結(jié)合分子。CD30與這些“混合并匹配的”抗體的結(jié)合可以用上文及實(shí)施例中所述的結(jié)合試驗(yàn)(例如ELISA，Biacore分析)檢測。優(yōu)選地，當(dāng)VHCDR序列混合并匹配時，來自特定VH序列的CDR1、CDR2和/或CDR3序列被替換為結(jié)構(gòu)上相似的CDR序列。同樣，當(dāng)VKCDR序列混合并匹配時，來自特定VK序列的CDR1、CDR2和/或CDR3序列優(yōu)選地被替換為結(jié)構(gòu)上相似的CDR序列。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言顯而易見的是，通過將一個或多個VH和/或VLCDR區(qū)序列替換為來自此處公開的單克隆抗體17G1、2H9和5F11的CDR序列的結(jié)構(gòu)上相似的序列，可以產(chǎn)生新的VH和VL序列。
因此，在另一個方面，本發(fā)明提供一種分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包括(a)包含選自SEQ ID NO16、28和40的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)CDR1；(b)包含選自SEQ ID NO17、29和41的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)CDR2；(c)包含選自SEQ ID NO18、30和42的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)CDR3；(d)包含選自SEQ ID NO22、34和46的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)CDR1；(e)包含選自SEQ ID NO23、35和47的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)CDR2；和(f)包含選自SEQ ID NO24、36和48的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)CDR3；其中該抗體特異性結(jié)合CD30，優(yōu)選人CD30。
在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，該抗體包括(a)包含SEQ ID NO16的重鏈可變區(qū)CDR1；(b)包含SEQ ID NO17的重鏈可變區(qū)CDR2；(c)包含SEQ ID NO18的重鏈可變區(qū)CDR3；(d)包含SEQ ID NO22的輕鏈可變區(qū)CDR1；(e)包含SEQ ID NO23的輕鏈可變區(qū)CDR2；和(f)包含SEQ ID NO24的輕鏈可變區(qū)CDR3。
在另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，該抗體包括(a)包含SEQ ID NO28的重鏈可變區(qū)CDR1；(b)包含SEQ ID NO29的重鏈可變區(qū)CDR2；(c)包含SEQ ID NO30的重鏈可變區(qū)CDR3；(d)包含SEQ ID NO34的輕鏈可變區(qū)CDR1；(e)包含SEQ ID NO35的輕鏈可變區(qū)CDR2；和(f)包含SEQ ID NO36的輕鏈可變區(qū)CDR3。
在另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，該抗體包括(a)包含SEQ ID NO40的重鏈可變區(qū)CDR1；(b)包含SEQ ID NO41的重鏈可變區(qū)CDR2；(c)包含SEQ ID NO42的重鏈可變區(qū)CDR3；(d)包含SEQ ID NO46的輕鏈可變區(qū)CDR1；(e)包含SEQ ID NO47的輕鏈可變區(qū)CDR2；和(f)包含SEQ ID NO48的輕鏈可變區(qū)CDR3。
具有特定種系序列的抗體的用途在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明方法中使用的抗體包含來自特定種系重鏈免疫球蛋白基因的重鏈可變區(qū)和/或來自特定種系輕鏈免疫球蛋白基因的輕鏈可變區(qū)。
例如，在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，包含產(chǎn)自或源自人VH4-34或人VH3-11基因的重鏈可變區(qū)，其中該抗體特異性結(jié)合CD30。在另外的優(yōu)選實(shí)施方案中，單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，包含產(chǎn)自或源自人VKL15基因、人VKA27基因或人VKL6基因的輕鏈可變區(qū)，其中該抗體特異性結(jié)合CD30。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其中該抗體(a)包含產(chǎn)自或源自人VH4-34或3-11基因(該基因分別編碼SEQ ID NO49和51所示的氨基酸序列)的重鏈可變區(qū)；(b)包含產(chǎn)自或源自人VKL15或VKA27或VKL6基因(該基因分別編碼SEQ ID NO50、52和53所示的氨基酸序列)的輕鏈可變區(qū)；且(c)特異性結(jié)合CD30，優(yōu)選人CD30。
分別具有VH4-34和VKL15的VH和VK的抗體的一個例子是5F11。分別具有VH3-11和VkA27的VH和VK的抗體的一個例子是2H9。
如此處所用的，如果一種人抗體的可變區(qū)是從使用人種系免疫球蛋白基因的系統(tǒng)中獲得的，則該抗體包含“產(chǎn)自”或“源自”特定種系序列的重鏈或輕鏈可變區(qū)。這樣的系統(tǒng)包括用目標(biāo)抗原免疫攜帶人免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因小鼠，或者用目標(biāo)抗原篩查展示在噬菌體上的人免疫球蛋白基因文庫?！爱a(chǎn)自”或“源自”人種系免疫球蛋白序列的人抗體可以這樣鑒定將該人抗體的氨基酸序列與人種系免疫球蛋白的氨基酸序列進(jìn)行比較，選擇在序列上最接近于該人抗體序列(即有最高％同一性)的人種系免疫球蛋白序列。“產(chǎn)自”或“源自”特定人種系免疫球蛋白序列的人抗體與該種系序列相比可能包含氨基酸差異，例如由于天然發(fā)生的體細(xì)胞突變或定點(diǎn)突變的有意引入而導(dǎo)致的。但是，選擇的人抗體在氨基酸序列上與人種系免疫球蛋白基因編碼的氨基酸序列一般至少90％相同，并且含有當(dāng)與其他物種的種系免疫球蛋白氨基酸序列(例如鼠種系序列)相比較時確認(rèn)該人抗體屬于人類抗體的氨基酸殘基。在某些情況下，人抗體在氨基酸序列上與該種系免疫球蛋白基因編碼的氨基酸序列可以至少95％、或者甚至至少96％、97％、98％或99％相同。一般來說，源自特定人種系序列的人抗體表現(xiàn)與該人種系免疫球蛋白基因編碼的氨基酸序列有不超過10個氨基酸的差異。在某些情況下，該人抗體可能表現(xiàn)與該種系免疫球蛋白基因編碼的氨基酸序列有不超過5個、或者甚至不超過4、3、2或1個氨基酸的差異。
同源抗體在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明中有用的抗體包含的重鏈和輕鏈可變區(qū)含有與此處所述優(yōu)選抗體的氨基酸序列同源的氨基酸序列，并且其中該抗體保留了優(yōu)選的抗-CD30抗體的需要的功能特性。
例如，在本發(fā)明的方法中有用的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，其中(a)重鏈可變區(qū)包含與選自SEQ ID NO2、6和10的氨基酸序列至少80％同源的氨基酸序列；
(b)輕鏈可變區(qū)包含與選自SEQ ID NO4、8和12的氨基酸序列至少80％同源的氨基酸序列；(c)該抗體以1×10-8M或更低的KD與人CD30結(jié)合；(d)該抗體與CD30的結(jié)合常數(shù)(Kassoc)至少約為103，更優(yōu)選約104，最優(yōu)選約105M-1S-1；(e)該抗體與CD30的解離常數(shù)(Kdis)約為10-3s-1，優(yōu)選約10-4s-1，更優(yōu)選10-5s-1，最優(yōu)選10-6s-1；(f)該抗體具有調(diào)理表達(dá)CD30的細(xì)胞的能力；(g)該抗體具有在人效應(yīng)細(xì)胞存在下，在約10μg/ml或更低(例如在體外)濃度時，抑制表達(dá)CD30的細(xì)胞(例如腫瘤細(xì)胞)的生長和/或介導(dǎo)其吞噬作用和殺傷的能力；或h)該抗體具有通過部分或完全阻斷CD30配體與CD30的結(jié)合(CD30配體的例子包括CD153、TRAF1、TRAF2、TRAF3和TRAF5)而結(jié)合CD30和抑制CD30功能(例如CD30介導(dǎo)的效應(yīng))的能力。
在各種實(shí)施方案中，該抗體可以是，例如人抗體、人源化抗體或嵌合抗體。
在另外一些實(shí)施方案中，VH和/或VL氨基酸序列可以與上述序列85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同源。具有與上述序列的VH和VL區(qū)高度(即80％或更高)同源的VH和VL區(qū)的抗體可以如下獲得誘變(例如定點(diǎn)誘變或PCR介導(dǎo)的誘變)編碼SEQ IDNO1、3、5、7、9和11的核酸分子，然后用此處所述的功能試驗(yàn)檢測編碼的被改變抗體的保留的功能(即以上(c)和(d)所述的功能)。
如此處所用的，兩個氨基酸序列之間的百分同源性等同于兩個序列之間的百分同一性。考慮為了兩個序列之間進(jìn)行最佳比對所需要引入的空位的數(shù)目和每個空位的長度后，兩個序列之間的百分同一性是這兩個序列共有的相同位點(diǎn)的數(shù)目的函數(shù)(即％同源性＝相同位點(diǎn)的數(shù)目/位點(diǎn)的總數(shù)×100)。兩個序列之間的序列比較和百分同一性的確定可以如下面的非限制性實(shí)施例中所述用數(shù)學(xué)算法實(shí)現(xiàn)。
兩個氨基酸序列之間的百分同一性可以用已經(jīng)整合入ALIGN程序(2.0版本)中的E.Meyers和W.Miller(Comput.Appl.Biosci.，411-17(1988))的算法來確定，其使用PAM 120權(quán)重殘基表，12的空位長度罰分，4的空位罰分。另外，兩個氨基酸序列之間的百分同一性也可以用已經(jīng)整合入GCG軟件包(可從http//www.gcg.com獲得)的GAP程序中的Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.48444-453(1970))的算法來確定，其使用Blossum 62矩陣或PAM250矩陣，16、14、12、10、8、6或4的空位權(quán)重，和1、2、3、4、5或6的長度權(quán)重。
另外，或者，本發(fā)明的蛋白質(zhì)序列可以進(jìn)一步用作“查詢序列”來對公共數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，例如用來鑒定相關(guān)序列。這種檢索可以用Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215403-10的XBLAST程序(2.0版本)進(jìn)行。BLAST蛋白質(zhì)檢索可以用XBLAST程序進(jìn)行，得分＝50，字長＝3，以獲得與本發(fā)明的抗體分子同源的氨基酸序列。為了獲得用于比較目的的空位比對，可以采用如Altschul等(1997)Nucleic AcidsRes.25(17)3389-3402所述的空位BLAST。當(dāng)采用BLAST和空位BLAST程序時，可以使用各自程序(例如XBLAST和NBLAST)的缺省參數(shù)。參見http//www.ncbi.nlm.nih.gov。
具有保守修飾的抗體在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包括含CDR1、CDR2和CDR3序列的重鏈可變區(qū)和含CDR1、CDR2和CDR3序列的輕鏈可變區(qū)，其中這些CDR序列中的一個或多個包含基于本文所述優(yōu)選抗體(例如17G1、2H9或5F11)的特定氨基酸序列或其保守修飾，并且其中該抗體保留本發(fā)明抗-CD30抗體的需要的功能特性。因此，本發(fā)明提供一種分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包括含CDR1、CDR2和CDR3序列的重鏈可變區(qū)和含CDR1、CDR2和CDR3序列的輕鏈可變區(qū)，其中
(a)重鏈可變區(qū)CDR3序列包含選自SEQ ID NO18、30和42的氨基酸序列及其保守修飾的氨基酸序列，(b)輕鏈可變區(qū)CDR3序列包含選自SEQ ID NO24、36和48的氨基酸序列及其保守修飾的氨基酸序列，(c)該抗體以1×10-8M或更低的KD與人CD30結(jié)合；(d)該抗體與CD30的結(jié)合常數(shù)(Kassoc)至少約為103，更優(yōu)選約104，最優(yōu)選約105M-1S-1；(e)該抗體與CD30的解離常數(shù)(Kdis)約為10-3s-1，優(yōu)選約10-4s-1，更優(yōu)選10-5s-1，最優(yōu)選10-6s-1；(f)該抗體具有調(diào)理表達(dá)CD30的細(xì)胞的能力；(g)該抗體具有在人效應(yīng)細(xì)胞存在下，在約10μg/ml或更低(例如在體外)濃度時，抑制表達(dá)CD30的細(xì)胞(例如腫瘤細(xì)胞)的生長和/或介導(dǎo)其吞噬作用和殺傷的能力；或h)該抗體具有通過部分或完全阻斷CD30配體與CD30的結(jié)合(CD30配體的例子包括CD153、TRAF1、TRAF2、TRAF3和TRAF5)而結(jié)合CD30和抑制CD30功能(例如CD30介導(dǎo)的效應(yīng))的能力。
在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，重鏈可變區(qū)CDR2序列包含選自SEQID NO17、29和41的氨基酸序列和其保守修飾的氨基酸序列；且輕鏈可變區(qū)CDR2序列包含選自SEQ ID NO23、25和47的氨基酸序列和其保守修飾的氨基酸序列。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，重鏈可變區(qū)CDR1序列包含選自SEQ ID NO16、28和40的氨基酸序列和其保守修飾的氨基酸序列；且輕鏈可變區(qū)CDR1序列包含選自SEQ IDNO22、34和46的氨基酸序列和其保守修飾的氨基酸序列。
在各種實(shí)施方案中，該抗體可以是，例如人抗體、人源化抗體或嵌合抗體。
如此處所用的，術(shù)語“保守序列修飾”是指不會顯著影響或改變含該氨基酸序列的抗體的結(jié)合特性的氨基酸修飾。這樣的保守修飾包括氨基酸置換、添加和缺失?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域公知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，如定點(diǎn)誘變和PCR介導(dǎo)的誘變，向本發(fā)明抗體中引入修飾。保守氨基酸置換是將氨基酸殘基替換為具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基。具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基的家族在本領(lǐng)域中已經(jīng)定義。這些家族包括具有堿性側(cè)鏈(例如賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、酸性側(cè)鏈(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不帶電荷極性側(cè)鏈(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非極性側(cè)鏈(例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β-分支側(cè)鏈(例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和芳族側(cè)鏈(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)的氨基酸。因此，本發(fā)明抗體的CDR區(qū)內(nèi)的一個或多個氨基酸殘基可以被置換為來自相同側(cè)鏈家族的其他氨基酸殘基，并且可以用此處所述的功能試驗(yàn)檢測改變的抗體保留的功能(即以上(c)至(j)所述的功能)。
與本發(fā)明的抗-CD30抗體結(jié)合相同表位的抗體除了此處所述的抗體以外，本發(fā)明的方法可以使用與此處所述的任一CD30單克隆抗體結(jié)合相同簇(A、B或C)或更優(yōu)選相同表位的抗體(即能夠與本發(fā)明的任一單克隆抗體交叉競爭結(jié)合CD30的抗體，例如17G1、2H9和5F11)。這些交叉競爭抗體可以根據(jù)它們在標(biāo)準(zhǔn)CD30結(jié)合測定中與17G1、2H9和5F11交叉競爭的能力來鑒定。例如，可以利用BIAcore分析、ELISA測定或流式細(xì)胞分析來證明與本發(fā)明抗體的交叉競爭。受試抗體抑制例如17G1、2H9或5F11與人CD30結(jié)合的能力證明，該受試抗體可以與該抗體競爭結(jié)合人CD30，因此與該抗體結(jié)合人CD30上相同的表位。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，與17G1、2H9或5F11結(jié)合人CD30上相同表位的抗體是人單克隆抗體，該人單克隆抗體可以使用本領(lǐng)域公知的方法如此處所述制備和分離。
工程化(engineered)和修飾的抗體本發(fā)明中使用的抗體還可以如下制備用此處所公開的抗體的一種或多種VH和/或VL序列作為起始材料，工程化一種修飾的抗體，該修飾的抗體可能具有與此處公開的起始抗體相比改變的特性?？梢酝ㄟ^修飾一個或兩個可變區(qū)(即VH和/或VL)例如一個或多個CDR區(qū)內(nèi)和/或一個或多個構(gòu)架區(qū)內(nèi)的一個或多個殘基來工程化抗體。另外，或者，可以通過修飾恒定區(qū)內(nèi)的殘基來工程化抗體，例如改變該抗體的效應(yīng)功能。
可以進(jìn)行的一種類型的可變區(qū)工程化是CDR移植?？贵w主要是通過位于六個重鏈和輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)中的氨基酸殘基與靶抗原相互作用。由于這個原因，CDR內(nèi)的氨基酸序列比CDR外的序列在各個抗體之間更加多樣化。由于CDR序列負(fù)責(zé)大多數(shù)抗體-抗原相互作用，因此通過構(gòu)建如下的表達(dá)載體能夠表達(dá)模擬特定天然存在抗體的特性的重組抗體該表達(dá)載體包含來自特定天然存在抗體的CDR序列，該CDR序列被移植到來自具有不同特性的不同抗體的構(gòu)架序列上(參見，例如，Riechmann，L.等(1998)Nature 332323-327；Jones，P.等(1986)Nature 321522-525；Queen，C.等(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.8610029-10033；Winter的美國專利5,225,539，和Queen等人的美國專利5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370)。
因此，本發(fā)明的另一個實(shí)施方案涉及一種分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包括含17G1、2H9或5F11的CDR1、CDR2和CDR3序列的重鏈可變區(qū)，但是含有構(gòu)架序列的修飾。因此，這些抗體含有單克隆抗體17G1、2H9或5F11的VH和VLCDR序列，但是可能含有與這些抗體不同的構(gòu)架序列。
這些構(gòu)架序列可以從包括種系抗體基因序列的公共DNA數(shù)據(jù)庫或發(fā)表的參考文獻(xiàn)中獲得。例如，人重鏈和輕鏈可變區(qū)基因的種系DNA序列可以在以下資源中發(fā)現(xiàn)“VBase”人種系序列數(shù)據(jù)庫(可從因特網(wǎng)上www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase獲得)，以及Kabat，E.A.等(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，U.S.Department of Health and Human Services，NIH出版號91-3242；Tomlinson，I.M.等(1992)“The Repertoire of Human Germline VHSequences Reveals about Fifty Groups of VH Segments with DifferentHypervariable Loops”J.Mol.Biol.227776-798；和Cox，J.P.L.等(1994)“A Directory of Human Germ-line VHSegments Reveals aStrong Bias in their Usage”Eur.J.Immunol.24827-836；其內(nèi)容均在此引用作為參考。
用于本發(fā)明抗體的優(yōu)選構(gòu)架序列在結(jié)構(gòu)上類似于所選擇的本發(fā)明抗體使用的構(gòu)架序列，例如，類似于本發(fā)明使用的優(yōu)選單克隆抗體使用的VH4-34構(gòu)架序列(SEQ ID NO49)和/或VH3-11構(gòu)架序列(SEQID NO51)和/或VKI15構(gòu)架序列(SEQ ID NO50)和/或VKA27構(gòu)架序列(SEQ ID NO52)和/或VKL6構(gòu)架序列(SEQ ID NO53)。VHCDR1、CDR2和CDR3序列和VKCDR1、CDR2和CDR3序列可以被移植到與該構(gòu)架序列的來源種系免疫球蛋白基因具有相同序列的構(gòu)架區(qū)上，或者CDR序列可以被移植到與該種系序列相比含有一個或多個突變的構(gòu)架區(qū)上。例如，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在某些情況中，將構(gòu)架區(qū)內(nèi)的殘基進(jìn)行突變對于保持或增強(qiáng)抗體的抗原結(jié)合能力是有利的(參見，例如，Queen等的美國專利5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370)。
另一種類型的可變區(qū)修飾是突變VH和/或VKCDR1、CDR2和/或CDR3區(qū)內(nèi)的氨基酸殘基，從而改善目標(biāo)抗體的一種或多種結(jié)合特性(例如親和力)?？梢赃M(jìn)行定點(diǎn)誘變或PCR介導(dǎo)的誘變，以引入突變，對抗體結(jié)合的影響，或者其他目標(biāo)功能特性，可以用此處所述和實(shí)施例中提供的體外或體內(nèi)試驗(yàn)來評價。優(yōu)選地引入(如上文所述的)保守修飾。這些突變可以是氨基酸置換、添加或缺失，但是優(yōu)選置換。而且，一般改變CDR區(qū)內(nèi)的不超過1、2、3、4或5個殘基。
因此，在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供分離的抗-CD30單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含的重鏈可變區(qū)含有(a)VHCDR1區(qū)，其包含選自SEQ ID NO16、28和40的氨基酸序列，或與SEQID NO16、28和40相比具有1、2、3、4或5個氨基酸置換、缺失或添加的氨基酸序列；(b)VHCDR2區(qū)，其包含選自SEQ ID NO17、29和41的氨基酸序列，或與SEQ ID NO17、29和41相比具有1、2、3、4或5個氨基酸置換、缺失或添加的氨基酸序列；(c)VHCDR3區(qū)，其包含選自SEQ ID NO18、30和42的氨基酸序列，或與SEQ ID NO18、30和42相比具有1、2、3、4或5個氨基酸置換、缺失或添加的氨基酸序列；(d)VKCDR1區(qū)，其包含選自SEQID NO22、34和46的氨基酸序列，或與SEQ ID NO22、34和46相比具有1、2、3、4或5個氨基酸置換、缺失或添加的氨基酸序列；(e)VKCDR2區(qū)，其包含選自SEQ ID NO23、35和47的氨基酸序列，或與SEQ ID NO23、35和47相比具有1、2、3、4或5個氨基酸置換、缺失或添加的氨基酸序列；和(f)VKCDR3區(qū)，其包含選自SEQ ID NO24、36和48的氨基酸序列，或與SEQ IDNO24、36和48相比具有1、2、3、4或5個氨基酸置換、缺失或添加的氨基酸序列。
本發(fā)明的工程化抗體包括例如為了改善抗體特性而對其VH和/或VK內(nèi)的構(gòu)架殘基進(jìn)行了修飾的抗體。進(jìn)行這樣的構(gòu)架修飾一般是為了降低抗體的免疫原性。例如，一種已知的方法是將一個或多個構(gòu)架殘基“回復(fù)突變”為相應(yīng)的種系序列。更特別地，經(jīng)歷體細(xì)胞突變的抗體可含有與衍生該抗體的種系序列不同的構(gòu)架殘基。通過比較抗體構(gòu)架序列與衍生該抗體的種系序列，可以鑒定這些殘基。
另一種類型的構(gòu)架修飾涉及對構(gòu)架區(qū)內(nèi)、或者甚至一個或多個CDR區(qū)內(nèi)的一個或多個殘基進(jìn)行突變，以除去T細(xì)胞表位，從而降低該抗體的潛在的免疫原性。該方法也被稱為“脫免疫”，在Carr等人的公布號為20030153043的美國專利中詳細(xì)記載。
除了在構(gòu)架區(qū)或CDR區(qū)內(nèi)進(jìn)行的修飾以外，或者作為它的替代方案，也可以將本發(fā)明的抗體工程化為在Fc區(qū)內(nèi)包括修飾，一般是為了改變該抗體的一種或多種功能特性，如血清半衰期、補(bǔ)體固定、Fc受體結(jié)合和/或抗原依賴性細(xì)胞毒性。此外，也可以將本發(fā)明的抗體化學(xué)修飾(例如一個或多個化學(xué)部分可以連接到該抗體上)，或者修飾改變其糖基化，以改變該抗體的一種或多種功能特性。這些實(shí)施方案均在下文詳細(xì)描述。Fc區(qū)中殘基的編號是Kabat的EU指數(shù)的編號。
在一個實(shí)施方案中，修飾CH1的鉸鏈區(qū)，使該鉸鏈區(qū)中半胱氨酸殘基的數(shù)目改變，例如增加或減少。該方法在Bodmer等人的美國專利No.5,677,425號中詳細(xì)記載。改變CH1鉸鏈區(qū)中半胱氨酸的數(shù)目是為了，例如，促進(jìn)輕鏈和重鏈的裝配，或提高或降低抗體的穩(wěn)定性。
在另一實(shí)施方案中，對抗體的Fc鉸鏈區(qū)進(jìn)行突變，以降低該抗體的生物半衰期。更特別地，向Fc-鉸鏈片段的CH2-CH3結(jié)構(gòu)域界面區(qū)引入一個或多個氨基酸突變，使得該抗體與葡萄球菌蛋白A(SpA)的結(jié)合比天然Fc-鉸鏈結(jié)構(gòu)域與SpA的結(jié)合減弱。該方法在Ward等人的美國專利No.6,165,745號中詳細(xì)記載。
在另一實(shí)施方案中，修飾抗體以提高其生物半衰期。可以使用各種方法。例如，可以引入一個或多個如下突變T252L、T254S、T256F，如Ward的美國專利No.6,277,375所述?；蛘撸瑸榱颂岣呱锇胨テ?，可以在CH1或CL區(qū)內(nèi)改變該抗體，使之含有來自IgGFc區(qū)CH2結(jié)構(gòu)域的兩個環(huán)的補(bǔ)救受體結(jié)合表位，如Presta等人的美國專利No.5,869,046和6,121,022所述。
在其他一些實(shí)施方案中，通過將至少一個氨基酸殘基置換為不同的氨基酸殘基來改變Fc區(qū)，以改變抗體的效應(yīng)功能。例如，可以將選自氨基酸殘基234、235、236、237、297、318、320、322的一個或多個氨基酸置換為不同的氨基酸殘基，使得該抗體對效應(yīng)配體的親和力改變，但是保留親本抗體的抗原結(jié)合能力。其親和力被改變的效應(yīng)配體可以是，例如，F(xiàn)c受體或補(bǔ)體的C1成分。該方法在Winter等人的美國專利No.5,624,821和5,648,260中更詳細(xì)地描述。
在另外一個實(shí)施例中，可以將選自氨基酸殘基329、331和322的一個或多個氨基酸置換為不同的氨基酸殘基，使得該抗體的C1q結(jié)合改變和/或補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)降低或消除。該方法在Idusogie等人的美國專利No.6,194,551中更詳細(xì)地描述。
在另外一個實(shí)施例中，改變氨基酸位點(diǎn)231和239中的一個或多個氨基酸殘基，從而改變該抗體固定補(bǔ)體的能力。該方法在Bodmer等人的PCT公布WO 94/29351中進(jìn)一步描述。
在另外一個實(shí)施例中，為了提高抗體介導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)的能力和/或提高抗體對Fcγ受體的親和力，通過在下列位點(diǎn)處修飾一個或多個氨基酸來修飾Fc區(qū)238，239，248，249，252，254，255，256，258，265，267，268，269，270，272，276，278，280，283，285，286，289，290，292，293，294，295，296，298，301，303，305，307，309，312，315，320，322，324，326，327，329，330，331，333，334，335，337，338，340，360，373，376，378，382，388，389，398，414，416，419，430，434，435，437，438或439。該方法在Presta的PCT公布WO00/42072中進(jìn)一步描述。而且，人IgG1上對于FcγRI、FcγRII、FcγRIII和FcRn的結(jié)合位點(diǎn)已經(jīng)作圖，并且已經(jīng)描述了具有改善的結(jié)合的變體(參見，Shields，R.L.等(2001)J.Biol.Chem.2766591-6604)。位點(diǎn)256、290、298、333、334和339處的特定突變顯示改善了與FcγRIII的結(jié)合。另外，下列組合突變體顯示改善了與FcγRIII的結(jié)合T256A/S298A，S298A/E333A，S298A/K224A和S298A/E333A/K334A。
在另一實(shí)施方案中，改變抗體的糖基化。例如，可以制備無糖基化的抗體(即該抗體缺乏糖基化)。例如，為了提高抗體對抗原的親和力，可以改變糖基化。這樣的碳水化合物修飾可以通過例如改變抗體序列內(nèi)的一個或多個糖基化位點(diǎn)來實(shí)現(xiàn)。例如，可以進(jìn)行一個或多個氨基酸置換，使一個或多個可變區(qū)構(gòu)架糖基化位點(diǎn)消失，從而消除該位點(diǎn)處的糖基化。這種無糖基化可以提高抗體對抗原的親和力。這種方法在Co等人的美國專利No.5,714,350和6,350,861中更詳細(xì)地描述。
另外，或者，可以制備糖基化類型改變的抗體，如巖藻糖基殘基數(shù)目減少的低巖藻糖基化抗體，或等分GlcNac結(jié)構(gòu)增多的抗體。已經(jīng)證明這種改變的糖基化模式提高了抗體的ADCC能力。這種碳水化合物修飾可以通過例如在糖基化機(jī)制改變的宿主細(xì)胞中表達(dá)抗體來實(shí)現(xiàn)。糖基化機(jī)制改變的細(xì)胞在本領(lǐng)域中已有描述，能夠用作宿主細(xì)胞在其中表達(dá)本發(fā)明的重組抗體，從而產(chǎn)生糖基化改變的抗體。例如，Hanai等的EP 1,176,195描述了具有功能破壞的FUT8基因的細(xì)胞系，該基因編碼巖藻糖轉(zhuǎn)移酶，因此這種細(xì)胞系中表達(dá)的抗體表現(xiàn)為低巖藻糖基化。Presta的PCT公布WO 03/035835記載了一種變異CHO細(xì)胞系，Lec13細(xì)胞，其將巖藻糖連接到Asn(297)-連接的碳水化合物上的能力降低，也導(dǎo)致在該宿主細(xì)胞中表達(dá)的抗體為低巖藻糖基化(參見，Shields，R.L.等(2001)J.Biol.Chem.27726733-26740)。Umana等人的PCT公布WO 99/54342記載了表達(dá)糖蛋白修飾的糖基轉(zhuǎn)移酶(例如β(1，4)-N-乙酰葡糖氨基轉(zhuǎn)移酶III(GnTIII))的工程化細(xì)胞系，因此該工程化細(xì)胞系中表達(dá)的抗體表現(xiàn)為等分GlcNac結(jié)構(gòu)增加，導(dǎo)致抗體的ADCC活性提高(參見，Umana等(1999)Nat.Biotech.17176-180)。
本發(fā)明方法中可以使用的抗體可以進(jìn)行的另一種修飾包括PEG化。例如，為了提高抗體的生物(例如血清)半衰期，可以將該抗體PEG化。為了PEG化一種抗體，一般在一個或多個PEG基團(tuán)與抗體或抗體片段連接的條件下，將該抗體或其片段與聚乙二醇(PEG)如PEG的反應(yīng)性酯或醛衍生物反應(yīng)。優(yōu)選地，通過與反應(yīng)性PEG分子(或類似的反應(yīng)性水溶性聚合物)的?；磻?yīng)或烷基化反應(yīng)進(jìn)行PEG化。如此處所用的術(shù)語“聚乙二醇”意在包括用來衍生化其他蛋白質(zhì)的任何PEG形式，如單(C1-C10)烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇或聚乙二醇-馬來酰亞胺。在某些實(shí)施方案中，將要PEG化的抗體是一種無糖基化的抗體。將蛋白質(zhì)PEG化的方法在本領(lǐng)域中公知，并且可以用于本發(fā)明的抗體。參見，例如，Nishimura等人的EP 0 154 316和Ishikawa等人的EP 0 401 384。
將抗體進(jìn)行工程化的方法如上所述，能夠利用具有此處公開的VH和VK序列的抗-CD30抗體，通過修飾VH和/或VK序列或與之連接的恒定區(qū)，產(chǎn)生新的抗-CD30抗體。因此，在本發(fā)明的另一方面，利用本發(fā)明的抗-CD30抗體例如17G1、2H9或5F11的結(jié)構(gòu)特征，產(chǎn)生結(jié)構(gòu)上相關(guān)的抗-CD30抗體，該結(jié)構(gòu)上相關(guān)的抗體保留本發(fā)明抗體的至少一種功能特性，如與人CD30結(jié)合。如上所述，例如，17G1、2H9或5F11的一個或多個CDR區(qū)或其突變可以與已知的構(gòu)架區(qū)和/或其他CDR重組組合，從而產(chǎn)生另外的重組工程化的本發(fā)明的抗-CD30抗體。其他類型的修飾包括以上部分所述的修飾。用于工程化方法的起始材料是此處提供的一種或多種VH和/或VK序列，或其一個或多個CDR區(qū)。為了產(chǎn)生工程化抗體，不一定必須實(shí)際制備(即表達(dá)為蛋白質(zhì))具有此處提供的一種或多種VH和/或VK序列，或其一個或多個CDR區(qū)的抗體。而是用該序列中所含的信息作為起始材料，產(chǎn)生由原始序列衍生的“第二代”序列，然后制備該“第二代”序列，并將其表達(dá)為蛋白質(zhì)。
因此，在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種制備抗-CD30抗體的方法，包括(a)提供(i)重鏈可變區(qū)抗體序列，其包含選自SEQ ID NO16、28和40的CDR1序列、選自SEQ ID NO17、29和41的CDR2序列、和/或選自SEQ ID NO18、30和42的CDR3序列；和/或(ii)輕鏈可變區(qū)抗體序列，其包含選自SEQ ID NO22、34和46的CDR1序列、選自SEQ ID NO23、35和47的CDR2序列、和/或選自SEQ ID NO24、36和48的CDR3序列；(b)改變重鏈可變區(qū)抗體序列和/或輕鏈可變區(qū)抗體序列內(nèi)的至少一個氨基酸殘基，從而產(chǎn)生至少一個改變的抗體序列；和(c)將該改變的抗體序列表達(dá)為蛋白質(zhì)。
可以利用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)制備和表達(dá)所述改變的抗體序列。
優(yōu)選地，由改變的抗體序列編碼的抗體保留此處所述抗-CD30抗體的一種、一些或全部功能特性，該功能特性包括但不限于(a)以1×10-8M或更低的KD與人CD30結(jié)合；
(b)輕鏈可變區(qū)包含與選自SEQ ID NO4、8和12的氨基酸序列至少80％同源的氨基酸序列；(c)該抗體以1×10-8M或更低的KD與人CD30結(jié)合；(d)該抗體與CD30的結(jié)合常數(shù)(Kassoc)至少約為103，更優(yōu)選約104，最優(yōu)選約105M-1S-1；(e)該抗體與CD30的解離常數(shù)(Kdis)約為10-3s-1，優(yōu)選約10-4s-1，更優(yōu)選10-5s-1，最優(yōu)選10-6s-1；(f)該抗體具有調(diào)理表達(dá)CD30的細(xì)胞的能力；(g)該抗體具有在人效應(yīng)細(xì)胞存在下，在約10μg/ml或更低(例如在體外)濃度時，抑制表達(dá)CD30的細(xì)胞(例如腫瘤細(xì)胞)的生長和/或介導(dǎo)其吞噬作用和殺傷的能力；或h)該抗體具有通過部分或完全阻斷CD30配體與CD30的結(jié)合(CD30配體的例子包括CD153、TRAF1、TRAF2、TRAF3和TRAF5)而結(jié)合CD30和抑制CD30功能(例如CD30介導(dǎo)的效應(yīng))的能力。
改變的抗體的功能特性可以用本領(lǐng)域中使用的和/或此處所述的，如實(shí)施例中所述的標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)(例如流式細(xì)胞術(shù)、結(jié)合測定)來評價。
在工程化本發(fā)明抗體的方法的某些實(shí)施方案中，可以沿全部或部分抗-CD30抗體編碼序列隨機(jī)或選擇性引入突變，并可以針對結(jié)合活性和/或如此處所述的其他功能特性，篩選獲得的修飾的抗-CD30抗體。突變方法在本領(lǐng)域中已經(jīng)描述。例如，Short的PCT公布WO02/092780記載了利用飽和誘變、合成連接裝配或它們的組合產(chǎn)生和篩選抗體突變的方法。另外，Lazar等人的PCT公布WO 03/074679也記載了利用計(jì)算篩選方法優(yōu)化抗體的生理化學(xué)性質(zhì)的方法。
編碼本發(fā)明的抗體的核酸分子此處描述了編碼本發(fā)明中有用的特定抗體的核酸分子(SEQ IDNO1，3，5，7，9和11)。這些核酸可以存在于完整細(xì)胞、細(xì)胞裂解物中，或以部分純化或基本上純的形式存在。當(dāng)通過包括堿/SDS處理、CsCl顯帶、柱層析、瓊脂糖凝膠電泳在內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)和本領(lǐng)域公知的其他方法從其他細(xì)胞成分或其他污染物例如其他細(xì)胞核酸或蛋白質(zhì)中分離純化時，核酸是“分離的”或“基本上純的”。參見，F(xiàn).Ausubel等ed.(1987)Current Protocols in Molecular Biology，GreenePublishing and Wiley Interscience，New York。本發(fā)明的核酸可以是例如DNA或RNA，并且可以含有或者可以不含內(nèi)含子序列。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，該核酸是cDNA分子。
本發(fā)明的核酸可以利用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)獲得。對于雜交瘤(例如，由如下文進(jìn)一步描述的攜帶人免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因小鼠制備的雜交瘤)表達(dá)的抗體，編碼由雜交瘤制備的抗體輕鏈和重鏈的cDNA可以用標(biāo)準(zhǔn)PCR擴(kuò)增或cDNA克隆技術(shù)獲得。對于從免疫球蛋白基因文庫中獲得的抗體(例如使用噬菌體展示技術(shù))，可以從文庫中回收編碼該抗體的核酸。
本發(fā)明優(yōu)選的核酸分子是編碼17G1、2H9或5F11單克隆抗體的VH和VL序列的核酸分子。編碼17G1、2H9和5F11的VH序列的DNA序列分別顯示在SEQ ID NO1、5和9中。編碼17G1、2H9和5F11的VL序列的DNA序列分別顯示在SEQ ID NO3、7和11中。
一旦獲得編碼VH和VL片段的DNA片段，即可通過標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)進(jìn)一步操作這些DNA片段，例如將可變區(qū)基因轉(zhuǎn)化為全長抗體鏈基因、Fab片段基因或scFv基因。在這些操作中，編碼VL或VH的DNA片段與編碼另外一種蛋白質(zhì)如抗體恒定區(qū)或柔性接頭的另一個DNA片段可操作地連接。如在本文中使用的術(shù)語“可操作地連接”意思是兩個DNA片段連接在一起，使得這兩個DNA片段編碼的氨基酸序列保持在閱讀框內(nèi)。
通過將編碼VH的DNA與編碼重鏈恒定區(qū)(CH1、CH2和CH3)的另外一種DNA分子可操作地連接，可以將分離的編碼VH區(qū)的DNA轉(zhuǎn)化為全長重鏈基因。人重鏈恒定區(qū)基因的序列在本領(lǐng)域中公知(參見，例如，Kabat，E.A.等(1991)Sequences of Proteins ofImmunologicl Interest，第五版，U.S.Department of Health and HumanServices，NIH出版號91-3242)，包括這些區(qū)域的DNA片段可以通過標(biāo)準(zhǔn)PCR擴(kuò)增獲得。重鏈恒定區(qū)可以是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定區(qū)，但是最優(yōu)選的是IgG1或IgG4恒定區(qū)。對于Fab片段重鏈基因，編碼VH的DNA可以與只編碼重鏈CH1恒定區(qū)的另外一種DNA分子可操作地連接。
通過將編碼VI的DNA與編碼輕鏈恒定區(qū)CL的另外一種DNA分子可操作地連接，可以將分離的編碼VL區(qū)的DNA轉(zhuǎn)化為全長輕鏈基因(以及Fab輕鏈基因)。人輕鏈恒定區(qū)基因的序列在本領(lǐng)域中公知(參見，例如，Kabat，E.A.等(1991)Sequences of Proteins ofImmunologicl Interest，第五版，U.S.Department of Health and HumanServices，NIH出版號91-3242)，包括這些區(qū)域的DNA片段可以通過標(biāo)準(zhǔn)PCR擴(kuò)增獲得。輕鏈恒定區(qū)可以是κ或λ恒定區(qū)，但是最優(yōu)選的是κ恒定區(qū)。
為了產(chǎn)生scFv基因，將編碼VH和VL的DNA片段與編碼柔性接頭例如編碼氨基酸序列(Gly4-Ser)3的另外一個片段可操作地連接，使得VH和VL序列可以表達(dá)為連續(xù)的單鏈蛋白質(zhì)，其VL和VH區(qū)通過該柔性接頭連接(參見，例如Bird等(1988)Science 242423-426；Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 855879-5883；McCafferty等(1990)Nature 348552-554)。
本發(fā)明的單克隆抗體的制備通過多種技術(shù)能制備本發(fā)明有用的單克隆抗體(mAb)，包括常規(guī)的單克隆抗體方法，例如，Kohler和Milstein(1975)Nature 256495所述的標(biāo)準(zhǔn)體細(xì)胞雜交技術(shù)。雖然優(yōu)選體細(xì)胞雜交技術(shù)，但是原則上，能使用制備單克隆抗體的其他技術(shù)，例如B淋巴細(xì)胞的病毒或致癌轉(zhuǎn)化。
用于制備雜交瘤的優(yōu)選的動物系統(tǒng)是鼠系統(tǒng)。用小鼠產(chǎn)生雜交瘤是一種完善建立的程序。免疫程序和分離用于融合的被免疫脾細(xì)胞的技術(shù)是本領(lǐng)域公知的。融合配偶體(例如鼠骨髓瘤細(xì)胞)和融合程序也是公知的。
本發(fā)明的嵌合或人源化抗體可以基于如上所述制備的鼠單克隆抗體的序列制備。編碼重鏈和輕鏈免疫球蛋白的DNA可以從目標(biāo)鼠雜交瘤中獲得，并且使用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)將其工程化為含有非鼠(例如人類)免疫球蛋白序列。例如，為了產(chǎn)生嵌合抗體，可以利用本領(lǐng)域公知的方法將鼠可變區(qū)連接到人恒定區(qū)上(參見，例如，Cabilly等人的美國專利No.4,816,567)。為了產(chǎn)生人源化抗體，可以利用本領(lǐng)域公知的方法將鼠CDR區(qū)插入人構(gòu)架內(nèi)(參見，例如，Winter的美國專利No.5,225,539，和Queen等人的美國專利No.5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370)。
在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體是人單克隆抗體。這種抗CD30人單克隆抗體能用攜帶部分人免疫系統(tǒng)而不是小鼠系統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)染色體小鼠產(chǎn)生。這些轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)染色體小鼠包括在此分別稱作HuMab小鼠和KM小鼠的小鼠，并且在此通稱為“人Ig小鼠”。這些小鼠是本領(lǐng)域眾所周知的(參見，例如，Lonberg等(1994)Nature368(6474)856-859)；綜述Lonberg，N.(1994)Handbook ofExperimental Pharmacology 11349-101；Lonberg，N.和Huszar，D.(1995)Intern.Rev.Immunol.Vol.1365-93，和Harding，F(xiàn).和Lonberg，N.(1995)Ann.N.Y.Acad.Sci 764536-546)。HuMab小鼠的制備和使用，以及該小鼠攜帶的基因組修飾，于下面的文獻(xiàn)中詳細(xì)描述Taylor，L.等(1992)Nucleic Acids Research 206287-6295；Chen，J.等(1993)International Immunology 5647-656；Tuaillon等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci USA 903720-3724；Choi等(1993)Nature Genetics 4117-123；Chen，J.等(1993)EMBO J.12821-830；Tuaillon等(1994)J.Immunol.1522912-2920；Taylor，L.等(1994)International Immunology 6579-591；和Fishwild，D.等(1996)Nature Biotechnology 14845-851，這些文獻(xiàn)的內(nèi)容全文在此引入作為參考。進(jìn)一步參見，美國專利No.5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,789,650；5,877,397；5,661,016；5,814,318；5,874,299；和5,770,429；都屬于Lonberg和Kay；和Surani等人的美國專利No.5,545,807；PCT公布號WO 92/03918,WO 93/12227，WO 94/25585，WO 97/13852，WO 98/24884和WO99/45962，都屬于Lonberg和Kay；和Korman等人的PCT公布號WO 01/14424。
在另一實(shí)施方案中，可以用轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)染色體上攜帶人免疫球蛋白序列的小鼠，例如攜帶人重鏈轉(zhuǎn)基因和人輕鏈轉(zhuǎn)染色體的小鼠，產(chǎn)生本發(fā)明的人抗體。這種小鼠在此稱為“KM小鼠”，在Ishida等人的PCT公布WO 02/43478中詳細(xì)描述。
再者，表達(dá)人免疫球蛋白基因的替代轉(zhuǎn)基因動物系統(tǒng)在本領(lǐng)域中可以獲得，能夠用來產(chǎn)生本發(fā)明使用的抗-CD30抗體。例如，可以使用一種稱作Xenomouse(Abgenix，Inc.)的替代轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)，這種小鼠在例如Kucherlapati等人的美國專利No.5,939,598；6,075,181；6,114,598；6,150,584和6,162,963中描述。
而且，表達(dá)人免疫球蛋白基因的替代轉(zhuǎn)染色體動物系統(tǒng)在本領(lǐng)域中可以獲得，能夠用來產(chǎn)生本發(fā)明使用的抗-CD30抗體。例如，可以使用攜帶人重鏈轉(zhuǎn)染色體和人輕鏈轉(zhuǎn)染色體的小鼠，其被稱作“TC小鼠”；這種小鼠在Tomizuka等(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA97722-727中描述。另外，本領(lǐng)域中已經(jīng)描述了攜帶人重鏈和輕鏈轉(zhuǎn)染色體的牛(Kuroiwa等(2002)Nature Biotechnology 20889-894)，其能夠用來產(chǎn)生本發(fā)明的抗-CD30抗體。
也可以使用篩查人免疫球蛋白基因文庫的噬菌體展示方法制備本發(fā)明的人單克隆抗體。這種用于分離人抗體的噬菌體展示方法在本領(lǐng)域中已經(jīng)建立。參見，例如，Ladner等人的美國專利No.5,223,409；5,403,484；和5,571,698；Dower等人的美國專利No.5,427,908和5,580,717；McCafferty等人的美國專利No.5,969,108和6,172,197；和Griffiths等人的美國專利No.5,885,793；6,521,404；6,544,731；6,555,313；6,582,915和6,593,081。
也可以用SCID小鼠制備本發(fā)明使用的人單克隆抗體，該SCID小鼠中重構(gòu)了人免疫細(xì)胞，因此在免疫時能夠產(chǎn)生人抗體應(yīng)答。這種小鼠在例如Wilson等人的美國專利No.5,476,996和5,698,767中描述。
人Ig小鼠的免疫用于產(chǎn)生人抗體的人Ig小鼠的免疫在公布號為2004/0006215的美國專利申請中詳細(xì)描述，在此全文引用作為參考。其中也描述了產(chǎn)生抗CD30的全人單克隆抗體的詳細(xì)程序。
產(chǎn)生本發(fā)明的人單克隆抗體的雜交瘤的制備為了制備產(chǎn)生本發(fā)明的人單克隆抗體的雜交瘤，從被免疫的小鼠中分離脾細(xì)胞和/或淋巴結(jié)細(xì)胞，并且與合適的無限增殖化細(xì)胞系例如小鼠骨髓瘤細(xì)胞系融合。針對抗原特異性抗體的產(chǎn)生篩選得到的雜交瘤。這些方法是本領(lǐng)域眾所周知的，在美國US 2004/0006125中描述。
產(chǎn)生本發(fā)明單克隆抗體的轉(zhuǎn)染瘤的制備例如，利用本領(lǐng)域公知并且在US 2004/0006125中詳細(xì)記載的重組DNA技術(shù)和基因轉(zhuǎn)染方法的組合(例如，Morrison，S.(1985)science 2291202)，也能在宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)染瘤系統(tǒng)中產(chǎn)生本發(fā)明使用的抗體。
人單克隆抗體與CD30結(jié)合的表征為了表征本發(fā)明的人單克隆CD30抗體的結(jié)合，可通過如ELISA對來自被免疫的小鼠的血清進(jìn)行檢驗(yàn)。在ELISA規(guī)程的一個典型(但非限制性的)例子中，將微量滴定板用PBS中的0.25μg/ml純化的CD30包被，然后用PBS中5％的牛血清清蛋白封閉。將來自CD30免疫的小鼠血漿的稀釋物加入到每一個孔中，并于37℃溫育1-2小時。將平板用PBS/Tween洗滌，然后于37℃與偶聯(lián)到堿性磷酸酶上的山羊抗人IgG Fc-特異性多克隆試劑溫育1小時。洗滌后，將平板用pNPP底物(1mg/ml)顯色，并在405-650的OD進(jìn)行分析。優(yōu)選地，將發(fā)展了最大效價的小鼠用于融合。
如上所述的ELISA分析也可以用來篩選表現(xiàn)出與CD30免疫原有陽性反應(yīng)性的雜交瘤。將高親合力結(jié)合CD30的雜交瘤進(jìn)行亞克隆，并且進(jìn)一步表征。從每個雜交瘤中選擇保留母細(xì)胞反應(yīng)性的一個克隆(通過ELISA)，制備5-10小瓶細(xì)胞庫，保存在-140℃下，用于抗體純化。
為了純化人抗-CD30抗體，選擇的雜交瘤在用于單克隆抗體純化的兩升旋轉(zhuǎn)搖瓶中生長。過濾上清液并且濃縮，然后用蛋白A-sepharose(Pharmacia，Piscataway，NJ)進(jìn)行親和層析。通過凝膠電泳和高效液相色譜檢查洗脫的IgG以確保純度。將緩沖溶液換成PBS，并且使用1.43的消光系數(shù)根據(jù)OD280確定濃度。將單克隆抗體分成等份并且在-80℃下保存。
為了確定選擇的人抗-CD30單克隆抗體是否與獨(dú)特表位結(jié)合，可以使用商售試劑(Pierce，Rockford，IL)將每種抗體生物素化?？梢允褂萌缟纤龅腃D30包被的ELISA板，應(yīng)用未標(biāo)記的單克隆抗體和生物素化單克隆抗體進(jìn)行競爭研究?？梢允褂面溍箍股锼氐鞍?堿性磷酸酶探針檢測生物素化mAb的結(jié)合。
為了確定被純化的抗體的同種型，可以進(jìn)行同種型ELISA。例如，在4℃下用10μg/ml抗人免疫球蛋白包被微量滴定板的孔過夜。用5％BSA封閉之后，平板與10μg/ml單克隆抗體或純化的同種型對照物在室溫下反應(yīng)2小時。這些孔然后與人IgG1或人IgM特異性堿性磷酸酶偶聯(lián)的探針反應(yīng)。如上所述使平板顯色并且分析。
為了證明單克隆抗體與表達(dá)CD30的活細(xì)胞的結(jié)合，可應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)。在流式細(xì)胞術(shù)規(guī)程的典型(但非限制性)例子中，使表達(dá)CD30的細(xì)胞系(在標(biāo)準(zhǔn)生長條件下生長)與含有0.1％BSA和20％小鼠血清的各種濃度的單克隆抗體混合，并于37℃溫育1小時。洗滌后，使細(xì)胞在與第一抗體染色相同的條件下與熒光素標(biāo)記的抗人IgG抗體反應(yīng)。樣品可通過FAcscan設(shè)備進(jìn)行分析，該設(shè)備應(yīng)用光學(xué)和側(cè)面散射的性質(zhì)來為單細(xì)胞畫門(gate)。除流式細(xì)胞儀測定之外或代替該測定，可應(yīng)用作為替代的應(yīng)用熒光顯微鏡的測定。細(xì)胞可精確地如上所述進(jìn)行染色，并由熒光顯微鏡進(jìn)行檢查。該方法使得能夠觀察到單個細(xì)胞，但依賴于抗原的密度可能靈敏性降低。
抗CD30的人IgG可進(jìn)一步通過蛋白質(zhì)印跡法檢驗(yàn)與CD30抗原的反應(yīng)性。例如，可以制備來自表達(dá)CD30的細(xì)胞的細(xì)胞提取物，并將其進(jìn)行十二烷基硫酸鈉(SDS)聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳后，將分離的抗原轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，用20％的小鼠血清進(jìn)行封閉，并用要檢驗(yàn)的單克隆抗體進(jìn)行探測。人IgG的結(jié)合可應(yīng)用抗人IgG的堿性磷酸酶進(jìn)行探測，并用BCIP/NBT底物片劑進(jìn)行顯影(Sigma Chem.Co.，St.Louis，MO)。
抗CD30的人單克隆抗體的吞噬和細(xì)胞殺傷活性除與CD30的特異性結(jié)合之外，可對人類單克隆抗CD30抗體介導(dǎo)表達(dá)CD30的細(xì)胞的吞噬作用和殺傷的能力進(jìn)行檢驗(yàn)。單克隆抗體活性的體外檢驗(yàn)將在檢驗(yàn)體內(nèi)模型之前提供初始的篩選。簡言之，來自健康供體的多形核細(xì)胞(PMN)或其他效應(yīng)細(xì)胞可通過FicollHypaque密度離心及隨后裂解污染的紅細(xì)胞而進(jìn)行純化。洗滌的PMN可懸浮于補(bǔ)充了10％熱滅活的胎牛血清的RPMI中，并以效應(yīng)細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞(效應(yīng)細(xì)胞∶腫瘤細(xì)胞)的各種比例與51Cr標(biāo)記的表達(dá)CD30的細(xì)胞混合。然后可以添加各種濃度的純化的人抗CD30IgG?？梢允褂脽o關(guān)人IgG作為陰性對照。測定可于37℃進(jìn)行4-18小時?？赏ㄟ^測量釋放入培養(yǎng)上清液中的51Cr以測定樣品的細(xì)胞溶解。也可對抗CD30單克隆抗體的相互組合進(jìn)行檢驗(yàn)，以確定多個單克隆抗體是否增強(qiáng)了細(xì)胞溶解。
也可在體內(nèi)模型(如小鼠)中檢驗(yàn)與CD30結(jié)合的人單克隆抗體，以確定它們在介導(dǎo)表達(dá)CD30的細(xì)胞如腫瘤細(xì)胞的吞噬作用和殺傷中的功效。例如，可基于如下標(biāo)準(zhǔn)選擇這些抗體，該標(biāo)準(zhǔn)不是排他的1)與表達(dá)CD30的活細(xì)胞結(jié)合；2)與CD30結(jié)合的高親和力；3)與CD30上獨(dú)特的表位的結(jié)合(以消除當(dāng)組合應(yīng)用時具有互補(bǔ)活性的單克隆抗體將競爭結(jié)合相同表位的可能性)；4)表達(dá)CD30的細(xì)胞的調(diào)理作用；5)在存在人類效應(yīng)細(xì)胞時介導(dǎo)表達(dá)CD30的細(xì)胞的生長抑制、吞噬作用和/或殺傷。
本發(fā)明優(yōu)選的人單克隆抗體滿足這些標(biāo)準(zhǔn)的一個或多個，且優(yōu)選地滿足全部標(biāo)準(zhǔn)。在一個特定實(shí)施方案中，這些人單克隆抗體組合應(yīng)用，如作為包含兩種或多種抗CD30單克隆抗體或其片段的藥物組合物應(yīng)用。例如，具有不同但互補(bǔ)活性的人抗CD30單克隆抗體可在單個治療中進(jìn)行組合，以實(shí)現(xiàn)所需的治療或診斷作用。其一個例子為一種組合物，該組合物含有在效應(yīng)細(xì)胞存在時介導(dǎo)對目標(biāo)細(xì)胞的高效殺傷的抗CD30人單克隆抗體與另一種抑制表達(dá)CD30的細(xì)胞生長的人抗CD30單克隆抗體。
與CD30結(jié)合的雙特異性/多特異性分子在本發(fā)明方法的另一實(shí)施方案中，抗CD30的人單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分可以被衍生化或連接到另一個功能性分子上，如另一個肽或蛋白質(zhì)(例如Fab′片段)上，生成可與多個結(jié)合位點(diǎn)或目標(biāo)表位結(jié)合的雙特異性或多特異性分子。例如，本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分可與一個或多個其他結(jié)合分子如其他抗體、抗體片段、肽或結(jié)合模擬物功能性連接(如通過化學(xué)偶聯(lián)、基因融合、非共價結(jié)合等)。本發(fā)明中有用的雙特異性分子包括US 2004/0006215所述的那些。在一個特定實(shí)施方案中，雙特異性抗體是H22xKi4，它也記載在US2004/0006215中。
如在此處所用的，“效應(yīng)細(xì)胞特異性抗體”指結(jié)合效應(yīng)細(xì)胞的Fc受體的抗體或功能性抗體片段。用于本發(fā)明中的優(yōu)選抗體在未由內(nèi)源免疫球蛋白結(jié)合的位點(diǎn)處結(jié)合效應(yīng)細(xì)胞的Fc受體。
如在此處所用的，術(shù)語“效應(yīng)細(xì)胞”指與免疫反應(yīng)的識別階段和活化階段相反，參與免疫反應(yīng)的效應(yīng)階段的免疫細(xì)胞。示例性的免疫細(xì)胞包括髓樣或淋巴樣來源的細(xì)胞，如淋巴細(xì)胞(如B細(xì)胞和T細(xì)胞，包括溶細(xì)胞性T細(xì)胞(CTL)、殺傷細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、多形核細(xì)胞、粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞。一些效應(yīng)細(xì)胞表達(dá)特定的Fc受體，并發(fā)揮特定的免疫功能。在優(yōu)選實(shí)施方案中，效應(yīng)細(xì)胞能夠誘導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)，如嗜中性粒細(xì)胞能夠誘導(dǎo)ADCC。例如，表達(dá)FcγRI的單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞參與目標(biāo)細(xì)胞的特異性殺傷和將抗原呈遞到免疫系統(tǒng)的其他成分或與呈遞抗原的細(xì)胞結(jié)合。在其他實(shí)施方案中，效應(yīng)細(xì)胞可吞噬目標(biāo)抗原、目標(biāo)細(xì)胞或微生物。效應(yīng)細(xì)胞上特定FcR的表達(dá)可由體液因子如細(xì)胞因子調(diào)節(jié)。例如，已發(fā)現(xiàn)FcγRI的表達(dá)可由干擾素γ(IFN-γ)上調(diào)。該增強(qiáng)的表達(dá)可增加帶有FcγRI的細(xì)胞對目標(biāo)的細(xì)胞毒性活性。效應(yīng)細(xì)胞可吞噬或溶解目標(biāo)抗原或目標(biāo)細(xì)胞。
“目標(biāo)細(xì)胞”應(yīng)指受試者(如人類或動物)中任何不需要的細(xì)胞，該細(xì)胞可由本發(fā)明的組合物(如人單克隆抗體、雙特異性或多特異性分子)導(dǎo)向。在優(yōu)選實(shí)施方案中，目標(biāo)細(xì)胞是表達(dá)或過度表達(dá)CD30的細(xì)胞，例如CD30陽性淋巴瘤。表達(dá)CD30的細(xì)胞一般包括腫瘤細(xì)胞，如膀胱、乳腺、結(jié)腸、腎、卵巢、前列腺、腎細(xì)胞、扁平細(xì)胞、肺(非小細(xì)胞)和頭頸腫瘤細(xì)胞。其他目標(biāo)細(xì)胞包括滑膜成纖維細(xì)胞。
嵌合的小鼠-人單克隆抗體(即嵌合抗體)可由本領(lǐng)域公知的重組DNA技術(shù)生產(chǎn)。例如，用限制酶消化編碼鼠(或其他物種)單克隆抗體分子的Fc恒定區(qū)的基因，以去除編碼鼠Fc的區(qū)域，并替代為編碼人類Fc恒定區(qū)的基因的等價部分。(參見Robinson等人，國際專利申請PCT/US86/02269；Akira等人，歐洲專利申請184,187；Taniguchi，M.，歐洲專利申請171,496；Morrison等人，歐洲專利申請173,494；Neuberger等人，國際中請WO 86101533；Cabilly等人，美國專利號4,816,567；Cabilly等人，歐洲專利申請125,023；Better等人(1988Science 2401041-1043)；Liu等人(1987)PNAS843439-3443；Liu等人，1987，J.Immunol.1393521-3526；Sun等人(1987)PNAS 84214-218；Nishimura等人，1987，Canc.Res.47999-1005；Wood等人(1985)Nature 314446-449；Shaw等人，1988，J.NatlCancer Inst.801553-1559)。
嵌合抗體可進(jìn)一步通過用來自人類Fv可變區(qū)的等價序列替代不直接參與抗原結(jié)合的Fv可變區(qū)序列而進(jìn)行人源化。人源化抗體的綜述由Morrison，S.L.，1985，Science 2291202-1207和Oi等人，1986，BioTechniques 4214提供。這些方法包括分離、處理和表達(dá)編碼來自至少一個重鏈或輕鏈的全部或部分免疫球蛋白Fv可變區(qū)的核酸序列。這種核酸的來源是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的，例如，可從7E3獲得，即一種產(chǎn)生抗GPIIbIIIa抗體的雜交瘤。然后，可將編碼嵌合抗體的重組DNA或其片段克隆入適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體中。適當(dāng)?shù)娜嗽椿贵w可選擇地由CDR替代產(chǎn)生。美國專利號5,225,539；Jones等人，1986 Nature 321552-525；Verhoeyan等人，1988 Science 2391534和Beidler等人，1988 J.Immunol.1414053-4060。
特定的人類抗體的所有CDR均可由至少一部分非人類的CDR替代，或者僅有一些CDR可由非人類的CDR替代。僅需要替代將人源化抗體結(jié)合到Fc受體上所必需的CDR的數(shù)目。
抗體可通過任何能夠用源自非人類抗體的CDR替代至少一部分人類抗體的CDR的方法進(jìn)行人源化。Winter描述了可用于制備本發(fā)明的人源化抗體的方法(于1989年3月26日提交的英國專利申請GB 2188638A)，將其內(nèi)容清楚地引入作為參考。人類CDR可應(yīng)用寡核苷酸定點(diǎn)誘變而由非人類的CDR替代，如描述于題為Humanized Antibodies to Fc Receptors for Immunoglobulin G onHuman Mononuclear Phagocytes的國際申請94/10332中的那樣。
同樣在本發(fā)明范圍內(nèi)的是嵌合的和人源化的抗體，其中特定的氨基酸已被替代、缺失或添加。具體而言，優(yōu)選的人源化抗體在構(gòu)架區(qū)中具有氨基酸替代，從而改進(jìn)與抗原的結(jié)合。例如，在一種具有小鼠CDR的人源化抗體中，位于人類構(gòu)架區(qū)中的氨基酸可由位于小鼠抗體中相應(yīng)位點(diǎn)的氨基酸替代。已知這種替代在一些例子中可改進(jìn)人源化抗體與抗原的結(jié)合。此處將氨基酸已進(jìn)行添加、缺失或替代的抗體稱為修飾的抗體或改變的抗體。
術(shù)語修飾的抗體也意欲包括已通過如缺失、添加或替代抗體的部分進(jìn)行修飾的抗體，如單克隆抗體、嵌合抗體和人源化抗體。例知，抗體可通過缺失恒定區(qū)并將其替代為意欲增加抗體的半衰期如血清半衰期、穩(wěn)定性或親和力的恒定區(qū)而進(jìn)行修飾。任何修飾均在本發(fā)明范圍之內(nèi)，只要雙特異性和多特異性分子具有至少一個對FcγRI特異性的抗原結(jié)合區(qū)，并觸發(fā)至少一種效應(yīng)功能。
本發(fā)明的雙特異性和多特異性分子可應(yīng)用化學(xué)技術(shù)(參見如D.M.Kranz等人(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 785807)、“polydoma”技術(shù)(參見授予Reading的美國專利號4,474,893)或重組DNA技術(shù)制備。
具體而言，本發(fā)明的雙特異性和多特異性分子可通過應(yīng)用本領(lǐng)域中公知的和在此處提供的實(shí)施例中描述的方法偶聯(lián)組分結(jié)合特異性如抗-FcR和抗-CD30結(jié)合特異性而制備。例如，雙特異性和多特異性分子的每一種結(jié)合特異性可單獨(dú)生成，然后相互偶聯(lián)。當(dāng)結(jié)合特異性為蛋白質(zhì)或肽時，多種偶聯(lián)或交聯(lián)劑可用于共價偶聯(lián)。交聯(lián)劑的例子包括蛋白A、碳二亞胺、N-琥珀酰亞氨基-S-乙酰-硫代乙酸鹽(SATA)、5，5’-二硫代二(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、鄰亞苯基雙馬來既亞胺(oPDM)、N-琥珀酰亞氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸鹽(SPDP)和磺基琥珀酰亞氨基4-(N-馬來酰亞氨基甲基)環(huán)己基-1-羧酸鹽(sulfo-SMCC)(參見如Karpovsky等人，(1984)J.Exp.Med.1601686；Liu，MA等人，(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA828648)。其他方法包括那些由Paulus(Behring Ins.Mitt.(1985)No.78，118-132)；Brennan等人(Science(1985)22981-83和Glennie等人，(J.Immunol.(1987)1392367-2375)所描述的方法。優(yōu)選的偶聯(lián)試劑為SATA和sulfo-SMCC，兩者均可購自Pierce Chemical Co.(Rockford，IL)。
當(dāng)結(jié)合特異性是抗體時(如兩種人源化抗體)，它們可通過兩個重鏈的C-末端鉸鏈區(qū)的巰基鍵偶聯(lián)。在一個特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，對鉸鏈區(qū)進(jìn)行修飾以使其在偶聯(lián)前含有奇數(shù)個巰基殘基，優(yōu)選為1個。
可選擇地，兩種結(jié)合特異性可在相同的載體中編碼，并在相同的宿主細(xì)胞中表達(dá)和裝配。當(dāng)雙特異性和多特異性分子是MAb×MAb，MAb×Fab，F(xiàn)ab×F(ab′)2或配體×Fab融合蛋白質(zhì)時，該方法是特別有用的。本發(fā)明的雙特異性和多特異性分子，如雙特異性分子，可為單鏈分子，如單鏈雙特異性抗體，包含一個單鏈抗體和一個結(jié)合決定簇的單鏈雙特異性分子或包含兩個結(jié)合決定簇的單鏈雙特異性分子。雙特異性和多特異性分子也可為單鏈分子，或者可包含至少兩個單鏈分子。用于制備雙特異性和多特異性分子的方法描述于如美國專利號5,260,203、美國專利號5,455,030、美國專利號4,881,175、美國專利號5,132,405、美國專利號5,091,513、美國專利號5,476,786、美國專利號5,013,653、美國專利號5,258,498和美國專利號5,482,858中。
雙特異性和多特異性分子與其特異性目標(biāo)的結(jié)合可通過酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、放射免疫測定(RIA)、FACS分析、生物測定(如生長抑制)或蛋白質(zhì)印跡測定進(jìn)行證實(shí)。這些測定的每一個通常通過應(yīng)用對感興趣的復(fù)合物特異性的標(biāo)記試劑(如抗體)檢測特別感興趣的蛋白質(zhì)-抗體復(fù)合物的存在。例如，F(xiàn)cR-抗體復(fù)合物可應(yīng)用如識別并特異性結(jié)合抗體-FcR復(fù)合物的酶聯(lián)抗體或抗體片段進(jìn)行檢測?？蛇x擇地，該復(fù)合物可應(yīng)用多種其他免疫測定中的任何一種進(jìn)行檢測。例如，抗體可為放射性標(biāo)記的并用于放射免疫測定(RIA)中(參見如Weintraub，B.，Principles of Radioimmunoassays，SeventhTraining Course on Radioligand Assay Techniques，The EndocrineSociety，1986年3月，在此處將其引入作為參考)。放射性同位素可通過以下方法檢測，如使用γ計(jì)數(shù)器或閃爍計(jì)數(shù)器或放射自顯影。
免疫偶聯(lián)物另一方面，本發(fā)明中使用的抗體可以與諸如細(xì)胞毒素、藥物(例如免疫抑制劑)或放射性毒素的治療性部分偶聯(lián)。這些偶聯(lián)物在此被稱為“免疫偶聯(lián)物”。包括一個或多個細(xì)胞毒素的免疫偶聯(lián)物被稱作“免疫毒素”。細(xì)胞毒素或細(xì)胞毒劑包括對細(xì)胞有害(例如殺傷細(xì)胞)的任何試劑。實(shí)例包括紫杉醇、細(xì)胞松弛素B、短桿菌肽D、溴化乙啶、吐根堿、絲裂霉素、表鬼臼毒吡喃葡糖苷、表鬼臼毒噻吩糖苷、長春新堿、長春堿、秋水仙素、阿霉素、柔紅霉素、二羥基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光輝霉素、放線菌素D、1-脫氫睪酮、糖皮質(zhì)激素、普魯卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛爾和嘌呤霉素和它們的類似物或同系物。治療劑還包括，例如，抗代謝物(例如，氨甲喋呤、6-巰基嘌呤、6-硫代鳥嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶、氨烯咪胺(decarbazine))，烷化劑(例如，氮芥、苯丁酸氮芥(thioepachlorambucil)、苯丙氨酸氮芥、卡莫司汀(BSNU)和洛莫司汀(CCNU)、環(huán)磷酰胺、白消安、二溴甘露糖醇、鏈唑霉素、絲裂霉素C和順-二氯二胺合鉑(II)(DDP)順白)，氨茴霉素類(例如，柔紅菌素(以前稱為道諾霉素)和阿霉素)，抗生素(例如，放線菌素D(以前稱為放線菌素)、博來霉素、光輝霉素和安曲霉素(AMC))，和抗有絲分裂劑(例如，長春新堿和長春堿)。
能與本發(fā)明抗體偶聯(lián)的治療性細(xì)胞毒素的其他優(yōu)選例子包括倍癌霉素、刺孢霉素、美坦生、auristatin、和它們的衍生物。刺孢霉素抗體偶聯(lián)物的一個例子是可作為商品購得的MylotargTM；Wyeth。
可以利用本領(lǐng)域使用的接頭技術(shù)將細(xì)胞毒素與本發(fā)明中使用的抗體偶聯(lián)。已經(jīng)用于將細(xì)胞毒素與抗體偶聯(lián)的接頭類型的實(shí)例包括但不限于腙、硫醚、酯、二硫化物和含肽的接頭。可以選擇，例如，在溶酶體區(qū)室內(nèi)易被低pH切割或易被蛋白酶切割的接頭，該蛋白酶例如是在腫瘤組織中優(yōu)先表達(dá)的蛋白酶，如組織蛋白酶(例如組織蛋白酶B、C、D)。
關(guān)于細(xì)胞毒素的類型，用于偶聯(lián)治療劑與抗體的接頭和方法的進(jìn)一步討論，參見Saito，G.等(2003)Adv.Drug Deliv.Rev.55199-215；Trail，P.A.等(2003)Cancer.Immunol.Immunother.52328-337；Payne，G.(2003)Cancer Cell 3207-212；Allen，T.M.(2002)Nat.Rev.Cancer2750-763；Pastan，I.和Kreitman，R.J.(2002)Curr.Opin.Investig.Drugs 31089-1091；Senter，P.D.和Springer，C.J.(2001)Adv.DrugDeliv.Rev.53247-264。
本發(fā)明中使用的抗體也可以與放射性同位素偶聯(lián)，產(chǎn)生細(xì)胞毒性放射性藥物，也稱作放射性免疫偶聯(lián)物。能夠與診斷或治療性使用的抗體偶聯(lián)的放射性同位素的例子包括但不限于碘131、銦111、釔90和镥177。制備放射性免疫偶聯(lián)物的方法在本領(lǐng)域中已經(jīng)建立。放射性免疫偶聯(lián)物的例子可以作為商品獲得，包括ZevalinTM(IDECPharmaceuticals)和BexxarTM(Corixa Pharmaceuticals)，并且能夠利用類似的方法使用本發(fā)明的抗體制備放射性免疫偶聯(lián)物。
本發(fā)明方法中使用的抗體偶聯(lián)物可以修飾特定的生物學(xué)反應(yīng)，且藥物部分不應(yīng)理解為局限于經(jīng)典的化學(xué)治療劑。例如，藥物部分可以是具有需要的生物活性的蛋白質(zhì)或多肽。這樣的蛋白質(zhì)包括，例如，具有酶活性的毒素或其活性片段，如相思豆毒蛋白、蓖麻毒蛋白A、假單胞菌外毒素或白喉毒素；蛋白質(zhì)，如腫瘤壞死因子或干擾素-γ；或生物學(xué)反應(yīng)調(diào)節(jié)物，如淋巴因子、白介素-1(“IL-1”)、白介素-2(“IL-2”)、白介素-6(“IL-6”)、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(“GM-CSF”)、粒細(xì)胞集落刺激因子(“G-CSF”)或其他生長因子。
將這種治療性部分與抗體偶聯(lián)的技術(shù)是眾所周知的，參見，例如，Arnon等，“Monoclonal Antibodies For Immunotargeting OfDrugs In Cancer Therapy”，in Monoclonal Antibodies And CancerTherapy，Reisfeld等(ed.)，pp.243-56(Alan R.Liss，Inc.1985)；Hellstrom等，“Antibodies For Drug Delivery”，in Controlled DrugDelivery(2nd Ed.)，Robinson等(ed.)，pp.623-53(Marcel Dekker，Inc.1987)；Thorpe，“Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In CancerTherapyA Review”，in Monoclonal Antibodies’84Biological AndClinical Applications，Pinchera等(ed.)，pp.475-506(1985)；“Analysis，Results，And Future Prospective Of The Therapeutic Use OfRadiolabeled Antibody In Cancer Therapy”，in Monoclonal AntibodiesFor Cancer Detection And Therapy，Baldwin等(ed.)，pp.303-16(Academic Press 1985)，和Thorpe等，“The Preparation And CytotoxicProperties Of Antibody-Toxin Conjugates”，Immunol.Rev.，62119-58(1982)。
蛋白酶體抑制劑本發(fā)明需要施用通過直接或間隔抑制的NF-κB的抑制劑，聯(lián)合抗CD30抗體，以治療CD30陽性淋巴瘤。蛋白酶體抑制劑在本發(fā)明的方法中有用。在一個特定實(shí)施方案中，蛋白酶體抑制劑降低或阻斷了哺乳動物細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的26S蛋白酶體的糜蛋白酶樣活性。26S蛋白酶體是一種大蛋白質(zhì)復(fù)合體，降解泛素化的蛋白質(zhì)和間接激活NF-κB途徑。蛋白酶體活性的選擇性抑制具有大量的可能與癌癥治療有關(guān)的效果，包括減弱控制細(xì)胞炎癥應(yīng)答的轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的活性，和抑制bcl-2的活性，bcl-2是一種與細(xì)胞存活有關(guān)的基因。提高的NF-κB和bcl-2活性使癌細(xì)胞能夠防御標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)治療劑的治療。通過阻斷NF-κB和bcl-2的正常功能，蛋白酶體抑制劑可以導(dǎo)致癌細(xì)胞的死亡。因此，例如通過抑制26S蛋白酶體的活性直接或間接降低NF-κB活性的化合物，能夠在本發(fā)明的方法中使用。
蛋白酶體活性的抑制劑及其制備方法是本領(lǐng)域公知的，例如，美國專利No.5,780,454，6,066,730，6,083,903，6,297,217，6,465,433，6,548,668，6,617,317和6,747,150中描述的硼酸和酯化合物。其它蛋白酶體抑制劑包括肽醛，例如ALLnL(N-乙酰基-亮氨酰-亮氨酰-正亮氨醛(N-acetyl-leucinyl-leucycil-norleucynal)，MG101)、LLM(N-乙?；?亮氨酰-亮氨酰-甲硫氨醛(N-acetyl-leucinyl-leucynil-methional)、Z-LLnV(芐氧羰基-亮氨酰-亮氨酰-正纈氨醛(carbobenzoxyl-leucinyl-leucynil-norvalinal)，MG115)、Z-LLL(芐氧羰基-亮氨酰-亮氨酰-亮氨醛(carbobenzoxyl-leucinyl-leucynil-leucynal)，MG132)，乳胞素及其β-內(nèi)酯(Lactacystine，b-lactone)、硼酸肽(Boronic Acid Peptides)、泛素連接酶抑制劑(Ubiquitin Ligase Inhibitors)、環(huán)孢菌素A、FK506(他克莫司)和脫氧精胍菌素。
另外，可以通過DNA結(jié)合試驗(yàn)檢測化合物抑制NF-κB激活的能力(Palombella，等人，Cell 78.773(1994))。例如，可以由未處理的或用待測化合物預(yù)處理1小時的TNF-α處理的細(xì)胞制備全細(xì)胞提取物。使用來源于人IFN-β基因啟動子的PRDII探針根據(jù)電泳遷移率變動分析測定NF-κB的DNA結(jié)合活性。作為NF-κB激活的間接測定指標(biāo)，可以利用細(xì)胞表面熒光免疫結(jié)合試驗(yàn)測定初級人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)上E-選擇素、I-CAM-1和V-CAM-1的細(xì)胞表面表達(dá)。由于E-選擇素、I-CAM-1和V-CAM-1處于NF-κB的調(diào)控下，NF-κB激活的抑制導(dǎo)致細(xì)胞表面上這些粘附分子水平降低。
在本發(fā)明的一個特定實(shí)施方案中，蛋白酶體抑制劑是硼替佐米(Millenium Pharmaceuticals；Cambridge，MA)，它是26S蛋白酶體的糜蛋白酶樣活性的可逆抑制劑，在美國專利No.5,780,454中描述。在另外一個實(shí)施方案中，蛋白酶體抑制劑是MG-132(Calbiochem，CA)。
如此處使用的短語“抑制NF-κB的化合物”用來指直接或間接影響NF-κB活性，從而使NF-κB活性降低或阻斷，以致引起凋亡的任意化合物。上述蛋白酶體抑制劑是間接影響NF-κB活性的化合物的例子。
藥物組合物本發(fā)明的方法使用(i)一種組合物，例如藥物組合物，其含有與藥學(xué)上可接受的載體配制在一起的一種或組合的本發(fā)明的抗CD30抗體或其抗原結(jié)合部分，和(ii)一種組合物，例如藥物組合物，其含有與藥學(xué)上可接受的載體配制在一起的蛋白酶體抑制劑?？贵w組合物可以包含一種或組合的(例如兩種或多種不同的)如本文所述的抗體或免疫偶聯(lián)物或雙特異性分子。例如，抗體藥物組合物可以含有結(jié)合CD30上的不同表位或具有互補(bǔ)活性的抗體組合(或免疫偶聯(lián)物或雙特異性分子)。
本發(fā)明中使用的藥物組合物也可以進(jìn)一步與其它的藥物聯(lián)用。例如，需要時，本發(fā)明的聯(lián)合治療，即抗體和蛋白酶體抑制劑，可包括至少一種其他的抗腫瘤或細(xì)胞抑制或細(xì)胞毒性劑?？稍诼?lián)合治療中使用的其他治療劑的例子在下面本發(fā)明抗體的應(yīng)用一節(jié)中更詳細(xì)地描述。
如此處所用的“藥學(xué)上可接受的載體”包括生理學(xué)相容的任何和所有的溶劑、分散介質(zhì)、包衣、抗細(xì)菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等。優(yōu)選地，該載體適合于靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、腸胃外、脊柱或表皮給藥(如通過注射或輸注)。根據(jù)給藥途徑，可將活性化合物即抗體、免疫偶聯(lián)物或雙特異性分子包裹于一種材料中，以保護(hù)該化合物免受可使該化合物失活的酸和其他天然條件的作用。
本發(fā)明的藥物組合物可包含一種或多種藥學(xué)上可接受的鹽?！八帉W(xué)上可接受的鹽”是指保持了親代化合物的所需生物活性而不引起任何不期望的毒理學(xué)作用的鹽(參見如Berge，S.M.等(1977)J.Pharm.Sci.661-19)。這樣的鹽的例子包括酸加成鹽和堿加成鹽。酸加成鹽包括那些由諸如鹽酸、硝酸、磷酸、硫酸、氫溴酸、氫碘酸、亞磷酸等無毒性無機(jī)酸衍生的鹽，以及由諸如脂族單羧酸和二羧酸、苯基取代的鏈烷酸、羥基鏈烷酸、芳族酸、脂族和芳族磺酸等無毒性有機(jī)酸衍生的鹽。堿加成鹽包括那些由諸如鈉、鉀、鎂、鈣等堿土金屬衍生的鹽，以及由諸如N，N’-二芐基乙二胺、N-甲基葡糖胺、氯普魯卡因、膽堿、二乙醇胺、乙二胺、普魯卡因等無毒性有機(jī)胺衍生的鹽。
本發(fā)明的藥物組合物也可含有藥學(xué)上可接受的抗氧化劑。藥學(xué)上可接受的抗氧化劑的例子包括(1)水溶性抗氧化劑，如抗壞血酸、鹽酸半胱氨酸、硫酸氫鈉、焦亞硫酸鈉，亞硫酸鈉等；(2)油溶性抗氧化劑，如棕櫚酸抗壞血酸酯、丁羥茴醚(BHA)、丁羥甲苯(BHT)、卵磷脂、沒食子酸丙酯、α-生育酚等；和(3)金屬螯合劑，如檸檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、二乙烯三胺五乙酸(DTPA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等。
可用于本發(fā)明藥物組合物中的適當(dāng)?shù)乃曰蚍撬暂d體的例子包括水，乙醇，多元醇(如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)，及其適當(dāng)?shù)幕旌衔?，植物油如橄欖油，和注射用有機(jī)酯如油酸乙酯。例如通過應(yīng)用包被材料如卵磷脂，在分散液的情況下通過維持所需的顆粒大小，以及通過應(yīng)用表面活性劑，能夠維持適當(dāng)?shù)牧鲃有浴?br> 這些組合物也可含有佐劑，如防腐劑、潤濕劑、乳化劑和分散劑?？梢酝ㄟ^上述的滅菌程序或通過包含諸如對羥基苯甲酸酯、氯代丁醇、苯酚山梨酸等各種抗細(xì)菌劑和抗真菌劑確保防止存在微生物。也可能需要在組合物中包含等滲劑，例如，糖、氯化鈉等。另外，通過包含延遲吸收劑，例如單硬脂酸鋁和明膠，可實(shí)現(xiàn)注射型藥物延長的吸收。
藥學(xué)上可接受的載體包括無菌水溶液或分散液和用于臨時制備無菌注射液或分散液的粉末劑。這些用于藥學(xué)活性物質(zhì)的介質(zhì)和試劑的使用是本領(lǐng)域公知的。除了任何與活性化合物不相容的常規(guī)介質(zhì)或試劑范圍外，包括其在本發(fā)明的藥物組合物中的應(yīng)用。還可以向組合物中摻入補(bǔ)充的活性化合物。
治療性組合物一般必須是無菌的并且在制備和貯存條件下穩(wěn)定的?？梢詫⒔M合物配制成溶液、微乳狀液、脂質(zhì)體或其他適合高藥物濃度的有序結(jié)構(gòu)。載體可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液態(tài)聚乙二醇等)及其合適的混合物的溶劑或分散劑。例如，通過使用包被材料，例如卵磷脂，在分散液的情況下通過保持所需的顆粒大小，以及通過使用表面活性劑，可以保持適當(dāng)?shù)牧鲃有?。在很多情況下，組合物中優(yōu)選包含等滲劑，例如，糖、多元醇例如甘露糖醇、山梨糖醇或氧化鈉。通過在組合物中加入延遲吸收劑，例如單硬脂酸鹽和明膠，可實(shí)現(xiàn)注射型藥物延長的吸收。
通過將活性化合物以需要的量混入合適的溶劑中，并且根據(jù)需要加入以上列舉的成分中的一種或其組合，接著無菌微過濾，可制備無菌注射液。通常，通過將活性化合物摻入到含有基本分散介質(zhì)和上面所列其他所需成分的無菌載體中制備分散劑。對于用于制備無菌注射液的無菌粉末劑，優(yōu)選的制備方法是真空干燥和冷凍干燥(凍干)，由其預(yù)先無菌過濾的溶液得到活性成分加任何額外所需成分的粉末。
可以與載體材料組合制備單一劑量形式的活性成分的量根據(jù)所治療的受試者和特定給藥方式而不同?？梢耘c載體材料組合制備單一劑量形式的活性成分的量一般是產(chǎn)生治療效果的組合物的量。通常，以100％計(jì)，這個量的范圍是大約0.01％至大約99％的活性成分，優(yōu)選大約0.1％至大約70％，最優(yōu)選大約1％至大約30％的活性成分，與藥學(xué)上可接受的載體相組合。
調(diào)節(jié)劑量方案，以提供最佳的期望的反應(yīng)(例如，治療反應(yīng))。例如，可以施用單一大丸劑，可以隨時間施用幾次分開的劑量，或者根據(jù)治療狀況的緊急情況所需，可以按比例減小或增加劑量。特別有利的是將腸胃外組合物配制成容易給藥并且劑量均勻的劑量單位形式。此處使用的劑量單位形式是指適合作為單位劑量用于所治療的受試者的物理不連續(xù)單位；每個單位含有預(yù)定量的活性化合物，經(jīng)計(jì)算該預(yù)定量的活性化合物與需要的藥物載體組合產(chǎn)生所需的治療效果。對本發(fā)明劑量單位形式的具體說明限定于且直接依賴于(a)活性化合物的獨(dú)特特性和要達(dá)到的特定治療效果，和(b)本領(lǐng)域中固有的對于配制這種用于治療個體敏感性的活性化合物的限制。
對于抗體的給藥，劑量范圍為約0.0001至100mg/kg，更通常為0.01至25mg/kg受者體重。例如，劑量可以是0.3mg/kg體重、1mg/kg體重、3mg/kg體重、5mg/kg體重或10mg/kg體重，12.5mg/kg體重、15mg/kg體重、或20mg/kg體重、或25mg/kg體重、或在1-25mg/kg范圍內(nèi)。一個治療方案的例子需要每周同時給予抗體和蛋白酶體抑制劑組合物一次、每兩周一次、每三周一次、每四周一次、每月一次、每3月一次、或每3-6月一次。本發(fā)明的抗-CD30抗體的優(yōu)選劑量方案包括經(jīng)靜脈內(nèi)給予1mg/kg體重或3mg/kg體重，該抗體使用如下劑量方案之一給藥(i)每4周一次，共6次，然后每3個月一次；(ii)每3周一次；(iii)3mg/kg體重一次，然后每3周1mg/kg體重。
對于蛋白酶體抑制劑的給藥，劑量范圍為約0.0001至100mg/kg，更典型地為0.01至25mg/kg受者體重。例如，劑量可以是0.3mg/kg體重、1mg/kg體重、3mg/kg體重、5mg/kg體重或10mg/kg體重、12.5mg/kg體重、15mg/kg體重、或20mg/kg體重、或在1-20mg/kg范圍內(nèi)。一個治療方案的例子需要每周給藥一次、每兩周一次、每三周一次、每四周一次、每月一次、每3月一次、或每3-6月一次。本發(fā)明的抗-CD30蛋白酶體抑制劑的優(yōu)選劑量方案包括經(jīng)靜脈內(nèi)給予1mg/kg體重或3mg/kg體重，該蛋白酶體抑制劑使用如下劑量方案之一給藥(i)每4周一次，共6次，然后每3個月一次；(ii)每3周一次；(iii)3mg/kg體重一次，然后每3周1mg/kg體重。
在一些方法中，同時施用具有不同結(jié)合特異性的兩種或多種單克隆抗體，在該情況中，每種抗體的給藥劑量落在所述范圍內(nèi)。抗體通常在有必要時多次給藥。單次給藥之間的間隔可以是，例如，每周、每月、每三個月或每年。間隔也可以是不定期的，例如通過測定患者中抗靶抗原的抗體的血液水平來確定。在一些方法中，調(diào)節(jié)劑量以達(dá)到約1-1000μg/ml的血漿抗體濃度，在一些方法中為約25-300μg/ml。
另外，抗體和蛋白酶體抑制劑也可以作為持續(xù)釋放制劑來給藥，在此情況中需要頻率較低的給藥。劑量和頻率根據(jù)抗體在患者中的半衰期而不同。通常，人抗體表現(xiàn)出最長的半衰期，之后是人源化抗體、嵌合抗體和非人類抗體。給藥劑量和頻率根據(jù)處理是預(yù)防性的還是治療性的而不同。在預(yù)防性應(yīng)用中，在長時間內(nèi)以較不頻繁的間隔給予相對較低的劑量。有些患者在余生中持續(xù)接受處理。在治療性應(yīng)用中，有時需要以較短的間隔給予較高的劑量，直到疾病的進(jìn)展減輕或停止，優(yōu)選直到患者表現(xiàn)為疾病癥狀部分或完全改善。之后，可以以預(yù)防性方案給患者給藥。
本發(fā)明藥物組合物中活性成分的實(shí)際劑量水平可能改變，以獲得可有效實(shí)現(xiàn)對特定患者、組合物和給藥方式的所需治療反應(yīng)，而對患者無毒性的活性成分的量。選擇的劑量水平取決于多種藥物代謝動力學(xué)因素，包括應(yīng)用的本發(fā)明特定組合物或其酯、鹽或酰胺的活性，給藥途徑，給藥時間，應(yīng)用的特定化合物的排泄速率，治療的持續(xù)時間，與應(yīng)用的特定組合物聯(lián)合應(yīng)用的其他藥物、化合物和/或材料，接受治療的患者的年齡、性別、體重、狀況、總體健康情況和病史，以及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中公知的類似因素。
本發(fā)明的抗-CD30抗體和蛋白酶體抑制劑的“治療有效劑量”優(yōu)選地導(dǎo)致疾病癥狀的嚴(yán)重性降低，疾病無癥狀期的頻率和持續(xù)時間增加，或者防止因疾病痛苦而引起的損傷或失能。例如，對于CD30+腫瘤的治療，相對于未接受治療的受試者，“治療有效劑量”優(yōu)選地將細(xì)胞生長或腫瘤生長抑制至少約20％，更優(yōu)選至少約40％，更優(yōu)選至少約60％，更優(yōu)選至少約80％?；衔镆种颇[瘤生長的能力可以在如下文實(shí)施例部分所述的預(yù)測對人類腫瘤的療效的動物模型系統(tǒng)中評價。另外，也可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的試驗(yàn)檢查該化合物的體外抑制能力，來評價組合物的這種性能。這些測定在下文的實(shí)施例中描述，例如XTT測定、報道基因測定、TUNEL測定、膜聯(lián)蛋白。治療有效量的治療性化合物能夠減小腫瘤大小，或者以其他方式緩解受試者的癥狀。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)如下因素確定這種量，如受試者的大小、受試者癥狀的嚴(yán)重性和選擇的特定組合物或給藥途徑。
本發(fā)明的組合物可以利用本領(lǐng)域公知的一種或多種方法通過一種或多種給藥途徑給藥。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，給藥途徑和/或方式根據(jù)期望的結(jié)果而不同。本發(fā)明抗體的優(yōu)選給藥途徑包括靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、脊柱或其他腸胃外給藥途徑，例如注射或輸注。如此處所用的短語“腸胃外給藥”是指腸和局部給藥以外的給藥模式，通常是注射，包括但不限于靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、動脈內(nèi)、鞘內(nèi)、囊內(nèi)、眶內(nèi)、心內(nèi)、皮內(nèi)、腹膜內(nèi)、經(jīng)氣管、皮下、表皮下、關(guān)節(jié)內(nèi)、囊下、蛛網(wǎng)膜下、脊柱內(nèi)、硬膜外和胸骨內(nèi)注射和輸注。
此外，本發(fā)明的抗體也可以通過非腸胃外途徑給藥，如局部、表皮或粘膜途徑給藥，例如，鼻內(nèi)、經(jīng)口、陰道、直腸、舌下或局部。
活性化合物可以與保護(hù)化合物不被快速釋放的載體一起制備，例如控釋制劑，包括植入物、透皮貼劑和微膠囊遞送系統(tǒng)?？梢允褂蒙锟山到獾?、生物相容的聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐類、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯和聚乳酸。制備這樣的制劑的很多方法受專利保護(hù)或者通常為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知。參見，例如，Sustainedand controlled Release Drug Delivery Systems，J.R.Robinson，ed.，Marcel Dekker，Inc.，New York，1978。
治療性組合物可應(yīng)用本領(lǐng)域公知的醫(yī)療裝置給藥。例如，在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的治療組合物可用無針皮下注射裝置給藥，如在美國專利No.5,399,163；5,383,851；5,312,335；5,064,413；4,941,880；4,790,824；或4,596,556中公開的裝置?？捎糜诒景l(fā)明的公知的植入物和模塊的例子包括美國專利No.4,487,603，該專利公開了用于以受控速率分散藥物的可植入微量輸注泵；美國專利No.4,486,194，該專利公開了用于通過皮膚給藥的治療裝置；美國專利No.4,447,233，該專利公開了用于以精確的輸注速率遞送藥物的醫(yī)用輸注泵；美國專利No.4,447,224，該專利公開了用于連續(xù)遞送藥物的變流可植入輸注裝置；美國專利No.4,439,196，該專利公開了具有多腔區(qū)室的滲透藥物遞送系統(tǒng)和美國專利No.4,475,196，該專利公開了一種滲透藥物遞送系統(tǒng)。這些專利在此引入作為參考。本領(lǐng)域技術(shù)人員公知許多其他這樣的植入物、遞送系統(tǒng)和模塊。
在某些實(shí)施方案中，可配制本發(fā)明的人單克隆抗體以確保在體內(nèi)的正確分布。例如，血-腦屏障(BBB)阻止了許多高度親水性的化合物。為了確保本發(fā)明的治療性化合物能夠跨過BBB(如果需要時)，可將它們配制在如脂質(zhì)體中。至于制備脂質(zhì)體的方法，參見，例如，美國專利4,522,811；5,374,548；和5,399,331。脂質(zhì)體包含可被選擇性地轉(zhuǎn)運(yùn)入特定細(xì)胞或器官內(nèi)的一個或多個部分，從而增強(qiáng)定向藥物遞送(參見，例如，V.V.Ranade(1989)J.Clin.Pharmacol.29685)。定向部分的例子包括葉酸或生物素(參見，例如，Low等人的美國專利5,416,016)；甘露糖苷(Umezawa等(1988)Biochem.Biophys.Res.Commun.1531038)；抗體(P.G.Bloeman等(1995)FEBS Lett.357140；M.Owais等(1995)Antimicrob.Agents Chemother.39180)；表面活性劑蛋白A受體(Briscoe等(1995)Am.J.Physiol.1233134)；p 120(Schreier等(1994)J.Biol.Chem.2699090)；也參見K.Keinanen；M.L.Laukkanen(1994)FEBS Lett.346123；J.J.Killion；I.J.Fidler(1994)Immunomethods 4273。
本發(fā)明的組合物可以通過本領(lǐng)域公知的多種方法施用。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，給藥途徑和/或模式將根據(jù)期望的結(jié)果而不同?；钚曰衔锟梢耘c保護(hù)化合物不被快速釋放的載體一起制備，例如控釋制劑，包括植入物、透皮貼劑和微膠囊遞送系統(tǒng)?？梢允褂蒙锟山到獾摹⑸锵嗳莸木酆衔?，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐類、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯和聚乳酸。制備這樣的制劑的很多方法受專利保護(hù)或者通常為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知。參見，例如，Sustained andcontrolled Release Drug Delivery Systems，J.R.Robinson，ed.，MarcelDekker，Inc.，New York，1978。
為了通過特定給藥途徑施用本發(fā)明的化合物，有必要將化合物包裹上阻止其失活的材料，或者將該化合物與該材料共同給藥。例如，該化合物可以在適當(dāng)?shù)妮d體中給受試者給藥，例如脂質(zhì)體或稀釋劑。藥學(xué)上可接受的稀釋劑包括鹽水和緩沖水溶液。脂質(zhì)體包括水包油包水型CGF乳劑以及常規(guī)脂質(zhì)體(Strejan等人(1984)J.Neuroimmunol.727)。
藥學(xué)上可接受的載體包括無菌水溶液或分散液和用于臨時制備無菌注射液或分散液的粉末劑。這些用于藥學(xué)活性物質(zhì)的介質(zhì)和試劑的使用是本領(lǐng)域公知的。除了任何與活性化合物不相容的常規(guī)介質(zhì)或試劑外，涉及其在本發(fā)明的藥物組合物中的應(yīng)用。還可以向組合物中摻入補(bǔ)充的活性化合物。
治療性組合物一般必須是無菌的并且在制備和貯存條件下穩(wěn)定的?？梢詫⒔M合物配制成溶液、微乳狀液、脂質(zhì)體或其他適合高藥物濃度的有序結(jié)構(gòu)。載體可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液態(tài)聚乙二醇等)及其合適的混合物的溶劑或分散劑。例如，通過使用包被材料，例如卵磷脂，在分散液的情況下通過保持所需的顆粒大小，以及通過使用表面活性劑，可以保持適當(dāng)?shù)牧鲃有浴Ｔ诤芏嗲闆r下，組合物中優(yōu)選包含等滲劑，例如，糖、多元醇例如甘露糖醇、山梨糖醇或氧化鈉。通過在組合物中加入延遲吸收劑，例如單硬脂酸鹽和明膠，可實(shí)現(xiàn)注射型藥物延長的吸收。
通過將活性化合物以需要的量混入合適的溶劑中，并且根據(jù)需要加入以上列舉的成分中的一種或其組合，接著無菌微過濾，可制備無菌注射液。通常，通過將活性化合物摻入到含有基本分散介質(zhì)和上面所列其他所需成分的無菌載體中制備分散劑。對于用于制備無菌注射液的無菌粉末劑，優(yōu)選的制備方法是真空干燥和冷凍干燥(凍干)，由其預(yù)先無菌過濾的溶液得到活性成分加任何額外所需成分的粉末。
調(diào)節(jié)劑量方案，以提供最佳的期望的反應(yīng)(例如，治療反應(yīng))。例如，可以施用單一大丸劑，可以隨時間施用幾次分開的劑量，或者根據(jù)治療狀況的緊急情況所需，可以按比例減小或增加劑量。特別有利的是將腸胃外組合物配制成容易給藥并且劑量均勻的劑量單位形式。此處使用的劑量單位形式是指適合作為單位劑量用于所治療的受試者的物理不連續(xù)單位；每個單位含有預(yù)定量的活性化合物，經(jīng)計(jì)算該預(yù)定量的活性化合物與需要的藥物載體組合產(chǎn)生所需的治療效果。對本發(fā)明劑量單位形式的具體說明限定于且直接依賴于(a)活性化合物的獨(dú)特特性和要達(dá)到的特定治療效果，和(b)本領(lǐng)域中固有的對于配制這種用于治療個體敏感性的活性化合物的限制。
藥學(xué)上可接受的抗氧化劑的例子包括(1)水溶性抗氧化劑，如抗壞血酸、鹽酸半胱氨酸、硫酸氫鈉、焦亞硫酸鈉，亞硫酸鈉等；(2)油溶性抗氧化劑，如棕櫚酸抗壞血酸酯、丁羥茴醚(BHA)、丁羥甲苯(BHT)、卯磷脂、沒食子酸丙酯、α-生育酚等；和(3)金屬螯合劑，如檸檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等。
對于治療組合物，本發(fā)明的制劑包括那些適合于口服、經(jīng)鼻的、局部的(包括經(jīng)口的和舌下的)、直腸的、陰道的和/或腸胃外施用的制劑。這些制劑可方便地以單位劑量形式存在，且可通過藥劑學(xué)領(lǐng)域中公知的任何方法制備。可以與載體材料組合以產(chǎn)生單劑量形式的活性成分的量將依賴于要治療的受試者和特定的給藥模式而變化?？梢耘c載體材料組合以產(chǎn)生單劑量形式的活性成分的量通常為產(chǎn)生治療作用的組合物的量。通常，在100％中，該量的范圍為約0.01％至約99％的活性成分，優(yōu)選約0.1％至約70％，最優(yōu)選約1％至約30％。
如在此處所用的短語“腸胃外給藥”和“腸胃外給藥的”指不同于腸的和局部給藥的給藥模式，通常通過注射，且包括但不局限于靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、動脈內(nèi)、鞘內(nèi)、囊內(nèi)、眶內(nèi)、心內(nèi)、皮內(nèi)、腹膜內(nèi)、氣管內(nèi)、皮下、表皮下、關(guān)節(jié)內(nèi)、囊下、蛛網(wǎng)膜下、脊柱內(nèi)、硬膜外和胸骨內(nèi)注射和輸注。
可用于本發(fā)明藥物組合物中的適當(dāng)?shù)乃曰蚍撬暂d體的例子包括水，乙醇，多元醇(如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)，及其適當(dāng)?shù)幕旌衔?，植物油如橄欖油，和注射用有機(jī)酯如油酸乙酯。例如通過應(yīng)用包被材料如卵磷脂，在分散液的情況下通過維持所需的顆粒大小，以及通過應(yīng)用表面活性劑，能夠維持適當(dāng)?shù)牧鲃有浴?br> 抗體和蛋白酶體抑制劑組合物也可含有佐劑，如防腐劑、潤濕劑、乳化劑和分散劑?？梢酝ㄟ^上述的滅菌程序或通過包含諸如對羥基苯甲酸酯、氯代丁醇、苯酚山梨酸等各種抗細(xì)菌劑和抗真菌劑確保防止存在微生物。也可能需要在組合物中包含等滲劑，例如，糖、氯化鈉等。另外，通過包含延遲吸收劑，例如單硬脂酸鋁和明膠，可實(shí)現(xiàn)注射型藥物延長的吸收。
當(dāng)本發(fā)明的化合物作為藥物施用于人和動物時，它們可單獨(dú)施用，或者作為藥物組合物施用，該藥物組合物含有如與藥學(xué)上可接受的載體組合的0.01-99.5％(更優(yōu)選地為0.1-90％)的活性成分。
不管所選擇的給藥途徑如何，將可以以適當(dāng)?shù)乃闲问绞┯玫谋景l(fā)明化合物和/或本發(fā)明的藥物組合物通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的常規(guī)方法制備為藥學(xué)上可接受的劑量形式。
本發(fā)明藥物組合物中活性成分的實(shí)際劑量水平可能改變，以獲得可有效實(shí)現(xiàn)對特定患者、組合物和給藥方式的所需治療反應(yīng)，而對患者無毒性的活性成分的量。選擇的劑量水平取決于多種藥物代謝動力學(xué)因素，包括應(yīng)用的本發(fā)明特定組合物或其酯、鹽或酰胺的活性，給藥途徑，給藥時間，應(yīng)用的特定化合物的排泄速率，治療的持續(xù)時間，與應(yīng)用的特定組合物聯(lián)合應(yīng)用的其他藥物、化合物和/或材料，接受治療的患者的年齡、性別、體重、狀況、總體健康情況和病史，以及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中公知的類似因素。
本領(lǐng)域普通的醫(yī)生或獸醫(yī)易于確定并開具有效量的所需藥物組合物。例如，醫(yī)生或獸醫(yī)可以由低于為實(shí)現(xiàn)所需的治療作用所必需的劑量開始應(yīng)用藥物組合物中應(yīng)用的本發(fā)明化合物，并逐漸增加劑量，直到實(shí)現(xiàn)了所需的作用。通常，本發(fā)明組合物適當(dāng)?shù)娜沼脛┝繛榭捎行Мa(chǎn)生治療作用的最小劑量。這種有效劑量通常依賴于上述因素。優(yōu)選的是通過靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)或皮下進(jìn)行施用，且優(yōu)選的是施用于目標(biāo)部位近處。如果需要，治療組合物的有效日用劑量可在一日中以適當(dāng)間隔以單獨(dú)施用的2次、3次、4次、5次、6次或更多次亞劑量進(jìn)行施用，任選地以單位劑量的形式。盡管可能單獨(dú)施用本發(fā)明的化合物，但優(yōu)選的是作為藥物制劑(組合物)施用。
治療性組合物可應(yīng)用本領(lǐng)域公知的醫(yī)療裝置給藥。例如，在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的治療組合物可用無針皮下注射裝置給藥，如在美國專利No.5,399,163；5,383,851；5,312,335；5,064,413；4,941,880；4,790,824；或4,596,556中公開的裝置?？捎糜诒景l(fā)明的公知的植入物和模塊的例子包括美國專利No.4,487,603，該專利公開了用于以受控速率分散藥物的可植入微量輸注泵；美國專利No.4,486,194，該專利公開了用于通過皮膚給藥的治療裝置；美國專利No.4,447,233，該專利公開了用于以精確的輸注速率遞送藥物的醫(yī)用輸注泵；美國專利No.4,447,224，該專利公開了用于連續(xù)遞送藥物的變流可植入輸注裝置；美國專利No.4,439,196，該專利公開了具有多腔區(qū)室的滲透藥物遞送系統(tǒng)和美國專利No.4,475,196，該專利公開了一種滲透藥物遞送系統(tǒng)。這些專利在此引入作為參考。本領(lǐng)域技術(shù)人員公知許多其他這樣的植入物、遞送系統(tǒng)和模塊。
在某些實(shí)施方案中，可配制本發(fā)明的人單克隆抗體以確保在體內(nèi)的正確分布。例如，血-腦屏障(BBB)阻止了許多高度親水性的化合物。為了確保本發(fā)明的治療性化合物能夠跨過BBB(如果需要時)，可將它們配制在如脂質(zhì)體中。至于制備脂質(zhì)體的方法，參見，例如，美國專利4,522,811；5,374,548；和5,399,331。脂質(zhì)體包含可被選擇性地轉(zhuǎn)運(yùn)入特定細(xì)胞或器官內(nèi)的一個或多個部分，從而增強(qiáng)定向藥物遞送(參見，例如，V.V.Ranade(1989)J.Clin.Pharmacol.29685)。定向部分的例子包括葉酸或生物素(參見，例如，Low等人的美國專利5,416,016)；甘露糖苷(Umezawa等(1988)Biochem.Biophys.Res.Commun.1531038)；抗體(P.G.Bloeman等(1995)FEBS Lett.357140；M.Owais等(1995)Antimicrob.Agents Chemother.39180)；表面活性劑蛋白A受體(Briscoe等(1995)Am.J.Physiol.1233134)，其不同類型可包括本發(fā)明的制劑，以及本發(fā)明的分子的成分；p120(Schreier等(1994)J.Biol.Chem.2699090)；也參見K.Keinanen；M.L.Laukkanen(1994)FEBS Lett.346123；J.J.Killion；I.J.Fidler(1994)Immunomethods 4273。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，將本發(fā)明的治療化合物配制在脂質(zhì)體中；在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，脂質(zhì)體包括導(dǎo)向性部分。在一個最優(yōu)選的實(shí)施方案中，脂質(zhì)體中的治療化合物通過快速注射送遞到靠近所需區(qū)域的部位，如炎癥或感染部位，或者腫瘤部位。組合物必須具有易于注射的流動程度。它在制造和貯藏條件下必須是穩(wěn)定的，且必須防止微生物如細(xì)菌和真菌的污染作用。
相對于未治療的受試者而言，“治療有效劑量”優(yōu)選地將細(xì)胞生長或腫瘤生長抑制至少約20％，更優(yōu)選至少約40％，更優(yōu)選至少約60％，更優(yōu)選至少約80％。組合物抑制腫瘤的能力可在預(yù)示在人類腫瘤中的功效的動物模型中進(jìn)行評估?？蛇x擇地，組合物的該性質(zhì)可通過用技術(shù)人員公知的試驗(yàn)檢查化合物抑制如體外抑制的能力而進(jìn)行評估。治療有效量的治療化合物可減小腫瘤大小，或者緩解患者的癥狀。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠基于如下因素確定這種量，該因素如受試者大小、受試者癥狀的嚴(yán)重性和選擇的特定組合物或給藥途徑。
組合物必須是無菌的，且流動性達(dá)到該組合物可通過注射器送遞的程度。除水之外，載體可為等滲緩沖的鹽溶液、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇和液態(tài)聚乙二醇等)及其適當(dāng)?shù)幕旌衔?。例如通過應(yīng)用包被材料如卵磷脂，在分散液的情況下通過維持所需的顆粒大小，以及通過應(yīng)用表面活性劑，能夠維持適當(dāng)?shù)牧鲃有?。在許多情形中，在組合物中優(yōu)選地包含等滲劑，例如，糖；多元醇(polyalcohol)，如甘露醇、山梨糖醇；和氯化鈉。注射型組合物長期的吸收可通過在組合物中包含延遲吸收的試劑，如單硬脂酸酯或明膠來實(shí)現(xiàn)。
如上所述，當(dāng)活性化合物得到適當(dāng)保護(hù)時，該化合物可應(yīng)用如惰性稀釋劑或可同化的可食用載體進(jìn)行口服。
例如，本發(fā)明的人抗體、抗體組合物和方法可用于治療患有致瘤性病癥的受試者，如特征在于存在表達(dá)CD30的腫瘤細(xì)胞的病癥，包括如何杰金氏病、間變性大細(xì)胞淋巴瘤(ALCL)、成人T細(xì)胞淋巴瘤(ATL)、血管免疫母細(xì)胞淋巴結(jié)病(AILD)樣T細(xì)胞淋巴瘤、HIV相關(guān)的基于體腔的淋巴瘤、胚胎癌、未分化的鼻咽癌(如施明克瘤)、卡斯?fàn)柭?、卡波西肉瘤和其他T細(xì)胞或B細(xì)胞淋巴瘤。本發(fā)明的人抗體、抗體組合物和方法可用于治療患有其他病癥的患者，如自身免疫病，包括如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、系統(tǒng)性硬化、特應(yīng)性皮炎、突眼性甲狀腺腫、橋本甲狀腺炎、韋格納肉芽腫病、Omen氏綜合征、慢性腎衰竭、急性傳染性單核細(xì)胞增多癥、HIV和皰疹病毒相關(guān)的疾病。
在一個特定實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法用于在體內(nèi)治療、預(yù)防或診斷多種CD30-相關(guān)的疾病.其中CD30-相關(guān)的疾病的例子包括癌癥、何杰金氏病、非何杰金氏淋巴瘤、間變性大細(xì)胞淋巴瘤(ALCL)、成人T細(xì)胞淋巴瘤(ATL)、血管免疫母細(xì)胞淋巴結(jié)病(AILD)樣T細(xì)胞淋巴瘤、HIV相關(guān)的基于體腔的淋巴瘤、胚胎癌、未分化的鼻咽癌(如施明克瘤)、卡斯?fàn)柭?、卡波西肉瘤和其他T細(xì)胞或B細(xì)胞淋巴瘤。其它CD30-介導(dǎo)的疾病包括自身免疫病，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、系統(tǒng)性硬化、特應(yīng)性皮炎、突眼性甲狀腺腫、橋本甲狀腺炎、韋格納肉芽腫病、Omen氏綜合征、慢性腎衰竭、急性傳染性單核細(xì)胞增多癥、HIV和皰疹病毒相關(guān)的疾病。
在一個特定實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體(如人單克隆抗體、多特異性和雙特異性分子和組合物)可用于治療或預(yù)防何杰金氏病(HD)，這是因?yàn)榭贵w可限制CD30在HD和其他致瘤性疾病的進(jìn)展中所起的作用。何杰金氏病是一類淋巴瘤。淋巴瘤是在淋巴系統(tǒng)中發(fā)展的癌癥，淋巴系統(tǒng)是身體免疫系統(tǒng)的一部分。因?yàn)樵谏眢w的許多部分存在淋巴組織，所以HD幾乎可在身體的任何部分開始。癌可擴(kuò)散到身體中的幾乎任何器官或組織，包括肝、骨髓(身體大骨骼中產(chǎn)生血細(xì)胞的海綿組織)和脾。已報道何杰金氏和Reed-Sternberg細(xì)胞中CD30升高的表達(dá)與HD的區(qū)分性診斷相關(guān)。因此，本發(fā)明的CD30抑制性抗體聯(lián)合蛋白酶體抑制劑可用于預(yù)防或阻斷導(dǎo)致HD的CD30的作用，因而，可用于預(yù)防或治療該疾病。
本發(fā)明的人抗體(如人單克隆抗體、多特異性和雙特異性分子)與蛋白酶體抑制劑組合也可用于阻斷或抑制CD30的其他作用。例如，已知CD30也由多種非何杰金氏淋巴瘤亞型進(jìn)行有規(guī)律的表達(dá)。因此，本發(fā)明抗體的另一個用途包括預(yù)防和治療與非何杰金氏淋巴瘤有關(guān)的疾病。這些疾病包括伯基特淋巴瘤、間變性大細(xì)胞淋巴瘤(ALCL)、皮膚T細(xì)胞淋巴瘤、結(jié)節(jié)性小卵裂細(xì)胞淋巴瘤、淋巴細(xì)胞性淋巴瘤、外周T細(xì)胞淋巴瘤、倫納特氏淋巴瘤、免疫母細(xì)胞淋巴瘤、T細(xì)胞白血病/淋巴瘤(ATLL)、成人T細(xì)胞淋巴瘤(T-ALL)和中心母細(xì)胞/中心細(xì)胞性(cb/cc)濾泡性淋巴瘤。
在另一個特定實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法也可用于阻斷或抑制CD30的其他作用。例如，已知可溶性CD30有規(guī)律地從表達(dá)CD30的細(xì)胞表面釋放。在患有多種致病性和自身免疫病癥的患者血清中已報道有升高的sCD30水平。因此，抗CD30抗體聯(lián)合蛋白酶體抑制劑的另一個用途包括預(yù)防或治療疾病，包括阻斷或抑制sCD30的釋放。這些疾病包括，但不局限于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、系統(tǒng)性硬化、特應(yīng)性皮炎、突眼性甲狀腺腫、橋本甲狀腺炎、韋格納肉芽腫病和Omen氏綜合征。
在體內(nèi)和體外通過本發(fā)明的方法施用抗體和蛋白酶體抑制劑藥物組合物的適當(dāng)途徑在本領(lǐng)域中公知，可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員選擇。例如，抗體組合物可以通過注射(例如靜脈內(nèi)或皮下)施用。使用的分子的適宜劑量將取決于受試者的年齡和體重以及抗體組合物的濃度和/或配方。
如前所述，本發(fā)明的人抗-CD30抗體和蛋白酶體抑制劑可以與諸如細(xì)胞毒劑、放射性毒劑或免疫抑制劑等一種或多種其他治療劑共同給藥?？贵w可以與該治療劑連接(作為免疫復(fù)合物)，或者可以與該治療劑分開給藥。對于后者(分開給藥)，抗體可以在治療劑之前、之后或同時給藥，或者可以與其他已知治療如抗癌治療例如放射治療共同應(yīng)用。這些治療劑包括，抗腫瘤劑，如多柔比星(阿霉素)、順鉑、硫酸博來霉素、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、環(huán)磷酰胺、羥基脲，它們本身僅在對患者具有毒性或亞毒性的水平時有效。順鉑以100mg/m2的劑量靜脈內(nèi)給藥，每4周1次，阿霉素以60-75mg/ml的劑量靜脈內(nèi)給藥，每21天1次。與其他化療劑共同給藥提供了兩種抗癌劑，它們通過對人腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用的不同的機(jī)制起作用。這種共同給藥能夠解決由于發(fā)展耐藥性或腫瘤細(xì)胞抗原性改變(這將使它們對抗體沒有反應(yīng)性)引起的問題。
靶特異性效應(yīng)細(xì)胞，例如與本發(fā)明的組合物(例如人抗體、多特異性和雙特異性分子)有關(guān)的效應(yīng)細(xì)胞，也可以用作治療劑。用于靶向的效應(yīng)細(xì)胞可以是人白細(xì)胞，如巨噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞或單核細(xì)胞。其他細(xì)胞包括嗜酸性細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞和其他帶有IgG或IgA受體的細(xì)胞。需要時，效應(yīng)細(xì)胞可以從所治療的受試者中獲得。靶特異性效應(yīng)細(xì)胞可以作為細(xì)胞在生理學(xué)可接受的溶液中的懸浮液給藥。施用的細(xì)胞數(shù)可以是108-109個的數(shù)量級，但是根據(jù)治療目的而不同。通常，該量足以獲得在靶細(xì)胞處如表達(dá)CD30的腫瘤細(xì)胞處的集中，以及通過例如吞噬作用實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞的殺傷。給藥途徑也可以不同。
應(yīng)用靶特異性效應(yīng)細(xì)胞的治療可以與其他清除靶細(xì)胞的技術(shù)一起進(jìn)行。例如，使用本發(fā)明的組合物(例如人抗體、多特異性和雙特異性分子)和/或具有這些組合物的效應(yīng)細(xì)胞的抗腫瘤治療可以與化學(xué)治療一起使用。另外，可以應(yīng)用聯(lián)合免疫治療將兩種不同的細(xì)胞毒性效應(yīng)群體導(dǎo)向至腫瘤細(xì)胞排斥。例如，與抗-Fc-γRI或抗-CD3連接的抗-CD30抗體可以與IgG-或IgA-受體特異性結(jié)合劑一起使用。
本發(fā)明的雙特異性和多特異性分子也可以用來調(diào)節(jié)效應(yīng)細(xì)胞上的FcγR或FcαR水平，例如通過對細(xì)胞表面上的受體加帽以及將其清除?？?Fc受體的混合物也可以用于該目的。
具有補(bǔ)體結(jié)合位點(diǎn)，如來自IgG1、-2或-3或IgM的補(bǔ)體結(jié)合部分的本發(fā)明使用的抗體和蛋白酶體抑制劑藥物組合物，也可以在補(bǔ)體的存在下使用。在一個實(shí)施方案中，用本發(fā)明的結(jié)合劑和適宜的效應(yīng)細(xì)胞離體處理含有靶細(xì)胞的細(xì)胞群體能夠通過加入補(bǔ)體或含有補(bǔ)體的血清來實(shí)現(xiàn)。補(bǔ)體蛋白的結(jié)合能夠改善用本發(fā)明的結(jié)合劑包被的靶細(xì)胞的吞噬作用。在另一實(shí)施方案中，用本發(fā)明的組合物(例如人抗體、多特異性和雙特異性分子)包被的靶細(xì)胞也能夠被補(bǔ)體裂解。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物不激活補(bǔ)體。
本發(fā)明的組合物(例如人抗體、多特異性和雙特異性分子和免疫偶聯(lián)物)也可以與補(bǔ)體一起施用。因此，在本發(fā)明的范圍內(nèi)包括含有人抗體、多特異性或雙特異性分子和血清或補(bǔ)體的組合物。這些組合物是有利的，因?yàn)檠a(bǔ)體與人抗體、多特異性或雙特異性分子緊密接近。另外，本發(fā)明的人抗體、多特異性或雙特異性分子和補(bǔ)體或血清也可以單獨(dú)施用。
因此，可以給用本發(fā)明的抗體和蛋白酶體抑制劑組合物治療的患者(在本發(fā)明的人抗體給藥之前、同時或之后)另外施用另一種治療劑，如細(xì)胞毒劑或放射性毒劑，該治療劑可以增強(qiáng)或增加人抗體的治療效果。
在另外一些實(shí)施方案中，可以另外用調(diào)節(jié)(例如增強(qiáng)或抑制)Fcγ或Fcα受體的表達(dá)或活性的藥物治療受試者，例如用細(xì)胞因子治療受試者。在用多特異性分子治療過程中施用的優(yōu)選細(xì)胞因子包括粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、干擾素-γ(IFN-γ)和腫瘤壞死因子(TNF)。
在另一個實(shí)施方案中，受試者可額外用淋巴因子制劑進(jìn)行治療。應(yīng)用淋巴因子制劑可誘導(dǎo)不高度表達(dá)CD30的癌細(xì)胞表達(dá)CD30。淋巴因于制劑可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞中更均一的CD30表達(dá)，這可導(dǎo)致更有效的治療。適合于施用的淋巴因子制劑包括干擾素-γ、腫瘤壞死因子及其組合。這些制劑可在靜脈內(nèi)施用。適當(dāng)?shù)牧馨鸵蜃觿┝繛?0,000-1,000,000單位/患者。
本發(fā)明使用的抗體和蛋白酶體抑制劑組合物也可用于導(dǎo)向于表達(dá)FcγR或CD30的細(xì)胞，例如標(biāo)記這些細(xì)胞。對于這種用途，結(jié)合劑可以與可被檢測的分子連接。因而，本發(fā)明提供了來自體內(nèi)或在體外定位表達(dá)Fc受體如FcγR或CD30的細(xì)胞的方法。可被檢測的標(biāo)記可為如放射性同位素、熒光化合物、醇或酶輔因子。
在另外一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了通過給受試者施用上述人抗體而治療受試者中CD30介導(dǎo)的病癥的方法，如何杰金氏病、成人T細(xì)胞淋巴瘤、傳染性單核細(xì)胞增多癥和系統(tǒng)性紅斑狼瘡。將這種抗體及其衍生物用于抑制與某些病癥相關(guān)的CD30誘導(dǎo)的活性，如增殖和分化?？捎杀景l(fā)明的抗體抑制的其他CD30誘導(dǎo)的活性包括增加的sCD30產(chǎn)生、增加的IL-4表達(dá)和增加的Th2表型的產(chǎn)生。通過使抗體與CD30接觸(如通過給受試者施用抗體)，CD30誘導(dǎo)這種活性的能力受到抑制，因而相關(guān)的病癥得到治療。優(yōu)選的抗體與對CD30特異性的表位結(jié)合，因而，有利地抑制CD30誘導(dǎo)的活性，但不干擾結(jié)構(gòu)相關(guān)的表面抗原如NGFR、CD27和CD40的活性。
因此，在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了治療或預(yù)防由人CD30介導(dǎo)的致瘤性病癥的方法，如何杰金氏病、非何杰金氏淋巴瘤、間變性大細(xì)胞淋巴瘤(ALCL)、成人T細(xì)胞淋巴瘤(ATL)、血管免疫母細(xì)胞淋巴結(jié)病(AILD)樣T細(xì)胞淋巴瘤、HIV相關(guān)的基于體腔的淋巴瘤、胚胎癌、未分化的鼻咽癌(如施明克瘤)、卡斯?fàn)柭?、卡波西肉瘤和其他T細(xì)胞或B細(xì)胞淋巴瘤。該方法包括以治療和預(yù)防病癥的有效量給受試者施用本發(fā)明的抗體組合物。抗體組合物可單獨(dú)施用，或者與另一種治療劑一起施用，如與該抗體組合物聯(lián)合或協(xié)同作用以治療或預(yù)防CD30介導(dǎo)的疾病的細(xì)胞毒性劑或放射毒性劑。在一個特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種治療何杰金氏病的方法。在另一個特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種治療ALCL的方法。
在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了治療或預(yù)防由人CD30介導(dǎo)的自身免疫病的方法，如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、系統(tǒng)性硬化、特應(yīng)性皮炎、突眼性甲狀膝腫、橋本甲狀膝炎、韋格納肉芽腫病、Omen氏綜合征、慢性腎衰竭、急性傳染性單核細(xì)胞增多癥、HIV和皰疹病毒相關(guān)的疾病。該方法包括以治療和預(yù)防病癥的有效量給受試者施用本發(fā)明的抗體組合物。抗體組合物可單獨(dú)施用，或者與另一種治療劑一起施用，如與該抗體組合物聯(lián)合或協(xié)同作用以治療或預(yù)防CD30介導(dǎo)的疾病的免疫抑制劑。
在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的免疫偶聯(lián)物可用于通過使這種化合物與抗體連接而使用蛋白酶體抑制劑將化合物(如治療劑、標(biāo)記、細(xì)胞毒素、放射毒素、免疫抑制劑等)導(dǎo)向于在其表面上結(jié)合有(如膜結(jié)合的或與CD30受體結(jié)合的)CD30的細(xì)胞。因而，本發(fā)明也提供了來自體內(nèi)或在體外定位表達(dá)CD30和CD30受體的細(xì)胞的方法，該細(xì)胞如何杰金氏細(xì)胞或Reed-Sternberg細(xì)胞(如具有可檢測的標(biāo)記，如放射性同位素、熒光化合物、酶或酶輔因子)?？蛇x擇地，免疫偶聯(lián)物可用于通過將細(xì)胞毒素或放射毒素導(dǎo)向于CD30而殺傷在其表面上結(jié)合有(如膜結(jié)合的或與CD30受體結(jié)合的)CD30的細(xì)胞。
本發(fā)明進(jìn)一步通過下面的實(shí)施例進(jìn)行闡述，不應(yīng)將該實(shí)施例理解為進(jìn)一步的限制。
實(shí)施例人抗CD30抗體激活NF-κB并且使淋巴瘤細(xì)胞對蛋白酶體抑制劑誘導(dǎo)的凋亡敏感5F11是一種抗CD30的全人單克隆抗體，已經(jīng)顯示在體外及體內(nèi)有效誘導(dǎo)表達(dá)CD30的淋巴瘤細(xì)胞系的生長停滯或殺傷。但是，某些細(xì)胞系證明對5F11誘導(dǎo)的凋亡有部分乃至完全抗性。在該實(shí)施例中，測試了5F11和硼替佐米的組合的效果，硼替佐米是一種具有抗腫瘤活性的蛋白酶體抑制劑。使用XTT存活檢驗(yàn)、TUNEL測定和FACS分析，發(fā)現(xiàn)5F11和硼替佐米對何杰金細(xì)胞系(L540，L428)和表達(dá)CD30的ALCL Karpas 299有協(xié)同細(xì)胞毒性作用。而且，SCID小鼠中皮下L540來源的人何杰金腫瘤的生長被5F11和硼替佐米的組合抑制，而單獨(dú)每種藥物的組合效果效果較差。在體外所見的5F11和硼替佐米的協(xié)同作用依賴于使用的日程，僅在同時加入兩者或者首先用5F11預(yù)孵育細(xì)胞時觀察到。
材料與方法細(xì)胞系何杰金來源的細(xì)胞系(L540和L428)、間變性大細(xì)胞淋巴瘤來源的Karpas299和CD30-陰性急性淋巴性白血病來源的細(xì)胞系REH從德國微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(German Collection ofMicroorganisms and Cell Cultures(DMSZ))獲得，以前已有描述。所有細(xì)胞都在添加了10％(v/v)熱滅活的胎牛血清(FCS)、50μg/ml鏈霉素、50μg/ml青霉素和2mM L-谷氨酰胺的RPMI-1640培養(yǎng)基中在37℃和5％CO2氣氛下培養(yǎng)。培養(yǎng)基在進(jìn)行試驗(yàn)前24小時每周更換兩次。在FCS和不含抗生素的培養(yǎng)基(簡單培養(yǎng)基)中進(jìn)行測定。
抗體、試劑和質(zhì)?？笴D30抗體5F11由Medarex Inc.(Bloomsbury，NJ)惠贈。山羊抗人Fc抗體(GaH)購自Dianova/Jackson，USA。蛋白酶體抑制劑MG-132購自Calbiochem，CA，硼替佐米(Velcade)購自Millennium，MA。
兔抗p65-IgG和FITC-標(biāo)記的小鼠抗兔IgG從Santa Cruz，USA獲得。測定NF-κB激活的表達(dá)載體和報道構(gòu)建體(NF-κB-luc，IkBaM)購自Clontech，BD Biosciences，CA(Mercury Vector Set)。
XTT-試驗(yàn)96孔微量滴定板(組織培養(yǎng)級，平底)的每個孔中培養(yǎng)2×104個細(xì)胞。細(xì)胞在37℃下與5μg/ml抗CD30抗體5F11和25μg/ml交聯(lián)的抗體山羊抗人(GaH)預(yù)孵育。孵育30分鐘后，添加指定濃度的硼替佐米，每孔的總體積最多200μl，細(xì)胞在37℃下孵育48小時。每個測定一式三份進(jìn)行。對照孔的孵育時間和濃度(單獨(dú)的和組合的每種抗體，硼替佐米而不含5F11)如上所述。
為了測定細(xì)胞存活率，將細(xì)胞用含有1.49mM XTT和0.025mM吩嗪硫酸甲酯的新鮮簡單培養(yǎng)基脈沖4小時，應(yīng)用ELISA讀數(shù)器(Bio-Tek，Winooski，Vermont，USA)測量樣品在450nm和650nm(參考波長)的分光光度吸收值。計(jì)算與未處理的對照培養(yǎng)相比，達(dá)到四唑鎓甲酰苯胺(tetrazolium carboxanilide)更新的50％減少所需的濃度(IC50)。
瞬時轉(zhuǎn)染和螢光素報道基因測定在1ml培養(yǎng)基中的5×106L428細(xì)胞通過電穿孔用10μg NF-κB-luc、IkBaM和CMV-GFP瞬時轉(zhuǎn)染。將細(xì)胞接種于含有另外2ml簡單培養(yǎng)基的六孔板中。37℃孵育24小時后，檢測GFP轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的綠色熒光，作為瞬時轉(zhuǎn)染率的指示，瞬時轉(zhuǎn)染率為5％至10％不等。在37℃下，細(xì)胞與20μg/ml 5F11+100μg/ml GaH孵育2小時，或與10ng/ml硼替佐米或這兩者或簡單培養(yǎng)基孵育12小時。收集細(xì)胞后，用PBS(磷酸緩沖液)洗滌兩次。
用1ml冰冷的報道裂解緩沖液(Promega)進(jìn)行裂解，裂解液在-70℃冷凍1小時。使用30μl裂解液在96孔光度板(luminometry-plate)中測定螢光素酶活性，并通過發(fā)光法(luminometry)分析。使用用報道基因轉(zhuǎn)染的未處理的細(xì)胞獲得基線NF-κB活性。所有測定都一式三份進(jìn)行，以獲得平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。
TUNEL測定和使用間接免疫熒光的NF-κB檢測提供細(xì)胞離心涂片器(Cytospins)(1min，1000U/min)以在單細(xì)胞水平上測定5F11和/或硼替佐米對L428和L540細(xì)胞中的凋亡和NFκB-激活的作用。將2×105個細(xì)胞接種到六孔微量滴定板上的3ml簡單培養(yǎng)基(對照)中，或含有5F11+GaH(5μg/25μg/ml)或硼替佐米(10nM)或兩者。5F11的孵育時間為30分鐘，交聯(lián)的GaH為1小時，硼替佐米為至少6小時，均在37℃下。玻片在室溫下干燥過夜，用冰冷的丙酮固定(孵育30秒鐘)。用原位細(xì)胞死亡檢測試劑盒(In Situ Cell Death Detection Kit，TMR red(Roche))按照廠商說明進(jìn)行TUNEL試驗(yàn)。最后，細(xì)胞用含有DAPI的VECTASHIELD封固培養(yǎng)基(Mounting Medium)(Vector Laboratories，Burlingame，CA)封固，或用兔抗-p65抗體(Santa Cruz，10nM)和FITC標(biāo)記的小鼠抗兔第二抗體(10nM)染色。細(xì)胞離心涂片器制品通過熒光顯微鏡檢查進(jìn)行分析。
為了排除非特異性抗體結(jié)合，未處理的細(xì)胞的玻片用兔抗p65-IgG或FITC-偶聯(lián)的小鼠抗兔-IgG或DAPI染色。
膜聯(lián)蛋白V結(jié)合試驗(yàn)2×105L540細(xì)胞與5F11/GaH、硼替佐米或兩者在如上所述的簡單培養(yǎng)基中37℃孵育12小時(一式三份)。為了檢測凋亡細(xì)胞，在如推薦的用偶聯(lián)到熒光素的膜聯(lián)蛋白V染色后，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測磷脂酰絲氨酸向質(zhì)膜外部小葉的移位(FACS calibur Bengton &Dickinson流式細(xì)胞儀)(膜聯(lián)蛋白V-FITC凋亡檢測試劑盒I，BDBioscience，USA)。利用三份重復(fù)計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。
SDS-PAGE和Western印跡分析在1×Laemmli溶液中制備全細(xì)胞蛋白質(zhì)提取物(10μg)，使用4-15％的凝膠通過十二烷基硫酸鈉凝膠電泳(SDS-PAGE)分離。將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜(Hybond-C，Amersham Pharmacia Biotech Inc.，F(xiàn)reiburg，Germany)上，用Roti-Block(Roth，Karlsruhe，Germany)在室溫下封閉1小時。免疫印跡與從Apoptosis Sampler Kits I和II(BDBioscience，CA)獲得的第一抗體在含10％胎牛血清的PBS中孵育。c-flip特異性抗體購自Sigma(F-6550)。結(jié)合的抗體1/10000稀釋的辣根過氧化物酶偶聯(lián)的驢抗小鼠或兔IgG mAb第二抗體(Dianova，Hamburg，Germany)或辣根過氧化物酶偶聯(lián)的山羊抗小鼠IgG(Dianova)檢測。按照廠商說明，用ECL Western印跡檢測試劑(Amersham Pharmacia)顯示蛋白質(zhì)。
電泳遷移率變動分析進(jìn)行電泳遷移率變動分析(EMSA)來顯示NF-κB與DNA的結(jié)合。來自不同抗體處理的細(xì)胞的核蛋白質(zhì)提取物(5μg；20mMHEPES，pH 7.9，400mM NaCl，1mM EDTA，1mM EGTA)與32p-標(biāo)記的具有NF-κB結(jié)合序列的寡核苷酸(Santa Cruz)在室溫下孵育30分鐘。在6％非變性聚丙烯酰胺凝膠上利用電泳分離DNA/蛋白質(zhì)復(fù)合物。
人HD的異種移植模型人HD的異種移植模型在以前已經(jīng)描述(17)。通過將重懸浮在200μL PBS中的L540Cy細(xì)胞(1×107)注射到無病原體重度聯(lián)合免疫缺陷(SCID)小鼠(FOX CHASE SCID；Taconic M&B A/S，Ry，Denmark)的右脅中建立皮下實(shí)體L540Cy腫瘤。每3天測量腫瘤發(fā)展，使用公式(長度×寬度×高度/2)確定腫瘤體積。具有建立的大約100mm3的腫瘤的動物隨機(jī)分為4組，接受100μg 5F11(在200μL PBS中，腹膜內(nèi))，6小時后經(jīng)尾靜脈靜脈內(nèi)接受10ng硼替佐米或單獨(dú)的每種試劑，總共注射4次。對照小鼠只接受PBS。當(dāng)對照組腫瘤直徑中值超過2500mm3時(第50天)，停止實(shí)驗(yàn)并殺死小鼠。治療組和對照組各由4只動物組成，結(jié)果經(jīng)重復(fù)實(shí)驗(yàn)證實(shí)。
結(jié)果5F11抗體和硼替佐米的組合提高了針對HD-和ALCL-來源的細(xì)胞系的細(xì)胞毒性在單細(xì)胞水平上分析了部分凋亡抗性HD來源的細(xì)胞系L540對5F11的細(xì)胞反應(yīng)。為了同時顯示5F11的結(jié)合和凋亡，在進(jìn)行TUNEL測定之前，將L540細(xì)胞與5F11和FITC標(biāo)記的交聯(lián)山羊抗人抗體一起孵育。所有L540細(xì)胞都在與5F11和GaH-FITC孵育后染色，表明整個群體都是CD30陽性的。使用這些細(xì)胞的TUNEL測定表明所有細(xì)胞都以相當(dāng)?shù)乃浇Y(jié)合5F11，而只有一部分細(xì)胞凋亡。這些數(shù)據(jù)提示L540細(xì)胞通過5F11對CD30刺激的差異應(yīng)答可能是由于甚至在單細(xì)胞型中下游信號分子的異源表達(dá)。已知在何杰金氏細(xì)胞中表達(dá)的一種這樣的候選物是轉(zhuǎn)錄因子NF-κB，它保護(hù)腫瘤細(xì)胞免于凋亡。
如果5F11誘導(dǎo)L540細(xì)胞中的NF-κB激活，從而使這些細(xì)胞耐受凋亡，則在NF-κB抑制時凋亡率應(yīng)當(dāng)提高。因此，將細(xì)胞暴露于MG132與5F11/GaH的組合，MG132是一種已知抑制NF-κB阻抑物IkB降解的蛋白酶體抑制劑。5F11和MG132的組合在大多數(shù)細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡，盡管每種試劑都使用亞毒性濃度。利用膜聯(lián)蛋白-V染色和FACS分析對凋亡率進(jìn)行定量。單獨(dú)的抗體或MG132沒有使凋亡較對照組增多，而組合的凋亡率大約為60％?？傊?，數(shù)據(jù)證明5F11-介導(dǎo)的CD30交聯(lián)和硼替佐米對凋亡的誘導(dǎo)具有協(xié)同作用(參見，圖M-1G)。
5F11和蛋白酶體抑制的細(xì)胞毒性能力通過對不同細(xì)胞系的XTT存活率試驗(yàn)來確定。顯示的是使用蛋白酶體抑制劑bortexomib的實(shí)驗(yàn)，但是用MG132獲得類似的結(jié)果(數(shù)據(jù)未示出)。在檢測的每一種細(xì)胞系中，硼替佐米與5F11的組合顯然降低了細(xì)胞存活率。在導(dǎo)致存活率最小降低的硼替佐米濃度(25ng/ml)時，當(dāng)用亞毒性濃度的5F11預(yù)處理時，L540細(xì)胞被完全殺死。對于Karpas 299細(xì)胞和L428細(xì)胞獲得類似的結(jié)果，它們甚至在較高濃度時仍耐受5F11(17)。為了分析5F11預(yù)孵育是否是協(xié)同作用所必需的，將順序改變?yōu)槭紫葘428與硼替佐米孵育30分鐘，然后與抗體孵育。如圖2所示，這種設(shè)置沒有提高硼替佐米的細(xì)胞毒活性。因此，5F11結(jié)合誘導(dǎo)的CD30信號可能對于硼替佐米對HD-來源的細(xì)胞系的細(xì)胞毒性的顯著提高是非常重要的。
為了證明細(xì)胞毒性協(xié)同作用對CD30是否是特異性的，用不表達(dá)CD30的急性淋巴細(xì)胞性白血病細(xì)胞系REH進(jìn)行XTT試驗(yàn)。REH細(xì)胞也被硼替佐米以劑量依賴的方式殺死，而與5F11預(yù)孵育對其細(xì)胞毒性能力沒有影響(圖2E)。
5F11和硼替佐米組合在人何杰金氏模型中的體內(nèi)活性也在實(shí)體皮下L540Cy何杰金氏腫瘤模型中分析了硼替佐米和5F11組合的活性。向荷瘤小鼠給予5F11、硼替佐米、5F11和硼替佐米的組合、或PBS。動物首先注射5F11，然后在6小時后施用硼替佐米；重復(fù)治療一次4天(q×天×4)。如圖3所示，與接受PBS的對照組相比，5F11和硼替佐米都誘導(dǎo)顯著延遲的腫瘤生長。在用5F11和硼替佐米的組合處理的動物中獲得甚至更具有希望的結(jié)果，因?yàn)槟[瘤生長幾乎完全被抑制。最重要的是，生長抑制在治療后保持?jǐn)?shù)周(用箭頭標(biāo)出)，而單獨(dú)接受5F11或硼替佐米的動物的腫瘤顯示腫瘤進(jìn)展。來源于如所示治療的L540荷瘤小鼠的腫瘤切片用蘇木精染色。組織內(nèi)腫瘤細(xì)胞的密度在5F11聯(lián)合硼替佐米治療后顯著降低。治療6周后L540腫瘤的組織學(xué)檢查顯示來源于5F11和硼替佐米聯(lián)合治療的小鼠的腫瘤組織內(nèi)具有無腫瘤區(qū)。
5F11依賴的CD30信號激活NF-κB用抗-p65mab和FITC標(biāo)記的第二抗體對甲醇固定的未處理的L540細(xì)胞檢測F-κB亞單位p65。NF-κB的表達(dá)水平和核定位在用交聯(lián)的5F11刺激后提高，而暴露于硼替佐米導(dǎo)致細(xì)胞核中不含NF-κB(細(xì)胞核用DAPI染色)。
數(shù)據(jù)提示單獨(dú)的5F11可能不足以在所有何杰金氏細(xì)胞系中誘導(dǎo)凋亡，抗性群體似乎表現(xiàn)出提高的對硼替佐米的敏感性。這種作用可能是由于存活因子NF-κB的活化，NF-κB是HD中凋亡抗性的一種關(guān)鍵因子。另外，NF-κB是最佳表征的硼替佐米的靶標(biāo)之一。在與交聯(lián)的5F11和/或硼替佐米孵育后分析何杰金細(xì)胞系L540和L428中的NF-κB的亞細(xì)胞分布。在未處理的L540細(xì)胞中可檢測到低水平的NF-κB亞單位p65的表達(dá)。該蛋白質(zhì)定位于細(xì)胞質(zhì)中，部分在細(xì)胞核中，反映了NF-κB在何杰金氏細(xì)胞中的組成型表達(dá)(4)。與5F11/GaH孵育誘導(dǎo)了NF-κB依賴性抗體染色和核積累的提高，證明了響應(yīng)于CD30信號的NF-κB激活。當(dāng)5F11刺激后30分鐘給予硼替佐米時這種作用被抑制，并且導(dǎo)致細(xì)胞核不含NF-κB，這在6和8小時后觀察到。與未處理的細(xì)胞的NF-κB染色的比較表明甚至組成型表達(dá)的NF-κB也被隔離在細(xì)胞質(zhì)中。分析NF-κB分布的L428細(xì)胞在5F11+/-硼替佐米處理后獲得類似的結(jié)果。
利用NF-κB-反應(yīng)性螢光素酶報道基因轉(zhuǎn)染的L428細(xì)胞測定NF-κB轉(zhuǎn)錄活性的激活(圖4)。5F11刺激導(dǎo)致報道基因大約2倍激活。這種激活在硼替佐米的存在下被抑制，這也降低了NF-κB報道基因的基線活性。當(dāng)編碼IkBaM(即NF-κB抑制劑IkB的組成活性突變體)的表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染時，沒有觀察到螢光素酶基因的激活，表明測定的效應(yīng)是NF-κB特異性的。暴露于5F11后細(xì)胞中NF-κB的DNA結(jié)合活性用電泳遷移率變動分析(EMSA)進(jìn)行測定。在未處理的L540和L428細(xì)胞中可以檢測到NF-κB DNA結(jié)合，暴露于交聯(lián)的5F11提高了這兩種細(xì)胞系中的DNA結(jié)合。在這種設(shè)置下使用抗CD30抗體Ber-H2作為不能激活NF-κB的對照(泳道3和6)，它們不誘導(dǎo)HD-來源的細(xì)胞系對硼替佐米的敏感性的任何提高，如在XTT試驗(yàn)中所測定的。發(fā)現(xiàn)5F11-處理的L540細(xì)胞的活細(xì)胞顯示強(qiáng)NF-κB染色，而這在凋亡細(xì)胞中未見到，從而支持了上述觀點(diǎn)。
5F11和硼替佐米調(diào)節(jié)抗凋亡蛋白c-flip的表達(dá)水平已經(jīng)報道有幾種因子阻斷凋亡級聯(lián)，因此，通過Western印跡法測定與前存活(pro-survival)基因的NF-κB激活有關(guān)的候選蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。有意思的是，觀察到半胱天冬酶(caspase)抑制劑c-flip的表達(dá)具有最顯著的變化。在用5F11刺激CD30后，在L540和L428細(xì)胞中c-flip被強(qiáng)烈誘導(dǎo)。相反，在細(xì)胞與硼替佐米共孵育6、8、16小時后觀察到c-flip的下調(diào)。只觀察到bcl-2和bax表達(dá)有較少改變，在5F11交聯(lián)或硼替佐米處理后TRADD和FADD的表達(dá)水平保持不變。
討論該實(shí)施例提供了證據(jù)證明HD細(xì)胞對CD30介導(dǎo)的細(xì)胞死亡的耐受性是由于NF-κB的激活，這可以用蛋白酶體抑制劑硼替佐米處理而克服。這一結(jié)論基于以下幾點(diǎn)(1)在單細(xì)胞水平上分析通過人抗體5F11的CD30刺激對NF-κB表達(dá)的影響，其中觀察到抗性細(xì)胞的凋亡中表達(dá)提高。這在對5F11-介導(dǎo)的細(xì)胞死亡不敏感的L428細(xì)胞系中觀察到，也在部分敏感性細(xì)胞系L540的抗性群體中觀察到；和(2)在5F11存在下使用亞毒性濃度的硼替佐米抑制NF-κB導(dǎo)致凋亡急劇增加。這在體外和皮下HD腫瘤模型中均得到證明，因?yàn)?F11和硼替佐米的組合比單獨(dú)的每種試劑更有效地抑制腫瘤生長。這種組合相對于單獨(dú)5F11治療的優(yōu)點(diǎn)在2-3周后最突出，反映了5F11介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)的動力學(xué)。開始時用5F11刺激在某些細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡，而抗性細(xì)胞顯示增殖率等同于、甚至高于未處理的對照細(xì)胞所估計(jì)的。盡管在許多研究中已經(jīng)使用CD30受體進(jìn)行靶向免疫治療，但是對許多單克隆抗體和抗體-毒素偶聯(lián)物的臨床評價卻令人失望(18-21)。一個例子是未偶聯(lián)的mAb Ber-H2，它能夠在體外有效地殺死惡性腫瘤細(xì)胞，但是在臨床上顯示沒有治療上的益處(20)。非常類似的，與皂草素毒素偶聯(lián)的Ber-H2的免疫毒素在HD患者中只顯示短暫的反應(yīng)(21)。此處提供的數(shù)據(jù)提示CD30引導(dǎo)的免疫治療與硼替佐米的組合將改善臨床結(jié)果。
TNF-R1是TNF家族的受體，能夠通過銜接蛋白(adapterprotein)的募集引發(fā)凋亡，但是也能夠通過NF-κB激活和抗凋亡靶基因保護(hù)細(xì)胞免于死亡(最新綜述；22)。在轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞中，與TNF-R2、CD40或CD30共同刺激可以提高TNF-RI-誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。這似乎依賴于TRAF2的消耗(23)，TRAF2是對于NF-κB激活非常關(guān)鍵的TNF-R相關(guān)因子之一。CD30介導(dǎo)的共轉(zhuǎn)染的TRAF-2的消耗、NF-κB失活和提高的凋亡在轉(zhuǎn)染的胚胎腎癌細(xì)胞系(24，25)和ALCL系Karpas299(15)中也觀察到。然而，這一機(jī)制迄今為止還沒有在HD來源的細(xì)胞中得到證明，最近對于TRAF1，已經(jīng)報道了在HD淋巴瘤和ALCL來源的細(xì)胞中的一種不同的功能(26)。相反，該實(shí)施例證明使用硼替佐米直接抑制NF-κB途徑顯然提高了HD和ALCL來源的細(xì)胞系中CD30介導(dǎo)的凋亡率。
用硼替佐米使原來的抗性腫瘤細(xì)胞對TRAIL介導(dǎo)的凋亡敏感主要不依賴于NF-κB抑制，因?yàn)榘腚滋於?的切割提高(27)和抗凋亡蛋白c-flip的減少(28)似乎分別克服了抗性。我們觀察到被NF-κB上調(diào)并且也經(jīng)歷泛素化和蛋白酶體降解的c-flip的表達(dá)(29，30)在CD30刺激后被激活，但是當(dāng)添加硼替佐米時降低。有意思的是，最近顯示c-flip是H-RS細(xì)胞中死亡受體抗性的關(guān)鍵調(diào)節(jié)物(31-33)。HD細(xì)胞中c-flip的表達(dá)也依賴于CD30、CD40和RANK信號調(diào)節(jié)的異?；钚缘腗EK/ERK途徑(34)。
NF-κB報道基因測定、免疫熒光和Western印跡分析證明，5F11刺激導(dǎo)致最初NF-κB和下游抗凋亡蛋白c-flip的初期激活，提示通過5F11的CD30信號傳導(dǎo)可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞對硼替佐米的敏感性?？梢缘贸鼋Y(jié)論，當(dāng)CD30刺激與蛋白酶體抑制組合時，凋亡誘導(dǎo)和生長刺激的平衡響應(yīng)于CD30信號而向凋亡轉(zhuǎn)移。在本實(shí)施例中觀察到的5F 11和硼替佐米組合的體外和體內(nèi)活性提示對于HD患者的治療具有治療價值。
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等同方案僅僅應(yīng)用常規(guī)實(shí)驗(yàn)，本領(lǐng)域技術(shù)人員就將認(rèn)識到或者能夠確定，在此處描述的本發(fā)明特定實(shí)施方案的許多等同方案。這種等同方案意欲包含在下面的權(quán)利要求中。
作為參考引入在此將所有此處引用的專利、未決的專利申請和其他出版物均整體引入作為參考。
序列表序列表<110>米德列斯公司等<120>治療CD30陽性淋巴瘤的方法<130>MXI-327PC<150>60/615284<151>2004-10-01<160>53<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>348<212>DNA<213>人<220>
<221>CDS<222>(1)...(348)<400>1gag gtg cag ttg gtg gag tct ggg gga ggc ttg gtc cag cct ggg ggg48Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15tcc ctg aga ctc tcc tgt gta gcc tct gga ttc acc ttt agt aac tct96Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ser20 25 30tgg atg agc tgg gtc cgc cag gct cca ggg aaa ggg ctg gag tgg gtg144Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45gcc aac ata aac gaa gat gga agt gag aaa ttc tat gtg gac tct gtg192Ala Asn Ile Asn Glu Asp Gly Ser Glu Lys Phe Tyr Val Asp Ser Val50 55 60aag ggc cga ttc acc ttc tcc aga gac aac gcc gag aac tca ctg tat240Lys Gly Arg Phe Thr Phe Ser Arg Asp Asn Ala Glu Asn Ser Leu Tyr65 70 75 80ctg caa atg aac agc ctg aga gcc gag gac acg gct gtg tat tac tgt288Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95gcg agg gtt cat tgg tac ttc cat ctc tgg ggc cgt ggc acc ctg gtc336Ala Arg Val His Trp Tyr Phe His Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val100 105 110act gtc tcc tca348Thr Val Ser Ser115<210>2<211>116<212>PRT<213>人<400>2Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ser20 25 30Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ala Asn Ile Asn Glu Asp Gly Ser Glu Lys Phe Tyr Val Asp Ser Val50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Phe Ser Arg Asp Asn Ala Glu Asn Ser Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95
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<221>CDS<222>(1)...(336)<400>9cag gtg cag cta cag cag tgg ggc gca gga ctg ttg aag cct tcg gag48Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu1 5 10 15acc ctg tcc ctc acc tgc gct gtc tat ggt ggg tcc ttc agt gct tac96Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Ala Tyr20 25 30tac tgg agc tgg atc cgc cag ccc cca ggg aag ggg ctg gag tgg att144Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile35 40 45ggg gac atc aat cat ggt gga ggc acc aac tac aac ccg tcc ctc aag192Gly Asp Ile Asn His Gly Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys50 55 60agt cga gtc acc ata tca gta gac acg tcc aag aac cag ttc tcc ctg240Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu65 70 75 80aag ctg aac tct gta acc gcc gcg gac acg gct gtg tat tac tgt gcg288Lys Leu Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala85 90 95agc cta act gcc tac tgg ggc cag gga agc ctg gtc acc gtc tcc tca336Ser Leu Thr Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Ser Leu Val Thr Val Ser Ser
100 105 110<210>10<211>112<212>PRT<213>人<400>10Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu15 10 15Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Ala Tyr20 25 30Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile35 40 45Gly Asp Ile Asn His Gly Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys50 55 60Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu65 70 75 80Lys Leu Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala85 90 95Ser Leu Thr Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Ser Leu Val Thr Val Ser Ser100 105 110<210>11<211>321<212>DNA<213>人<220>
<221>CDS<222>(1)...(321)<400>11gac atc cag atg acc cag tct cca acc tca ctg tct gca tct gta gga48Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Thr Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15gac aga gtc acc atc act tgt cgg gcg agt cag ggt att agc agc tgg96Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp20 25 30tta acc tgg tat cag cag aaa cca gag aaa gcc cct aag tcc ctg atc144Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile35 40 45tat gct gca tcc agt ttg caa agt ggg gtc cca tca agg ttc agc ggc192Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60agt gga tct ggg aca gat ttc act ctc acc atc agc agc ctg cag cct240Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80gaa gat ttt gca act tat tac tgc caa cag tat gat agt tac cct atc288Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Ser Tyr Pro Ile85 90 95acc ttc ggc caa ggg aca cga ctg gag att aaa321Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys100 105<210>12<211>107<212>PRT<213>人<400>12Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Thr Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp20 25 30Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile35 40 45Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Ser Tyr Pro Ile85 90 95Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys100 105<210>13<211>15<212>DNA<213>人<400>13aactcttgga tgagc15<210>14<211>5<212>PRT<213>人<400>14Asn Ser Trp Met Ser1 5<210>15<211>51<212>DNA<213>人<400>15aacataaacg aagatggaag tgagaaattc tatgtggact ctgtgaaggg c51<210>16<211>17<212>PRT<213>人<400>16Asn Ile Asn Glu Asp Gly Ser Gl u Lys Phe Tyr Val Asp Ser Val Lys1 5 10 15Gly<210>17<211>21<212>DNA<213>人<400>17gttcattggt acttccatct c 21<210>18<211>5<212>DNA<213>人<400>18yhwyh 5<210>19<211>36<212>DNA<213>人<400>19agggccagtc agagtgttag cagcagctac ttagcc 36<210>20<211>12<212>PRT<213>人<400>20Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala
1 5 10<210>21<211>21<212>DNA<213>人<400>21ggtgcatcca gcagggccac t21<210>22<211>7<212>PRT<213>人<400>22Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr1 5<210>23<211>27<212>DNA<213>人<400>23cagcagtatg gtagc tcacc gtggacg 27<210>24<211>9<212>PRT<213>人<400>24Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Trp Thr1 5<210>25<211>15<212>DNA<213>人<400>25ggttactact ggagc 15<210>26<211>5<212>PRT<213>人<400>26Gly Tyr Tyr Trp Ser1 5<210>27<211>48<212>DNA<213>人<400>27gaaatcaatc atagtggaag caccaagtac accccgtccc tcaagagc 48<210>28<211>16<212>PRT<213>人<400>28Glu Ile Asn His Ser Gly Ser Thr Lys Tyr Thr Pro Ser Leu Lys Ser1 5 10 15<210>29<211>24
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1.一種治療CD30陽性淋巴瘤的方法，包括對需要這種治療的患者施用治療有效量的(i)結(jié)合CD30的單克隆抗體，和(ii)抑制NF-κB活性的化合物。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述抑制NF-κB活性的化合物是蛋白酶體抑制劑。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述蛋白酶體抑制劑抑制26S蛋白酶體的糜蛋白酶樣活性。
4.權(quán)利要求2的方法，其中所述蛋白酶體抑制劑選自硼替佐米、ALLnL(N-乙酰基-亮氨酰-亮氨酰-正亮氨醛，MG101)、LLM(N-乙?；?亮氨酰-亮氨酰-甲硫氨醛)、Z-LLnV(芐氧羰基-亮氨酰-亮氨酰-正纈氨醛，MG115)、Z-LLL(芐氧羰基-亮氨酰-亮氨酰-亮氨醛，MG132)、乳胞素及其β-內(nèi)酯、硼酸肽、泛素連接酶抑制劑、環(huán)孢菌素A、FK506(他克莫司)和脫氧精胍菌素。
5.一種治療CD30陽性淋巴瘤的方法，包括對需要這種治療的患者施用治療有效量的人單克隆抗體5F11和硼替佐米。
6.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中所述患者在蛋白酶體抑制劑給藥之前接受抗體給藥。
7.一種治療CD30陽性淋巴瘤的方法，包括對需要這種治療的患者施用治療有效量的抑制NF-κB的化合物，其中所述患者以前接受過包括施用治療有效量的抗CD30抗體的治療。
8.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中所述抗體包括人IgG重鏈和人κ輕鏈。
9.權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的方法，其中所述抗體包括人IgG1或IgG3重鏈。
10.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中所述單克隆抗體包括包含F(xiàn)R1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4序列的人重鏈可變區(qū)和包含F(xiàn)R1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4序列的人輕鏈可變區(qū)，其中(a)人重鏈可變區(qū)CDR3序列選自SEQ ID NO18、30和42及其保守修飾；(b)人輕鏈可變區(qū)CDR3序列選自SEQ ID NO24、36和48及其保守修飾；(c)該抗體以至少107M-1的親和常數(shù)與人CD30結(jié)合；(d)該人抗體在抗體依賴的細(xì)胞毒性(ADCC)試驗(yàn)中介導(dǎo)CD30+腫瘤細(xì)胞的裂解；和(e)該人抗體在體內(nèi)抑制CD30+腫瘤細(xì)胞的生長。
11.權(quán)利要求10的方法，其中人重鏈可變區(qū)CDR2序列選自SEQ ID NO17、29和41及其保守修飾；人輕鏈可變區(qū)CDR2序列選自SEQ ID NO23、35和47及其保守修飾。
12.權(quán)利要求11的方法，其中人重鏈可變區(qū)CDR1序列選自SEQ ID NO16、28和40及其保守修飾；人輕鏈可變區(qū)CDR1序列選自SEQ ID NO22、34和46及其保守修飾。
13.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中所述抗體以至少108M-1的親和常數(shù)與人CD30結(jié)合。
14.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中所述抗體以至少109M-1的親和常數(shù)與人CD30結(jié)合。
15.權(quán)利要求10的方法，其中人重鏈可變區(qū)FR1、FR2、FR3和FR4序列來源于人重鏈VH4-34或VH3-11種系序列。
16.權(quán)利要求10的方法，其中人輕鏈可變區(qū)FR1、FR2、FR3和FR4序列來源于人輕鏈L15、A27或L6種系序列。
17.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中所述抗體包括人重鏈可變區(qū)和人輕鏈可變區(qū)，其中(a)人重鏈可變區(qū)包括選自SEQ ID NO2、6、10的氨基酸序列和與SEQ ID NO2、6和10至少80％同源的序列；(b)人輕鏈可變區(qū)包括選自SEQ ID NO4、8、12的氨基酸序列和與SEQ ID NO4、8和12至少80％同源的序列；(c)該人抗體以至少107M-1的親和常數(shù)與人CD30結(jié)合；(d)該人抗體在抗體依賴的細(xì)胞毒性(ADCC)試驗(yàn)中介導(dǎo)CD30+腫瘤細(xì)胞的裂解；和(e)該人抗體在體內(nèi)抑制CD30+腫瘤細(xì)胞的生長。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述抗體以至少108M-1的親和常數(shù)與人CD30結(jié)合。
19.權(quán)利要求17的方法，其中所述抗體以至少109M-1的親和常數(shù)與人CD30結(jié)合。
20.權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)的方法，其中所述抗體包括來源于人重鏈VH4-34種系序列的人重鏈可變區(qū)和來源于人輕鏈L15種系序列的人輕鏈可變區(qū)，其中(a)人重鏈可變區(qū)包括SEQ ID NO10的氨基酸序列或與SEQ IDNO10至少80％同源的序列；(b)人輕鏈可變區(qū)包括SEQ ID NO12的氨基酸序列或與SEQ IDNO12至少80％同源的序列；(c)該人抗體以至少107M-1的親和常數(shù)與人CD30結(jié)合；(d)該人抗體在抗體依賴的細(xì)胞毒性(ADCC)試驗(yàn)中介導(dǎo)CD30+腫瘤細(xì)胞的裂解；和(e)該人抗體在體內(nèi)抑制CD30+腫瘤細(xì)胞的生長。
21.權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)的方法，其中所述抗體包括分別包含SEQ ID NO2和SEQ ID NO4所示氨基酸序列的人重鏈可變區(qū)和人輕鏈可變區(qū)。
22.權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)的方法，其中所述抗體包括分別包含SEQ ID NO6和SEQ ID NO8所示氨基酸序列的人重鏈可變區(qū)和人輕鏈可變區(qū)。
23.權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)的方法，其中所述抗體包括分別包含SEQ ID NO10和SEQ ID NO12所示氨基酸序列的人重鏈可變區(qū)和人輕鏈可變區(qū)。
24.權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)的方法，其中所述抗體由雜交瘤產(chǎn)生，其中所述雜交瘤是由從轉(zhuǎn)基因非人動物中獲得的B細(xì)胞與無限增殖化細(xì)胞融合而制備的，該動物具有包括人重鏈轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)染色體和人輕鏈轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)染色體的基因組。
25.權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)的方法，其中所述抗體選自5F11、AC-10、HeFi-1或與5F11、AC-10、HeFi-1競爭結(jié)合CD-30的抗體。
26.一種抑制表達(dá)CD30的細(xì)胞生長的方法，包括使所述細(xì)胞接觸有效細(xì)胞生長抑制量的抗體和蛋白酶體抑制劑，使所述細(xì)胞的生長受到抑制。
27.一種治療或預(yù)防以CD30表達(dá)性腫瘤細(xì)胞生長為特征的疾病的方法，包括給患者施用結(jié)合CD30的單克隆抗體和蛋白酶體抑制劑。
28.權(quán)利要求27的方法，其中所述疾病選自何杰金氏病、間變性大細(xì)胞淋巴瘤(ALCL)、成人T細(xì)胞淋巴瘤(ATL)、血管免疫母細(xì)胞淋巴結(jié)病(AILD)樣T細(xì)胞淋巴瘤、HIV相關(guān)的基于體腔的淋巴瘤、胚胎癌、未分化的鼻咽癌(如施明克瘤)、卡斯?fàn)柭?、卡波西肉瘤和其他T細(xì)胞或B細(xì)胞淋巴瘤。
29.權(quán)利要求27的方法，其中所述疾病是何杰金氏病。
30.權(quán)利要求27的方法，其中所述疾病是非何杰金氏淋巴瘤。
31.權(quán)利要求30的方法，其中所述非何杰金氏淋巴瘤是間變性大細(xì)胞淋巴瘤(ALCL)。
全文摘要
公開了使用抗CD30抗體和蛋白酶體抑制劑聯(lián)合治療以CD30表達(dá)為特征的淋巴瘤的方法。
文檔編號C07K16/28GK101056655SQ200580038361
公開日2007年10月17日 申請日期2005年9月30日 優(yōu)先權(quán)日2004年10月1日
發(fā)明者T·凱萊爾, E·P·V·施特蘭德曼, A·恩格爾特, P·博爾希曼, B·伯爾 申請人:米德列斯公司