專利名稱：用于將化合物導(dǎo)入神經(jīng)細胞的轉(zhuǎn)運蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種結(jié)合于神經(jīng)元的轉(zhuǎn)運蛋白，其由受體介導(dǎo)的胞吞作用調(diào)節(jié)并且從酸性內(nèi)體小室(endosomal compartment)轉(zhuǎn)移進入神經(jīng)元胞質(zhì)液。該蛋白質(zhì)被用作轉(zhuǎn)運手段用于轉(zhuǎn)移其它化學(xué)物質(zhì)(例如蛋白酶)，該蛋白酶是不能生理學(xué)地穿過質(zhì)膜滲入神經(jīng)細胞胞質(zhì)液。本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)運蛋白用于抑制神經(jīng)遞質(zhì)釋放的用途。
背景技術(shù)：
神經(jīng)細胞通過胞吐作用釋放遞質(zhì)。胞內(nèi)泡囊的膜與質(zhì)膜的融合稱為胞吐作用。在這一加工過程中，將泡囊的內(nèi)容物同時地排至突觸間隙。兩種膜的融合由鈣調(diào)節(jié)，與蛋白質(zhì)突觸結(jié)合蛋白(synaptotagmin)發(fā)生反應(yīng)。與其它輔助因子突觸結(jié)合蛋白一起控制三個所謂的融合蛋白SNAP-25、小突觸泡蛋白2和突觸融合蛋白1A的狀態(tài)。而突觸融合蛋白1A和小突觸泡蛋白2被整合進入血漿和/或泡囊膜中，SNAP-25僅松弛地結(jié)合于質(zhì)膜。三種蛋白質(zhì)彼此結(jié)合至胞內(nèi)鈣濃度增加的程度，彼此兩個膜靠近，接著融合在一起。在釋放膽堿能神經(jīng)元乙酰膽堿情況下，會引起肌肉收縮，出汗及其它膽堿能激發(fā)反應(yīng)。
上述的融合蛋白是靶分子(底物)梭菌神經(jīng)毒素輕鏈，由肉毒桿菌(Clostridium botulinum)形成。
厭氧的革蘭氏陽性細菌肉毒桿菌產(chǎn)生七種不同類型的蛋白質(zhì)神經(jīng)毒素。末尾的神經(jīng)毒素稱為肉毒桿菌神經(jīng)毒素(BoNT/A至BoNT/G)。其中，特別是BoNT/A和BoNT/B會引起人和動物神經(jīng)性麻痹的機能障礙，稱為肉毒中毒。在土壤中可以找到肉毒桿菌孢子，但在經(jīng)不正確殺菌和密封的自制食品保存時也可以生長，許多肉毒中毒情況可歸于此因。
BoNT/A是在已知生物制劑物質(zhì)中最致命的。少至5-6pg的純化BoNT/A代表一個最低致死劑量MLD(MultipleLowDose)。每個重18-20g的雌性Swiss Webster鼠腹膜內(nèi)注射后，殺死一半的一個單位(Engl.單位U)BoNT定義為MLD。七種免疫不同的BoNT得到表征。它們標示為BoNT/A、B、C1、D、E、F和G，并且可以通過與特定血清型抗體的中和而辨別。就引起的麻痹嚴重程度和持續(xù)時間而言，在被影響的動物種類中不同血清型的BoNT是不同的。這樣，就麻痹而言，例如BoNT/A在大鼠中的效力是500倍于BoNT/B。另外，已經(jīng)證明在靈長類動物中480U/kg體重的BoNT/B劑量是無毒的。相同量的BoNT/A相當(dāng)于該物質(zhì)在靈長類動物中致死量(LD)的12倍。另一方面，在老鼠身上注射BoNT/A后麻痹持續(xù)時間比注射BoNT/E后長十倍。
BoNTs在臨床上已經(jīng)用于處理神經(jīng)肌肉失調(diào)，通過骨骼肌機能亢進得到表征，是由病理性活動過度的周圍神經(jīng)引起的。BoNT/A已經(jīng)被美國食品和藥物管理局批準用于處理眼瞼痙攣、斜視和半面痙攣。相比BoNT/A，殘留的BoNT血清型明顯地有效性較小，并且顯示出較短的效力持續(xù)時間。周圍肌肉注射給藥BoNT/A的臨床效果通常觀察一周。通過一種單一肌肉注射BoNT/A的癥狀抑制持續(xù)時間通常是大約3個月。
梭菌神經(jīng)毒素專一性地水解不同融合組織的蛋白質(zhì)。BoNT/A、C1和E裂解SNAP-25，而BoNT/B、D、G以及破傷風(fēng)神經(jīng)毒素(TeNT)攻擊泡囊相關(guān)膜蛋白(vesicle-associatedmembrane protein，VAMP)2-也稱為小突觸泡蛋白2-。此外BoNT/C1也裂解突觸融合蛋白1A。
梭狀芽孢桿菌細菌釋放神經(jīng)毒素，其為單鏈多肽，都具有1251至1315個氨基酸。其后內(nèi)源蛋白酶在限定位置處將每一種這些蛋白質(zhì)分解為2條鏈(切斷)，然而兩條殘留的鏈通過二硫橋相連結(jié)。這些雙鏈蛋白質(zhì)稱為赫勒毒素(holo-toxins)(參見Shone等(1985)，Eur JBiochem 151，75-82)。兩條鏈具有不同的功能。較小的片段即輕鏈(輕鏈LC)代表Zn2+依賴性內(nèi)切蛋白酶，而較大的單元(重鏈HC)代表輕鏈的轉(zhuǎn)運手段。通過用內(nèi)肽酶處理HC，產(chǎn)生兩個50kDa片段(參見Gimenez等(1993)，J Protein Chem 12，351-363)。該氨基端的一半(HN片段)在低pH值下整合進入膜內(nèi)，并且使得LC能夠滲入神經(jīng)細胞胞質(zhì)液內(nèi)。羧基端的一半(Hc片段)結(jié)合于復(fù)合物聚唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂(polysialoganglioside)，該結(jié)合在神經(jīng)細胞膜中排他性地發(fā)生，并且迄今為止未鑒定蛋白質(zhì)受體(Halpern等(1993)，Curr Top MicrobialImmunol 195，221-241)。后者解釋了梭菌神經(jīng)毒素的高神經(jīng)選擇性(neuroselectivity)。晶態(tài)結(jié)構(gòu)證實BoNT/A去掉了三個結(jié)構(gòu)域，其可以通過三個步驟的作用機制進行調(diào)和(參見Lacy等(1998)，Nat Struct Biol 5，898-902)。此外，這些數(shù)據(jù)得出這樣一種結(jié)論在Hc片段內(nèi)部有兩個自主性的亞單元(亞結(jié)構(gòu)域)存在，每個25kDa。存在兩個功能性亞結(jié)構(gòu)域的第一個證據(jù)是由TeNT的Hc片段的氨基端(HCN)和羧基端一半(Hcc)產(chǎn)生的，其表達為重組體形式，并且顯示Hc-，但沒有HCN結(jié)構(gòu)域結(jié)合于神經(jīng)元(參見Herreros等(2000)，Biochem J 347，199-204)，人們在BoNT/B和G的Hcc結(jié)構(gòu)域內(nèi)部發(fā)現(xiàn)了突觸結(jié)合蛋白的蛋白質(zhì)受體結(jié)合部位，證明它們有單獨的功能性(參見Rummel等(2004)，J Biol Chem 279，30865-70)。
在生理條件下，HC結(jié)合神經(jīng)元的神經(jīng)節(jié)苷脂，這是通過受體介導(dǎo)的胞吞作用在細胞內(nèi)部得到接收，并且經(jīng)由內(nèi)體小室(endosomal compartment)到達固有的泡囊循環(huán)(vesiclecirculation)。在早期內(nèi)體(early endosomes)的酸性介質(zhì)內(nèi)，HN即HC的氨基端一半滲入泡囊膜并且形成小孔。每種經(jīng)由二硫橋與HC連接的物質(zhì)(X)將通過胞內(nèi)氧化還原系統(tǒng)從HC分裂出來，進入二硫橋并使其還原。X最終出現(xiàn)在胞質(zhì)液內(nèi)。
在梭菌神經(jīng)毒素HC是LC載體情況下，在最后的步驟中于胞質(zhì)液內(nèi)裂解它的專一性底物。融合蛋白的復(fù)合物形成和分解周期中斷，并且因此抑制了乙酰膽堿的釋放。其結(jié)果是，橫紋肌無力并且汗腺停止分泌。單獨的BoNT血清型的活性周期各不相同，并且取決于胞質(zhì)液內(nèi)完整LC的存在。因為所有神經(jīng)元都具有梭菌神經(jīng)毒素受體，不僅乙酰膽堿的釋放可能受影響，而且可能也影響P物質(zhì)、去甲腎上腺素、γ-氨基丁酸(GABA)、甘氨酸、內(nèi)啡肽及其它遞質(zhì)和激素的釋放。
膽堿能傳遞優(yōu)先受到阻塞，這可以通過在外圍的HC進入神經(jīng)元的事實得到解釋。中心突觸通過不能復(fù)蓋有蛋白質(zhì)的血腦屏障得到保護。
HC對周圍神經(jīng)細胞具有高的親合力，其主要通過與復(fù)合物聚唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂相互作用被傳遞，這些復(fù)合物聚唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂是乙二醇類脂物，由一種以上唾液酸組成(參見Halpern等(1995)，Curr Top Microbiol Immunol 195，221-41)。其結(jié)果是，與它們相結(jié)合的LC僅到達該細胞類型并且僅在這些細胞中變得有活性。BoNT/A和B每個僅僅結(jié)合一分子神經(jīng)節(jié)苷脂GT1b。
為了研究構(gòu)建結(jié)合腔的氨基酸扮演的角色，根據(jù)本發(fā)明制造出一個重組體Hc片段。該技術(shù)允許交換單獨的氨基酸，這樣，荷正電的氨基酸可以由荷負的電或者中性的氨基酸代替，反之亦然。結(jié)合腔表面的輕微改變沒有對神經(jīng)節(jié)苷脂的通過能力產(chǎn)生顯著效果。例如如果用脂肪族殘基例如亮氨酸代替位于1266的氨基酸即在SXWY始動(SXWY-motive)中稱作W的色氨酸，可以顯示出親合力降低99％以上。然而，也觀察到相反的情況。擴展到結(jié)合腔中的氨基酸取代導(dǎo)致對于神經(jīng)節(jié)苷脂親合力的提高。因為結(jié)合腔的構(gòu)造對于HC對神經(jīng)節(jié)苷脂受體的親合力如此具有決定性，相關(guān)聯(lián)的LC蛋白水解效價隨著HC對神經(jīng)節(jié)苷脂受體的親合力同步地增加或者降低，與親合力相協(xié)調(diào)。
在進行配體-受體研究中，根據(jù)本發(fā)明神經(jīng)節(jié)苷脂的BoNT/A結(jié)合腔中表征并取代特定的氨基酸殘基，從而提高對神經(jīng)節(jié)苷脂受體的親合力。在神經(jīng)節(jié)苷脂和突觸體結(jié)合分析中測定突變Hc片段的親合力。隨后，顯示出相同突變的HC與LC-A耦合，為此目的，使用凝血酶敏感的氨基酸序列。重組蛋白質(zhì)被凝血酶活化(切開)，并且產(chǎn)生雙鏈分子，兩條鏈通過單一的二硫橋連結(jié)。在鼠腦--釋放遞質(zhì)的標本的突觸體中試驗該構(gòu)造的活性。抑制遞質(zhì)釋放的程度被認為是該構(gòu)造活度的測量。另外，通過分離的老鼠神經(jīng)-肌肉標本的手段(半隔膜分析，HDA)，分析該獨特構(gòu)造的效價，其代表梭菌神經(jīng)毒素的生理學(xué)目的。
將要用TrapoX處理的機能障礙和癥狀伴隨有運動神經(jīng)元和植物神經(jīng)細胞活性的集中提高。提高的活性導(dǎo)致受這些細胞刺激的肌肉疼痛性痙攣，并導(dǎo)致腺細胞過度分泌液體。另外，由于活性提高，面部皺紋發(fā)生在不同的區(qū)域。原因是病理性增加的來自周圍神經(jīng)末端的乙酰膽堿釋放。如果把TrapoX注入到損傷的肌肉，損傷肌肉的松弛、分泌物的干涸和面部皮膚的光滑在1-3天的潛伏期后發(fā)生。這是由于由TrapoX抑制了乙酰膽堿的釋放。病人變得幾乎無痛感，并且被肌肉痙攣激發(fā)的痛感減輕并完全消失。
在人以及動物身上，乙酰膽堿的釋放都得到抑制。所以習(xí)慣上使用動物試驗既作為中毒情況下BoNT證據(jù)，也用于BoNT藥物活性測定(Botox、Dysport、Xeomin)。通過在老鼠身上進行LD50測定而進行BoNT活性定量。本文中，其值為測定殺死一個動物試驗組中50％的劑量。很明顯，不同于不傷害任何動物的劑量，可以對動物給藥至殺死一組動物中的100％的劑量。因為毒物是系統(tǒng)性(腹腔注射)給藥，這樣很多動物痛苦地死于由呼吸肌麻痹引起的呼吸停止。為了避免動物試驗，我們對于老鼠半隔膜分析進行介紹。LD50試驗中，試驗老鼠因由呼吸肌麻痹引起的呼吸麻痹致死。這意味著可以從老鼠身上除掉呼吸肌，包括刺激神經(jīng)(膈神經(jīng))，并且在活體外給毒。BoNT將與其受體結(jié)合，進入細胞并移位，并且最終裂解其底物，在此處肌肉麻痹。在LD50值和呼吸肌麻痹之間有嚴格的相關(guān)性。體外試驗代表，按照本來的情況打了折扣的動物試驗?zāi)Ｐ?Wohlfarth K，Goeschel H，F(xiàn)revert J，Dengler R，Bigalke H，Botolinum A中毒單元對單元.Naunyn Schmiedeberg’s Arch Pharmacol.1997年3月；335(3)335-40)。
所以可以假定在活體外使隔膜麻痹的BoNT也在活老鼠體內(nèi)作用，根據(jù)給藥劑量殺死活鼠。如此，該動物試驗置換法證明，老鼠半隔膜分析不久將為歐盟成員國通過歐盟藥典接受，作為官方的BoNT測試方法。在老鼠隔膜標本中增加的TrapoX功效表明在人身上功效也會提高。
在更多近年來的實踐中，BoNT/A復(fù)合物用于處理運動肌張力障礙，而且用于減小過度的交感神經(jīng)活性(參見Benecke等(1995)，Akt Neurol 22，209ff)，并且用于止痛和減輕偏頭痛(參見Sycha等(2004)，J Neurol 251，19-30)。該復(fù)合物由神經(jīng)毒素、多種血細胞凝聚素和無毒的無血細胞凝聚作用的蛋白質(zhì)組成。該復(fù)合物在生理pH迅速分解。得到的神經(jīng)毒素是復(fù)合物的唯一組分，與治療相關(guān)，并且使癥狀減輕。因為深部的神經(jīng)疾病沒有治療，該復(fù)合物需要每隔三到四個月再次注射。取決于注射異種蛋白質(zhì)的數(shù)量，一些病人產(chǎn)生了專一性的BoNT/A抗體。這些病人變得對神經(jīng)毒素有抵抗力。一旦抗原敏感細胞識別出神經(jīng)毒素并且形成抗體，相關(guān)的腦細胞可以保存若干年?；谶@個原因，用活性盡可能高的制劑、盡可能小的劑量治療病人是很重要的。此外該制劑不含任何別的細菌源蛋白質(zhì)，因為它們可以作為免疫佐劑。這樣的物質(zhì)會引誘巨噬細胞，巨噬細胞會同時識別出免疫佐劑和神經(jīng)毒素，將它們遞至淋巴細胞，于是通過形成免疫球蛋白而應(yīng)答。因此，僅極純的不含任何異種蛋白質(zhì)的產(chǎn)品可以用于治療。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種轉(zhuǎn)運蛋白(Trapo)，其能克服迄今為止已知方法的上述問題。
優(yōu)選提供一種轉(zhuǎn)運蛋白(Trapo)，其對復(fù)合神經(jīng)節(jié)苷脂的親合力提高了至少三倍。
“以比天然神經(jīng)毒素更高的親合力結(jié)合于神經(jīng)細胞”。本案中，天然神經(jīng)毒素優(yōu)選肉毒桿菌的天然神經(jīng)毒素。在這里，優(yōu)選天然神經(jīng)毒素是來源于肉毒桿菌的肉毒桿菌神經(jīng)毒素A和/或肉毒桿菌神經(jīng)毒素B和/或肉毒桿菌神經(jīng)毒素G。以重組體形式從大腸桿菌(E.coli)制備的肉毒桿菌神經(jīng)毒素，其尤其含有和天然的肉毒桿菌神經(jīng)毒素一致的氨基酸序列，以同一種藥理學(xué)方式作用于天然的肉毒桿菌神經(jīng)毒素，并且稱為重組體肉毒桿菌神經(jīng)毒素野生型。在本案中提及的神經(jīng)細胞是膽堿能運動神經(jīng)元。優(yōu)選轉(zhuǎn)運蛋白專一性結(jié)合于神經(jīng)細胞膜表面上的聚唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂，比如是結(jié)合于GD1a、GD1b或者GT1b。優(yōu)選活體外測定該結(jié)合。特別優(yōu)選通過利用在實施例中詳細闡明的分析方法進行測定。
術(shù)語“肉毒桿菌形成的神經(jīng)毒素重鏈的修飾”，肉毒桿菌形成的神經(jīng)毒素重鏈(HC)的氨基酸和/或核酸序列通常購自公開的可進入的數(shù)據(jù)庫，用于每一種已知的血清型A至G(也請參見表1)。在這里修飾包括刪除、添加至少一個氨基酸，將其插入氨基酸序列中，或者天然神經(jīng)毒素中至少一個氨基酸被另一個天然產(chǎn)生或非天然產(chǎn)生的氨基酸取代，和/或在規(guī)定氨基酸序列中氨基酸進行翻譯后修飾。在這里，翻譯后修飾包括糖基化、乙?；?、酰化、脫胺化、磷酸化、異戊二烯化、糖基磷脂酰基肌醇化，和為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的進一步修飾。
由肉毒桿菌形成的神經(jīng)毒素的HC包括三個亞結(jié)構(gòu)域，即位于氨基端的50kDa大小的易位結(jié)構(gòu)域HN、其后25kDa大小的HCN結(jié)構(gòu)域和位于羧基端的25kDa的Hcc結(jié)構(gòu)域。HCN結(jié)構(gòu)域和Hcc結(jié)構(gòu)域一起標示為Hc片段。從表1明顯可知單獨血清型相應(yīng)的各個亞結(jié)構(gòu)域的氨基酸部分及其變化。
為了詳細描述具有不同BoNT血清型結(jié)構(gòu)域的雜合蛋白，引入下述術(shù)語。術(shù)語scAtAAB例如表示單鏈神經(jīng)毒素(sc)，其由四個結(jié)構(gòu)域LC、HN、HCN和Hcc組成，根據(jù)結(jié)構(gòu)域起源，用各個血清型的大寫字母標注每個結(jié)構(gòu)域。這意味著scAtAAB衍生于LC、HN和HCN，同時BoNT/A的Hcc結(jié)構(gòu)域由BoNT/B取代。小寫字母“t”代表在LC和HN之間插入的凝血酶標記序列。
表1氨基酸序列數(shù)據(jù)庫編號和七種肉毒桿菌神經(jīng)毒素的亞結(jié)構(gòu)域分布。

本發(fā)明特別涉及到一種通過修飾肉毒桿菌形成的神經(jīng)毒素的HC而得到的轉(zhuǎn)運蛋白，所述蛋白質(zhì)以比天然神經(jīng)毒素更高的親合力專一性地結(jié)合于神經(jīng)細胞，并且通過胞吞作用被這些細胞接受。
本發(fā)明提供的轉(zhuǎn)運蛋白顯示出提高了的其神經(jīng)節(jié)苷脂結(jié)合結(jié)構(gòu)域?qū)τ趶?fù)合聚唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂的專一性親合力。親合力提高優(yōu)選通過氨基酸取代或缺失而實現(xiàn)。
根據(jù)優(yōu)選實施方式，轉(zhuǎn)運蛋白顯示出比天然神經(jīng)毒素至少高15％的親合力。優(yōu)選轉(zhuǎn)運蛋白顯示出比天然神經(jīng)毒素至少高50％的親合力，尤其優(yōu)選比天然神經(jīng)毒素至少高80％的親合力，并且特別優(yōu)選比天然神經(jīng)毒素至少高90％的親合力。
根據(jù)優(yōu)選實施方式，HC修飾發(fā)生在給定神經(jīng)毒素Hc片段區(qū)域。如果修飾包括取代、缺失、插入或附加，后者例如也可以通過特異性的誘變而進行，在本文中的方法已為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知。在這里，天然神經(jīng)毒素中的氨基酸可以用天然或者非天然氨基酸修飾。氨基酸基本上被分成不同的物理化學(xué)組。天冬氨酸和谷氨酸屬于荷負電氨基酸。
組氨酸、精氨酸和賴氨酸屬于荷正電的氨基酸。天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸和酪氨酸屬于極性氨基酸。甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸和色氨酸屬于非極性氨基酸。在氨基酸中組氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸中有芳香族側(cè)基。一般來講，優(yōu)選用屬于另一個物理化學(xué)組的不同的氨基酸來取代。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，轉(zhuǎn)運蛋白是肉毒桿菌神經(jīng)毒素血清型A至G。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式中，轉(zhuǎn)運蛋白衍生于肉毒桿菌神經(jīng)毒素類型A的蛋白質(zhì)序列(數(shù)據(jù)庫No.AAA23262和CAA51824)。
本發(fā)明另一個實施方式涉及一種轉(zhuǎn)運蛋白，其中至少一個位于肉毒桿菌神經(jīng)毒素類型A(數(shù)據(jù)庫No.AAA23262和CAA51824)的蛋白質(zhì)序列第1117、1202至1204、1252至1254、1262至1267、1270和1278至1279位的氨基酸被除去或者由天然或者非天然產(chǎn)生的氨基酸取代。
本發(fā)明另一個實施方式涉及一種轉(zhuǎn)運蛋白，其中位于肉毒桿菌神經(jīng)毒素類型A的蛋白質(zhì)序列(數(shù)據(jù)庫No.AAA23262和CAA51824)第1092至1296位的氨基酸--該區(qū)域包括神經(jīng)節(jié)苷脂結(jié)合的結(jié)構(gòu)域，已被下述序列取代肉毒桿菌神經(jīng)毒素類型B蛋白質(zhì)(數(shù)據(jù)庫No.AAA23211)，第1079至1291位氨基酸，肉毒桿菌神經(jīng)毒素類型C1蛋白質(zhì)(數(shù)據(jù)庫No.CAA51313)，第1093至1291位氨基酸，肉毒桿菌神經(jīng)毒素類型D蛋白質(zhì)(數(shù)據(jù)庫No.CAA38175)，第1080至1276位氨基酸，肉毒桿菌神經(jīng)毒素類型E蛋白質(zhì)(數(shù)據(jù)庫No.CAA44558)，第1067至1252位氨基酸，
丁酸梭菌(Clostridium butyricum)神經(jīng)毒素類型E蛋白質(zhì)(數(shù)據(jù)庫No.CAA43998)，第1067至1251位氨基酸，肉毒桿菌神經(jīng)毒素類型F蛋白質(zhì)(數(shù)據(jù)庫No.CAA57358)，第1085至1278位氨基酸，巴拉蒂梭菌(Clostridium baratii)神經(jīng)毒素類型F蛋白質(zhì)(數(shù)據(jù)庫No.CAA48329)，第1076至1268位氨基酸，肉毒桿菌神經(jīng)毒素類型G蛋白質(zhì)(數(shù)據(jù)庫No.CAA52275)，第1087至1297位氨基酸。
此外，從表1明顯看出，Hcc結(jié)構(gòu)域適合于與氨基酸位置互換。
本發(fā)明另一個實施方式涉及到一種含有根據(jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)運蛋白和至少一種間插分子(X)的組合物。該間插分子可以是小的有機分子、肽或蛋白質(zhì)；優(yōu)選例如通過肽-，酯-，醚-，硫代-，二硫代-或者碳-碳鍵而共價成鍵。
另外，間插分子包括所有已知的治療用活性物質(zhì)。細胞靜止劑、抗生素、抗病毒劑，并且在這里優(yōu)選免疫球蛋白。
為了更好地利用親合力提高的Trapo，將其氨基端經(jīng)由氨基酸序列與BoNT/A、B、C1、D、E、F或者G的LC相結(jié)合，其被專一性地識別并被蛋白酶凝血酶分解，產(chǎn)生特異的TrapoX。與天然的BoNT/A相比，所述TrapoX的活性強度得到提高，并且尤其優(yōu)選所述TrapoX的活性強度提高至少2倍。該不含異種蛋白的新產(chǎn)品，由于材料的更高純度和低劑量，將顯著地降低免疫系統(tǒng)刺激。
本發(fā)明另一個實施方式涉及一種轉(zhuǎn)運蛋白，其中蛋白質(zhì)是蛋白酶，該轉(zhuǎn)運蛋白分解一種或者多種神經(jīng)遞質(zhì)釋放組織蛋白質(zhì)，蛋白酶選自由肉毒桿菌神經(jīng)毒素的LC組成的神經(jīng)毒素組，特別是類型A、B、C1、D、E、F和G或者肉毒桿菌神經(jīng)毒素的LC的蛋白水解活性片段，特別是血清型A、B、C1、D、E、F和G的神經(jīng)毒素，該片段顯示出至少0.01％的天然蛋白酶的蛋白質(zhì)分解活性，優(yōu)選至少5％，尤其優(yōu)選至少50％，特別優(yōu)選至少90％。優(yōu)選轉(zhuǎn)運蛋白和蛋白酶衍生于相同的肉毒桿菌神經(jīng)毒素血清型，特別并優(yōu)選轉(zhuǎn)運蛋白的HN結(jié)構(gòu)域，并且蛋白酶衍生于肉毒桿菌神經(jīng)毒素血清型A。蛋白酶序列是通常可進入的數(shù)據(jù)庫并且數(shù)據(jù)庫編號從表1明顯可見。蛋白酶的蛋白質(zhì)分解活性通過底物分離動力學(xué)(參見Bina等，(2002)，Biochemistry 41(6)，1717-23)的方法進行測定。
這些LC的特征在于它們含有序列His-Glu-Leu-Xaa-His-(Xaa)33-35-Glu-(Xaa)84-90-Glu-(Xaa)11-Arg-Xaa-Xaa-Tyr，其中Xaa可以是任何氨基酸。本發(fā)明的轉(zhuǎn)運蛋白的特征在于蛋白質(zhì)和蛋白酶選自上述蛋白質(zhì)和/或蛋白酶的組。
根據(jù)本發(fā)明的另一個實施方式，提供了一種用于生產(chǎn)轉(zhuǎn)運蛋白的方法。在本案中，在第一步中提供了編碼轉(zhuǎn)運蛋白的核酸。在這里，編碼核酸代表RNA、DNA或其混合物。鑒于其核酸酶抗性(nuclease resistance)，可以比如通過插入硫代磷酸酯(phosphorthioate)鍵進一步修飾該核酸。該核酸可以從起始核酸(starting nucleic acid)生產(chǎn)出來，后者是例如通過基因組或者cDNA的克隆-數(shù)據(jù)庫而得到。此外，核酸可以直接通過由固相合成而生產(chǎn)出來。合適的方法已為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知。假定對例如通過定點特定突變可以產(chǎn)生對起始核酸的特異性修飾，導(dǎo)致至少在氨基酸水平上的一個附加、插入、缺失和/或取代。然后將核酸有效地連接至合適的啟動子。用于在已知表達系統(tǒng)中表達的合適啟動子已為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知。在本案中，啟動子的選擇取決于用于表達的表達系統(tǒng)。一般來講，優(yōu)選組成型啟動子(constitutive promoter)，但誘導(dǎo)型啟動子(inducible promoter)同樣可以使用。用這樣的方式生產(chǎn)的構(gòu)造包括至少一個部分載體，特別是調(diào)控元件；例如選自λ-衍生物、腺病毒、桿狀病毒、牛痘苗病毒、猿猴腎病毒40(SV4O-viruses)和逆轉(zhuǎn)錄病毒的載體。優(yōu)選載體能夠在給定的寄主細胞內(nèi)表達核酸。
本發(fā)明進一步提供了寄主細胞，其含有載體并且適合于表達載體。許多原核和真核表達系統(tǒng)已知屬于現(xiàn)有技術(shù)，寄主細胞例如選自原核細胞，比如大腸桿菌(E.coil)或者巨大芽孢桿菌(B.megaterium)，選自真核細胞，比如釀酒酵母(S.cerevisiae)和巴斯德比赤酵母(P.pastoris)。盡管也可以使用更高級的真核細胞，比如昆蟲細胞或者哺乳動物細胞，然而寄主細胞優(yōu)選像肉毒桿菌一樣，不具有糖基化組織。
根據(jù)一種優(yōu)選實施方式，核酸編碼肉毒桿菌神經(jīng)毒素的Hcc結(jié)構(gòu)域。該核酸含有內(nèi)切核酸酶界面(在編碼Hc片段的核酸二側(cè))，其內(nèi)切核酸酶位點與肉毒桿菌神經(jīng)毒素的其它Hc片段位點一致，為了使得它們在編碼轉(zhuǎn)運蛋白的基因中容易進行模塊置換，保持了氨基酸序列的相似性。
如果根據(jù)本發(fā)明提供一種組合物，除轉(zhuǎn)運系統(tǒng)外，其進一步含有至少一個間插分子，并且用羧基端半胱氨酸或者巰基基團使該間插分子、肽或蛋白質(zhì)功能化，然后，以與前述相類似的方式，可以通過重組法例如使用雙載體或者多種寄主細胞來生產(chǎn)肽和/或蛋白質(zhì)。如果相同的寄主細胞同時用于表達轉(zhuǎn)運蛋白和肽或蛋白質(zhì)，優(yōu)選分子間二硫鍵原位形成。為了在相同的寄主細胞中進行更有效地生產(chǎn)，也可以在相同的閱讀框中將編碼肽或蛋白的核酸與編碼轉(zhuǎn)運蛋白的核酸一起翻譯，結(jié)果生產(chǎn)出單鏈多肽。該情況下優(yōu)選分子內(nèi)二硫鍵是原位形成。為了簡單水解在轉(zhuǎn)運蛋白與肽和/或蛋白質(zhì)之間同樣出現(xiàn)的肽交聯(lián)，將氨基酸序列插入轉(zhuǎn)運蛋白氨基端，其被專一性地識別并且被蛋白酶凝血酶或被專一性的的寄主細胞內(nèi)切蛋白酶分離。
如果這不可能，在分離提純轉(zhuǎn)運蛋白和蛋白質(zhì)后，可以接著通過本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的氧化工藝產(chǎn)生適當(dāng)?shù)姆肿娱g二硫鍵。也可以通過合成或者片段縮合直接得到肽或者蛋白質(zhì)，合適的方法已為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知。
接著分別純化轉(zhuǎn)運蛋白和肽，或者蛋白質(zhì)。為該目的所使用的方法例如色譜法或者電泳法，已為本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知。
本發(fā)明另一個實施方式涉及一種藥物組合物，其包括轉(zhuǎn)運蛋白和任意藥用上可接受的賦形劑、稀釋劑和/或添加劑，并且適合于治療下述的機能障礙或者疾病半面痙攣、痙攣性斜頸、痙攣狀態(tài)、肌張力障礙、偏頭痛、疼痛、頸部和腰椎脊柱機能障礙、斜視、唾液分泌過多和抑郁疾病。
該藥物組合物適合于口服、靜脈注射、皮下注射、肌肉注射和表面給藥。優(yōu)選肌肉注射給藥。藥物組合物的一個劑量單位含有大約0.1pg～1mg轉(zhuǎn)運蛋白和/或根據(jù)本發(fā)明的組合物。
本發(fā)明另一個實施方式包括一種美容組合物，由轉(zhuǎn)運蛋白和藥物賦形劑、稀釋劑和/或添加劑組成，適合于治療多汗和非常明顯的面部皺紋。該美容組合物適合于口服、靜脈注射、皮下注射、肌肉注射和體表給藥。優(yōu)選肌肉注射給藥。美容組合物的一個劑量單位含有大約0.1pg～1mg轉(zhuǎn)運蛋白和/或根據(jù)本發(fā)明的組合物。該美容組合物適合于治療多汗和面部皺紋。
在本發(fā)明中描述的轉(zhuǎn)運蛋白可以由合適的寄主細胞比如大腸桿菌、釀酒酵母、巴斯德畢赤酵母或者巨大芽孢桿菌來生產(chǎn)，它們使重組體表達載體增殖，該載體編碼轉(zhuǎn)運蛋白。


使用下述附圖來解釋本發(fā)明，其中圖1顯示了突變的BoNT/A上Hc片段對鼠腦的突觸體膜標本的親合力比野生型BoNT/A的Hc片段對鼠腦的突觸體膜標本的親合力高3倍。
圖2顯示了不同BoNT/A的Hc片段突變體與鼠腦突觸體的結(jié)合情況，將BoNT/A的Hc片段野生型對鼠腦突觸體的親合力設(shè)定為100％作為標準。第一縱列顯示了BoNT/A突變體的親合力，這顯示了導(dǎo)致提高的氨基酸Y1117的突變，。第二縱列顯示了另一個BoNT/A突變體的親合力。第三縱列顯示了表現(xiàn)出雙重突變的BoNT/A突變體的親合力，增強了對神經(jīng)細胞膜(突觸體)的結(jié)合。
圖3顯示，與BoNT/A野生型對于分離的老鼠的膈神經(jīng)-隔膜肌標本相比，BoNT/A的Y1117A突變體的神經(jīng)毒性有了提高。
圖4顯示了四個BoNT/A的Hc片段雜交體HcAB、HcAC、HcAE和HcAT(T為破傷風(fēng)神經(jīng)毒素)在神經(jīng)細胞膜(突觸體)中的結(jié)合情況，將BoNT/A的Hc片段野生型設(shè)定為100％作為標準。
圖5顯示了在分離的老鼠隔神經(jīng)-隔膜肌標本中，由BoNT/A和BoNT/B的Hc片段或Hcc結(jié)構(gòu)域組成的總毒素雜交體與BoNT/A野生型相比神經(jīng)毒性有了提高。
具體實施例方式
具體地講，本發(fā)明含有轉(zhuǎn)運蛋白(Trapo)，其通過修飾由肉毒桿菌所產(chǎn)神經(jīng)毒素的Hc而形成，優(yōu)選專一性地結(jié)合于神經(jīng)元，由受體介導(dǎo)的胞吞作用進行細胞內(nèi)調(diào)節(jié)，并且從酸性內(nèi)體小室易位進入神經(jīng)元胞質(zhì)液。該蛋白質(zhì)被用作轉(zhuǎn)運手段，以便將蛋白酶及結(jié)合于所述轉(zhuǎn)運手段的其它物質(zhì)導(dǎo)入細胞，不會生理學(xué)地滲入質(zhì)膜并且到達神經(jīng)細胞胞質(zhì)液。該蛋白酶底物是細胞內(nèi)定位蛋白質(zhì)和參與遞質(zhì)釋放的肽。在底物分離后，阻斷了神經(jīng)元的特定功能，細胞本身不受損害。這些功能之一是造成神經(jīng)遞質(zhì)釋放的胞吐作用，如果遞質(zhì)的釋放得到抑制，從細胞到細胞的信號傳送被阻斷。例如，如果在神經(jīng)肌肉接觸點抑制了乙酰膽堿的釋放，會使橫紋肌麻痹。如果把TrapoX應(yīng)用于痙攣或張力障礙肌肉的神經(jīng)末端，可以臨床使用該效果。其它活性物質(zhì)例如是表現(xiàn)出抗病毒作用的物質(zhì)。與Trapo相配合，它們可以用于治療神經(jīng)系統(tǒng)病毒感染。本發(fā)明也涉及到轉(zhuǎn)運蛋白用于抑制神經(jīng)遞質(zhì)釋放的用途。
如果病人用天然形式的BoNT/A和BoNT/B治療，注射這些非人源蛋白質(zhì)，盡管劑量低，也會引起抗體形成，使得治療必須停止以防止過敏性休克。通過施用具有相同作用機制、具有更高酶活性轉(zhuǎn)運效率的物質(zhì)，劑量可以大大降低，并且不會形成抗體。這些特性歸因于在此描述的轉(zhuǎn)運蛋白。
雖然實施例是應(yīng)用的情形，但是合適的應(yīng)用模式和劑量通常是由主治醫(yī)生分別確定。這樣的決定通常由精通相關(guān)專業(yè)領(lǐng)域的醫(yī)生作出。這樣，例如可以基于例如所選神經(jīng)毒素溶解度或者待治療痛感強度的標準，按照本發(fā)明在此的描述而選擇應(yīng)用模式和神經(jīng)毒素劑量。
天然BoNT/A和BoNT/B的治療間隔一般是平均三至四個月。延長該間隔將會降低形成抗體的風(fēng)險，并且使得BoNT有較長的治療周期。在胞質(zhì)液中LC的增加將隨時間延伸其分解，并且因此也延長了作用的持續(xù)時間。這里描述的轉(zhuǎn)運蛋白表現(xiàn)出比天然HC-A更高的親合力和接受速率(reception rate)。
下述實施例僅用于闡明本發(fā)明，并不得理解為一種對本發(fā)明的限制方式。
實施例在大腸桿菌內(nèi)基因工程TrapoX重組體的表達通過PCR方法在肉毒桿菌(數(shù)據(jù)庫No.AAA23262)染色體DNA上擴增BoNT/A中HC的DNA序列。為實現(xiàn)該目的，利用專一性的低聚核苷酸，由用于編碼丙氨酸氨基酸殘基的堿基三聯(lián)體取代氨基酸酪氨酸1117的密碼子。另外，基因的5’-端用DNA序列補平，用于編碼凝血酶識別序列的氨基酸。將該DNA序列插入細菌表達載體。在該情況下，用于Trapo的插入基因在3′-端與低聚核苷酸融合，用于編碼羧基端親和肽比如Strep-day、6xHN-day或者His6-day。用這樣的方式產(chǎn)生的表達載體pAR-Trapo，是用于添加載體分子比如BoNT的LC的起始堿基。
通過PCR方法在肉毒桿菌(數(shù)據(jù)庫No.AAA23262)染色體DNA序列上擴增BoNT/A中LC的DNA序列，并且將其插入被編碼的凝血酶識別序列的表達載體pAR-Trapo上游。將這樣產(chǎn)生的表達載體pAR-TrapoX轉(zhuǎn)化進入E.coli K12菌株，并且在生物安全2級條件下和遵照漢諾威地區(qū)政府發(fā)布的用于該項目的規(guī)章制度(文件參考號501g.40654/3/57/3)，誘導(dǎo)蛋白質(zhì)TrapoX表達。按照廠商的指導(dǎo)，用親和色譜手段分離體外表達的TrapoX，得到分子量150kDa的單鏈蛋白質(zhì)。接著用連接在瓊脂糖凝膠上的凝血酶水解該蛋白，生產(chǎn)出純的蛋白質(zhì)，其兩條鏈通過二硫橋保持連結(jié)。
與野生型BoNT/A相比較，該蛋白質(zhì)表現(xiàn)出對固定在微型滴定板上的分離的神經(jīng)節(jié)苷脂GT1b的親合力、以及對鼠腦突觸體膜標本的親合力增加了300％(圖1)。LC-A的催化活性未改變，如同在重組體SNAP-25體外分解中顯示的那樣。就抑制鼠腦功能性突觸體中神經(jīng)遞質(zhì)釋放而言，與從肉毒桿菌回收的天然BoNT/A相比較，TrapoX效價增加了300％。在老鼠的神經(jīng)肌肉標本(HDA)中，與天然BoNT/A相比較，TrapoX效價同樣地增加了300％(圖2)。
與鼠腦突觸體的結(jié)合的測量和在不同BoNT/A突變體的HDA中神經(jīng)毒性的測量。
按照Rummel等在J Mol Biol 326(2003)，835-847中陳述的方法，測量放射性標記的Hc片段與大鼠突觸體的結(jié)合。按照Habermann等在Naunyn Schmiedeberg’s Arch Pharmacol311(1980)，33-4D中描述的方法，測定BoNT/A突變體的神經(jīng)毒性。
與野生型相比，不同的BoNT/A突變體的結(jié)合對比情況顯示于下表與圖2有關(guān)的表


在BoNT/A的神經(jīng)節(jié)苷脂結(jié)合腔內(nèi)部單獨測定的氨基酸的突變導(dǎo)致與神經(jīng)細胞的結(jié)合的提高。優(yōu)選在1117位，由丙氨酸、半胱氨酸或者纈氨酸取代酪氨酸。具體地說，1117位酪氨酸殘基被丙氨酸的取代導(dǎo)致親合力提高大約330％。
在神經(jīng)節(jié)苷脂結(jié)合腔1252和1253位的個別氨基酸的進一步突變同樣導(dǎo)致結(jié)合性的提高。具體地說，酪氨酸中F1252突變和賴氨酸中H1253突變導(dǎo)致親合力分別增加110％和50％。
此外，可以預(yù)期1202、1262、1270、1278和1279位的突變會導(dǎo)致與神經(jīng)細胞結(jié)合的提高。
此外，BoNT/A的突變體也進行了雙重突變試驗，而在這種情況下，具體地說，突變體Y1117C/H1253K和Y1117V/H1253K導(dǎo)致與突觸體結(jié)合的提高(參見圖2)。
此外測定出結(jié)合的提高，尤其是BoNT/A的突變體Y1117A結(jié)合的提高導(dǎo)致在膈神經(jīng)-神經(jīng)毒性分析(HDA分析)中神經(jīng)毒性的提高(圖3)。
BoNT/A的Hcc雜交體的結(jié)合及神經(jīng)毒性的測定按如上所述方法進行結(jié)合及神經(jīng)毒性的測定。
結(jié)果顯示于下表中并進一步顯示于圖4和圖5中。
與圖4有關(guān)的表

用其它血清型特別是肉毒桿菌神經(jīng)毒素B和肉毒桿菌神經(jīng)毒素C取代BoNT/A的Hcc結(jié)構(gòu)域，導(dǎo)致與神經(jīng)細胞結(jié)合的提高。此外觀察到用破傷風(fēng)神經(jīng)毒素的相應(yīng)結(jié)構(gòu)域取代BoNT/A中Hc片段的Hcc結(jié)構(gòu)域同樣導(dǎo)致神經(jīng)細胞中親合力的提高。整個BoNT/A中Hcc結(jié)構(gòu)域的取代也會導(dǎo)致親合力變化。在這里，圖5顯示，在雜交體scAtAAB中親合力提高對于神經(jīng)毒性提高具有類似的影響。如果取代整個Hc片段scAtAAB來代替Hcc結(jié)構(gòu)域，會觀察到相應(yīng)結(jié)果。具體地說，可以觀察到當(dāng)用BoNT/B取代BoNT/A中Hc片段的Hcc結(jié)構(gòu)域時，神經(jīng)毒性提高了大約350％。
BoNT突變體與神經(jīng)節(jié)苷脂GT1b結(jié)合的測定將神經(jīng)節(jié)苷脂GT1b[NAcNeuα3Galβ3NAcGalβ4(NAcNeuα8NAcNeuα3)Galβ4Glcβ](Sigma-Aldrich公司)溶于甲醇，并且施涂到把高親合力96孔聚苯乙烯微型滴定板(Corning公司；100μl/孔中含有1μg GT1b)，或者，在進行競爭分析情況下，施涂到具有125I-BoNTs(Greiner Bio-ohne公司；100μl/孔中含有0.1μg GT1b)的高親合力CS單縫條形孔板(singlefracture strip plate)上。在室溫下蒸發(fā)溶劑，并且所述孔用結(jié)合緩沖液(binding buffer，10mMTris-HCl、10mM Na2HPO4、0.5％ BSA，pH7.2))漂洗三次。然后通過在PBS/Tween溶液[140mM NaCl、7mM KCl、10mM Na2HPO4、1.8mM KH2PO4、0.05％(V/V)Tween20，pH 7.2]中培育兩小時以阻斷非專一性的結(jié)合部位，溶液中補充3％(w/v)BSA。使用增加量的野生型，或使用特定量的突變體，在結(jié)合緩沖液(100μl/孔)中于室溫下進行2小時的結(jié)合分析，在3次漂洗步驟中除去未結(jié)合的蛋白質(zhì)，每個步驟使用250μl PBS/Tween緩沖液。按照廠商的指導(dǎo)，通過用與堿性磷酸酶(ST-AP，IBA GmbH)連接的Strep Tactin在結(jié)合緩沖液中于室溫下培育2小時，鑒定已結(jié)合的Hc片段。P-硝基苯磷酸酯(在100mM甘氨酸、1mM MaCl2、1mM ZnCl2，pH 10.4溶液中含量1mg/ml)最終用作堿性磷酸酶底物。通過添加3M的NaOH溶液終止脫磷酸化反應(yīng)，并且使用光譜計數(shù)微型板讀數(shù)裝置(Packard公司)測量405nm處的消光值。在100μl含有700000cpm/孔 -BoNT、不同量的天然BoNT或者重組體Hc片段的結(jié)合緩沖液中，于室溫下進行2小時競爭分析。在培育并除去上清液后，各孔用PBS/Tween緩沖液漂洗三次，干燥并且分離。然后在自動伽馬計數(shù)器(Wallac 1480 Wizard 3型)上測定結(jié)合放射性標記BoNT的量。
權(quán)利要求
1.一種轉(zhuǎn)運蛋白，其通過對肉毒桿菌形成的神經(jīng)毒素重鏈修飾而獲得，所述蛋白結(jié)合于神經(jīng)細胞的親合力比天然神經(jīng)毒素結(jié)合于神經(jīng)細胞的親合力更高。
2.如權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)運蛋白，其特征在于，所述蛋白專一性地結(jié)合于神經(jīng)細胞并且通過胞吞作用進入細胞。
3.如權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)運蛋白，其特征在于，所述蛋白專一性地結(jié)合于膽堿能運動神經(jīng)元的復(fù)合神經(jīng)節(jié)苷脂，在質(zhì)膜內(nèi)定位，優(yōu)選GT1b。
4.如權(quán)利要求3所述的轉(zhuǎn)運蛋白，其特征在于，所述轉(zhuǎn)運蛋白的神經(jīng)節(jié)苷脂結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含氨基酸的取代和缺失，對提高的親合力有作用。
5.如權(quán)利要求1～4中任一項所述的轉(zhuǎn)運蛋白，其特征在于，所述蛋白顯示出比天然神經(jīng)毒素高出至少15％的親合力，優(yōu)選高出至少50％，尤其優(yōu)選高出至少80％，特別是高出至少90％。
6.如權(quán)利要求1～5中任一項所述的轉(zhuǎn)運蛋白，其特征在于，所述神經(jīng)毒素是肉毒桿菌神經(jīng)毒素類型A(BoNT/A)。
7.如權(quán)利要求6所述的轉(zhuǎn)運蛋白，其特征在于，在肉毒桿菌神經(jīng)毒素類型A蛋白質(zhì)序列第1092～1296位氨基酸中的至少一個氨基酸被除去或被天然的或非天然源的氨基酸取代。
8.如權(quán)利要求7所述的轉(zhuǎn)運蛋白，其特征在于，其中至少一個位于所述肉毒桿菌神經(jīng)毒素類型A的蛋白質(zhì)序列第1117、1202至1204、1252至1254、1262至1267、1270、1278至1279位的氨基酸被除去或被天然的或非天然源的氨基酸取代。
9.如權(quán)利要求8所述的轉(zhuǎn)運蛋白，其特征在于，在所述肉毒桿菌神經(jīng)毒素類型A蛋白質(zhì)序列第1117位氨基酸被除去或被天然的或非天然源的氨基酸取代。
10.如權(quán)利要求9所述的轉(zhuǎn)運蛋白，其特征在于，所述被取代的氨基酸是丙氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸，天門冬酰胺、脯氨酸、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸或者纈氨酸。
11.如權(quán)利要求9所述的轉(zhuǎn)運蛋白，其特征在于，所述被取代的氨基酸是丙氨酸、半胱氨酸或者纈氨酸。
12.如權(quán)利要求8所述的轉(zhuǎn)運蛋白，其特征在于，所述肉毒桿菌神經(jīng)毒素類型A的蛋白質(zhì)序列第1252位的氨基酸被酪氨酸取代，或者第1253位的氨基酸被賴氨酸取代。
13.如權(quán)利要求8所述的轉(zhuǎn)運蛋白，其特征在于，從所述肉毒桿菌神經(jīng)毒素類型A的蛋白質(zhì)序列中第1117、1202至1204、1252至1254、1262至1267、1270和1278至1279位中選出的兩個或三個氨基酸被除去或取代，優(yōu)選為1117/1252、1117/1253、1117/1262、1117/1278、1117/1279、1117/1252/1253，尤其優(yōu)選Y1117A/F1252Y、Y1117A/H1253K、Y1117A/V1262I、Y1117A/L1278H、Y1117A/G1279N、Y1117C/F1252Y、Y1117C/H1253K、Y1117C/V1262I、Y1117C/L1278H、Y1117C/G1279N、Y1117V/F1252Y、Y1117V/H1253K、Y1117V/V1262I、Y1117V/L1278H、Y1117V/G1279N、Y1117A/F1252Y/H1253K、Y1117C/F1252Y/H1253K和Y1117V/F1252/H1253K。
14.如權(quán)利要求4所述的轉(zhuǎn)運蛋白，其特征在于，含有神經(jīng)節(jié)苷脂結(jié)合結(jié)構(gòu)域的所述肉毒桿菌神經(jīng)毒素類型A的1092～1296位氨基酸，被如下序列取代肉毒桿菌神經(jīng)毒素類型B蛋白質(zhì)，1079至1291位氨基酸；肉毒桿菌神經(jīng)毒素類型C1蛋白質(zhì)，第1093至1291位氨基酸；肉毒桿菌神經(jīng)毒素類型D蛋白質(zhì)，第1080至1276位氨基酸；肉毒桿菌神經(jīng)毒素類型E蛋白質(zhì)，第1067至1252位氨基酸；丁酸梭菌神經(jīng)毒素類型E蛋白質(zhì)，第1067至1251位氨基酸；肉毒桿菌神經(jīng)毒素類型F蛋白質(zhì)，第1085至1278位氨基酸；巴拉蒂梭菌神經(jīng)毒素類型F蛋白質(zhì)，第1076至1268位氨基酸；肉毒桿菌神經(jīng)毒素類型G蛋白質(zhì)，第1087至1297位氨基酸。
15.如權(quán)利要求4所述的轉(zhuǎn)運蛋白，其特征在于，所述神經(jīng)毒素類型A的完整Hc片段被其它神經(jīng)毒素類型中一個的完整Hc片段取代，其中優(yōu)選BoNT/A的完整Hc片段(867～1296位氨基酸)被BoNT/B的Hc片段(866～1291位氨基酸)取代。
16.一種組合物，含有如權(quán)利要求1～15中任一項所述的轉(zhuǎn)運蛋白，并且含有至少一個間插分子。
17.如權(quán)利要求16所述的組合物，其特征在于，所述間插分子通過肽鍵、酯鍵、醚鍵、硫鍵、二硫鍵或者碳-碳鍵共價成鍵。
18.如權(quán)利要求16所述的組合物，其特征在于，所述間插分子包括小的有機分子、肽或者蛋白質(zhì)。
19.如權(quán)利要求18所述的組合物，其特征在于，所述小的有機分子是抗病毒劑、癌細胞抑制劑、抗生素或者免疫球蛋白。
20.如權(quán)利要求18所述的組合物，其特征在于，所述蛋白質(zhì)包括蛋白酶。
21.如權(quán)利要求20所述的組合物，其特征在于，所述蛋白酶包括肉毒桿菌類型A、B、C、D、E、F和G的神經(jīng)毒素蛋白質(zhì)。
22.如權(quán)利要求21所述的組合物，其特征在于，含有序列His-Glu-Leu-Xaa-His-(Xaa)33-35-Glu-(Xaa)84-90-Glu-(Xaa)11-Arg-Xaa-Xaa-Tyr，其中Xaa可以是任何氨基酸。
23.如權(quán)利要求20所述的組合物，其特征在于，所述蛋白酶含有由肉毒桿菌類型A、B、C、D、E、F和G的蛋白質(zhì)衍生的蛋白水解活性片段。
24.如權(quán)利要求23所述的組合物，其特征在于，含有序列His-Glu-Leu-Xaa-His-(Xaa)33-35-Glu-(Xaa)84-90-Glu-(Xaa)11-Arg-Xaa-Xaa-Tyr，其中Xaa可以是任何氨基酸。
25.如權(quán)利要求21～24中任一項所述的組合物，其特征在于，所述蛋白酶在膽堿能運動神經(jīng)元內(nèi)部分解專一性底物。
26.如權(quán)利要求25所述的組合物，其特征在于，所述底物選自于在周圍神經(jīng)內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)的釋放所涉及的蛋白質(zhì)和能夠在神經(jīng)細胞內(nèi)部催化反應(yīng)的蛋白質(zhì)。
27.如權(quán)利要求26所述的組合物，其特征在于，所述蛋白酶和轉(zhuǎn)運蛋白通過氨基酸序列而共價成鍵，被內(nèi)肽酶專一性地識別并分解。
28.如權(quán)利要求27所述的組合物，在被內(nèi)肽酶分解后，蛋白酶和轉(zhuǎn)運蛋白接著被二硫橋連結(jié)起來，導(dǎo)致活性全毒素的形成。
29.一種藥物組合物，含有如權(quán)利要求1～15中任一項所述的轉(zhuǎn)運蛋白或如權(quán)利要求16～28中任一項所述的組合物，以及可選的任何藥用上可接受的賦形劑、稀釋劑和/或添加劑。
30.如權(quán)利要求29所述的藥物組合物的用途，系用于治療肉毒桿菌神經(jīng)毒素對其顯示出機能障礙或者疾病治療效果的用途。
31.如權(quán)利要求30所述的用途，其特征在于，所述機能障礙或疾病是下述一種半面痙攣、痙攣性斜頸、痙攣狀態(tài)、肌張力障礙、偏頭痛、疼痛、頸和腰椎脊柱的機能障礙、斜視、唾液分泌過多和抑郁疾病。
32.一種美容組合物，含有如權(quán)利要求1～15中任一項所述的轉(zhuǎn)運蛋白或如權(quán)利要求16～28中任一項所述組合物，以及可選的任何藥用上可接受的賦形劑、稀釋劑和/或添加劑。
33.如權(quán)利要求32所述的藥物組合物的用途，其特征在于，所述美容適應(yīng)癥是多汗和非常明顯的面部皺紋。
34.一種生產(chǎn)工藝，系通過已知重組方法來生產(chǎn)如權(quán)利要求1～15中任一項所述的轉(zhuǎn)運蛋白或如權(quán)利要求16～28中任一項所述的組合物。
35.生產(chǎn)如權(quán)利要求15所述轉(zhuǎn)運蛋白的工藝，其特征在于，用含有在蛋白酶側(cè)面的內(nèi)核界面的核酸編碼神經(jīng)節(jié)苷脂結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中限制性內(nèi)切核酸酶位點與其它肉毒桿菌神經(jīng)毒素的神經(jīng)節(jié)苷脂結(jié)合結(jié)構(gòu)域相容，以便使得它們?nèi)菀走M行模塊取代而又同時保持氨基酸序列的相似性。
36.生產(chǎn)如權(quán)利要求21～24中任一項所述蛋白酶的工藝，其特征在于，用含有在蛋白酶側(cè)面的限制性內(nèi)核界面的核酸編碼蛋白酶，其中所述限制性內(nèi)核界面是相容的，以便容易被肉毒桿菌神經(jīng)毒素蛋白酶結(jié)構(gòu)域模塊取代而又同時保持氨基酸序列的相似性。
37.一種寄主細胞，含有重組表達載體，所述表達載體用以編碼如權(quán)利要求1～15中任一項所述的轉(zhuǎn)運蛋白或如權(quán)利要求16～28中任一項所述的組合物。
38.如權(quán)利要求37所述的寄主細胞，其特征在于，所述寄主細胞可以是大腸桿菌、釀酒酵母、巴斯德畢赤氏酵母或巨大芽孢桿菌的細胞。
39.一種表達載體，其特征在于，包括用以編碼如權(quán)利要求1～15中任一項所述轉(zhuǎn)運蛋白或如權(quán)利要求16～28中任一項所述組合物的核酸。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種轉(zhuǎn)運蛋白，其可以通過修飾肉毒桿菌形成的神經(jīng)毒素重鏈而得到。該蛋白以比天然神經(jīng)毒素更高的親合力專一性地結(jié)合于神經(jīng)細胞。本發(fā)明還涉及一種轉(zhuǎn)運蛋白的生產(chǎn)方法、編碼轉(zhuǎn)運蛋白的核酸、含有藥物的轉(zhuǎn)運蛋白和美容組合物及其用途。
文檔編號C07K14/33GK101056888SQ200580038112
公開日2007年10月17日 申請日期2005年9月6日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月6日
發(fā)明者安德列斯·隆美爾 申請人:托克索基因有限公司