專利名稱：：抗ccr5抗體及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及抗CCR5抗體、其制備方法、含有所述抗體的藥物組合物及其用途。
背景技術(shù)：
：過(guò)去幾年間對(duì)于HIV-1侵入靶細(xì)胞的具體機(jī)制出現(xiàn)了日益增進(jìn)的理解。這促成了攻擊該進(jìn)程中不連續(xù)步驟的藥物研發(fā)成就。靶向侵入的第一種藥物最近獲得批準(zhǔn)進(jìn)行臨床應(yīng)用(恩夫韋地(enfuvirtide)，T20;Lazzarin，A.等人，N.EnglJ.Med.348(2003)2186-2195)。恩夫韋地是阻斷趨化因子受體結(jié)合之后階段的融合的一種肽類藥物。HIV-1感染通過(guò)病毒包膜糖蛋白(Env)與由CD4加上趨化因子受體組成的細(xì)胞受體復(fù)合物之間的相互作用而得以起始(Pierson，T.C.和Doms，R.W"Immuno.Lett.85(2003)113-118;以及Kilby，J.M.和Eron，J.J.，N.Engl.J.Med.348(2003)2228-2238)。Env具有兩個(gè)亞基其中表面糖蛋白gp120與細(xì)胞CD4受體相互作用，且與病毒跨膜亞基gp41非共價(jià)締合。gp"將gpl加錨定至病毒包膜，并參與融合。gpl加與細(xì)胞上CD4的結(jié)合觸發(fā)構(gòu)象改變，暴露出或產(chǎn)生能夠使gp120與細(xì)胞表面趨化因子受體"輔助受體(co-receptor)"相互作用的結(jié)合位點(diǎn)。趨化因子受體為七次跨膜G蛋白偶聯(lián)受體(7TMGPCR)，其響應(yīng)具有趨化性、炎性及其他功能的趨化因子、小細(xì)胞因子而正常地傳遞信號(hào)。臨床應(yīng)用的藥物很大比例針對(duì)其他7TMGPCR,因此靼向這些分子以阻斷病毒侵入是過(guò)去最成功型藥物研發(fā)計(jì)劃的延伸。HIV-1分離林需要CD4和輔助受體4曼入和感染細(xì)胞。CC趨化因子受體CCR5是巨噬細(xì)胞嗜性(R5)林系的輔助受體，并在HIV-1的性傳播方面起著決定性的作用(Berger，E.A"AIDS11(增刊A)(1997)S3-S16;Bieniasz，P.D.和Cullen，B.R.，F(xiàn)rontiersinBioscience3(1998)44-58;Littman，D.R.，Cell93(1998)677-680)。CCR5為大多數(shù)HIV-1原代分離林所利用，并且對(duì)于建立和維持感染非常重要。另外，CCR5功能對(duì)于人類健康是非必需的。突變的CCR5等位基因"CCR5A32"編碼截短的無(wú)功能蛋白質(zhì)(Samson，M.等人，Nature382(1996)722-725;Dean,M.等人，Science273(1996)1856-1862)。該突變純合個(gè)體沒(méi)有CCR5表達(dá)，且受到免于HIV-1感染的強(qiáng)有力保護(hù)。他們不表現(xiàn)出明顯的表型后果，對(duì)于巨噬細(xì)胞嗜性HIV感染呈現(xiàn)出高度的抗性，而雜合個(gè)體呈現(xiàn)出延遲的疾病進(jìn)程(Schwarz，M.K.和Wells,T.N.，Nat.Rev.DrugDiscov.1(2002)347-358)。缺乏CCR5沒(méi)有明顯的不利后果，原因很可能在于CCR5作為a趨化因子MIP-la、MIP-ip和RANTES的受體，是高度冗余的趨化因子網(wǎng)絡(luò)的一部分,所述趨化因子共享許多重疊的功能，且大多數(shù)具有可選的受體(Rossi，D.和Zlotnik，A.，Annu.Rev.Immunol.18(2000)217-243)。CCR5作為HIV-1輔助受體的鑒定是建立在其配體MIPla、MIP-ip和RANTES阻斷R5而非R5X4或X4分離林感染的能力的基礎(chǔ)上的(Cocchi,F.等人，Science270(1995)1811-1815)。CCR5也是"簇性(cluster)"趨化因子的受體，所述"簇性"趨化因子主要在炎性應(yīng)答期間產(chǎn)生，且控制嗜中性粒細(xì)胞(CXC趨化因子)、巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞亞型(T輔助Thl和Th2細(xì)胞)的募集。Thl應(yīng)答通常參與細(xì)胞介導(dǎo)的免疫作用，例如有效針對(duì)病毒和腫瘤，而Th2應(yīng)答據(jù)認(rèn)為對(duì)于變態(tài)反應(yīng)是關(guān)鍵性的。因此，這些趨化因子受體的抑制劑可用作為免疫調(diào)節(jié)劑。例如，對(duì)于Thl應(yīng)答而言，用于抑制自身免疫作用包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中過(guò)度活躍的應(yīng)答；或者對(duì)于Th2應(yīng)答而言，用于減輕哞喘發(fā)作或變態(tài)反應(yīng)應(yīng)答包括特應(yīng)性皮炎(例如參見(jiàn)Schols,D.,Curr.Top.Med.Chem.4(2004)883-893;Mueller,A.和Strange,P.G"Int.J.Biochem.CellBiol.36(2004)35-38;Kazmierski,W.M.等人，Curr.DrugTargetsInfect.Disord.2(2002)265-278;Lehner，T"TrendsImmunol.23(2002)347-351)。例如，抗CCR5抗體有PRO140(Olson，W.C.等人，J.Virol.73(1999)4145-4155)和2D7(Samson,M.等人，J.Biol.Chem272(1997)24934-24941)。其他抗體在US20040043033、US6610834、US20030228306、US20030195348、US20030166870、US20030166024、US20030165988、US20030152913、US20030100058、US20030099645、US20030049251、US20030044411、US20030003440、US6528625、US20020147147、US20020146415、US20020106374、US20020061834、US20020048786、US20010000241、EP1322332、EP1263791、EP1207202、EP1161456、EP1144006、WO2003072766、WO2003066830、WO2003033666、WO2002083172、WO0222077、WO0158916、WO0158915、WO0143779、WO0142308中提及。本發(fā)明的目的在于提供新的抗CCR5抗體，其主要用作艾滋病(AIDS)的治療劑。發(fā)明概述本發(fā)明涵蓋與CCR5結(jié)合的抗體，其特征在于所述抗體的可變重鏈氨基酸序列CDR3選自重鏈CDR3序列SEQIDNO:16或17。優(yōu)選本發(fā)明提供與CCR5結(jié)合的抗體，包含可變重鏈和可變輕鏈，其特征在于可變重鏈包含CDR序列CDR1、CDR2和CDR3，且CDRl選自SEQIDNO:9、10、11、12，CDR2選自SEQIDNO:13、14、15，CDR3選自SEQIDNO:16、17，其中所述CDR彼此獨(dú)立選擇。根據(jù)本發(fā)明的抗體優(yōu)選特征在于可變重鏈包含CDR序列CDRl、CDR2和CDR3，且CDR1選自SEQIDNO:18、19、20,CDR2選自SEQIDNO:21、22、23,而CDR3選自SEQIDNO:24或25，其中所述CDR;^>匕《蟲(chóng)_^^#?？贵w優(yōu)選特征在于含有SEQIDNO:1的CDR作為重鏈CDR以及SEQIDNO:2的CDR作為輕鏈CDR;含有SEQIDNO:3的CDR作為重鏈CDR以及SEQIDNO:4的CDR作為輕鏈CDR;含有SEQIDNO:5的CDR作為重鏈CDR以及SEQIDNO:6的CDR作為輕鏈CDR;含有SEQIDNO:7的CDR作為重鏈CDR以及SEQIDNO:8的CDR作為輕鏈CDR。CDR序歹'J可依才居Kabat等人,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第5版,PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD(1991)的標(biāo)準(zhǔn)定義來(lái)確定。SEQIDNO:1-8的CDR在SEQIDNO:925中顯示。各鏈上的CDR通過(guò)框架氨基酸分隔開(kāi)。根據(jù)本發(fā)明的抗體優(yōu)選特征在于所述抗體結(jié)合CCR5且包含獨(dú)立選自下組的可變重鏈和輕鏈區(qū)a)氨基酸序列SEQIDNO:1定義的重鏈(VH)可變結(jié)構(gòu)域和SEQIDNO:2定義的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VL);b)氨基酸序列SEQIDNO:3定義的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和SEQIDNO:4定義的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域；c)氨基酸序列SEQIDNO:5定義的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和SEQIDNO:6定義的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域；d)氨基*列SEQIDNO:7定義的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和SEQIDNO:8定義的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域；或其CCR5結(jié)合片段。根據(jù)本發(fā)明的抗體優(yōu)選特征在于重鏈可變區(qū)包含獨(dú)立選自SEQIDNO:l、3、5、7的氨基酸序列。根據(jù)本發(fā)明的抗體優(yōu)選特征在于輕鏈可變區(qū)包含獨(dú)立選自SEQIDNO:2、4、6、8的氨基酸序列。根據(jù)本發(fā)明的抗體優(yōu)選特征在于恒定鏈?zhǔn)侨嗽吹摹＿@樣的恒定鏈為本々頁(yè)域眾所周知，并由例如Kabat描述(例如參見(jiàn)Johnson,G.和Wu，T.T.，NucleicAcidsRes.28(2000)214-218)。例如，有用的人重鏈恒定區(qū)包含獨(dú)立選自SEQIDNO:26、27的氨基酸序列。例如，有用的人輕鏈恒定區(qū)包含SEQIDNO:28K輕鏈恒定區(qū)的^J^酸序列。還優(yōu)選抗體為鼠源的，且包含依據(jù)Kabat所述的小鼠抗體可變序列骨架(例如參見(jiàn)Johnson,G.和Wu，T.T"NucleicAcidsRes.28(2000)214-218)。所述抗體抑制人CCR5的一種或多種功能，例如CCR5的配體結(jié)合、信號(hào)傳遞活性(例如激活哺乳動(dòng)物G蛋白，誘導(dǎo)胞漿游離Ca"濃度快速而短暫地升高)和/或刺激細(xì)胞應(yīng)答(例如刺激趨化作用、胞吐作用、白細(xì)胞釋放炎性介質(zhì)、整聯(lián)蛋白激活)。所述抗體抑制RANTES、MIP-la、MIP-ip和/或HIV與人CCR5的結(jié)合，并抑制人CCR5介導(dǎo)的功能，如白細(xì)胞聚集(trafficking)、HIV侵入細(xì)胞、T細(xì)胞激活、炎性介質(zhì)釋放和/或白細(xì)胞脫粒。根據(jù)本發(fā)明的抗體在如下測(cè)定中與人CCR5特異性結(jié)合，并抑制HIV與靶細(xì)胞的融合，其ICs。值4.0jig/ml或更低所述測(cè)定包括在存在所述靶細(xì)胞的情況下，將病毒與有效抑制病毒與所述細(xì)胞之間膜融合濃度的抗體接觸。根據(jù)本發(fā)明的抗體與CCR5特異性結(jié)合，并抑制共表達(dá)CCR5和CD4多肽的第一細(xì)胞與表達(dá)HIVenv蛋白的第二細(xì)胞之間的膜融合，其IC50值1.5ng/ml或更低，優(yōu)選0.3照/ml或更低。根據(jù)本發(fā)明的抗體優(yōu)選在結(jié)合測(cè)定中在抗體濃度高達(dá)100pg/ml時(shí)不抑制趨化因子與CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR6和CXCR4的結(jié)合。根據(jù)本發(fā)明的抗體優(yōu)選在抗體濃度高達(dá)50照/ml、在表達(dá)CCR5和Galphal6的CHO細(xì)胞中檢測(cè)時(shí)不刺激胞內(nèi)Ca"升高。根據(jù)本發(fā)明的抗體優(yōu)選為人同種型IgGl、IgG2、IgG3或IgG4，其中優(yōu)選IgGl或IgG4。根據(jù)本發(fā)明的抗體優(yōu)選為IgG4同種型，優(yōu)選具有附加的突變S228P;或者優(yōu)選為IgGl同種型，在鉸鏈區(qū)CH1和CH2之間大約aa220-240處(Angal，S.等人，Mol.Immunol.30(1993)105-108)和/或在第二域間區(qū)域CH2和CH3之間大約aa330處(編號(hào)依據(jù)Kabat，例如參見(jiàn)Johnson,G.和Wu,T.T"NucleicAcidsRes.28(2000)214誦218)#"飾。此類^f務(wù)飾避免效應(yīng)功能(ADCC和/或CDC)。轉(zhuǎn)換IgG類型可以通過(guò)用期望類型抗體象IgGl突變體或IgG4的重鏈和輕鏈交換所述抗體的恒定重鏈和輕鏈來(lái)進(jìn)行。此類方法在本領(lǐng)域是眾所周知的。根據(jù)本發(fā)明的抗體優(yōu)選特征在于為人IgGl亞型，含有L234(氨基酸位置234處的亮氨酸)、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331和/或P329(編號(hào)依據(jù)EU索引)處的至少一個(gè)突變。優(yōu)選抗體為人IgGl型，包含突變L234A(氨基酸位置234處以丙氨酸取代亮氨酸)和L235A。本發(fā)明因此優(yōu)選涉及這樣的抗體，其特征在于所述抗體結(jié)合CCR5，含有人源Fc部分，且不結(jié)合人補(bǔ)體因子Clq和/或激活C3。優(yōu)選抗體不與至少一種人Fq受體結(jié)合。本發(fā)明還提供產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的雜交瘤細(xì)胞系保藏在德國(guó)的德意志微生物保藏中心(DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmBH)(DSMZ)?？捎伤黾?xì)胞系獲得的抗體為本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案。本發(fā)明的另一實(shí)施方案為與CCR5結(jié)合的抗體，其特征在于由細(xì)胞系m<CCR5>Pz01.F3、m<CCR5>Pz04.1F6、m<CCR5>Pz03.1C5或m<CCR5>Pz02.1Cll產(chǎn)生。如果與序列庫(kù)中描述的序列發(fā)生沖突，以這些準(zhǔn)。根據(jù)本發(fā)明的抗體與選自抗體A至E的細(xì)胞系抗體竟?fàn)幗Y(jié)合人CCR5。本發(fā)明還涵蓋核酸分子，其編碼根據(jù)本發(fā)明的抗體鏈、其可變鏈或CDR結(jié)構(gòu)域。所編碼的多肽能夠與相應(yīng)的其他抗體鏈裝配在一起，形成根據(jù)本發(fā)明的抗CCR5抗體分子。本發(fā)明還提供含有所述核酸的表達(dá)載體，以及含有這類載體的宿主細(xì)胞，所述載體能夠在原核或真核宿主細(xì)胞中表達(dá)所述核酸，用于重組生產(chǎn)這樣的抗體。本發(fā)明還涵蓋含有根據(jù)本發(fā)明載體的原核或真核宿主細(xì)胞。本發(fā)明還涵蓋用于生產(chǎn)根據(jù)本發(fā)明的重組人抗體的方法，其特征在于在原核或真核宿主細(xì)胞中表達(dá)根據(jù)本發(fā)明的核酸，并從所述細(xì)胞回收所述抗體。本發(fā)明還涵蓋可通過(guò)此類重組方法獲得的抗體。根據(jù)本發(fā)明的抗體對(duì)需要CCR5靶向治療的患者表現(xiàn)出益處。根據(jù)本發(fā)明的抗體具有新穎獨(dú)創(chuàng)的特性，為此類疾病患者、尤其是免疫抑制患者、尤其是HIV感染患者帶來(lái)益處。本發(fā)明還提供治療免疫抑制患者尤其是HIV感染患者的方法，包括向診斷為具有此類疾病(從而需要此類治療)的患者施用有效量的根據(jù)本發(fā)明與CCR5結(jié)合的抗體?？贵w優(yōu)選以藥物組合物的形式施用。本發(fā)明還涵蓋根據(jù)本發(fā)明抗體治療免疫抑制患者以及制備根據(jù)本發(fā)明藥物組合物的用途。另外，本發(fā)明涵蓋制備根據(jù)本發(fā)明藥物組合物的方法。本發(fā)明還涵蓋藥物組合物，包含藥物有效量的根據(jù)本發(fā)明的抗體，任何地還包含用于配制抗體的藥用緩沖劑和/或佐劑。本發(fā)明還提供藥物組合物，包含處于可藥用載體中的此類抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，可在制品或試劑盒中納入所述藥物組合物。發(fā)明詳述術(shù)語(yǔ)"抗體"涵蓋多種形式的抗體結(jié)構(gòu)，包括但不限于完整抗體、抗體片段。根據(jù)本發(fā)明的抗體優(yōu)選人源化抗體、嵌合抗體或其他遺傳改造的抗體，只要保留根據(jù)本發(fā)明的特征性特性即可。"抗體片段"包括全長(zhǎng)抗體的一部分，優(yōu)選其可變區(qū)或至少其抗原結(jié)合部分?？贵w片段的實(shí)例包括雙鏈抗體、單鏈抗體分子、免疫毒素以及由抗體片段形成的多特異性抗體。另外，抗體片段包括單鏈多肽，其具有VH鏈的特征，即能夠與VL鏈裝配在一起；或具有與CCR5結(jié)合的VL鏈的特征，即能夠與VH鏈裝配在一起；從而形成功能性抗原結(jié)合口袋，由此提供抑制膜融合或抑制HIV與靶細(xì)胞融合的特性。如本文所用的術(shù)語(yǔ)"單克隆抗體"或"單克隆抗體組合物"是指具有單一^J^酸組成的抗體分子制品。術(shù)語(yǔ)"嵌合抗體"是指包含來(lái)自小鼠的可變區(qū)即結(jié)合區(qū)以及至少一部分衍生自不同來(lái)源或物種的恒定區(qū)的單克隆抗體，通常通過(guò)重組DNA技術(shù)制備。特別優(yōu)選包含小鼠可變區(qū)和人恒定區(qū)的嵌合抗體。此類小鼠/人嵌合抗體為免疫球蛋白基因的表達(dá)產(chǎn)物，所述免疫球蛋白基因包含編碼小鼠免疫球蛋白可變區(qū)的DNA區(qū)段以及編碼人免疫球蛋白恒定區(qū)的DNA區(qū)段。本發(fā)明所涵蓋的其他形式的"嵌合抗體"是那些與原始抗體相比，其類型或亞型經(jīng)過(guò)修飾或改變的抗體。此類"嵌合"抗體稱為"類型轉(zhuǎn)換抗體"。生產(chǎn)嵌合抗體的方法包括目前本領(lǐng)域眾所周知的常規(guī)重組DNA技術(shù)和基因轉(zhuǎn)染技術(shù)。例如，參見(jiàn)Morrison,S丄.等人，Proc.Natl.AcadSci.USA81(1984)6851-6855;美國(guó)專利No.5,202,238和5,204,244。術(shù)語(yǔ)"人源化抗體"是指這樣的抗體，其中框架或"互補(bǔ)決定區(qū)"(CDR)已經(jīng)被修飾，以包含與親本免疫球蛋白相比具有不同特異性的免疫球蛋白CDR。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，將小鼠CDR移植至人抗體的框架區(qū)，以制備"人源化抗體"。例如，參見(jiàn)Riechm謹(jǐn)，L.等人,Nature332(1988)323-327;以及Neuberger，M.S.等人，Nature314(1985)268-270。特別優(yōu)選的CDR對(duì)應(yīng)于提供這樣序列的CDR,所述序列識(shí)別上述嵌合及雙功能抗體的抗原。如本文所用的術(shù)語(yǔ)"與CCR5結(jié)合"是指在基于細(xì)胞的體外ELISA試驗(yàn)(表達(dá)CCR5的CHO細(xì)胞)中抗體與CCR5的結(jié)合。在抗體濃度為100ng/ml時(shí)、抗體產(chǎn)生5或以上，優(yōu)選10或以上信噪比(S/N比，信號(hào)/噪音比率)，則發(fā)生結(jié)合。根據(jù)本發(fā)明的抗體與選自抗體A至E的抗體結(jié)合相同的CCR5表位，或由于結(jié)合的空間位阻而抑制與CCR5結(jié)合。根據(jù)Olson，W.C.等人，J.Virol.73(1999)4145-4155所述的表位作圖方法，通過(guò)丙氨酸突變來(lái)研究表位結(jié)合。75%或以上的信號(hào)降低表明突變的氨基酸促成所述抗體的表位。如果促成所研究抗體表位的氨基酸與促成抗體A、B、C、D或E表位的氨基酸相同，則結(jié)合相同的表位。在HIV測(cè)定中其ICs。值比抗體2D7低的抗體C所結(jié)合的表位包括CCR5上ECL2結(jié)構(gòu)域中的氨基酸(Lee，B.等人，J.Biol.Chem.274(1999)9617-9626)，有別于抗體2D7所識(shí)別的表位(2D7結(jié)合ECL2A中^J^酸K171和E172,但不結(jié)合ECL2B氨基酸184-189)?？贵wC對(duì)CCR5突變體K171A或E172A(glu172突變?yōu)閍la)的表位結(jié)合為20%。對(duì)野生型CCR5的表位結(jié)合定義為100%。因此，本發(fā)明的另一實(shí)施方案為與CCR5上抗體C所結(jié)合的相同表位結(jié)合的抗體。如本文所用的術(shù)語(yǔ)"七次跨膜趨化因子分子結(jié)構(gòu)"是指當(dāng)CCR5位于細(xì)胞膜雙層中時(shí)所顯示出的天然結(jié)構(gòu)(例如參見(jiàn)Oppermann，M.，Cell.Sig.16(2004)1201-1210)。同其他lbG蛋白偶聯(lián)受體一樣，CCR5由胞外N畫(huà)末端結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)C-末端結(jié)構(gòu)域組成?？缒そY(jié)構(gòu)域由7個(gè)疏水跨膜區(qū)段組成，這些區(qū)段由3個(gè)胞質(zhì)和3個(gè)胞外區(qū)段連接在一起。根據(jù)本發(fā)明的抗體以其7次跨膜趨化因子分子結(jié)構(gòu)與CCR5結(jié)合。術(shù)語(yǔ)"表位"是指能夠與抗體特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)決定簇。表位通常由化學(xué)上活躍的表面分子基團(tuán)如氨基酸或糖側(cè)鏈組成，并且通常具有特定的三維結(jié)構(gòu)特征以及特定的電荷特征。構(gòu)象表位有別于非構(gòu)象表位，因?yàn)樵谧冃匀軇┑拇嬖谙虑罢叨呛笳呦?。?yōu)選4艮據(jù)本發(fā)明的抗體與天然而非變性的CCR5結(jié)合。這樣的抗體優(yōu)選包含重鏈CDR3SEQIDNO:17，且優(yōu)選另外包含重鏈CDRSEQIDNO:IO、11、12、14和/或15。優(yōu)選這樣的抗體為抗體B、C、D或E，或包含抗體B、C、D或E的可變區(qū)。優(yōu)選與變性CCR5結(jié)合的抗體為抗體A，或包含抗體A的可變區(qū)。術(shù)語(yǔ)"膜融合"是指共表達(dá)CCR5和CD4多肽的第一細(xì)胞與表達(dá)HIVenv蛋白的第二細(xì)胞之間的融合。膜融合通過(guò)熒光素酶報(bào)告基因測(cè)定來(lái)檢測(cè)。術(shù)語(yǔ)"抑制HIV與靶細(xì)胞的融合"是指在如下測(cè)定中測(cè)量時(shí)抑制HIV與革巴細(xì)胞的融合所述測(cè)定包括在存在所述靼細(xì)胞的情況下，將病毒與有效抑制病毒與所述細(xì)胞之間膜融合濃度的抗體接觸，并測(cè)量熒光素酶報(bào)告基因的活性。如本文所用，術(shù)語(yǔ)"核酸分子"旨在包括DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是單鏈或雙鏈的，但優(yōu)選為雙鏈DNA。如本文所用的"可變區(qū)"(輕鏈可變區(qū)(VL)、重鏈可變區(qū)(VH))表示直接參與抗體與抗原結(jié)合的每一對(duì)輕鏈和重鏈。可變輕鏈和重鏈結(jié)構(gòu)域具有相同的整體結(jié)構(gòu)，且每一結(jié)構(gòu)域包含序列普遍保守的四個(gè)框架(FR)區(qū)，由三個(gè)"高變區(qū)"(或互補(bǔ)決定區(qū)CDR)連接在一起?？蚣軈^(qū)釆取P-片層構(gòu)象，而CDR可以形成連接P-片層結(jié)構(gòu)的環(huán)。每條鏈上的CDR通過(guò)框架區(qū)保持其三維結(jié)構(gòu)，并與其他鏈上的CDR—起形成抗原結(jié)合位點(diǎn)?？贵w重鏈和輕鏈CDR3區(qū)對(duì)于根據(jù)本發(fā)明抗體的結(jié)合特異性/親和力起著極其重要的作用，從而提供本發(fā)明的另一目的。術(shù)語(yǔ)"高變區(qū)"或"抗體的抗原結(jié)合部分"在文中是指抗體中負(fù)責(zé)抗原結(jié)合的氨基酸殘基。高變區(qū)包括來(lái)自"互補(bǔ)決定區(qū)"或"CDR"的氨基酸殘基。"框架區(qū)"或"FR"區(qū)是除了文中所定義的高變區(qū)殘基以外的那些可變結(jié)構(gòu)域區(qū)域。因此，抗體的可變輕鏈和重鏈從N-端至C-端包括結(jié)構(gòu)域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。特別地，重鏈CDR3是對(duì)抗原結(jié)合貢獻(xiàn)最大的區(qū)域，從而定義抗體，根據(jù)本發(fā)明抗體的特征在于其重鏈可變區(qū)包含CDR3序列SEQIDNO:16或SEQIDNO:17。CDR和FR區(qū)依據(jù)Kabat等人，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第5版，PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda，MD(1991))的標(biāo)準(zhǔn)定義和/或來(lái)自"高變環(huán)"的那些殘基進(jìn)行確定。如本文所用，術(shù)語(yǔ)"核酸，，或"核酸分子"旨在包括DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是單鏈或雙鏈的，但優(yōu)選為雙鏈DNA。當(dāng)核酸與另一核酸序列處于功能關(guān)聯(lián)狀態(tài)時(shí)，其"有效連接"。例如，肽分泌的前蛋白，則他們有效連接；如果啟動(dòng)子或增強(qiáng)子的連接影響編碼序列的轉(zhuǎn)錄，則他們有效連接；或者如果核糖體結(jié)合位點(diǎn)與編碼序列如此安置從而有利于翻譯，則他們有效連接。通常，"有效連接"表示相連的DNA序列是共線性的(colinear),而且在分泌前導(dǎo)肽的情況下是相鄰且同讀框相連的。不過(guò)，增強(qiáng)子不必相鄰。相連通過(guò)便利的限制性位點(diǎn)處的連接實(shí)現(xiàn)。如果不存在這樣的位點(diǎn)，則按照常規(guī)操作使用合成的寡核苷酸接納體或接頭。如本文所用，表述"細(xì)胞"、"細(xì)胞系，，及"細(xì)胞培養(yǎng)物"互換使用，且所有這樣的指代包括子代。從而，措辭"轉(zhuǎn)化林"和"轉(zhuǎn)化細(xì)胞"包括原代受試細(xì)胞以及由之衍生的培養(yǎng)物，而不考慮傳代次數(shù)。也應(yīng)當(dāng)理解，由于蓄意的或疏忽的突變，所有的子代在DNA含量上可能并不精確地完全相同。從原始轉(zhuǎn)化細(xì)胞中篩選出的具有相同功能或生物活性的變體子代包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。"恒定結(jié)構(gòu)域，，不直接參與抗體與抗原的結(jié)合，但表現(xiàn)出多種效應(yīng)功能?？贵w或免疫球蛋白根據(jù)其重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列進(jìn)行分型IgA、IgD、IgE、IgG和IgM,且其中若干可進(jìn)一步劃分為亞型(同種型)，如IgGl、IgG2、IgG3和IgG4，IgAl和IgA2。對(duì)應(yīng)于不同類型免疫球蛋白的重鏈恒定區(qū)分別稱為a、3、￡、y和P。根據(jù)本發(fā)明的抗體優(yōu)選為IgG類型。如本文所用，術(shù)語(yǔ)"人源Fc部分，，表示IgG4亞型人抗體的Fc部分，或者IgGl、IgG2或IgG3亞型人抗體的Fc部分，經(jīng)^奮飾從而檢測(cè)不到下文所定義的FcR(F(7RIIIa)結(jié)合和/或Clq結(jié)合。"抗體的Fc部分"為技術(shù)人員所熟知的術(shù)語(yǔ)，且基于抗體的木瓜蛋白酶切割而定義。根據(jù)本發(fā)明的抗體含有人源Fc部分作為Fc部分，且優(yōu)選含有人恒定區(qū)的所有其他部分。優(yōu)選Fc部分為人Fc部分，且尤其優(yōu)選來(lái)自人IgG4亞型，或?yàn)閬?lái)自人IgGl亞型的突變Fc部分。最優(yōu)選如下所示的Fc部分和重鏈恒定區(qū)SEQIDNO:26和27、具有L234A和L235A突變的SEQIDNO:26或具有S228P突變的SEQIDNO:27。盡管IgG4表現(xiàn)出降低的Fc受體(FcyRIIIa)結(jié)合，其他IgG亞型抗體表現(xiàn)出強(qiáng)結(jié)合。不過(guò)，如果改變Pro238、Asp265、Asp270、Asn297(喪失Fc糖類)、Pro329以及234、235、236和237、Ue253、Ser254、Lys288、Thr307、Gln311、Asn434還有His435殘基，也提供降低的FcR結(jié)合(Shields,R.L.等人J.Biol.Chem.276(2001)6591-6604;Lund，J.等人FASEBJ.9(1995)115-119;Morgan,A.等人Immunology86(1995)319-324;以及EP0307434)。優(yōu)選根據(jù)本發(fā)明的抗體涉及IgG4亞型或者IgGl或IgG2亞型的FcR結(jié)合，具有S228、L234、L235和/或D265突變、和/或含有PVA236突變。優(yōu)選突變S228P、L234A、L235A、L235E和/或PVA236。尤其優(yōu)選IgG4在S228P處突變，而IgGl在L234A+L235A處突變。抗體的Fc部分直接參與補(bǔ)體激活和Clq結(jié)合。雖然抗體對(duì)于補(bǔ)體系統(tǒng)的影響有賴于某些條件，但是與Clq的結(jié)合是由Fc部分明確的結(jié)合位點(diǎn)引起的。此類結(jié)合位點(diǎn)是本領(lǐng)域公知的，并由例如Lukas，T.J.等人，J.Immunol.127(1981)2555-2560;Brunhouse，R.和Cebra，J.J.，Mol.Immunol.16(1979)卯7-917;Burton,D.R.等人，Nature288(1980)338-344;Thommesen，J.E.等人，Mol.Immunol.37(2000)995-1004;Idusogie,E.E.等人，J.Immunol.164(2000)4178-4184;Hezareh，M.等人，J.Virol.75(2001)12161-12168;Morgan,A.等人，Immunology86(1995)319-324;以及EP0307434描述。此類結(jié)合位點(diǎn)有例如L234、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331和P329(編號(hào)依據(jù)Kabat的EU索引)。IgGl、IgG2和IgG3亞型的抗體通常表現(xiàn)出補(bǔ)體激活和Clq及C3結(jié)合，而IgG4并不激活補(bǔ)體系統(tǒng)，而且不結(jié)合Clq和C3。本發(fā)明涉及結(jié)合CCR5而不結(jié)合Fc受體和/或補(bǔ)體因子Clq的抗體。所述抗體不引發(fā)抗體依賴性細(xì)胞毒作用(ADCC)和/或補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒作用(CDC)。優(yōu)選此抗體特征在于結(jié)合CCR5、含有人源Fc部分而不結(jié)合Fc受體和/或補(bǔ)體因子Clq。更優(yōu)選此抗體為人或人源化抗體或清除了T細(xì)胞抗原的抗體，例如按照WO98/52976和WO00/34317所述。Clq結(jié)合可按照Idusogie，E.E.等人，J.Immunol.164(2000)4178-4184進(jìn)行測(cè)量。如果在抗體濃度為8pg/ml時(shí)，OD492-405nm處比具有未^務(wù)飾(野生型)Fc部分抗體的人Clq結(jié)合值低15。/。，則不發(fā)生"Clq結(jié)合"。ADCC可通過(guò)抗體對(duì)人NK細(xì)胞上人FcyRIIIa的結(jié)合來(lái)測(cè)量。結(jié)合在抗體濃度為20pg/ml時(shí)進(jìn)行檢測(cè)。"無(wú)FcR結(jié)合或無(wú)ADCC"表示在抗體濃度為20pg/ml時(shí)，與人IgGl(SEQIDNO:26)對(duì)相同抗體的結(jié)合相比，對(duì)人NK細(xì)胞上人FcyRIIIa的結(jié)合至多為30%。另外，根據(jù)本發(fā)明的抗體包括具有"保守序列修飾"[即不影響或改變抗體)。修飾可通過(guò)本領(lǐng)域公知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)引入，如定點(diǎn)誘變和PCR介導(dǎo)基進(jìn)行替換的取代。具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基家族在本領(lǐng)域已有定義。這些家族包括具有堿性側(cè)鏈(如賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、酸性側(cè)鏈(如天冬氨酸、谷氨酸)、不帶電荷的極性側(cè)鏈(如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非極性側(cè)鏈(如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、p-支鏈側(cè)鏈(如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和芳香族側(cè)鏈(如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)的氨基酸。從而，人抗CCR5抗體中推斷的非必需氨基酸殘基可以優(yōu)選替換為來(lái)自相同側(cè)鏈家族的其他M酸殘基。因此，"變體"抗CCR5抗體在文中指其氨基酸序列有別于"親本"抗CCR5抗體氨基酸序列、在親本抗體重鏈CDR3之外的一個(gè)或多個(gè)可變區(qū)存在多至10個(gè)、優(yōu)選大約2個(gè)至大約5個(gè)添加、缺失和/或取代的分子。每一個(gè)其他CDR區(qū)包含至多l(xiāng)個(gè)單氨基酸添加、缺失和/或取代，本發(fā)明涵蓋修飾與CCR5結(jié)合的親本抗體的CDR氨基酸序列的方法，其特征在于選擇選自SEQIDNO:l、3、5、7的重鏈CDR和/或選自SEQIDNO:2、4、6、8的抗體輕鏈CDR,提供編碼所述初始CDR氨基酸序列的核酸，修飾所述核酸，從而重鏈CDR1中的一個(gè)M酸經(jīng)修飾，重鏈CDR2中的一個(gè)氨基酸經(jīng)修飾，輕鏈CDR1中的1-3個(gè)氨基酸經(jīng)修飾，輕鏈CDR2中的1-3個(gè)氨基酸經(jīng)修飾，和/或輕鏈CDR3中的1-3個(gè)氨基酸經(jīng)修飾，在抗體結(jié)構(gòu)中表達(dá)所述經(jīng)修飾的CDR氨基酸序列，測(cè)量所述抗體是否與CCR5結(jié)合，并且如果抗體與CCR5結(jié)合，則選擇所述修飾的CDR。優(yōu)選此類修飾為保守序列修飾。氨基酸取代可基于Riechmann，L.等人，Nature332(1988)323-327以及Queen,C.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86(1989)10029-10033所述的分子建模通過(guò)誘變進(jìn)行。本發(fā)明的另一實(shí)施方案是生產(chǎn)不結(jié)合Fqr受體和/或Clq的抗CCR5抗體的方法，其特征在于以這樣的方式修飾與CCR5結(jié)合的人IgGl型抗體重鏈的編碼核酸序列，從而所述修飾的抗體不結(jié)合Clq和/或Fey受體，述載體插入到真核宿主細(xì)胞中，表達(dá)并從宿主細(xì)胞或上清液中回收所編碼的蛋白質(zhì)。優(yōu)選抗體通過(guò)"類型轉(zhuǎn)換"修飾，即改變或突變Fc部分(例如，從IgGl轉(zhuǎn)換為IgG4，和/或IgGl/IgG4突變)，優(yōu)選如IgGlvl(E233P;L234V;L235A;AG236;A327G;A330S;P331S所定義的PVA-236;GLPSS331)、IgGlv2(L234A;L235A)和IgG4vl(S228P;L235E)以及IgG4x(S228P)所定義。就序列而言的同一性或同源性在文中定義為在比對(duì)序列并且必要時(shí)？1入空位以獲得最大序列同一性百分比之后，候選序列中與親本抗體殘基相同的氨基酸殘基的百分比?？贵w序列的N-末端、C-末端或內(nèi)部延伸、缺失或插入都不應(yīng)闡釋為影響序列同一性或同源性。變體保留結(jié)合人CCR5的能力，且優(yōu)選具有比親本抗體更為優(yōu)越的特性。例如，變體在治療期間具有降低的副作用。文中的"親本，，抗體是用以制備變體的氨基酸序列所編碼的抗體。優(yōu)選親本抗體具有人框架區(qū)，并且如果存在的話，具有人抗體恒定區(qū)。例如，親本抗體可以是人源化或人抗體。根據(jù)本發(fā)明的抗體優(yōu)選通過(guò)重組手段生產(chǎn)。此類方法在本領(lǐng)域廣為人知，并且包括在原核和真核細(xì)胞中表達(dá)蛋白質(zhì)，隨后分離抗體多肽，并通常純化至可藥用的純度。為進(jìn)行蛋白質(zhì)表達(dá)，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法將編碼輕鏈和重鏈或其片段的核酸插入表達(dá)載體中。表達(dá)在合適的原核或真核宿主細(xì)胞象CHO細(xì)胞、NSO細(xì)胞、SP2/0細(xì)胞、HEK293細(xì)胞、COS細(xì)胞、酵母或大腸桿菌細(xì)胞中進(jìn)行，并從細(xì)胞(上清液或裂解后的細(xì)胞)中回收抗體?？贵w的重組生產(chǎn)在本領(lǐng)域眾所周知，并描述在例如Makrides，S.C.，ProteinExpr.Purif.17(1999)183-202;Geisse，S.等人，ProteinExpr.Purif.8(1996)271-282;Kaufman,R.J.，Mol.Biotechnol.16(2000)151-161;Werner,R.G"DrugRes.48(1998)870-880的綜述文章中。抗體可以存在于完整細(xì)胞或細(xì)胞裂解物中，或?yàn)椴糠旨兓蚧旧霞兊男问?。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，包括本領(lǐng)域眾所周知的^SDS處理、氯化銫分帶(CsClbanding)、柱層析、瓊脂糖凝膠電泳等等進(jìn)行純化，以除去其他細(xì)胞組分或其他雜質(zhì)，如其他細(xì)胞核酸或蛋白質(zhì)。參見(jiàn)Ausubel，F(xiàn).等人編輯CurrentProtocolsinMolecularBiology,GreenePublishingandWileyInterscience，NewYork(1987)。NS0細(xì)胞中的表達(dá)由例如Barnes，L.M.等人，Cytotechnology32(2000)109-123;以及Barnes,L.M.等人，Biotech.Bioeng.73(2001)261-270描述。瞬時(shí)表達(dá)由例如Durocher，Y.等人，Nucl.Acids.Res.30(2002)E9描述?？勺兘Y(jié)構(gòu)域的克隆由Orlandi，R.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86(1989)3833-3837;Carter,P.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89(1992)4285-4289;以及Norderhaug，L.等人，J.Immunol.Methods204(1997)77-87描述。優(yōu)選的瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)(HEK293)由Schlaeger，E.-J.和Christensen，K.在Cytotechnology30(1999)71-83中以及Schlaeger，E.國(guó)J.在J.Immunol.Methods194(1996)191-199中描述。當(dāng)核酸與另一核酸序列處于功能關(guān)聯(lián)狀態(tài)時(shí)，其"有效連接"。例如，如果前序列或分泌前導(dǎo)肽的DNA與多肽的DNA的連接表達(dá)為參與所述多肽分泌的前蛋白，則他們有效連接；如果啟動(dòng)子或增強(qiáng)子的連接影響編碼序列的轉(zhuǎn)錄，則他們有效連接；或者如果核糖體結(jié)合位點(diǎn)與編碼序列如此安置從而有利于翻譯，則他們有效連接。通常，"有效連接，，表示相連的DNA序列是相鄰的，而且在分泌前導(dǎo)肽的情況下是相鄰且同讀框相連的。不過(guò)，增強(qiáng)子不必相鄰。相連通過(guò)便利的限制性位點(diǎn)處的連接實(shí)現(xiàn)。如果不存在這樣的位點(diǎn)，則按照常規(guī)操作使用合成的寡核苷酸接納體或接頭。通過(guò)常規(guī)的免疫球蛋白純化方法如蛋白質(zhì)A-瓊脂糖、羥基磷灰石層析、凝膠電泳、透析或親和層析從培養(yǎng)基中適當(dāng)?shù)胤蛛x單克隆抗體。編碼單克隆抗體的DNA和RNA很容易分離，并利用常規(guī)方法進(jìn)行測(cè)序。雜交瘤細(xì)胞可用作為此類DNA和RNA的來(lái)源。DNA—經(jīng)分離，即可插入到表達(dá)載體中，隨之轉(zhuǎn)染進(jìn)宿主細(xì)胞，例如否則將不生產(chǎn)免疫球蛋白的HEK293細(xì)胞、CHO細(xì)胞或骨髓瘤細(xì)胞，以實(shí)現(xiàn)宿主細(xì)胞中重組單克隆抗體的合成。人CCR5抗體的氨基酸序列變體通過(guò)向抗體DNA中引入適當(dāng)?shù)暮塑账嶙兓蛲ㄟ^(guò)肽合成而制備。不過(guò)，此類修飾可以僅在極其有限的范圍內(nèi)進(jìn)行，例如，如上文所述的那樣。例如，修飾不改變上述抗體特征如IgG同種型和表位結(jié)合，但是可以提高重組生產(chǎn)的產(chǎn)率、蛋白質(zhì)穩(wěn)定性或便于純化。任何不參與維持抗CCR5抗體正確構(gòu)象的半胱氨酸殘基也可以進(jìn)行取代，通常取代為絲氨酸，以提高分子的氧化穩(wěn)定性并防止異常交聯(lián)。相反，可以向抗體中引入半胱氨酸鍵以提高其穩(wěn)定性(在抗體為抗體片段如Fv片段的情況下尤為如此)。抗體的另一類氨基酸變體改變抗體原始的糖基化模式。所述改變是指缺失抗體中所見(jiàn)的一個(gè)或多個(gè)糖部分，和/或添加抗體中不存在的一個(gè)或多個(gè)糖基化位點(diǎn)?？贵w的糖基化通常是N-連接的。N-連接是指糖部分附著于天冬酰胺殘基的側(cè)鏈。三肽序列天冬酰胺-X-絲氨酸以及天冬酰胺-X-蘇氨酸(其中X為除脯氨酸之外的任意氨基酸)為糖部分酶促附著于天冬酰胺側(cè)鏈的識(shí)別序列。從而，多肽中存在這些三肽序列中的任何一個(gè)都會(huì)產(chǎn)生潛在的糖基化位點(diǎn)。通過(guò)改變氨基酸序列從而使之含有一個(gè)或多個(gè)上述三肽序列(對(duì)于N-連接的糖基化位點(diǎn)而言)，可以便利地向抗體中添加糖基化位點(diǎn)。方法制備。這些方法包括但不限于從天然來(lái)源中分離(對(duì)于天然存在的氨基酸序列變體而言)或由早先制備的變體或非變體形式的人源化抗CCR5抗體通過(guò)寡核苷酸介導(dǎo)的(或定點(diǎn))誘變、PCR誘變以及盒誘變來(lái)制備。另一類共價(jià)修飾包括將糖苷化學(xué)或酶促偶聯(lián)于抗體。這些方法具有優(yōu)勢(shì)，在于無(wú)需在宿主細(xì)胞中生產(chǎn)能夠進(jìn)行N-或O-連接的糖基化作用的抗體。根據(jù)所用的偶聯(lián)模式，糖可以附著于(a)精氨酸和組氨酸，(b)游離羧基，(c)游離巰基如半胱氨酸的巰基，(d)游離羥基如絲氨酸、蘇氨酸或羥脯氨酸的羥基，(e)芳香族殘基如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸的殘基，或者(f)谷氨酰胺的氨基。這些方法描述在WO87/05330以及Aplin，J.D.和Wriston，J.C.Jr"CRCCrit.Rev.Biochem.4(1981)259-306。除去抗體中存在的任何糖部分可以化學(xué)或酶促實(shí)現(xiàn)?；瘜W(xué)去糖基化作用需要將抗體與化合物三氟甲磺酸或等價(jià)化合物進(jìn)行接觸。這種處理導(dǎo)致切除除了連接糖(N-乙酰葡糖胺或N-乙酰半乳糖胺)之外的大多數(shù)或所有糖，而留下完整的抗體?；瘜W(xué)去糖基化作用由Sojahr，H.T.和Bahl，O.P.，Arch.Biochem.Biophys.259(1987)52-57以及Edge,A.S.等人Anal.Biochem.ll8(l卵l)lM-l37描述?？贵w上糖部分的酶促切割可如Thotakura,N.R.和Bahl,O.P.，Meth.Enzymol.138(1987)350-359所述，通過(guò)多種內(nèi)切糖苷酶和外切糖苷酶實(shí)現(xiàn)?？贵w的另一類共價(jià)修飾包括以美國(guó)專利No.4,640,835;4,496,689;4,301,144;4,670,417;4,791,192或4,179,337所述的方式，將抗體連接于多種非蛋白原性聚合物之一，如聚乙二醇、聚丙二醇或聚氧化烯。將重建的重鏈和輕鏈可變區(qū)與啟動(dòng)子、翻譯起始、恒定區(qū)、3，非翻譯、多聚腺苷酸化以及轉(zhuǎn)錄終止序列組合起來(lái)，以形成表達(dá)載體構(gòu)建體。重鏈和輕鏈表達(dá)構(gòu)建體可以組合為單個(gè)載體、共轉(zhuǎn)染、順次轉(zhuǎn)染，或分別轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞中，然后融合以形成表達(dá)兩條鏈的單個(gè)宿主細(xì)胞。本發(fā)明還涵蓋根據(jù)本發(fā)明的抗體用于體外診斷艾滋病易感性的用途，優(yōu)選通過(guò)免疫測(cè)定法檢測(cè)人血漿樣品的可溶性CCR5(TsimanisT.，ImmunologyLetters96(2005)55-61)與根據(jù)本發(fā)明抗體之間的結(jié)合。CCR5的表達(dá)與疾病進(jìn)程相關(guān)，并可用于鑒定艾滋病易感的低或高風(fēng)險(xiǎn)個(gè)體。出于診斷目的，抗體或抗原結(jié)合片段可以是標(biāo)記或非標(biāo)記的。通常，診斷測(cè)定需要檢測(cè)因抗體或片段與CCR5結(jié)合所產(chǎn)生的復(fù)合物的形成。本發(fā)明在另一方面提供了組合物如藥物組合物，含有與可藥用載體配制在一起的本發(fā)明單克隆抗體之一或抗體組合或其抗原結(jié)合片段。如本文所用，"可藥用載體"包括生理上相容的任何及所有溶劑、分散介質(zhì)、包衣、抗菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等等。優(yōu)選載體適于注射或輸注。本發(fā)明的組合物可通過(guò)本領(lǐng)域公知的多種方法施用。正如技術(shù)人員將會(huì)理解的那樣，施用路徑和/或施用方式將隨期望的結(jié)果而變動(dòng)?？伤幱幂d體包括無(wú)菌水性溶液或分散液，以及用于制備無(wú)菌注射液或分散液的無(wú)菌粉劑。此類介質(zhì)和藥劑用于藥物活性物質(zhì)的用途是本領(lǐng)域公知的。例如，除了水之外，栽體還可以是等滲緩沖鹽溶液。無(wú)論所選的施用路徑如何，本發(fā)明的化合物(可以以適宜水合物的形式使用)和/或本發(fā)明的藥物組合物通過(guò)本領(lǐng)域公知的常規(guī)方法配制為可藥用劑型。根據(jù)本發(fā)明藥物組合物中活性成分的實(shí)際劑量水平可有變動(dòng)，以獲得有效量的活性成分，對(duì)于特定的患者、組合物和施用模式實(shí)現(xiàn)期望的治療反應(yīng)，而對(duì)患者沒(méi)有毒性。所選的劑量水平將取決于多種藥代動(dòng)力學(xué)因素，包括所采用的本發(fā)明特定組合物和其酯、鹽或氬基化合物的活性、施用路徑、施用時(shí)間、所采用特定化合物的排泄速率、與所采用特定組合物組合使用的其他藥物、化合物和/或材料、所治療患者的年齡、性別、體重、病情、總體健康和既往病史、以及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域眾所周知的類似因素。本發(fā)明涵蓋根據(jù)本發(fā)明的抗體用于治療免疫抑制患者的用途，例如患有免疫缺陷綜合癥如艾滋病患者出現(xiàn)的免疫抑制，經(jīng)歷放射治療、化療、自身免疫疾病治療或其他藥物治療(如皮質(zhì)類固醇治療)而導(dǎo)致免疫抑制、GvHD或HvGD(如移植后)的患者。本發(fā)明還涵蓋治療此類免疫抑制患者的方法。本發(fā)明還提供制備包括有效量的根據(jù)本發(fā)明的抗體以及可藥用載體的藥物組合物的方法，以及根據(jù)本發(fā)明的抗體在此類方法中的用途。本發(fā)明還提供有效量的根據(jù)本發(fā)明的抗體在制備藥物中的用途，優(yōu)選所述藥物還包括可藥用載體，用于治療免疫抑制患者。提供如下實(shí)施例、參考文獻(xiàn)和序列表以幫助理解本發(fā)明，本發(fā)明的真正范圍闡釋在所附權(quán)利要求書(shū)之中。應(yīng)當(dāng)理解可對(duì)所述方法進(jìn)行修飾而不偏離本發(fā)明的精神?？贵w保藏<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>SEQIDNO:16重鏈CDR3SEQIDNO:17重鏈CDR3SEQIDNO:18輕鏈CDR1SEQIDNO:19輕鏈CDR1SEQIDNO:20輕鏈CDR1SEQIDNO:21輕鏈CDR2SEQIDNO:22輕鏈CDR2SEQIDNO:23輕鏈CDR2SEQIDNO:24輕鏈CDR3SEQIDNO:25輕鏈CDR3SEQIDNO:26重鏈恒定區(qū)SEQIDNO:27重鏈恒定區(qū)SEQIDNO:28K輕鏈恒定區(qū)抗體命名<CCR5>Pz01.F3:抗體A<CCR5>Pz02.1Cll:抗體B<CCR5>Pz03.1C5:抗體C<CCR5>F3.1H12.2E5:抗體D<CCR5>Pz04.1F6:抗體ESEQIDNO:1，2SEQIDNO:3，4SEQIDNO:5，6SEQIDNO:7，8圖1:CCR5融合測(cè)定，2D7與抗體B的比較圖2:CCR5細(xì)胞ELISA，2D7與抗體B和C的比較實(shí)施例1人CCR5單克隆抗體的生產(chǎn)a)小鼠的免疫雌性Balb/c小鼠用107CCRS表達(dá)細(xì)胞(CHO或Ll."與佐劑CFA(弗氏完全佐劑)一起進(jìn)行初次皿內(nèi)免疫。接著于4-6周后再次用相同的107CCR5表達(dá)細(xì)胞與IFA(弗氏不完全佐劑)一起再進(jìn)行一次腹膜內(nèi)免疫。之后以4-6周的間隔對(duì)每只小鼠再次施用溶于PBS的107CCR5表達(dá)細(xì)胞(CHO或L1.2)。隨后在融合前第3天或第4天進(jìn)行末次免疫，再次用107CCR5表達(dá)細(xì)胞腹膜內(nèi)免疫，或者用2x106CCR5表達(dá)細(xì)胞靜脈內(nèi)免疫。b)融合及克隆根據(jù)a)免疫的小鼠的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞按照Galfr6，MethodsinEnzymology73，1981，3進(jìn)行融合。將大約1x108免疫小鼠脾細(xì)胞與大約相同數(shù)量的骨髓瘤細(xì)胞(P3X63-Ag8-653，ATCCCRL1580)混合，融合，隨后在HAZ培養(yǎng)基(IOOmmol/l次黃噤呤，1ng/ml重氮絲氨酸，溶于RPMI1640十10。/。FCS)中培養(yǎng)。在大約10天之后，測(cè)試原代培養(yǎng)物中特異性抗體的生產(chǎn)。在細(xì)胞測(cè)定中與CCR5表現(xiàn)出陽(yáng)性反應(yīng)且與未轉(zhuǎn)染親本細(xì)胞沒(méi)有交叉反應(yīng)的原代培養(yǎng)物，在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中通過(guò)有限稀釋法或焚光激活細(xì)胞分選進(jìn)行克隆。所保藏的細(xì)胞系就是以這種方式獲得的。c)抗體的重組生產(chǎn)用以表達(dá)嵌合抗體(包括連接于鼠源可變區(qū)的人恒定區(qū))的載體可如下構(gòu)建。在表達(dá)載體pSVgpt中構(gòu)建兩種嵌合重鏈表達(dá)載體，包括連接于人IgGl和人IgG4恒定區(qū)的抗CCR5小鼠VH。在表達(dá)載體pSVhyg中構(gòu)建嵌合輕鏈載體，包括連接于人Ck的抗CCR5小鼠VK。利用載體VH-PCR1和VK-PCR1作為模板，引入包括前導(dǎo)信號(hào)肽、前導(dǎo)內(nèi)含子和鼠源免疫球蛋白啟動(dòng)子的5個(gè)側(cè)翼序列，以及包括剪接位點(diǎn)和內(nèi)含子序列的3個(gè)側(cè)翼序列。將重鏈和輕鏈表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染至NSO細(xì)胞(ECACCNo85110503，非免疫球蛋白生產(chǎn)小鼠骨髓瘤)中。通過(guò)針對(duì)人IgG的ELISA篩選生產(chǎn)人抗體的轉(zhuǎn)染細(xì)胞克隆。實(shí)施例2突變(變體)抗CCR5IgGl和IgG4表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建編碼突變抗CCR5yl-和Y4-重鏈的表達(dá)質(zhì)?？衫肣uickChangeTM定點(diǎn)誘變?cè)噭┖?Stratagene)通過(guò)野生型表達(dá)質(zhì)粒的定點(diǎn)誘變建立，并描述在表1中。氨基酸編號(hào)依據(jù)EU編號(hào)[Edelman，G.M.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA63(1969)78-85;Kabat，E.A.等人，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第5版，NIHPublicationNo.91-3242(1991)。表l:<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>突變說(shuō)明S228P表示Kabat氨基酸位置228處的絲氨酸變?yōu)楦彼?。?shí)施例3細(xì)胞-細(xì)胞融合測(cè)定第1天，將表達(dá)gpl60的HeLa細(xì)胞(2x104細(xì)胞/50jil/孔)植入白色96孔孩i量滴定板的DMEM培養(yǎng)基中，補(bǔ)充有10%FCS和2ng/ml強(qiáng)力霉素。第2天，向清潔的96孔微量滴定板每孔添加100pl上清液樣品或抗體對(duì)照。然后添加IOOpl含8xl04CEM-NKr-Luc懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)基，并于37。C孵育30分鐘。從96孔板中吸出Hela細(xì)胞培養(yǎng)基，加入來(lái)自200|iil抗體/CEM-NKr-Luc混合物的100pl混合物，于37。C孵育過(guò)夜。第3天，添加100nl/孔Bright-GloTM熒光素酶測(cè)定底物(l，4-二硫蘇糖醇和連二亞疏酸鈉；PromegaCorp.USA),并在室溫孵育至少15分鐘后測(cè)量發(fā)光。材料Hela-R5-16細(xì)胞(經(jīng)強(qiáng)力霉素豫導(dǎo)表達(dá)HIVgpl60的細(xì)胞系)在含營(yíng)養(yǎng)物和10%FCS以及400pg/mlG418和200jig/ml潮霉素B的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。CEM,NKR國(guó)CCR5畫(huà)Luc(CatalogNumber:5198)為可購(gòu)自NIHAIDSResearch&ReferenceReagentProgramMcKessonBioServicesCorporationGermantown,MD20874，USA的T細(xì)胞系。細(xì)胞類型轉(zhuǎn)染(電穿孔)CEM.NKR-CCR5(Cat.#4376)，從而在HIV-2LTR的轉(zhuǎn)錄控制下表達(dá)熒光素酶基因，并在含10。/。胎牛血清、4mM谷氨酰胺、青霉素/鏈霉素和0.8mg/ml遺傳霉素硫酸鹽(G418)的RPMI1640中增殖。生長(zhǎng)特征圓形淋巴樣細(xì)胞，形態(tài)不是非常多變。細(xì)胞在懸浮液中作為單細(xì)胞生長(zhǎng)，能夠形成小凝塊。每周1:10分傳兩次。專有特征在HIV-2LTR轉(zhuǎn)錄激活后表達(dá)熒光素酶活性。適用于原代HIV分離林侵染、中和及藥物敏感性測(cè)定(Spenlehauer，C.等人，Virology280(2001)292-300;Trkola，A.等人，J.Virol.73(1999)8966—8974)。此細(xì)胞系通過(guò)NIHAIDSResearchandReferenceReagentProgram,NIAJD，NIH由JohnMoore博士和CatherineSpenlehauer博士獲得。Bright-GloTM熒光素酶測(cè)定緩沖液(PromegaCorp.USA，PartNoE2264B)Bright-GloTM熒光素酶測(cè)定底物(PromegaCorp.USA,partNoEE26B)結(jié)果抗體B的結(jié)果如圖l所示?？贵wC的ICso值為0.38pg/ml，抗體B為0.79pg/ml，而抗體A為7.0fig/ml。ICs。值也例如使用JRCSF林在PhenoSenseHIV測(cè)定(ViroLogic，Inc.USA)中進(jìn)行了測(cè)量?？贵wC的ICso值為0.16pg/ml，抗體B為0.17pg/ml，抗體A為0.82pg/ml，而抗體2D7為1.4pg/ml。實(shí)施例4使用活病毒的抗病毒測(cè)定PBMC由利用LymphoprepTM(NycomedPharmaAG,Oslo,Norway)通過(guò)密度梯度離心所分離的buffycoat制備。混合來(lái)自四個(gè)不同供體的細(xì)胞，用PHA剌激l天，隨后在含l。/。青霉素/鏈霉素、1%glutamax、1%丙酮酸鈉、1%非必需氨基酸和10%FBS的RPMI培養(yǎng)基中在5U/mlIL-2的存在下培養(yǎng)2天。向100pi抗體溶液中添加50pi的100,000PBMC(抗體在補(bǔ)充RPMI培養(yǎng)基中系列稀釋，范圍0.006-17.5照/ml，并用250TCID50的NLBal(NL4.3林(Adachi，A.等人,J.Virol,59(1986)284-291)，具有BaL的env(gpl20)侵染))或用50pi體積的JRCSF侵染(O，Brien，W.A.等人，Nature348(19卯)69-73)。將混合物在C02溫箱中于37。C孵育6天。收獲上清液，隨后用補(bǔ)充5U/mlIL-2的RPMI培養(yǎng)基進(jìn)行1:50稀釋。p24的測(cè)量通過(guò)HIV-1p24ELISA(Perkin-Elmer，USA)進(jìn)行。然后中和樣品，并轉(zhuǎn)移到包被有HIV-1p24高特異性小鼠單克隆抗體的微量滴定板孔中。固定化的單克隆抗體捕獲HIV-lp24。細(xì)胞培養(yǎng)物樣品無(wú)需破壞，直接加至單克隆抗體包被的微量滴定板孔中。使所捕獲的抗原與HIV-1p24生物素化的多克隆抗體形成復(fù)合物，之后加入鏈親合素-HRP(辣根過(guò)氧化物酶)綴合物。所得的復(fù)合物通過(guò)與鄰苯二胺-HCl(OPD)孵育進(jìn)行檢測(cè)，產(chǎn)生的黃顏色與所捕獲的HIV-lp24量成正比。微量滴定板各孔的吸收值利用微板讀數(shù)器測(cè)定，并根據(jù)HIV-1p24抗原標(biāo)準(zhǔn)的吸收值或者標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行校準(zhǔn)。結(jié)果示于表2。表2:<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>實(shí)施例5CCR5細(xì)胞ELISA將重組表達(dá)CCR5的20000CHO細(xì)胞植入各96孔板中，并于37°C孵育過(guò)夜。之后吸出培養(yǎng)基，并加入40jil新鮮培養(yǎng)基。加入10pl經(jīng)培養(yǎng)基稀釋的抗體，并于4。C孵育2小時(shí)。吸出培養(yǎng)基，加入100fil戊二醛(濃度=0.05%PBS溶液)，并于室溫孵育10分鐘。以200plPBS洗滌3x后，加入50pl檢測(cè)抗體1(在ELISA封閉液中進(jìn)行l(wèi)，OOO倍稀釋)，并于室溫孵育2小時(shí)。加入50nl3，3，，5，5，-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)，并在7分鐘后終止反應(yīng)。于450nm處(相對(duì)于620nm)測(cè)量光密度。第一抗體Pharmingen2D7(CD195;Cat.Nr.555990)或抗體B/C第二抗體檢測(cè)抗體(針對(duì)鼠源IgG和POD的抗體綴合物；Biorad，#170-6516，1:1000稀釋)培養(yǎng)基HAM，sF-12或GIBCO,含Glutamax、10%FCS、200ng/ml潮霉素(RocheDiagnosticsGmbH,DE)ELISA封閉液RocheDiagnosticsGmbH,DE#1112589，10。/。(v/v)水溶液，在PBS中1/10稀釋TMB:RocheDiagnosticsGmbH,DE#1432559，使用液結(jié)果示于圖2。實(shí)施例6CCR5單抗結(jié)合NK細(xì)胞上FcyRIIIa的潛力為測(cè)定本發(fā)明抗體結(jié)合自然殺傷(NK)細(xì)胞上FcyRIIIa(CD16)的能力，分離外周血單核細(xì)胞(PBMC)，并與20jig/ml抗體及對(duì)照抗體在存在或不存在20照/mlFcyRIIIa小鼠封閉抗體(anti-CD16，clone3G8，RDI，F(xiàn)landers,NJ)的情況下孵育，以檢驗(yàn)介由FcyRIIIa的結(jié)合。作為陰性對(duì)照，使用不結(jié)合FcyRIIIa的人IgG2和IgG4(所謂的結(jié)合位點(diǎn))。納入人IgGl和IgG3(所謂的結(jié)合位點(diǎn))作為FqRIIIa結(jié)合的陽(yáng)性對(duì)照。NK細(xì)胞上結(jié)合的抗體4吏用PE標(biāo)記的小鼠抗人CD56(NK細(xì)胞表面標(biāo)志)抗體(BDBiosciencesPharmingen,SanDiego,CA)組合FITC標(biāo)記的山羊F(ab)2抗人IgG(Fc)抗體(ProtosImmunoresearch,Burlingame，CA)通過(guò)FACS分析進(jìn)行檢測(cè)。最大結(jié)合(Bmax)在抗體濃度為20pg/ml時(shí)進(jìn)行測(cè)定。與人IgGl的100。/oBmax相比，對(duì)照抗體(人IgG4)顯示至多30%Bmax。因此，"無(wú)FcyRIIIa結(jié)合或無(wú)ADCC"表示抗體濃度為20照/ml時(shí)，與人IgGl相比Bmax值至多30%。參考文獻(xiàn)清單Adachi，A.等人，丄Virol.59(1986)284-291Angal，S.等人，Mol.Immunol.30(1993)105-108Aplin，J.D.和Wriston,J.C.Jr"CRCCrit.Rev，Biochem.4(1981)259-306Ausubel，F(xiàn).等人編輯CurrentProtocolsinMolecularBiology,GreenePublishingandWileyInterscience，NewYork(1987)Barnes,L.M.等人，Biotech.Bioeng.73(2001)261-270Barnes,L.M.等人，Cytotechnology32(2000)109-123Berger，E.A.，AIDS11(Suppl.A)(1997)S3-S16Bieniasz，P.D.和Cullen，B.R.，F(xiàn)rontiersinBioscience3(1998)44-58Brunhouse,R.和Cebra，J丄，Mol.Immunol.16(1979)907-917Burton,D.R.等人，Nature288(1980)338-344Carter,P.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89(1992)4285-4289Cocchi，F(xiàn).等人，Science270(1995)1811-1815Dean,M.等人，Science273(1996)1856-1862Durocher，Y.等人，Nucl.Acids.Res.30(2002)E9Edelman，G.M.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA63(1969)78-85Edge,A.S.等人，Anal.Biochem.118(1981)131-137EP1144006EP1161456EP1207202EP1263791EP1322332EP0307434Geisse，S.等人，ProteinExpr.Purif.8(1996)271-282Hezareh，M.等人，J.Virol.75(2001)12161-12168Idusogie,E.E.等人，J.Immunol.164(2000)4178-4184Johnson,G.和Wu,T.T.，NucleicAcidsRes.28(2000)214-218Kabat等人，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第5版，PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda，MD，NIHPublicationNo.91-3242(1991)Kaufman,R.J.，Mol.Biotechnol.16(2000)151-161Kazmierski,W.M.等人，Curr.DrugTargetsInfect.Disord.2(2002)265-278Kilby，J.M.和Eron，J.J.，N.Engl.J.Med.348(2003)2228-2238Lazzarin，A.等人，N.EnglJ.Med.348(2003)2186-2195Lee，B.等人，J.Biol.Chem.274(1999)9617-9626Lehner，T.，TrendsImmunol.23(2002)347-351Littman,D.R"Cell93(1998)677-680Lukas，T.J.等人，J.Immunol.127(1981)2555-2560Lund,J.等人FASEBJ.9(1995)115-119Makrides，S.C.，ProteinExpr.Purif.17(1999)183-202Morgan,A.等人，Immunology86(1995)319-324Morrison,S丄.等人，Proc.Natl.AcadSci.USA81(1984)6851-6855Mueller,A.和Strange，P.G.，Int.J.Biochem.CellBiol.36(2004)35-38Neuberger，M.S.等人,Nature314(1985)268-270Norderhaug，L.等人,J.Immunol.Methods204(1997)77-87O'Brien,W.A.等人，Nature348(1990)69-73Olson,W.C.等人，J.Virol.73(1999)4145-4155Oppermann，M.，Cell.Sig.16(2004)1201-1210Orlandi，R.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86(1989)3833-3837Pierson,T.C.和Doms，R.W.，Immuno.Lett.85(2003)113-118Queen,C.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86(1989)10029-10033Riechmann,L.等人，Nature332(1988)323-327Rossi，D.和Zlotnik,A.，Annu.Rev.Immunol.18(2000)217-243Samson,M.等人，J.Biol.Chem272(1997)24934-24941Samson，M.等人，Nature382(1996)722-725Schlae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