專利名稱：肽的環(huán)化的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及環(huán)肽的合成，所述環(huán)肽包含由一個氨基酸殘基側(cè)鏈的羧基和第二個氨基酸殘基側(cè)鏈的氨基閉合形成的環(huán)。
已經(jīng)描述過肽的樹脂上環(huán)化(on-resin cyclisation)，所述環(huán)化是通過在氨基酸側(cè)鏈的ω-羧基(即與碳鏈長度無關(guān)的側(cè)鏈上的羧基)，通常是天冬氨?；蚬劝滨；鶜埢?，和氨基酸側(cè)鏈的ω-氨基(即與碳鏈長度無關(guān)的側(cè)鏈上的氨基)，通常是賴氨酸殘基，之間形成內(nèi)酰胺。
Rijkers等(An optimized solid phase strategy-including on-resin lactamization-ofAstressin，its retro-，inverso-and retro-inverso isomers，2002，Biopolymers 63，141-149)描述了Boc-保護(hù)的41-聚體在Rink酰胺樹脂上的內(nèi)酰胺化作用。30位(Glu)和33位(Lys)在Pd(0)催化的除去烯丙基和alloc保護(hù)基的一個步驟中被去保護(hù)，隨后在存在BOP/HOBt和Hünig堿時在N-甲基吡咯烷酮中環(huán)化。用標(biāo)準(zhǔn)正交保護(hù)法(orthogonalprotection scheme)采用FMOC合成肽，但最后一個被Boc保護(hù)的殘基除外。隨后，通過TFA酸處理除去N-末端Boc保護(hù)基，然后從樹脂上釋放該肽。
這種方法的缺點在于，終止合成全長肽是肽區(qū)段隨后環(huán)化的預(yù)先要求。由于不希望的側(cè)鏈反應(yīng)(形成焦谷氨酸鹽)或者烯丙基/alloc不完全去保護(hù)，因此會造成非常有價值的全長肽損失。此外，在樹脂上使用酸不穩(wěn)定的保護(hù)基并不總是理想的，因為這會防止肽在樹脂上隨后進(jìn)一步衍生，例如，乙?；蚍忾]N-末端。其N-末端乙?；安豢梢赃M(jìn)行任何反應(yīng)，因為這會使末端Nα易于在手性Cα上差向異構(gòu)(epimerisation)。
Kates等(《固相合成環(huán)肽的一種新型方便的三維正交方法》(A novel，convenientthree dimensional orthogonal strategy for solid-phase synthesis of cyclic peptides)，1993，Tetrahedron Letters 341549-1552)描述了通過將C-末端天冬氨?；蚬劝滨；鶜埢鶄?cè)鏈錨定于其Cα殘基受被烯丙基酯保護(hù)基保護(hù)的不同樹脂手柄(resin handle)上而從頭到尾環(huán)化十聚肽。對完整肽鏈進(jìn)行線形固相FMOC合成之后，通過Pd催化除去烯丙基酯部分，然后除去Nα-FMOC序列并隨后進(jìn)行BOP/HOBt/DIEA介導(dǎo)的頭-尾環(huán)化。有趣的是，我們發(fā)現(xiàn)該方案在不存在FMOC保護(hù)基時將去保護(hù)的C-末端天冬氨?；鶜埢?將FMOC-Asp偶聯(lián)到PAL樹脂手柄而構(gòu)成的Asn8)偶聯(lián)于脫去N-末端天冬氨?；鶜埢腘α比沿環(huán)肽序列改變合成起點的其它合成方案更加有效。
該方法的有限缺點在于，它未考慮主要的烯丙基去保護(hù)步驟中作為副反應(yīng)發(fā)生的部分FMOC去保護(hù)，這是由于存在親核試劑且由于它不能確實影響反應(yīng)方案。隨后在任何事件中進(jìn)一步完成FMOC去保護(hù)，且這是隨后進(jìn)行頭-尾肽結(jié)合所必需的。相反，僅通過肽側(cè)鏈官能團(tuán)的內(nèi)酰胺化作用進(jìn)行環(huán)化主要取決于保持Nα的完全保護(hù)。
Blankemeyer等(1988，Tetrahedron Lett.29，5871-5874)描述了在含有4-(4’-甲氧基三苯甲氧基)-丁-2-烯氧基-己酸作為固相的烯丙型手柄的纖維素盤上合成一些保護(hù)的肽片段，合成還采用了FMOC化學(xué)。用無水THF中的Pd(PPh3)4進(jìn)行處理隨后加入HOBt的THF溶液以清除烯丙基酯接頭(linker)。
本發(fā)明發(fā)明了另一種環(huán)化肽側(cè)鏈的方法，該方法避免了上述缺點，且特別適用于環(huán)化含有天冬氨?；鶄?cè)鏈的肽。
根據(jù)本發(fā)明，肽的環(huán)化方法包括以下步驟a.脫去肽的烯丙基(allyl或丙烯基)型保護(hù)基，所述肽在其Nα上用堿不穩(wěn)定性保護(hù)基團(tuán)保護(hù)，所述肽還包含至少一個烯丙氧基-羰基-保護(hù)的賴氨酸側(cè)鏈(即ε-氨基)或該賴氨酸側(cè)鏈類似物的氨基官能團(tuán)，并且還包含至少一個烯丙基-酯-保護(hù)的谷氨?；鶄?cè)鏈(即β-羧基)或天冬氨?；鶄?cè)鏈(即γ-羧基)或者該側(cè)鏈類似物的ω-羧基，同時保留Nα上的堿不穩(wěn)定性保護(hù)基團(tuán)，b.在弱堿試劑存在下通過所述去保護(hù)側(cè)鏈的內(nèi)酰胺化作用使肽環(huán)化，和c.脫去所述肽Nα上的堿不穩(wěn)定性保護(hù)基團(tuán)。
進(jìn)一步的前提是，所述烯丙型保護(hù)基可以是未取代的或者可被烷基或芳烷基進(jìn)一步取代，所述烷基或芳烷基本身可以是未取代的或被鹵素或烷氧基進(jìn)一步取代。在一優(yōu)選的常規(guī)實施方案中，用標(biāo)準(zhǔn)的未取代的Alloc(即烯丙氧基-羰基或丙-2-烯基-氧-羰基)保護(hù)基來保護(hù)ε-氨基官能團(tuán)，并通過用烯丙氧基(丙烯-2-氧基)酯化來保護(hù)γ-羧基。
在本發(fā)明文中，氨基酸側(cè)鏈的‘ω-羧基’應(yīng)理解為與碳鏈長度無關(guān)的側(cè)鏈上的‘末端’羧基，而氨基酸側(cè)鏈的‘ω-氨基’應(yīng)理解為與碳鏈長度無關(guān)的側(cè)鏈上的‘末端’氨基。也可以是其類似物，例如其側(cè)鏈異構(gòu)體。例如，賴氨酸的γ-或δ-氨基異構(gòu)體是天然賴氨酸的合適類似物。在本發(fā)明文中，用于氨基酸或氨基酸衍生物的術(shù)語‘側(cè)鏈’的含義分別符合IUPAC-IUB的定義(國際理論與應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會以及國際生物化學(xué)聯(lián)合會/生物化學(xué)命名聯(lián)合委員會(Joint Commission on BiochemicalNomenclature)，“Nomenclature and Symbolism for Amino Acids and Peptides”，PureAppl.Chem，56，595-624(1984))。
該反應(yīng)途徑之前未描述過。出乎意料的是，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在烯丙基去保護(hù)之后，尤其是當(dāng)在固相結(jié)合肽上進(jìn)行烯丙基去保護(hù)并在固相結(jié)合材料上進(jìn)行隨后的環(huán)化時，大大保留了FMOC基團(tuán)的完整性。優(yōu)選地，反應(yīng)完成之后，肽鏈繼續(xù)延伸，更優(yōu)選以固相模式繼續(xù)延伸，由于具有這種優(yōu)點，之前的環(huán)化步驟則不需要使用有限稀釋條件來幫助分子內(nèi)反應(yīng)中的分子內(nèi)環(huán)化。因此，該反應(yīng)對于在最終的肽鏈中存在多個谷氨?；?或天冬氨酰基和賴氨酸殘基或它們的類似物如正賴氨酸(nor-lysine)或高賴氨酸、但只計劃在最終完整大小的肽鏈的首先合成的部分上環(huán)化這些殘基中的特定一對的情況將特別有益。當(dāng)完整大小的肽含有一些隨后用于要通過側(cè)鏈環(huán)化而穩(wěn)定的生物活性肽的亞域或肽環(huán)結(jié)構(gòu)時這種局部內(nèi)酰胺化法特別有益。相比天然穩(wěn)定的二硫鍵橋連或者使用氨基酸類似物的其非天然化學(xué)類似物，內(nèi)酰胺化作用更加穩(wěn)定、受到氧化還原損傷的可能性更小。非天然化學(xué)類似物通常被證實在體內(nèi)更具免疫原性，而本發(fā)明優(yōu)選使用天然氨基酸類似物。
在優(yōu)選的實施方案中，所述肽只含有一個烯丙基-保護(hù)的賴氨酸殘基和一個烯丙基-保護(hù)的天冬氨?；蚬劝滨；鶜埢?，因此在環(huán)化時有且只有一個結(jié)合選擇，從而得到均一產(chǎn)物。
與現(xiàn)有技術(shù)不同，本發(fā)明方法的肽可用于肽N-末端的進(jìn)一步延伸，任選且優(yōu)選在固相上進(jìn)行，以連續(xù)和逐步的方式添加或修飾氨基酸殘基或其它基團(tuán)，如加入新的N-保護(hù)的氨基酸或與其它肽進(jìn)行N-末端縮合反應(yīng)。
在另一個特別優(yōu)選的實施方案中，在其Nα上具有堿不穩(wěn)定性保護(hù)基團(tuán)的保護(hù)的肽的N-末端殘基被稱為至少一個烯丙基酯-保護(hù)的天冬氨?；蚬劝滨；鶜埢蚱漕愃莆?。這種N-末端保護(hù)的(優(yōu)選FMOC保護(hù)的)并同時側(cè)鏈-保護(hù)的氨基酸的一個很少遇到的問題是，天冬酰亞胺(aspartimide)或戊二酰亞胺(glutarimide)在FMOC去保護(hù)時容易發(fā)生堿催化的側(cè)鏈反應(yīng)。這是目前采用FMOC保護(hù)基的標(biāo)準(zhǔn)固相鏈延伸合成法的一個不需要的缺點，通常認(rèn)為通過保護(hù)γ-羧酸基團(tuán)能夠避免這一缺點。然而事實并非如此，Kates等和其它人(Kates等，Lett.Pept.Sci.，1995，1，213；Nicolas等，Tetrahedron Lett.1989，30，497)證明對于γ-羧基存在不同的保護(hù)基團(tuán)。本發(fā)明人在對標(biāo)準(zhǔn)FMOC去保護(hù)固相條件下FMOC保護(hù)的N-末端天冬氨酰基殘基的γ-羧基的烯丙基酯保護(hù)也觀察到是如此。其精確的定量程度對處理時間和條件的輕微變化高度敏感，從而導(dǎo)致形成不同產(chǎn)物 因此，采用本發(fā)明的方法，現(xiàn)在可以避免由于這種N-末端FMOC和烯丙基酯-保護(hù)的天冬氨?；蚬劝滨；鶜埢闹苯觽?cè)鏈環(huán)化而發(fā)生的不良副反應(yīng)，還保存了FMOC保護(hù)，從而有效防止天冬酰亞胺形成。因此，F(xiàn)MOC去保護(hù)后的進(jìn)一步鏈延伸就可能由于先前的內(nèi)酰胺化作用而不會形成戊二酰亞胺或天冬酰亞胺。
更優(yōu)選地，所述N-末端烯丙基酯-保護(hù)的酸性殘基是天冬氨酰基殘基。天冬酰亞胺形成的反應(yīng)速率高于戊二酰亞胺形成，且通常是更占優(yōu)勢的副反應(yīng)。在二肽序列L-Asp-L-X中尤其如此，其中X是Gly、Ser、Thr或Asn，我們在這里第一個報道，當(dāng)X是His時容易產(chǎn)生高達(dá)30或40％的天冬酰亞胺。尤其，-Asp-Gly-二肽高度傾向于形成天冬酰亞胺；通常，這要求在甘氨酸上使用額外的HMB保護(hù)基以阻礙天冬酰亞胺形成，如以下文獻(xiàn)所述Packman等，1995，Tetrahedron Lett.36，7523。然而，使用Gly(HMB)二肽非常昂貴，因此盡量避免使用。因此，在這些實例中，本發(fā)明提供了一種比現(xiàn)有技術(shù)更加有利的方法。
烯丙基和/或alloc去保護(hù)步驟(下文簡稱為烯丙基去保護(hù))可用本發(fā)明領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行，例如用Bu3SnH錫氫解(hydrostannolysis)或在基本中性條件下在存在嗎啉、雙甲酮、N-甲基苯胺、HOBt、氫硼化物(borhydride)或N，N’-二甲基巴比妥酸等烯丙基受體的親核試劑時，用THF配的四三苯基膦鈀(0)[Pd(PPh3)4]處理。所述方法的變化形式采用不同pH，但當(dāng)然必需注意樹脂的連接鍵或手柄基團(tuán)以及堿敏感性保護(hù)基對pH的敏感性。
烯丙基去保護(hù)優(yōu)選用烯丙基反應(yīng)性鈀絡(luò)合物催化，優(yōu)選用Pd(0)絡(luò)合物，優(yōu)選用含有C1-C10三烷基亞磷酸、C3-C10三環(huán)烷基亞磷酸(phophite)或三芳基膦(posphine)或三雜芳基膦配體的鈀絡(luò)合物，其中所述芳基或雜芳基還可被用電子取代基取代或者是未取代的，更優(yōu)選用含有苯基膦配體的鈀絡(luò)合物取代，所述苯基還可被C1-C5烷基取代，優(yōu)選所述苯基是甲苯基或二甲苯酰基，更優(yōu)選是苯基、2，4-二甲苯?；騩-甲苯基。優(yōu)選地，所述膦配體是單-膦配體，更優(yōu)選是非螯合的單價配體。盡管所述鈀絡(luò)合物優(yōu)選是單-鈀絡(luò)合物，但術(shù)語絡(luò)合物可理解為也包括二-鈀或更多鈀的絡(luò)合物，盡管單-鈀絡(luò)合物是優(yōu)選的。本發(fā)明最優(yōu)選的是在存在烯丙基受體或清除劑時使用四(三苯基膦)-鈀[Pd(PPh3)4]或使用相應(yīng)的Pd(P[鄰-甲苯基]3)2或Pd(P[2，4-二甲苯?；鵠3)2絡(luò)合物或同時含有三苯基膦和三-(o-甲苯基)膦配體的混合的絡(luò)合物。與三苯基膦相比，甲基苯基膦配體且尤其是三-o-甲苯基膦配體提高了催化反應(yīng)速率，還降低了所使用的貴金屬催化劑的重量同時維持了最佳產(chǎn)量。為比較Pd(0)-催化的烯丙基和烯丙氧基去保護(hù)，可參考Jeffrey等，J.Org.Chem.1982，47587-590。如Jeffrey所述，本領(lǐng)域中，通過原位催化劑交換，也就是將不太穩(wěn)定的配位Pd絡(luò)合物與本發(fā)明的優(yōu)選配體混合，也是可行且通常是優(yōu)選的。因此，除了強(qiáng)烈推薦的Pd(PPh3)4，合適的催化劑絡(luò)合物的例子有PdCl2(PPh3)2/PPh3、PdCl2(PPh3)2/P(oTol)3、Pd(DBA)2/P(oTol)3或Pd[P(oTol)3]2(Organometallics 1995，14(6)3030-3039)、Pd(OAc)2/三乙基-亞磷酸鹽、Pd(OAc)2/PPh3或Pd(OAc)2/P(oTol)3。一開始加入的Pd(0)絡(luò)合物中存在少量配位陰離子、堿性配體如乙酸根、苯甲?；虬?例如Huenig堿)能夠原位形成優(yōu)選的絡(luò)合物，這是由于存在合適的游離配體如PPh3或P(oTol)3[oTol＝鄰-甲苯基-]。盡管通常不需要加入游離配體與催化劑交換，尤其是當(dāng)一開始就使用高活性芳基膦鈀絡(luò)合物時-當(dāng)使用0價Pd(PPh3)4時值得注意該選項，所述0價Pd(PPh3)4最初由Jeffrey等(同上)使用并在反應(yīng)物中加入了過量PPh3。存在烯丙基受體時Pd-催化的去保護(hù)的一般機(jī)制是?；D(zhuǎn)移反應(yīng)(轉(zhuǎn)酰基)，這是本領(lǐng)域已知的。因此烯丙基受體試劑或清除劑的選擇對于在溫和反應(yīng)條件下實現(xiàn)定量去保護(hù)同時避免不良副反應(yīng)同樣重要。合適的清除劑是各種親核試劑，如嗎啉、雙甲酮、N，N-二甲基巴比妥酸、甲基苯胺或硫代水楊酸。
優(yōu)選Pd(0)絡(luò)合物的合適催化用量相當(dāng)于離析物的0.005-0.5當(dāng)量(eq.)，更優(yōu)選的用量為0.01到至多0.1當(dāng)量的催化劑，最優(yōu)選的用量為0.015到至多0.07當(dāng)量催化劑。優(yōu)選地，反應(yīng)溫度在10-60℃之間，更優(yōu)選在30-50℃之間，最優(yōu)選約為40℃。
在本發(fā)明最優(yōu)選的實施方案中，胺-硼烷復(fù)合物(complexe)作為親核烯丙基清除劑，其用量至少高于離析物每個烯丙基官能團(tuán)的1.5-2倍，如以下文獻(xiàn)所述Gomez-Martin等，J.Chem.Soc，Perkin Trans.1(1999)2871-2874，《固相肽合成中的Nα-Alloc臨時保護(hù)-使用胺-硼烷復(fù)合物作為烯丙基清除劑》(Nα-Alloc temporaryprotection in solid-phase peptide synthesis-use of amine-borane complexes as allylscavengers)。根據(jù)該復(fù)合物中胺部分的確切組成，例如用t-Bu-NH2-BH3、Me2NH-BH3或NH3-BH3可實現(xiàn)高轉(zhuǎn)化速率和反應(yīng)時間非常短。季銨不包括在本發(fā)明合適復(fù)合物的定義之內(nèi)，而所述胺優(yōu)選伯烷基胺或仲烷基胺或者氨水。在任選的更優(yōu)選的實施方案中，所述Pd(0)催化的烯丙基-去保護(hù)在存在氫化物供體苯基-三氫硅烷PhSiH3或其功能性衍生物時在質(zhì)子惰性極性有機(jī)溶劑(如二氯甲烷)中以硅氫解(hydrosilylolysis)方式進(jìn)行，基本上如Dessolin等，Tetrahedron Lett.1995，365741-5744，《鈀催化的烯丙基氨基甲酸酯轉(zhuǎn)?；男碌南┍荏w》(New allyl group acceptors forpalladium catalyzed transacylation of allyl carbamates)中所述。優(yōu)選采用通式R1-PhnSiHm的苯基-氫硅烷(hydrosilane)試劑作為烯丙基受體，且通常以1.5-2當(dāng)量過量使用，其中，R1是芳核上的取代基，為芳基、烷基或芳烷基，n是1或2，m是2或3，最優(yōu)選的烯丙基受體是PhSiH3。
苯基硅烷和合適的胺-硼烷復(fù)合物都能夠迅速完成去保護(hù)，其反應(yīng)時間小于1小時，通常約為20-40分鐘。因此可采用溫和且較短的反應(yīng)條件。其它烯丙基清除劑可能需要相對較長的反應(yīng)時間。
盡管在技術(shù)上是完全可行的試劑，但必需提到的是，上述兩類烯丙基清除劑都是有害的試劑，它們可能會造成環(huán)境和操作安全問題。在另一個對于工業(yè)規(guī)模制造特別有吸引力的強(qiáng)烈推薦的實施方案中，使用有機(jī)亞磺酸鹽(sulphinate)作為烯丙基受體試劑(Honda等，《用亞磺酸和鈀催化劑將烯丙基去保護(hù)》(Deprotection of allyl withsulfinic acids and palladium catalyst)，J.Org.Chem.1997，62，8932-8936)。奇怪的是，在本發(fā)明的反應(yīng)中，該反應(yīng)的產(chǎn)率特別高，這可能是由于如此形成的加成物的穩(wěn)定性以及溫和的反應(yīng)條件。這種亞磺酸鹽的例子是4-氯-3-硝基苯-亞磺酸鹽、-噻吩亞磺酸鹽、苯-亞磺酸鹽、p-甲苯基亞磺酸鹽或羥基甲烷亞磺酸鹽(其鈉鹽或鋅鹽也稱為RongalitTM，這種鹽的俗名叫做甲醛合次硫酸鹽)。有機(jī)亞磺酸鹽Ri-SO2-，或Ri-S(O)O-，分別可含有任何類型的進(jìn)一步取代的有機(jī)殘基、烷基、環(huán)烷基、芳基、雜芳基或芳烷基(參見Honda等，同上)?？梢云潲}或酸形式加入。所述亞磺酸鹽甚至也可存在競爭性親核分子，但這不是優(yōu)選的。優(yōu)選地，為得到最佳產(chǎn)量，Ri是任選被進(jìn)一步取代的苯基，更優(yōu)選被烷基-、烷氧基烷基-或烷氧基-單取代或多取代的苯基，最優(yōu)選是苯基、二甲苯?；蚣妆交绕涫菍?甲苯基。除了更加優(yōu)選的是三芳基膦復(fù)合物，使用亞磺酸鹽時也能使用三烷基或環(huán)烷基亞磷酸鹽配體復(fù)合物以得到較好產(chǎn)量。
內(nèi)酰胺化反應(yīng)以基本類似于存在堿不穩(wěn)定性胺-保護(hù)基如FMOC時進(jìn)行的標(biāo)準(zhǔn)肽鏈延伸反應(yīng)的方式進(jìn)行，但堿不穩(wěn)定性基團(tuán)攜帶在相同的肽上而不像鏈延伸那樣加入了額外的N-末端保護(hù)的氨基酸。當(dāng)然，在環(huán)化和去保護(hù)后的任選步驟d中隨后可采用相同的化學(xué)(機(jī)制)以進(jìn)一步延伸肽鏈。內(nèi)酰胺化作用和鏈延伸都需要偶聯(lián)劑，并且根據(jù)最初偶聯(lián)劑或助劑的類型需要最終的偶聯(lián)加合劑(additive)。
用于肽合成的偶聯(lián)劑是本領(lǐng)域熟知的(見Bodansky，M.，《肽合成原理》(Principlesof Peptide Synthesis)，第二版，Springer Verlag Berlin/Heidelberg，1993；也可見其中對偶聯(lián)加合劑或佐劑作用的討論)。偶聯(lián)劑可以是混合是酸酐(例如T3P丙烷膦酸酐)或其它?；瘎缁罨孽セ蛩嵝喳u化物(例如ICBF，異丁基-氯甲酸酯)，或者可以是碳二亞胺(例如1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亞胺)，活化的苯并三嗪衍生物(DEPBT3-(二乙氧基磷酰氧基)-1，2，3-苯并三嗪-4(3H)-酮)或苯并三唑(benzotriazol)的尿或鹽(phosphonium salt)衍生物。
就最佳產(chǎn)量、較短反應(yīng)時間和在鏈延伸期間抗外消旋作用的保護(hù)而言，更加優(yōu)選的偶聯(lián)劑選自能夠活化游離羧酸官能團(tuán)的苯并三唑的尿鹽或鹽，且反應(yīng)在一種弱堿存在時進(jìn)行。合適且同樣優(yōu)選的這種尿或偶合鹽的例子有，例如，HBTU(O-1H-苯并三唑-1-基)-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸鹽)、BOP(苯并三唑-1-基-氧-三-(二甲基氨基)-六氟磷酸鹽)、PyBOP(苯并三唑-1-基-氧基-三吡咯烷基六氟磷酸鹽)、PyAOP、HCTU(O-(1H-6-氯-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸鹽)、TCTU(O-1H-6-氯苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲四氟硼酸鹽)、HATU(O-(7-氮雜苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸鹽)、TATU(O-(7-氮雜苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲四氟硼酸鹽)，TOTU(O-[氰基(乙氧羰基)亞甲基氨基]-N，N，N’，N”-四甲基脲四氟硼酸鹽)、HAPyU(O-(苯并三唑-1-基)氧基二-(吡咯烷基)-脲六氟磷酸鹽。
優(yōu)選地，所述堿試劑是弱堿，其共軛酸的pKa值為pKa 7.5-15，更優(yōu)選為pKa7.5-10，不包含肽或氨基酸或氨基酸衍生物的α-氨基官能團(tuán)，且所述堿優(yōu)選是空間位阻叔胺。這種堿和其它優(yōu)選的堿的例子是Hünig堿(N，N-二異丙基乙胺)、N，N’-二烷基苯胺、2，4，6-三烷基吡啶、2，6-三烷基吡啶或N-烷基-嗎啉，所述烷基為直鏈和支鏈C1-C4烷基，更優(yōu)選是N-甲基嗎啉或可力丁(2，4，6-三甲基吡啶)，最優(yōu)選是可力丁。
也可使用偶聯(lián)加合劑，尤其是苯并三唑類型的偶聯(lián)加合劑(見Bodansky，同上)。當(dāng)使用高度活化的尿或鹽偶聯(lián)劑時尤其優(yōu)選使用它們。因此還優(yōu)選所述偶聯(lián)加合劑是能夠形成活化的酯的親核羥基化合物，更優(yōu)選具有酸性親核N-羥基官能團(tuán)，其中的N是酰亞胺或是N-?；騈-芳基取代的三氮烯基，最優(yōu)選所述偶聯(lián)加合劑是N-羥基-苯并三唑衍生物(或1-羥基-苯并三唑衍生物)或是N-羥基-苯并三嗪衍生物。這種偶聯(lián)加合劑N-羥基化合物已描述于WO 94/07910和EP-410 182，所述各文獻(xiàn)通過引用納入本文。例子有，例如N-羥基-琥珀酰亞胺、N-羥基-3，4-二氫-4-氧代-1，2，3-苯并三嗪(HOOBt)、1-羥基-7-氮雜苯并三唑(HOAt)和N-羥基-苯并三唑(HOBt)。N-羥基-苯并三嗪衍生物特別優(yōu)選，在最優(yōu)選的實施方案中，所述偶聯(lián)劑加合劑是羥基-3，4-二氫-4-氧代-1，2，3-苯并三嗪。偶聯(lián)加合劑的銨鹽化合物是已知的，它們在偶聯(lián)化學(xué)中的引用已有描述，例如，見US4806641。
在另一個特別優(yōu)選的實施方案中，所述尿或鹽偶聯(lián)劑是尿鹽試劑，優(yōu)選是HCTU、TCTU或HBTU，且更優(yōu)選與N-羥基-3，4-二氫-4-氧代-1，2，3-苯并三嗪或其鹽組合用于反應(yīng)。該實施方案主要優(yōu)選用于除去堿不穩(wěn)定性Nα-保護(hù)基后的肽合成的鏈延伸步驟，但也可用于側(cè)鏈環(huán)化過程中的內(nèi)酰胺化反應(yīng)。
注意，在本發(fā)明文中，HCTU和TCTU的定義包括在術(shù)語“尿鹽試劑”之內(nèi)，盡管這些化合物及其可能的類似物已通過晶體結(jié)構(gòu)分析顯示其包括肟基部分而不是尿部分(O.Marder，Y.Shvo和F.Albericio“新型偶聯(lián)劑HCTU和TCTU的開發(fā)和工業(yè)應(yīng)用”(HCTU and TCTUNew Coupling ReagentsDevelopment and IndustrialApplications”，Poster，Presentation Gordon Conference 2002/02)，雜環(huán)核上的N-脒基取代基導(dǎo)致胍(guanidium)結(jié)構(gòu)替代。在本發(fā)明文中，這類化合物被稱為本發(fā)明所述尿鹽試劑的“胍型亞類”。在更加優(yōu)選的實施方案中，主要用于內(nèi)酰胺化反應(yīng)的偶聯(lián)劑是苯并三唑的鹽，如BOP、PyBOP或PyAOP。
堿不穩(wěn)定性Nα的去保護(hù)可按照本發(fā)明的常規(guī)方法進(jìn)行，例如使用20％的哌啶的N-甲基嗎啉溶液。
本發(fā)明的另一個目的是式II或III的環(huán)肽，其具有用堿不穩(wěn)定性保護(hù)基團(tuán)保護(hù)的Nα， 其中，Y是堿不穩(wěn)定性保護(hù)基團(tuán)，n＝1-10，優(yōu)選n＝1或2，最優(yōu)選n＝1，此外，其中，m＝1-15，優(yōu)選m＝3-6，最優(yōu)選m＝3，此外，x＝1-200，q＝0-200，其中，R1和R2分別為天然氨基側(cè)鏈或其非天然衍生物，所述側(cè)鏈還可包含除烯丙基醚和烯丙氧基羰基保護(hù)基之外的保護(hù)基，且其中的A是樹脂或樹脂手柄，或者其中的R2任選為天然氨基側(cè)鏈或其非天然衍生物，所述側(cè)鏈通過醚、硫醚、酯、硫酯、酰氨基或者仲氨基或叔氨基部分結(jié)合到樹脂或樹脂手柄，條件是，此時A選自下組OH、NH2、NR’1H或NR’1R’2、OR’3，其中R’1和R’2獨立為C1-C4烷基，R’3是烯丙基之外的保護(hù)基，優(yōu)選R’3是叔丁基或五氟苯基。
側(cè)鏈基團(tuán)如R1(X＝1)不能解釋為表示單一類型的任選保護(hù)的氨基酸側(cè)鏈；這就是說，殘基R1(1)、R1(2)等各自可以是唯一的或者可以和至少一個其它殘基相同。殘基R2(q＝1)、R2(q＝2)等也是如此。
樹脂或樹脂手柄組合物實體原則上可以是任何用于合成的樹脂，例如聚苯乙烯-二乙烯基苯樹脂，Merrifield將其與羥基芐基-苯基整合接頭一起使用，而Wang將其與羥基-芐基-p-芐氧基部分一起使用，所述部分上可進(jìn)一步接枝例如更多的酸不穩(wěn)定的接頭，或者后一種接頭可整合在樹脂上或直接連接到樹脂上。原則上，用于合成的固相樹脂必需含有至少一個整合接頭或手柄作為固相核心材料的一部分；這種整合接頭或手柄可被看作是固定的保護(hù)基(Guillier等，Chem.Rev.100，2091-2157，2000)。其例子有，例如，Sieber樹脂，所述呫噸基類型的PAL樹脂手柄，Rink酰胺樹脂，Rink酸性樹脂，更復(fù)雜的PEG-接枝聚苯乙烯樹脂，如基于tentagel的NovasynTG(Novabiochem，Merck Biosciences，德國)，其上可有不同的接枝手柄如2’-氯三苯甲基可利用或者通過在諸如硅膠等基質(zhì)材料上接枝功能性手柄所構(gòu)成的樹脂。優(yōu)選地，該樹脂是三苯甲基樹脂或樹脂手柄，這種樹脂是4-甲氧基或4，4’-二甲氧基-三苯甲基樹脂。用于本發(fā)明的樹脂具有標(biāo)準(zhǔn)篩目大小，其約為50-500目，更優(yōu)選100-400目。式IV所示的樹脂或固相R被認(rèn)為包括交聯(lián)的聚合基質(zhì)材料，所述材料可通過任何類型化學(xué)性質(zhì)惰性的烷基、烷氧基、芳氧基或烷基酯間隔基或接頭結(jié)合于式IV-VII所示的手柄而視為是R的整合部分。然而需要注意，樹脂材料的化學(xué)性質(zhì)特別是手柄基團(tuán)的化學(xué)性質(zhì)除了影響從樹脂上切除的條件外，還會以一種仍不十分清楚的方式影響偶聯(lián)反應(yīng)特別是內(nèi)酰胺化反應(yīng)的合成效率。根據(jù)所用樹脂或樹脂手柄類型的不同，樹脂(合成)階段成熟肽的產(chǎn)量也可不同。因此，在本發(fā)明的一優(yōu)選實施方案中，所述樹脂或樹脂手柄是權(quán)利要求書中詳細(xì)描述的式IV，更優(yōu)選是權(quán)利要求書中詳細(xì)描述的式IV，最優(yōu)選是權(quán)利要求書中詳細(xì)描述的式VII化合物。這種樹脂或樹脂手柄的例子分別是(4-甲氧基苯基)-甲基-聚苯乙烯和(4-甲基苯基)-甲基-聚苯乙烯(Atkinson等，2000，J.Org.Chem.65，5048)，O-或N-連接于肽的樹脂或它們的PEG-樹脂衍生物。其它的例子有，例如，酸不穩(wěn)定的HMPB-MBHA或HMPB-BHA樹脂(Sieber等，1987，Tetrahedron Lett.28，6147)，酸不穩(wěn)定的Rink酰胺樹脂或Rink酸性樹脂(Rink等，1987，Tetrahedron Lett.28，3787)。術(shù)語‘酸不穩(wěn)定的’指室溫下在2-10％的TFA的二氯甲烷溶液中放置至少1小時即可基本上定量切除。奇怪的是，使用這種具有聯(lián)苯基-甲基結(jié)構(gòu)核心基序的優(yōu)選的樹脂能夠在線性合成和內(nèi)酰胺化作用中進(jìn)行更加有效的偶聯(lián)反應(yīng)；注意，這種樹脂也允許采用15-25℃較低反應(yīng)溫度，而與之相比，例如在三苯甲基樹脂上進(jìn)行有效偶聯(lián)要求40℃標(biāo)準(zhǔn)溫度。
優(yōu)選殘基A(如式II或III所示)含有樹脂手柄或樹脂接頭部分，但含有烯丙氧基羰基部分的樹脂手柄除外。更優(yōu)選地，這種樹脂或樹脂手柄具有式IV
其中，R是樹脂，R”1、R”2、R”3獨立為氫、C1-C4烷基或C1-C4烷氧基，并且可以相同或不同，條件是，R”1、R”2中只有一個可以是氫，且其中L是氧、硫、氮或具有式V 更加優(yōu)選的是所述樹脂或樹脂手柄具有式VI，適用上文對殘基R、R”1和R”2的定義，條件是，L選自氧或氮， 更加優(yōu)選的是所述樹脂或樹脂手柄具有式VII，適用上文對殘基R、R”1和R”2的定義，條件是，L選自氧或氮， 在更加優(yōu)選的實施方案中，當(dāng)L是氧時，優(yōu)選R”1、R”2獨立為氫、甲基或甲氧基，條件是，R”1、R”2中只有一個可以是氫，而當(dāng)L是氮時，優(yōu)選R”1、R”2獨立為甲基或甲氧基，優(yōu)選甲氧基。更加優(yōu)選的是，L是氧，R”1是氫，R”2是甲基或甲氧基，且優(yōu)選A是樹脂或樹脂手柄。最優(yōu)選地，R”2是甲基。
最優(yōu)選地，本發(fā)明的肽在其羧基末端偶聯(lián)到樹脂或樹脂手柄(A＝式IV的樹脂或樹脂手柄)。
優(yōu)選地，本發(fā)明所述的肽序列是Ac-Nle-環(huán)(Asp-His-D-Phe-Arg-Trp-Lys)或Nle-環(huán)(Asp-His-D-Phe-Arg-Trp-Lys)，如表1所示，內(nèi)酰胺鍵位于Asp和Lys側(cè)鏈之間。所述肽是藥物活性黑皮質(zhì)素受體特異性肽，可用于治療包括人類的男性勃起功能障礙和女性性功能障礙在內(nèi)的性功能障礙。
在另一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明所述的肽序列由下述序列的至少一部分構(gòu)成或包含下述序列的至少一部分環(huán)(Asp-His-Phe-Arg-Trp-Lys)，其中的Phe殘基也可被D-Phe或被pF-Phe、Phe(4-Br)、Phe(4-CF3)、Phe(4-Cl)、Phe(2，4-二Cl)、Phe(3，4-二Cl)、Phe(3，4-二F)、Phe(4-I)、Phe(3，4-二-OMe)、Phe(4-Me)或Phe(4-NO2)的D-或L-異構(gòu)體取代。用Phe的非天然衍生物進(jìn)行的這些修飾改變了所述肽的藥物活性。同樣，在上述序列中，Arg也可被D-Arg或被Arg(NO2)、Arg(Tos)、Arg(Pbf)、Arg(Mtr)、Arg(Me)或Arg(Pmc)的D-或L-異構(gòu)體取代。
優(yōu)選在合成期間用例如甲苯磺?；?、芐氧基羰基、亞戊基色烷磺?；?Pmc)、五甲基二氫苯并呋喃磺酰基(Pbf)、4-甲氧基-2，3，6-三甲基苯磺酰基(Mtr)及其4-叔丁基-2，3，5，6-四甲基同系物(tart)、金剛烷基氧基羰基或Boc共價保護(hù)精氨酸側(cè)鏈。強(qiáng)烈推薦用Pmc、Pbf、Mtr或Tart保護(hù)Arg，最優(yōu)選Pbf。
優(yōu)選在合成期間用Boc保護(hù)Trp。任選地，可用甲?；?、sym-均三甲基苯-磺酰基對其進(jìn)行N-保護(hù)。
優(yōu)選通過N-三苯甲基保護(hù)基保護(hù)His。任選地，可用Boc、甲基三苯甲基或甲苯磺?；瑯訉ζ溥M(jìn)行N-保護(hù)，盡管這不是優(yōu)選的。
實驗已經(jīng)按照表1所示的本發(fā)明的方法重新在不同的樹脂如2-氯三苯甲基-聚苯乙烯樹脂上合成了肽Ac-Nle-環(huán)(Asp-His-D-Phe-Arg-Trp-Lys)的完全保護(hù)的FMOC形式(這種形式的特征描述于WO 01/000224，其中僅主要描述了所述肽)，其序列為FMOC-Asp(OAll)-His(Trt)-....。Lys(Alloc)和Asp(OAll)是5個間隔殘基，其之間含有伸出的大側(cè)鏈，例如Arg(Pbf)。在下表中，Nle是正亮氨酸。
表1；模型肽和反應(yīng)途徑
1.1與2-CTC樹脂結(jié)合的模型肽的烯丙基/alloc去保護(hù)在存在PhSiH3或二氨基硼烷(5當(dāng)量)時將0.1當(dāng)量Pd(PPh3)4溶于DCM。將該溶液加入含有1當(dāng)量烯丙基/alloc保護(hù)的表1所示的起始肽的CTC-樹脂(35克樹脂，負(fù)載0.44mmol/g烯丙基/alloc保護(hù)的表1所示的起始肽)。穩(wěn)定鼓入氮氣下室溫反應(yīng)最多15分鐘后過濾混合物，并對回收的樹脂再進(jìn)行三次相同的處理，每次都使用相同量的催化劑且每輪循環(huán)都用5當(dāng)量苯基硅烷作為清除劑。
洗滌步驟然后用以下溶液連續(xù)洗滌樹脂·N-甲基-吡咯烷酮(NMP)(3次)·二氯甲烷(DCM)(3次)·0.5％DIEA(Hünig堿)，溶于DCM(3次)·二乙胺基二硫代甲酸鈉三水合物，0.02N，溶于NMP·NMP(5次)1.2環(huán)化側(cè)鏈的內(nèi)酰胺化將1當(dāng)量PyBOP和1.8當(dāng)量HOBt溶于NMP并在存在4當(dāng)量DIEA時加入到Asp/Lys-未保護(hù)的FMOC肽中。室溫攪拌反應(yīng)物2小時。過濾回收內(nèi)酰胺化的肽并用NMP洗滌。
對用2％TFA從CTC樹脂上釋放的中間體肽樣品進(jìn)行反相HPLC(C-18柱，加樣量約為0.1g/ml溶液，溶液用含有0.1％TFA的70％水/30％乙腈配制，用0.1％TFA乙腈梯度洗脫)分析顯示，幾乎完全轉(zhuǎn)化，有90％以上內(nèi)酰胺化的受保護(hù)的肽保留了FMOC部分。
1.3FMOC去保護(hù)和肽延伸用20％的哌啶NMP溶液進(jìn)行FMOC去保護(hù)。隨后在大約室溫(40℃)下在存在1當(dāng)量HCTU、3當(dāng)量HOOBt和3當(dāng)量DIEA時用FMOC-L-Nle(1當(dāng)量)處理1小時以進(jìn)行30分鐘鏈延伸。
濾去與樹脂結(jié)合的產(chǎn)品并用DMF洗滌之后用20％的哌啶NMP溶液除去Nle上的FMOC部分，并在室溫下與約1.5當(dāng)量乙酸酐一起在吡啶中孵育1-2小時以摻入N-末端乙酰基。
濾去樹脂之后用濃TFA處理以釋放肽并全面去保護(hù)。根據(jù)初步純化產(chǎn)物粗略計算出乙?；?、內(nèi)酰胺化肽的總產(chǎn)率約為60％。
需要用?；瘎┻M(jìn)一步在樹脂上進(jìn)行最終衍生進(jìn)一步證實了本發(fā)明的效用，即在存在但不損害堿不穩(wěn)定性Nα-保護(hù)基時進(jìn)行內(nèi)酰胺化的效用。在這里使用酸可切除的N-保護(hù)基如Boc至少會在樹脂上處理階段產(chǎn)生進(jìn)一步的問題。
2.1存在氨基硼烷時與溴-(4-甲基苯基)甲基聚苯乙烯樹脂結(jié)合的模型肽的烯丙基/alloc去保護(hù)基本上重復(fù)實驗1.1，用(CH3)2NH-BH3作為清除劑，但將CTC樹脂替換為溴-(4-甲基苯基)甲基聚苯乙烯(約200目，1.2-2.2mmol/g)(CBL Patras，Greece)。將催化劑溶于AcOH/DMF(約4∶1)，同時在40℃在DMF(5倍樹脂體積)中進(jìn)行30分鐘去保護(hù)反應(yīng)。如上文1.2、1.3所述進(jìn)行步驟2.2和2.3，當(dāng)在存在2％TIS時在5％TFA的二氯甲烷溶液中進(jìn)行切除。乙酰化的成熟肽的產(chǎn)率約為72.8％(分析純)。
3.1與溴-(4-甲基苯基)甲基聚苯乙烯樹脂結(jié)合的模型肽的烯丙基/alloc去保護(hù)，催化劑替換為Pd(Oac)2/P(oTol)3基本上重復(fù)反應(yīng)2.1，但作以下修改在存在0.05當(dāng)量鄰-甲苯基膦時用0.05當(dāng)量Pd(Oac)2代替0.1當(dāng)量Pd(PPh3)4。并加入2.2當(dāng)量p-甲苯基亞磺酸鈉作為清除劑。即便在2小時后也只發(fā)生痕量轉(zhuǎn)化；將溫度升至60℃沒有變化。
4.1與溴-(4-甲基苯基)甲基聚苯乙烯樹脂結(jié)合的模型肽的烯丙基/alloc去保護(hù)，催化劑替換為Pd(P[oTol]3)2并使用亞磺酸酯如Paul等，Organometallics(1995)，14(6)，3030-3039所述獲得催化劑Pd(P[oTol]3)2，Paul等進(jìn)一步描述了如何獲得相關(guān)的Pd(P[2，4-二甲苯?；鵠3)2。將催化劑溶于AcOH/DMF(2∶1)?；旧先?.1所述進(jìn)行反應(yīng)，但使用0.05當(dāng)量Pd(P[oTol]3)2。在穩(wěn)定鼓入氮氣下加入2.2當(dāng)量p-甲苯基亞磺酸鈉。
40℃反應(yīng)30分鐘。反應(yīng)平靜進(jìn)行，步驟4.2后分析切下的乙?；漠a(chǎn)率為82％，如上面第2部分所述進(jìn)行步驟4.3。將烯丙基/alloc去保護(hù)的反應(yīng)時間延長至150分鐘不會顯著提高產(chǎn)率(產(chǎn)率84.5％)。將催化劑的用量降低約1半顯著減慢了反應(yīng)動力學(xué)。
5.1與溴-(4-甲基苯基)甲基聚苯乙烯樹脂結(jié)合的模型肽的烯丙基/alloc去保護(hù)，催化劑替換為Pd(PPh3)2并使用亞磺酸酯基本上如上所述重復(fù)反應(yīng)4.1，但現(xiàn)在用0.1當(dāng)量Pd(PPh3)4作為催化劑，烯丙基/alloc去保護(hù)反應(yīng)時間為30-60分鐘。切下的乙?；墒祀漠a(chǎn)率為82％。
可采用通用的或特別描述的本發(fā)明反應(yīng)物和/或操作條件代替上述實施例所用的那些，重復(fù)上述實施例并獲得同樣的成功。
盡管已經(jīng)特別參照這些優(yōu)選實施方案詳細(xì)描述了本發(fā)明，但其它實施方案也能獲得相同結(jié)果。本發(fā)明的變化和修改對于那些精通本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的，且本發(fā)明包括所有這些修飾和等價變化。上文提到的所有參考文獻(xiàn)、專利申請、專利和公開的完整內(nèi)容通過引用納入本文。
權(quán)利要求
1.通過內(nèi)酰胺化作用環(huán)化肽的方法，所述方法包括以下步驟a.脫去肽的烯丙基型保護(hù)基團(tuán)，所述肽在其Nα上用堿不穩(wěn)定性保護(hù)基團(tuán)保護(hù)，所述肽還包含至少一個烯丙氧基-羰基-保護(hù)的賴氨酸側(cè)鏈或該賴氨酸側(cè)鏈類似物的氨基官能團(tuán)，并且還包含至少一個烯丙基-酯-保護(hù)的谷氨?；蛱於滨；鶄?cè)鏈或者該側(cè)鏈類似物的ω-羧基，同時保留Nα上的堿不穩(wěn)定性保護(hù)基團(tuán)，其中所述烯丙型保護(hù)基是取代的或未取代的，b.在弱堿試劑存在下通過所述去保護(hù)側(cè)鏈的內(nèi)酰胺化作用使肽環(huán)化，和c.脫去所述肽Nα上的堿不穩(wěn)定性保護(hù)基團(tuán)。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述用堿不穩(wěn)定性保護(hù)基團(tuán)保護(hù)的Nα是還含有所述烯丙基-酯-保護(hù)的羧基的天冬氨?；鶜埢腘α，優(yōu)選所述天冬氨?；鶜埢嵌男蛄蠥sp-His的一部分。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，還包括通過連續(xù)肽合成或去保護(hù)Nα的肽區(qū)段偶聯(lián)來延伸所述肽的最終步驟d.。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述肽在環(huán)化過程中結(jié)合到固相，條件是，所述烯丙型保護(hù)基不作為樹脂手柄，所述步驟d.的肽延伸是連續(xù)固相肽合成。
5.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述環(huán)化反應(yīng)步驟b.在存在弱堿試劑和偶聯(lián)劑時在質(zhì)子惰性極性溶劑中進(jìn)行。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述環(huán)化反應(yīng)采用HCTU或TCTU或者采用苯并三唑的鹽作為偶聯(lián)劑進(jìn)行。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述肽通過酸不穩(wěn)定的鍵連接到樹脂支持物上。
8.如權(quán)利要求1-5中任一項所述的方法，其特征在于，所述肽通過酸不穩(wěn)定的鍵在其C末端共價連接。
9.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述堿不穩(wěn)定性保護(hù)基團(tuán)是FMOC基團(tuán)。
10.如權(quán)利要求1或7所述的方法，其特征在于，所述烯丙基和alloc保護(hù)基在存在烯丙基受體時通過Pd(0)催化除去，優(yōu)選用Rl-PhnSiHm作為烯丙基受體，所述受體是過量的，其中，R1是芳核上的取代基，并且是芳基、烷基或芳烷基，n是1或2，m是2或3，更優(yōu)選其中的烯丙基受體是PhSiH3。
11.一種如式II或III所示的具有用堿不穩(wěn)定性保護(hù)基團(tuán)保護(hù)的Nα的環(huán)肽， 其中，Y是堿不穩(wěn)定性保護(hù)基團(tuán)，n＝1-10，優(yōu)選n＝1或2，最優(yōu)選n＝1，此外，其中，m＝1-15，優(yōu)選m＝3-6，最優(yōu)選m＝3，此外，x＝1-200，q＝0-200，優(yōu)選x＝3-50，q＝0-50，其中，R1和R2分別為天然氨基側(cè)鏈或其非天然衍生物，所述側(cè)鏈還可包含除烯丙基醚和烯丙氧基羰基保護(hù)基之外的保護(hù)基，且其中的A是樹脂或樹脂手柄，或者其中的R2任選為天然氨基側(cè)鏈或其非天然衍生物，所述側(cè)鏈通過醚、硫醚、酯、硫酯、酰氨基或者仲氨基或叔氨基部分結(jié)合到樹脂或樹脂手柄，條件是，此時A選自O(shè)H、NH2、NR’1H或NR’1R’2，其中R’1和R’2獨立為C1-C4烷基。
12.如權(quán)利要求11所述的肽，其特征在于，所述堿不穩(wěn)定性基團(tuán)是FMOC。
13.如權(quán)利要求11或12所述的肽，其特征在于，所述肽具有式II，其中n＝1或2，更優(yōu)選n＝1。
14.如權(quán)利要求11-13中任一項所述的肽，其特征在于，A包括樹脂手柄或樹脂連接部分，但含有烯丙氧基羰基部分的樹脂手柄除外。
15.如權(quán)利要求14所述的肽，其特征在于，所述樹脂或樹脂手柄具有式IV 其中，R是樹脂，而R”1、R”2、R”3獨立為氫、C1-C4烷基或C1-C4烷氧基，并且可以相同或不同，條件是，R”1和R”2中只有一個可以是氫，且其中L是氧、硫、氮、或具有式V
16.如權(quán)利要求15所述的肽，其特征在于，所述樹脂或樹脂手柄具有式VI，基團(tuán)R、R”1和R”2采用上文的定義，條件是，L選自氧或氮，
17.如權(quán)利要求16所述的肽，其特征在于，所述樹脂或樹脂手柄具有式VII，基團(tuán)R、R”1和R”2采用上文的定義，條件是，L選自氧或氮，
18.如權(quán)利要求17所述的肽，其特征在于，當(dāng)X是氧時，R”1、R”2獨立為氫、甲基或甲氧基，條件是R”1、R”2中只有一個可以是氫，而當(dāng)X是氮時，R”1、R”2獨立為甲基或甲氧基，優(yōu)選甲氧基。
19.如權(quán)利要求18所述的肽，其特征在于，X是氧，R”1是氫，R”2是甲基或甲氧基，優(yōu)選A是樹脂或樹脂手柄。
20.如權(quán)利要求19所述的肽，其特征在于，R”2是甲基。
21.一種如式II或III所示的具有用堿不穩(wěn)定性保護(hù)基團(tuán)保護(hù)的Nα的環(huán)肽， 其中，Y是堿不穩(wěn)定性保護(hù)基團(tuán)，n＝1-10，優(yōu)選n＝1或2，最優(yōu)選n＝1，此外，其中，m＝1-15，優(yōu)選m＝3-6，最優(yōu)選m＝3，此外，x＝1-200，q＝0-200，其中，R1和R2分別獨立為天然氨基側(cè)鏈或其非天然衍生物，所述側(cè)鏈還可包含除烯丙基醚和烯丙氧基羰基保護(hù)基之外的保護(hù)基，且其中的A是樹脂或樹脂手柄，或者其中的R2任選為天然氨基側(cè)鏈或其非天然衍生物，所述側(cè)鏈通過醚、硫醚、酯、硫酯、酰氨基或者仲氨基或叔氨基部分結(jié)合到樹脂或樹脂手柄，條件是，此時A是OR’3，R’3是烯丙基之外的保護(hù)基，優(yōu)選R’3是叔丁基或五氟苯基。
22.Pd(P[鄰-甲苯基]3)2或Pd(P[2，4-二甲苯?；鵠3)2絡(luò)合物在催化烯丙基-保護(hù)的羧基或烯丙氧基羰基保護(hù)的氨基和/或羥基的去保護(hù)中的用途。
23.如權(quán)利要求22所述的用途，其特征在于，用有機(jī)亞磺酸鹽作為烯丙基受體或清除劑。
24.如權(quán)利要求21或22所述的用途，其特征在于，所述烯丙基-或烯丙氧基羰基-保護(hù)的基團(tuán)是任選被進(jìn)一步保護(hù)的肽的一部分，優(yōu)選為Fmoc保護(hù)的肽的一部分，其中，F(xiàn)moc基團(tuán)連接到肽的Nα上。
全文摘要
提供了一種通過內(nèi)酰胺化作用使肽的側(cè)鏈環(huán)化的新方法。
文檔編號C07K7/00GK101056884SQ200580038600
公開日2007年10月17日 申請日期2005年9月20日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月20日
發(fā)明者M·吉羅德, O·韋爾比茨基, M·維利納 申請人:隆薩股份公司