專利名稱：：TGF-β結(jié)合組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及與對(duì)TGF-p相關(guān)的細(xì)胞增殖性疾病、障礙和病癥的治療。具體而言，本發(fā)明提供了能中和成熟的人TGF-pi、TGF-P2和TGF-(J3的抗體和其抗原結(jié)合片段。
背景技術(shù)：
：TGF-p蛋白質(zhì)家族由三種不同的同種型(TGF-pi、TGF-卩2和TGF-卩3)構(gòu)成，其途徑對(duì)能影響到疾病狀態(tài)(state)的多種基因應(yīng)答進(jìn)行活化和調(diào)控，所述疾病狀態(tài)例如，細(xì)胞增殖性、炎性和心血管病癥。TGF-P同種型在癌癥中的表達(dá)復(fù)雜多變，TGF-p同種型的不同組合在特定癌癥中具有不同作用。例如，TGF-pi和TGF-p3在卵巢癌及其t艮中的作用要高過TGF-卩2，而在高級(jí)軟骨肉瘤中TGF-卩1和TGF-卩2的表達(dá)要大于TGF-卩3。在人乳腺癌中，TGF-pi和TGF-P3高度表達(dá)，其中TGF-|53的表達(dá)與總體存活率相關(guān)——具有結(jié)節(jié)轉(zhuǎn)移和陽性TGF-P3表達(dá)的患者預(yù)后較差。但是，在結(jié)腸癌中，TGF-pi和TGF-p2比TGF-p3的表達(dá)更高，它們以比無癌癥個(gè)體更高的循環(huán)水平存在。在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中，TGF-P2對(duì)于細(xì)胞遷移來說是關(guān)鍵的。由此，人們需要對(duì)細(xì)胞增殖性病癥(例如癌癥)中的多種TGF-p同種型表達(dá)加以調(diào)節(jié)。US5，571，714公開了抗TGF抗體治療惡性肺瘤和轉(zhuǎn)移性癌癥的用途，具體地，公開了被命名為lD11.16(ATCCNo.HB9849)的鼠抗體，其被報(bào)道為能與TGF-pi和TGF-(52兩者都結(jié)合。該文獻(xiàn)聲稱，抗體1D11.16能以僅3.4xl08L/mo1的Ka(Kd=1/Ka)結(jié)合TGF-p2?？赏ㄟ^使用能以提高的結(jié)合動(dòng)力學(xué)和親和性中和成熟的人TGF-pi、TGF-P2和TGF-P3的抗體來改進(jìn)對(duì)細(xì)胞增殖性障礙(例如惡性腫瘤和癌癥)的治療。對(duì)于藥物產(chǎn)品而言，相當(dāng)?shù)奈锢砗突瘜W(xué)穩(wěn)定性、足夠的藥代動(dòng)力學(xué)和良好的溶解性也是人們想要的。因此，人們?nèi)杂袑?duì)于下述抗體的尚未滿足的需求，所述抗體具有適合對(duì)細(xì)胞增殖性障礙進(jìn)行藥物治療的特征。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供了單克隆抗體組合物，其能以對(duì)成熟的人TGF-pi而言小于4pM的Kd,對(duì)成熟的人TGF-p2而言小于8pM的Kd以;Sjt成熟的人TGF-P3而言小于4pM的Kd，中和成熟的人TGF-卩1、TGF-卩2和TGF-卩3。本發(fā)明還提供了具有下述輕鏈可變區(qū)(LCVR)和重鏈可變區(qū)(HCVR)序列的組合的抗體SEQIDNO:27和51、27和59、27和60、27和61、27和62、27和63、27和64、28和52、29和51、30和53、31和54、32和55、33和56、34和51、34和57、35和58、36和51、36和69、36和75、37和51、38和51、39和51、40和51、41和64、41和67、42和66、43和68、44和66、45和51、45和69、46和70、46和71、47和71、48和72、49和73、50和65，或50和74。本發(fā)明還包括此類抗體的抗原結(jié)合片段以及具有人或人源化構(gòu)架和恒定區(qū)域的抗體和片段。本發(fā)明的抗體和片段可用于治療細(xì)胞增殖性疾病、障礙和病癥。在一種實(shí)施方案中，在體外HT-2細(xì)胞中和測(cè)定中，本發(fā)明的抗體能中和成熟的人TGF-pi、成熟的人TGF-P2和成熟的人TGF-P3，并且，對(duì)于成熟的人TGF-pi而言具有小于或等于約100pM的IC5G，對(duì)于成熟的人TGF-P2而言具有小于或等于約400pM的IC5。，對(duì)于成熟的人TGF-卩3而言具有小于或等于約200pM的IC50。在一種實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含重鏈可變區(qū)(HCVR)和輕鏈可變區(qū)(LCVR)，其中，所述HCVR包含CDRH1處，具有SEQIDNO:96或SEQIDNO:100所示的序列的肽，CDRH2處，具有SEQIDNO:97、SEQIDNO:99、SEQIDNO:101或SEQIDNO:102所示的序列的肽，以及CDRH3處，具有SEQIDNO:98所示的序列的肽；并且其中，所述LCVR包含CDRLl處，具有SEQIDNO:88、SEQIDNO:91、SEQIDNO:92或SEQIDNO:93所示的序列的肽，CDRL2處，具有SEQIDNO:89或SEQIDNO:94所示的序列的肽，以及CDRL3處，具有SEQIDNO:90或SEQIDNO:95所示的序列的肽。在一種實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體還包含人構(gòu)架區(qū)。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含具有選自SEQIDNO:64、68、69、70和74的序列的HCVR和具有選自SEQIDNO:41、43、45、46和50的序列的LCVR。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含具有SEQIDNO:69所示的序列的HCVR和具有SEQIDNO:45所示的序列的LCVR。在一種實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含具有選自SEQIDNO:77、79、81、83和85的序列的重鏈和具有選自SEQIDNO:76、78、80、82和84的序列的輕鏈。在一種實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含具有SEQIDNO:81所示的序列的重鏈和具有SEQIDNO:80所示的序列的輕鏈。本發(fā)明提供了在哺乳動(dòng)物(優(yōu)選地，靈長(zhǎng)類動(dòng)物，更優(yōu)選地，人)中治療細(xì)胞增殖性障礙的方法，所述方法包括向需要此類治療的哺乳動(dòng)物施用有效量的本發(fā)明抗體或其片段。本發(fā)明提供了在哺乳動(dòng)物(優(yōu)選地，靈長(zhǎng)類動(dòng)物，更優(yōu)選地，人)中治療與TGF-p介導(dǎo)的纖維發(fā)生和/或血管發(fā)生相關(guān)的疾病或病癥的方法，所述疾病或病癥例如，骨髓增生異常綜合征(MDS)/骨髓增生性疾病(MPD)、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、肝細(xì)胞癌、胰腺癌、多發(fā)性骨髓瘤、結(jié)直腸癌、其它血液惡性腫瘤(多毛細(xì)胞白血病、CML、AML等)，所述方法包括向需要此類治療的哺乳動(dòng)物施用有效量的本發(fā)明抗體或其片段。所述方法還包括向哺乳動(dòng)物施用有效量的并非抗TGF-P抗體的治療劑，例如，化療劑、抗血管發(fā)生劑或細(xì)胞毒性化療物。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了治療患有過量表達(dá)HER2的轉(zhuǎn)移性乳腺癌的患者的方法，所述方法包括向所述患者施用有效量的本發(fā)明的抗體和能阻止經(jīng)由HER-2受體的信號(hào)傳導(dǎo)的抗體，即，曲妥珠單抗(trastuzumab)。本發(fā)明還提供了藥物組合物，其包含本發(fā)明的抗體與可藥用載體、稀釋劑或賦形劑的組合。本發(fā)明還提供了本發(fā)明的抗體用于制備下述藥物的用途，所述藥物用于在哺乳動(dòng)物中治療細(xì)胞增殖性障礙。此外，本發(fā)明提供了適于治療細(xì)胞增殖性障礙的藥物組合物，其包含本發(fā)明的抗體與其一種或多種可藥用賦形劑、栽體或稀釋劑的組合。本發(fā)明還提供了本發(fā)明的抗體用于制備下述藥物的用途，所述藥物用于治療能通過中和TGF-P活性來改善或預(yù)防的疾病或病癥。本發(fā)明還提供了本發(fā)明的抗體用于制備下述藥物的用途，所述藥物用于在哺乳動(dòng)物(優(yōu)選地，靈長(zhǎng)類動(dòng)物，更優(yōu)選地，人)中治療與TGF-p介導(dǎo)的纖維發(fā)生和/或血管發(fā)生相關(guān)的疾病或病癥，所述疾病或病癥包括MDS/MPD、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、肝細(xì)胞癌、胰腺癌、多發(fā)性骨髓瘤、結(jié)直腸癌、其它血液惡性腫瘤(多毛細(xì)胞白血病、CML、AML等)，所述用途包括向需要此類治療的哺乳動(dòng)物施用有效量的本發(fā)明抗體或其片段。這還包括向哺乳動(dòng)物施用有效量的并非抗TGF-P抗體的治療劑，例如，化療劑、抗血管發(fā)生劑或細(xì)胞毒性劑或細(xì)胞因子。此外，本發(fā)明提供了一種藥物組合物，其適合用于在哺乳動(dòng)物中治療下述病癥，其中，對(duì)TGF-卩活性的中和或降4氐將對(duì)所述病癥有益處，所述病癥包括MDS/MPD、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、肝細(xì)胞癌、胰腺癌、多發(fā)性骨髓瘤、結(jié)直腸癌、其它血液惡性腫瘤(多毛細(xì)胞白血病、CML、AML等)，所述組合物包含本發(fā)明的抗體與一種或多種可藥用賦形劑、載體或稀釋劑的組合。本發(fā)明還提供了本發(fā)明的抗體用于制備下述藥物的用途，所述藥物用于治療能通過中和或降低TGF-P活性來改善或預(yù)防的疾病或病癥。附圖簡(jiǎn)述圖1A和1B分別顯示了本發(fā)明的數(shù)種優(yōu)選抗體的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的M酸序列。CDR結(jié)構(gòu)域以粗體表示。圖2A和2B顯示了對(duì)本發(fā)明的數(shù)種優(yōu)選抗體的CDR結(jié)構(gòu)域M^列的比對(duì)。變化以粗體和下劃線表示。圖3列出了本發(fā)明的單克隆抗體(即，mAb12.7)的輕鏈和重鏈的M紗列。發(fā)明詳述術(shù)語"單克隆抗體"指具有均質(zhì)抗體群(homogeneousantibodypopulation)的組合物，其包含四條肽鏈，兩條重鏈(H)和兩條輕鏈(L)，它們通過二硫鍵相互連接。每條鏈的氨基末端部分包括大約100-110個(gè)或更多個(gè)氨基酸的可變區(qū)。每條鏈的這一可變區(qū)包括三個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)域(CDRs)，它們能識(shí)別并結(jié)合特定抗原。"單克隆抗體"可以是完整抗體(包含完整的輕鏈和完整的重鏈)、充分完整的抗體或包含抗原結(jié)合部分的抗體部分或抗體片段，例如，抗體的Fab片段或F(ab，)2片段。此外，"單克隆抗體"可以是由抗體的可變重鏈區(qū)域(VH)和可變輕鏈區(qū)域(VL)構(gòu)成的單鏈可變片段，所述區(qū)域通過可彎曲(flexible)肽接頭連到一起。"均質(zhì)抗體群"指均質(zhì)或充分均質(zhì)的抗體群(即，在ELISA測(cè)定中，群中抗體的至少大約85%、87%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%,更優(yōu)選地，至少大約97%或98%，或者最優(yōu)選地，至少99%能針對(duì)同樣的抗原或表位竟?fàn)??？贵w可以被糖基化或者可以不被糖基化，這仍落在本發(fā)明的界限內(nèi)。單克隆抗體如果具有相同的^J^酸序列，雖然可能在翻譯后修飾(例如，糖基化模式)上有所不同，它們?nèi)钥墒蔷|(zhì)的。術(shù)語"有效量"被用來表示獲得想要的藥理學(xué)效果所必需的式I化合物的劑量。術(shù)語"表位，，指分子中能被抗體在抗體的抗原結(jié)合區(qū)域上識(shí)別并結(jié)合的部分。表位通常由分子的具化學(xué)活性表面基團(tuán)構(gòu)成，例如氨基酸或糖側(cè)鏈，它們具有特定的三維結(jié)構(gòu)特征以及特定的電荷特征。術(shù)語"Kd"指特定抗體-抗原相互作用的解離常數(shù)。其是通過式koff/k^=Kd計(jì)算出來的。術(shù)語"kon，，指正向或復(fù)合物形成反應(yīng)的締合或進(jìn)行速率常數(shù)(onrate)或反應(yīng)比速，其測(cè)量單位為M"秒"。術(shù)語"koff"指針對(duì)抗體從抗體/抗原復(fù)合物解離的解離或取消速率(offrate)常數(shù)或者比反應(yīng)常數(shù)，其測(cè)量單位為1/秒。通常，本發(fā)明的單克隆抗體的親和性與較低的koff的相關(guān)性高于與較高的kon的相關(guān)性，但是，在不希望被理論束縳的情況下，本發(fā)明包括改進(jìn)的kon和koff的兩種實(shí)施方案。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的單克隆抗體是高效力(potency)抗體或其片段，其通常展示出低k^值。本文中使用的術(shù)語"中和"在關(guān)于本發(fā)明單克隆抗體活性的方面表示充分對(duì)抗、阻止、防止、制止、減緩、破壞、消除、停止、降低或逆轉(zhuǎn)被抑制物的，例如，^A或嚴(yán)重性的能力，所述被抑制物包括但不限于生物學(xué)活性或性質(zhì)、疾病或病癥。抑制或中和優(yōu)選至少大約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、卯％、95%或更高。在關(guān)于本發(fā)明抗體結(jié)合和中和能力的方面，本文提到的TGF-p是TGF-pi、TGF-卩2和TGF-p3(SEQIDNO:1、2和3)的成熟、人、生物活性形式。還見，例如，NCBI登錄號(hào)P01137、NP—003229和NP—003230，其分別描述了TGF-pi、TGF-(52和TGF-P3(包括它們的前體結(jié)構(gòu)域和成熟部分)的DNA和M酸序列。成熟的、二石危鍵連接的同型二聚體人TGF-卩1、TGF-p2或TGF-P3含有兩條112個(gè)氨基酸殘基的多肽,具有大約為25kDa的預(yù)計(jì)分子質(zhì)量。本發(fā)明的抗體能結(jié)合并中和此類成熟的TGF-P同種型，但是在相似糾下卻不會(huì)顯示出與潛在(latent)TGF-pi、TGF-卩2和TGF-卩3同種型的顯著結(jié)合。親和性和結(jié)合動(dòng)力學(xué)的提高解決了抗體問題，這例如通過協(xié)助增加藥代動(dòng)力學(xué)和安全情形；通過降低療法的劑量、毒性和成本；以及通過提高生物學(xué)療效來實(shí)現(xiàn)?？墒褂帽绢I(lǐng)域的方法來獲得抗體的解離常數(shù)(Ka)，例如，Kinexa⑧(見，例如，Darling,等人，2004ASSAYandDrugDevelopmentTechnologies2:647-57)或BIAcoreAB(烏普薩拉(Upsala)，Sweden)或?qū)arlsson等人,1991J.Immunol.Methods145,299-340加以改動(dòng)。術(shù)語"kon，，在本文中指正向或抗體:抗原復(fù)合物形成反應(yīng)的締合或進(jìn)行速率常數(shù)或反應(yīng)比速，M"秒"。術(shù)語"koff"在本文中指針對(duì)抗體從抗體:抗原復(fù)合物解離的解離或"取消速率"常數(shù)或者反應(yīng)比速(秒—1)。術(shù)語"Kd"在本文中指特定抗體:抗原復(fù)合物的解離常數(shù)——其被計(jì)算為Kd=koff/kon。Ka是Kd的倒數(shù)。本發(fā)明的抗體針對(duì)成熟人TGF-pi的Kd在大約0.0001pM至大約5.0pM的范圍內(nèi)。更優(yōu)選地，其在大約0.001pM至大約3.0pM的范圍內(nèi)。最優(yōu)選地，其在大約0.01pM至大約0.5pM的范圍內(nèi)。本發(fā)明的抗體針對(duì)成熟人TGF-P2的Kd在大約0.01pM至大約5.0pM的范圍內(nèi)。更優(yōu)選地，其在大約0.05pM至大約2.0pM的范圍內(nèi)，最優(yōu)選地，其在大約O.lpM至大約1.5pM的范圍內(nèi)。本發(fā)明的抗體針對(duì)成熟人TGF-P3的Ka在大約0.005pM至大約3pM的范圍內(nèi)。更優(yōu)選地，其在大約0.05pM至大約2.8pM的范圍內(nèi)。最優(yōu)選地，其在大約0.2]\1至大約2]\1的范圍內(nèi)。優(yōu)選地，本發(fā)明的抗體的特征在于針對(duì)成熟的人TGF-pl而言，4.0xlO_12M或更小的Kd，針對(duì)成熟的人TGF-P2而言，8.0xl(T12M或更小的Kd，以及針對(duì)成熟的人TGF-P3而言，4.0xl(T12M或更小的Kd。本發(fā)明的抗體針對(duì)TGF-pi的Kd是1D11.16對(duì)TGF-pi的Ka的至少2倍，更優(yōu)選地，至少25倍，最優(yōu)選地，至少50倍。就清楚的目的而言，更高的親和性將意味著更小的Kd值。本發(fā)明的抗體針對(duì)TGF-(52的Kd是1D11.16對(duì)TGF-P2的Kd的至少1.5倍，更優(yōu)選地，至少10倍，最優(yōu)選地，至少20倍。本發(fā)明的抗體針對(duì)TGF-I53的Ka是1D11.16對(duì)TGF-(J3的Kd的至少4倍，更優(yōu)選地，至少6倍，最優(yōu)選地，至少10倍。本發(fā)明的Fab針對(duì)成熟人TGF-pi的Kd在大約0.009pM至大約75.0pM的范圍內(nèi)，更優(yōu)選地，在大約0.018pM至大約50pM的范圍內(nèi)，以及最優(yōu)選地，在大約0.02pM至大約25pM的范圍內(nèi)。本發(fā)明的Fab針對(duì)成熟人TGF-卩2的Kd在大約0.0045pM至大約60pM的范圍內(nèi)，更優(yōu)選地，在大約0.002pM至大約45pM的范圍內(nèi)，以及最優(yōu)選地，在大約0.02pM至大約35pM的范圍內(nèi)。本發(fā)明的Fab針對(duì)TGF-pi的Ka是lD11.16針對(duì)TGF-pl的Kd的至少30倍，更優(yōu)選地，至少300倍，最優(yōu)選地，至少1500倍。本發(fā)明的Fab針對(duì)TGF-P2的Kd是1D11.16針對(duì)TGF-卩2的Kd的至少10倍，更優(yōu)選地，至少100倍，最優(yōu)選地，至少500倍。本發(fā)明的抗體展示出針對(duì)成熟人TGF-pi的koff優(yōu)選在大約110至大約1的范圍內(nèi)(對(duì)koff的所有值都xl(T6s")，更優(yōu)選地，在大約50至大約6的范圍內(nèi)，甚至更優(yōu)選地,在大約15至大約4的范圍內(nèi)；針對(duì)成熟人TGF-P2的koff優(yōu)選在大約240至大約1的范圍內(nèi)，更優(yōu)選地，在大約50至大約2的范圍內(nèi)，甚至更優(yōu)選地，在大約20至大約4的范圍內(nèi)；以及針對(duì)成熟人TGF-p3的koff優(yōu)選在大約卯至大約1的范圍內(nèi)，更優(yōu)選地，在大約50至大約4的范圍內(nèi)，甚至更優(yōu)選地，在大約35至大約6的范圍內(nèi)。相對(duì)于1D11.16對(duì)TGF-卩1、TGF-卩2和TGF-P3而言，本發(fā)明的抗體展示出大約2至大約50倍范圍內(nèi)的koff提高，更優(yōu)選地，大約2.5至大約25倍的范圍內(nèi)，甚至更優(yōu)選地，大約3至大約15倍的范圍內(nèi)。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體具有Kon，其針對(duì)成熟的人TGF-pl而言大于5，針對(duì)成熟的人TGF-p2而言大于2.8，以及針對(duì)成熟的人TGF-卩3而言大于1.56(對(duì)kon的所有值都x107M—1s-1)。針對(duì)成熟人TGF-|51的kon優(yōu)選在大約1.5至大約60的范圍內(nèi)，更優(yōu)選在大約2至大約45的范圍內(nèi)，甚至更優(yōu)選在大約3至大約30的范圍內(nèi)；針對(duì)成熟人TGF-P2的kon優(yōu)選在大約1至大約40的范圍內(nèi)，更優(yōu)選在大約1至大約25的范圍內(nèi)，甚至更優(yōu)選在大約1至大約15的范圍內(nèi)；針對(duì)成熟人TGF-J53的k^優(yōu)選在大約1.2至大約20的范圍內(nèi)，更優(yōu)選在大約1.2至大約IO的范圍內(nèi)，甚至更優(yōu)選在大約1.2至大約5的范圍內(nèi)。相對(duì)于lD11.16對(duì)TGF-pi、TGF-卩2和TGF-P3而言，本發(fā)明的抗體展示出優(yōu)選在大約1.5至大約40倍范圍內(nèi)的平均kon提高，更優(yōu)選地，大約2至大約15倍的范圍內(nèi)，甚至更優(yōu)選地，大約2至大約IO倍的范圍內(nèi)。在一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體與TGF-pi的結(jié)合優(yōu)于TGF-j52和TGF-(J3。如果抗體與抗原的結(jié)合導(dǎo)致對(duì)抗原生物學(xué)功能完全或部分的抑制或降低，那么我們說抗體"中和，，了其抗原。通過測(cè)量對(duì)TGF-p活性的一種或多種體外或體內(nèi)指示物(例如，受體結(jié)合，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用；趨化作用、凋亡、細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)磷酸化或者信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo))的完全或部分抑制或降低，來評(píng)價(jià)對(duì)TGF-p同種型生物學(xué)活性的中和。最優(yōu)選地，按照本文所述，通過HT-2細(xì)胞增殖測(cè)定，或者通過測(cè)量對(duì)Smad2磷酸化的抑制來評(píng)價(jià)中和TGF-p活性的能力。在體外HT-2細(xì)胞中和測(cè)定中，本發(fā)明的抗體中和成熟的人TGF-pi、成熟的人TGF-p2和成熟的人TGF-p3，并且具有對(duì)于成熟的人TGF-|51而言，小于或等于大約100pM、75pM、50pM、25pM、17.5pM、10pM、4pM或3pM的ICSG，對(duì)于成熟的人TGF-P2而言，小于或等于大約400pM、345pM、200pM、100pM、77,5pM、50pM、40pM或23pM的ICso，對(duì)于成熟的人TGF-P3而言，小于或等于大約200pM、115pM、105pM、75pM、50pM、45pM或35pM的IC50。提高的中和活性增加了藥代動(dòng)力學(xué)和安全情形；降低了療法的劑量、毒性和成本；以及提高了生物學(xué)療效。在一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，本文所述的HT-2細(xì)胞增殖/中和測(cè)定中，本發(fā)明抗體的ICso針對(duì)TGF-pi小于大約20pM，4十對(duì)TGF-jJ2小于大約325pM，4十對(duì)TGF-P3小于大約125pM。針對(duì)TGF-pi而言，本發(fā)明的抗體優(yōu)選具有大約0.1至大約50pM范圍內(nèi)的ICso，更優(yōu)選地，大約0.1至大約30pM的范圍內(nèi)，最優(yōu)選地，大約O,l至大約20pM的范圍內(nèi)。針對(duì)TGF-P2而言，本發(fā)明的抗體優(yōu)選具有大約l至大約400pM范圍內(nèi)的ICso，更優(yōu)選地，大約10至大約350pM的范圍內(nèi)，最優(yōu)選地，大約15至大約325pM的范圍內(nèi)。針對(duì)TGF-j53而言，本發(fā)明的抗體優(yōu)選具有大約0.1至大約200pM范圍內(nèi)的ICSo,更優(yōu)選地，大約l至大約150pM的范圍內(nèi)，最優(yōu)選地，大約IO至大約125pM的范圍內(nèi)。在另一實(shí)施方案中，對(duì)于TGF-pi而言，在HT-2細(xì)胞增殖測(cè)定中，相對(duì)于1D11.16而言，本發(fā)明的抗體展示出的平均ICso提高在大約100至大約600倍范圍內(nèi)，更優(yōu)選地，大約200至大約500倍范圍內(nèi)，甚至更優(yōu)選地，大約300至大約400倍范圍內(nèi)；對(duì)于TGF-P2而言，大約10至大約400倍的范圍內(nèi)，更優(yōu)選地，大約25至大約300倍的范圍內(nèi)，甚至更優(yōu)選地，大約50至大約200倍的范圍內(nèi)；對(duì)于TGF-P3而言，大約2至大約200倍的范圍內(nèi)，更優(yōu)選地，大約4至大約50倍的范圍內(nèi)，甚至更優(yōu)選地，大約6至大約25倍的范圍內(nèi)。中和TGF-j5活性需要的抗體的濃度取決于多種參數(shù)，例如，細(xì)胞因子濃度、細(xì)胞類型、生長(zhǎng)條件以及研究的活性的類型。通過在本文所述的U87MG人肺瘤異種移植才莫型測(cè)定中，測(cè)量對(duì)Smad2蛋白質(zhì)磷酸化抑制的程度，來評(píng)價(jià)本發(fā)明抗體的中和特征。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，在此類測(cè)定中，本發(fā)明的抗體具有大約100至大約200mg/kg范圍內(nèi)的TEDs。(治療有效劑量)，更優(yōu)選地，大約50至大約80mg/kg的范圍內(nèi)，甚至更優(yōu)選地，大約5至大約25mg/kg的范圍內(nèi)。本發(fā)明的某些抗體和片段具有特定的CDR:VHCDR1X^2WMN[SEQIDNO:IO，其中Xn是T或S;以及X2是E或Y；VHCDR2QIFPX，X2GSTNYX3EMX4EG[SEQIDNO:ll，其中Xi是A或F;X:是S、T或L;X3是N、G、S、D或A;X4是F或Y];VHCDR3GX，YALDAMDY[SEQIDNO:12，其中X!是D、I、M、Y、L、V、Q或F；VLCDRlRASESVDXtXaGNSFMHSEQIDNO:13，其中&是S、Y、F或L;X2是Y或W；VLCDR2&ASNLES[SEQIDNO:14，其中&是L或Y];以及VLCDR3XiQXzXsEDPLT[SEQIDNO:15，其中Xi是Q、T或C;X2是N或H;X3是N、I、M、D、T或A。本發(fā)明還包括下述抗體，它們被制備為具有來自上式的CDR，這是在對(duì)人或人源化抗體構(gòu)架序列中的CDR進(jìn)行改造(以合適的方向)之后實(shí)現(xiàn)的，以生產(chǎn)中和成熟的人TGF-(51、TGF-P2和TGF-P3的本發(fā)明組合物。本領(lǐng)域已知的任何方法可用于將特定CDR包括進(jìn)構(gòu)架序列。如描述過的，可變?nèi)嘶蛉嗽椿瘶?gòu)架序列可來自任何種系(germline)或重排人可變結(jié)構(gòu)域，或者，例如，基于已知人可變結(jié)構(gòu)域的共有序列的合成的可變結(jié)構(gòu)域。優(yōu)選的可變結(jié)構(gòu)域構(gòu)架序列是不顯著影響抗TGF-pi、TGF-P2和TGF-j53抗體實(shí)施方案的生物學(xué)性質(zhì)(即，以高親和性結(jié)合并中和成熟的人TGF-pi、TGF-P2和TGF-p3的能力)的那些。優(yōu)選地，此類構(gòu)架施用給人時(shí)，也不另外引發(fā)顯著的免疫原性反應(yīng)。構(gòu)架序列可以是天然存在的人若干種人抗體的共有序列。1對(duì)于本發(fā)明抗體實(shí)施方案的重鏈可變區(qū)而言，構(gòu)架序列的非限制性實(shí)例包括VH片斷DP-5(Tomlinson，等人1992J.Mol.Biol.227:776-98)和J片斷JH4、JH1或JH5(Ravetch，等人1981Cell27:583-91)。Vk片斷Ll(Cox，等人1994Eur.J.Immunol.24:827-36)和J片斷Jk4(Hieter，等人1982J.Biol.Chem.10:1516-22)是針對(duì)輕鏈可變區(qū)的構(gòu)架序列的非限制性實(shí)例。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，HCVRFRl構(gòu)架包含SEQIDNO:16];HCVRFR2構(gòu)架包含[SEQIDNO:17；HCVRFR3構(gòu)架包含[SEQIDNO:18];HCVRFR4構(gòu)架包含[SEQIDNO:19]。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，LCVRFR1構(gòu)架包含[SEQIDNO:20；LCVRFR2構(gòu)架包含[SEQIDNO:21；LCVRFR3構(gòu)架包含[SEQIDNO:22；LCVRFR4構(gòu)架包含[SEQIDNO:23]。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，HCVR構(gòu)架包含[SEQIDNO:86，其中，Xi是S、Y、F或L;X2是Y或W;Xs是A或F;X4是S、T或L;Xs是N、G、S、D或A;X6是F或Y;以及X是D、I、M、Y、L、V、Q或F。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，LCVR構(gòu)架包含[SEQIDNO:87，其中X!是T或S;X2是E或Y;X3是L或Y;X-是Q、T或C;Xs是N或H;以及X6是N、I、M、D、T或A。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，構(gòu)架和恒定區(qū)較"序列可以含有改變、缺失、添加、取代或其任何組合。其中1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個(gè)M酸被以任何組合取代、缺失或添加的構(gòu)架和恒定區(qū)是優(yōu)選的。在另一實(shí)施方案中，構(gòu)架與本文^^開的構(gòu)架具有85-99%的序列同一性。在一種實(shí)施方案中，用于本發(fā)明的抗體結(jié)合組合物的優(yōu)選重鏈恒定區(qū)是IgG恒定區(qū)。在一種更優(yōu)選的實(shí)施方案中，IgG恒定區(qū)是IgGl恒定區(qū)或IgG4恒定區(qū)(甚至更優(yōu)選地，是[SEQIDNO:24或[SEQIDNO:25]的恒定區(qū))。優(yōu)選的本發(fā)明的輕鏈恒定區(qū)序列是[SEQIDNO:26。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，抗體結(jié)合組合物含有IgGl重鏈恒定區(qū)或IgG4重鏈恒定區(qū)和K輕鏈恒定區(qū)。本發(fā)明還包括編碼本發(fā)明抗體的多核苷酸序列。當(dāng)使用本發(fā)明的CDR來對(duì)抗體進(jìn)行工程改造時(shí)，可通過與從抗體庫(repertoires)獲得的序列模板進(jìn)行比對(duì)，來鑒定抗體構(gòu)架中可能影響到抗原結(jié)合餘沐和受體序列的殘基?？梢澡b定出"不變殘基，，(Kabat等人，1991)和"關(guān)鍵殘基，，(Chothia等人，1989)，可以通過針對(duì)序列模板對(duì)給出的序列加以篩選，來分別確定供體抗原結(jié)合環(huán)Ll-L3、Hl和H2典范類比對(duì)(canonical-classassignments)(見，例如Martin&Thornton,1996Mol.Biol.263:800~15)。將VH/VL界面處的殘基(Chothia等人，1985)和已知在核心位點(diǎn)結(jié)構(gòu)上保守的殘基(Chothia等人，1998)與相應(yīng)的供體和受體殘勤目比較?；趤碜砸阎Y(jié)構(gòu)的其它抗體的信息，分析這些位點(diǎn)上不匹配的供體和受體構(gòu)架殘基(Berman，等人，2000Nucl.AcidsRes.28(1):235-42)。選出作為對(duì)非人V區(qū)域進(jìn)行人源化的模板的人構(gòu)架，可確定隨后關(guān)于哪些殘基,ilA源化的決定?？梢詮膩碜钥色@得的數(shù)據(jù)庫的種系、非種系或共有序列，從具有已知晶體結(jié)構(gòu)的抗體選擇同源模板(見，例如，Routledge等人(Routledge，等人，1993在ProteinEngineeringofAntibodyMoleculesforProphylacticandTherapeuticApplicationsinMan中(Clark,M"編著)第14-44頁，AcademicTitles,Nottingham,UK;andB.Lo，2004AntibodyEngineering:MethodsandProtocols,HumanaPress))。對(duì)抗體進(jìn)行工程改造的另一途徑是使用最佳符合策略，搜索數(shù)據(jù)庫中的種系序列，選用最接近的人種系序列作為構(gòu)架，以接受供體CDR(Tomlinson等人，1992)。種系構(gòu)架方法是有用的，因?yàn)槿朔N系序列不呈現(xiàn)體細(xì)胞高突變(這可能是免疫原性的)?？墒褂霉灿腥朔N系策略(其中人亞組被用作為構(gòu)架)，對(duì)編碼構(gòu)架區(qū)域和本發(fā)明CDR(包埋到經(jīng)修飾的人構(gòu)架中)的組合的變體本發(fā)明抗體的核酸分子加以工程改造(見，例如，Presta等人，1993J.Immunol151:2623~32;Couto等人，1994Hybridoma,13:215-9;Couto等人，1995CancerRes.(Suppl.)，55，5973s—7s;Werther等人，1996J.Immunol"157:4986-95;O'Connor等人，1998ProteinEngng11:321—8)。本文所述的SEQIDNO或序列的一部分或抗體片段(如所描述的)也包括在本發(fā)明內(nèi)。此類蛋白質(zhì)和/或多肽片段可以是"自立的(free-standing)"或者包含較大多肽或蛋白質(zhì)的一部分，其片段形成一部分或區(qū)域，例如本文SEQIDNO:的單獨(dú)的連續(xù)區(qū)域，例如，連接進(jìn)融合蛋白。編碼此類片段的多核苷酸也包括在本發(fā)明內(nèi)。通過本領(lǐng)域已知的任何方法來對(duì)本發(fā)明的抗體加以工程改造，例如，化學(xué)合成；或者重組、遺傳或分子工程改造，這并不被制備方法所限。通序列，這包括天然相關(guān)的或異源的啟動(dòng)子區(qū)域。優(yōu)選地，表達(dá)控制序列是轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染真核宿主細(xì)胞的載體中的真核啟動(dòng)子系統(tǒng)，但是也可以使用針對(duì)原核宿主的控制序列。一旦將載體并入到合適的宿主細(xì)胞中，其在適合表達(dá)序列，以及，如果需要的話，適合收集和純化輕鏈、重鏈、輕/重鏈二聚體或完整抗體、結(jié)合片段或其它免疫球蛋白形式的M下增殖。通過本領(lǐng)域已知的方法從多種人細(xì)胞(但是優(yōu)選從永生化B細(xì)胞)分離人恒定區(qū)DNA序列。針對(duì)多核苷酸序列的合適的來源細(xì)胞和用于免疫球蛋白表達(dá)和分泌的宿主細(xì)胞獲得自本領(lǐng)域已知的來源。本發(fā)明包括使用本領(lǐng)域已知的方法(例如，優(yōu)化殘基匹配)時(shí)，與本文所示的序列具有高度序列相似性或同一性的功能性多肽序列(例如，與本發(fā)明的序列(或片段)至少87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一)。此類序列包括具有本發(fā)明抗體的功能性特征(例如，在本文所述的測(cè)定中，結(jié)合并中和成熟的人TGF-pi、TGF-p2和TGF-P3)的任何序列。此類功能相關(guān)實(shí)施方案包括在CDR或恒定區(qū)中對(duì)本發(fā)明的序列的氨基酸殘基的添加、取代和/或缺失。M酸取代和/或添加可基于涉及的殘基的極性、電荷、溶解性、疏水性、親水性和/或兩親性方面的相似性。此外，非經(jīng)典氛基酸或化學(xué)氨基酸類似物也可被取代或添加進(jìn)多肽序列。雖然本文的教導(dǎo)特別指出了獨(dú)特的式或多肽序列以及對(duì)本發(fā)明的功能性限制，但是所有此類變體都是分子生物學(xué)領(lǐng)域技術(shù)人員能獲知的范圍內(nèi)的。本發(fā)明的組合物的優(yōu)選實(shí)施方案具有下述特征中的一種或多種Kd針對(duì)TGF-pi小于2xlO"M，針對(duì)TGF-卩2小于5xlO"3M，針對(duì)TGF-卩3小于8xl(T13M;koff針對(duì)TGF-pi小于8xl(T6s-1，針對(duì)TGF-卩2小于llxi(T6s—1，針對(duì)TGF-卩3小于13xl(T6s";k^針對(duì)TGF-卩1大于5xl07M"s"，針對(duì)TGF-卩2大于2xl07M_1s"，針對(duì)TGF-卩3大于1.5x107M"s";相對(duì)于1D11.16Fab針對(duì)TGF-pi而言，F(xiàn)ab組合物對(duì)TGF-pi的Kd提高為至少6000倍；相對(duì)于1D11.16而言，針對(duì)TGF-pi抗體組合物的Kd提高為超過大約34倍，針對(duì)TGF-P2為超過大約13倍，針對(duì)TGF-p3為超過大約9倍；在HT-2測(cè)定中，IC5o高于1D11.16的ICso值的大約300倍；在U87MG人腫瘤異種移植體模型中，針對(duì)對(duì)Smad2磷酸化的抑制(如本文所迷)而言的ED幼值在大約11至大約17mg/kg的范圍內(nèi)；在以1mg/mL的濃度于40°C在標(biāo)準(zhǔn)緩沖液(例如檸檬酸鹽(20mM);磷酸鹽(10mM)或PBS(10mM磷酸鹽，含有150mMNaCl))于pH(5.0，6.5或7.4)儲(chǔ)藏30天后，通過大小排阻層析測(cè)定的本發(fā)明組合物的聚集小于5,0%;在lmg/mL、小于35。C、在標(biāo)準(zhǔn)緩沖液(例如檸檬酸鹽(20mM);磷酸鹽(10mM)或PBS(10mM磷酸鹽，含有150mMNaCl))以及〈pH7.0儲(chǔ)藏30天后，通過陽離子交換層析(CEX)測(cè)定到的產(chǎn)物降解小于1。/?；蛘邲]有酸的形式；以及使用本領(lǐng)域已知方法，在以2mg/mL的濃度于4。C儲(chǔ)藏2周后，在pH6.0時(shí)透析回收，能蛋白質(zhì)回收超過80%的本發(fā)明組合物。本發(fā)明的組合物可用作為治療劑，用于調(diào)節(jié)、治療、抑制、減輕或預(yù)防與TGF-pi、TGF-P2和TGF-P3中一種或多種相關(guān)的疾病、障礙、狀態(tài)、綜合征或病癥?？墒褂帽绢I(lǐng)域已知的任何方法來施用抗體，抗體可與傳統(tǒng)的可藥用載體、稀釋劑、穩(wěn)定劑和賦形劑組合使用。這些組合可被置入劑量形式中，例如通過在密封劑量小瓶中凍干或者在穩(wěn)定含水制品中儲(chǔ)藏來實(shí)現(xiàn)?？伤幱幂d體、稀釋劑、穩(wěn)定劑和賦形劑是本領(lǐng)域已知的，其被描述于，例如MerckIndex,Merck&Co.，Rahway，NJ中。特別地，本發(fā)明的抗體(或片段)可用于治療細(xì)胞增殖性障礙，包括下述任何疾病、綜合征、障礙、病癥或狀態(tài)，它們能影響到任何細(xì)胞、組織、任何位點(diǎn)或器官、組織或身體部分的任何組合，其特征在于細(xì)胞、細(xì)胞組或組織的單或多局部異常增殖，無論是良性還是惡性的。如本文所定義的，細(xì)胞增殖性障礙包括例如，血液惡性腫瘤(例如MDS或MPD,例如，牽涉到巨核細(xì)胞的(見，例如Sakamaki,等人，1999Blood94(6):1961-70)、多毛細(xì)胞白血病或其它血液惡性肺瘤，例如，慢性髓性白血病(CML)、慢性淋巴細(xì)胞白血病(CKK)、急性成淋巴細(xì)胞性白血病(ALL)、急性髓性白血病(AML)等)；非小細(xì)胞肺癌；乳腺癌；前列腺癌(包括激素抵抗性)；卵巢癌；肝細(xì)胞癌；膽腺癌；多發(fā)性骨髓瘤；結(jié)直腸癌；結(jié)腸、腹部、骨、乳房、消化系統(tǒng)、肝、胰腺、皿、內(nèi)分泌系統(tǒng)(例如，腎上腺、副甲狀腺、垂體、睪丸、卵巢、胸腺或甲狀腺)、目艮、頭、頸、神經(jīng)系統(tǒng)(中樞或外周)、淋巴系統(tǒng)、骨盆、皮膚、脾、胸部和泌尿生殖系統(tǒng)的腫瘤。此外，本發(fā)明的抗體可用于骨骼肌疾病，例如，治療肌萎縮(例如惡病質(zhì))；促進(jìn)肌生長(zhǎng)(例:f(口，疾病、受傷、重建(reconstruction)、置換(replacement)之后)。"化療劑"是可用于治療癌癥的化學(xué)化合物?；焺┑膶?shí)例包括烷化劑，例如，環(huán)磷酰胺和氟尿嘧啶；抗代謝物，例如氟尿嘧啶和吉西他濱；抗生素，例如阿霉素；以及抗縮瞳劑，例如，長(zhǎng)春新堿和長(zhǎng)春瑞濱。"抗血管發(fā)生劑，，指能在一定程度上阻斷或干擾血管發(fā)展的化合物。抗血管發(fā)生劑可以例如是能與參與促進(jìn)血管發(fā)生的生長(zhǎng)因子或生長(zhǎng)因子受體結(jié)合的抗體或小分子。術(shù)語"細(xì)胞毒性化療物，，在本文中使用時(shí)指能抑制或防止細(xì)胞功能和/或?qū)е录?xì)胞被破壞的物質(zhì)，其包括放射性同位素(例如，At.211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32和Lu的放射性同位素)以及毒素，例如，細(xì)菌、真菌、植物或動(dòng)物來源的小分子毒素或餘波活性毒素，包括其片段和/或變體。當(dāng)將多核苷酸與另一多核苷皿置成有功能性關(guān)系時(shí)，該多核苷酸就是"有效相連，，的。例如，啟動(dòng)子或增強(qiáng)子如果能影響到序列轉(zhuǎn)錄，那么它們就是與編碼序列有效相連的。當(dāng)編碼肽的多核苷酸有效相連(優(yōu)選地，它們位于同樣的可讀框中)時(shí)，肽就是與另一個(gè)肽"有效相連"的。術(shù)語"載體"包括這樣的核酸分子，其能轉(zhuǎn)運(yùn)與之連接另一核酸，包括但不限于質(zhì)粒和病毒載體。某些載體能在其被引入的宿主細(xì)胞中自主復(fù)制，而其它栽體在引入宿主細(xì)胞后可整合進(jìn)宿主細(xì)胞的基因組，并且因此隨著宿主基因組一起復(fù)制。此外，某些載體能指導(dǎo)它們有效相連的基因的表達(dá)。此類載體在本文中被稱為"重組表達(dá)載體"(或簡(jiǎn)稱為"表達(dá)載體")，示例性的載體是本領(lǐng)域公知的。在本文中使用時(shí)，"細(xì)胞"、"宿主細(xì)胞"、"細(xì)胞系，，和"細(xì)胞培養(yǎng)物，，這些表達(dá)可互換使用，其包括下述個(gè)體細(xì)胞或細(xì)胞培養(yǎng)物，所述細(xì)胞或細(xì)胞培養(yǎng)物是本發(fā)明的任何經(jīng)分離多核苷酸或包含編碼本發(fā)明HCVR、LCVR或單克隆抗體的序列的任何重組載體的受體。宿主細(xì)胞包括單個(gè)宿主細(xì)胞的后代，由于自然的、偶然的或刻意的突變和/或變化，后代可以不必(在形態(tài)上或在總DNA互補(bǔ)上)與原來的親本細(xì)胞完全相同。宿主細(xì)胞包括用表達(dá)本發(fā)明的單克隆抗體或其重鏈或輕鏈的多核苷酸或一種或多種重組栽體體內(nèi)或體外轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)或感染過的細(xì)胞。包含本發(fā)明重組栽體的宿主細(xì)胞(穩(wěn)定并入宿主染色體或沒有的)也可被稱為"重組宿主細(xì)胞"。用于本發(fā)明的優(yōu)選的宿主細(xì)胞是CHO細(xì)胞(例如ATCCCRL-9096)、NSO細(xì)胞、SP2/0細(xì)胞和COS細(xì)胞(ATCC例如，CRL-1650，CRL-1651)、HeLa(ATCCCCL-2)。可用于本發(fā)明的其它宿主細(xì)胞包括植物細(xì)胞、酵母細(xì)胞、其它哺乳動(dòng)物細(xì)胞和原核細(xì)胞?？贵w表達(dá)和純化為表達(dá)本發(fā)明的抗體，可將編碼部分或全長(zhǎng)輕鏈和/或重鏈的DNA插入表達(dá)栽體，使得基因與轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列有效相連。選用與所用的表達(dá)宿主細(xì)胞相容的表達(dá)載體和表達(dá)控制序列?？贵w輕鏈基因和抗體重鏈基因可插入分別的栽體，或者更通常地，兩種基因插入相同的表達(dá)載體。通過標(biāo)準(zhǔn)方法將抗體基因插入表達(dá)載體。此外，重組表達(dá)載體可編碼協(xié)助抗TGF-p單克隆抗體輕鏈和/或重鏈從宿主細(xì)胞分泌的信號(hào)肽?？筎GF-p單克隆抗體輕鏈和/或重鏈基因可被克隆進(jìn)載體，使得信號(hào)肽與抗體鏈基因的氨基末端符合讀框地有效相連。信號(hào)肽可以是免疫球蛋白信號(hào)肽或異源信號(hào)肽。除了抗體重鏈和/或輕鏈基因之外，本發(fā)明的重組表達(dá)栽體攜帶有調(diào)控序列，其控制抗體鏈基因在宿主細(xì)胞中的表達(dá)。術(shù)語"調(diào)控序列"意欲包括啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和需要的控制抗體鏈基因轉(zhuǎn)錄或翻譯的其它表達(dá)控制元件(例如，聚腺苷化信號(hào))。對(duì)表達(dá)載體的設(shè)計(jì)，包括對(duì)調(diào)控序列的選擇，可依賴于多種因素，例如，對(duì)待轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的選擇、想要的蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。對(duì)于哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞表達(dá)而言，優(yōu)選的調(diào)控序列包括指導(dǎo)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中高水平蛋白質(zhì)表達(dá)的病毒元件，例如來自巨細(xì)胞病毒(CMV)、猴病毒40(SV40)、腺病毒(例如，腺病毒主要晚期啟動(dòng)子(AdMLP))和多瘤病毒的啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子。除了抗體重鏈和/或輕鏈基因和調(diào)控序列之外，本發(fā)明的重組表達(dá)載體可攜帶額外的序列，例如，調(diào)控載體在宿主細(xì)胞中的復(fù)制的序列(例如，復(fù)制起點(diǎn))和一種或多種選擇標(biāo)記基因。選擇標(biāo)記基因協(xié)助對(duì)其中引入了載體的宿主細(xì)胞的選擇。例如，通常，選擇標(biāo)記基因在其中引入了載體的宿主細(xì)胞上賦予對(duì)藥物，例如G418、潮霉素或氨曱蝶呤的抗性。優(yōu)選的選擇標(biāo)記基因包括二氫葉酸還原酶(DHFR)基因(用于DHFR-負(fù)宿主細(xì)胞中，用甲氨蝶呤進(jìn)行選擇/擴(kuò)增)、neo基因(用于G418選擇)和谷氨酰胺合成酶(GS),其在GS陰性細(xì)胞系(例如NSO)中，用于選"^/擴(kuò)增。為表達(dá)輕鏈和/或重鏈，通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，例如電穿孔、磷酸鉤沉淀、DEAE-葡聚糖轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)、感染等，將編碼重鏈和/或輕鏈的表達(dá)載體引入宿主細(xì)胞。雖然理論上可在原核或真核宿主細(xì)胞中表達(dá)本發(fā)明的抗體，但是真核細(xì)胞是優(yōu)選的，最優(yōu)選地，哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞，因?yàn)榇祟惣?xì)胞更可能裝配并分泌正確折疊的免疫活性抗體。用于表達(dá)本發(fā)明重組抗體的優(yōu)選哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞包括中國(guó)倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞(包括DHFR-CHO細(xì)胞，如Urlaub和Chasin，Proc.Natl,Acad.Sci.USA77:4216-20，1980所述，和DHFR選擇標(biāo)記一起4吏用，例如，如Kaufman和Sharp,J.Mol.Biol.159:601-21，1982所述，以及GS-CHO細(xì)胞，如Enosawa，等人，CellTransplantation6:537-540,1997所述，與谷氨酰胺合成酶(GS)選擇標(biāo)記一起使用)、NSO骨髓瘤細(xì)胞、COS細(xì)胞和SP2/0細(xì)胞。當(dāng)將編碼抗體基因的重組表達(dá)載體引入哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞時(shí)，通過將宿主細(xì)胞培養(yǎng)一定時(shí)間來生產(chǎn)抗體，所述時(shí)間是足以允許在宿主細(xì)胞中表達(dá)抗體的，或者，更優(yōu)選地，足以允許將抗體分泌進(jìn)宿主細(xì)胞所生長(zhǎng)于的培養(yǎng)基中的?？墒褂脴?biāo)準(zhǔn)純化方法，從宿主細(xì)胞和/或培養(yǎng)基回收抗體。還可通過常規(guī)技術(shù)，使用宿主細(xì)胞來生產(chǎn)完整抗體的部分或片段，例如，F(xiàn)ab片段或scFv分子。技術(shù)人員將理解，對(duì)上述流程的變化也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。例如，可能想要用編碼本發(fā)明抗體輕鏈或重鏈的DNA來轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞。還可使用重組DNA技術(shù)來除去對(duì)于與TGF-p的結(jié)合來說不必要的、編碼輕鏈或重鏈或兩者的一些或全部DNA。從此類截短的DNA分子表達(dá)的分子也是本發(fā)明抗體所包括的。在用于重組表達(dá)本發(fā)明抗體的一種優(yōu)選系統(tǒng)中，通過電穿孔將編碼抗體重鏈和抗體輕鏈的重組表達(dá)載體引入GS-CHO細(xì)胞。在重組表達(dá)載體中，抗體重鏈和輕鏈基因各自有效連接到增強(qiáng)子/啟動(dòng)子調(diào)控元件(例如，從SV40、CMV、腺病毒等獲得的，例如CMV增強(qiáng)子/AdMLP啟動(dòng)子調(diào)控元件或SV40增強(qiáng)子/AdMLP啟動(dòng)子調(diào)控元件)上，以驅(qū)動(dòng)基因高水平轉(zhuǎn)錄。重組表達(dá)載體還攜帶DHFR基因，其允許使用氨甲蝶呤選擇/擴(kuò)增選出經(jīng)載體轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞。培養(yǎng)選出的轉(zhuǎn)化體宿主細(xì)胞，令抗體重鏈和輕M達(dá)，并從培養(yǎng)基中回收完整抗體。用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)來制備重組表達(dá)載體、轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞、選擇轉(zhuǎn)化體、培養(yǎng)宿主細(xì)胞以及從培養(yǎng)基中回收抗體。本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)^P分可在轉(zhuǎn)有人免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(例如，小鼠)中表達(dá)(見，例如Taylor,等人，NucleicAcidsRes.20:6287-95,1992)。本發(fā)明的完整抗體、其二聚體、各輕鏈和重鏈或其它免疫球蛋白形式一旦表達(dá)后，可按照本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)流程來對(duì)它們進(jìn)行純化，所述流程包括硫酸銨沉淀，離子交換、親和性、反相、疏水相互作用柱層析，凝膠電泳等。對(duì)于藥物用途而言，至少大約90%、92%、94%或96%同質(zhì)性的充分上純的免疫球蛋白是優(yōu)選的，98至99%或更高的同質(zhì)性是最優(yōu)選的。一旦純化(部分或純化至想要的同質(zhì)性)之后，可按照本文所指導(dǎo)的那樣治療或預(yù)防性地使用這些肽。組合物本發(fā)明的抗體可被并入適合施用給受試者的藥物組合物。本發(fā)明的化合物可單獨(dú)施用，或與可藥用載體、稀釋劑和/或賦形劑組合施用，可以單劑量或多劑量施用。對(duì)用于施用的組合物加以設(shè)計(jì)，使其適合于選用的施用的模式，并且可按照需務(wù)使用可藥用稀釋劑、栽體和/或賦形劑，例如，M劑、緩沖劑、表面活性劑、防腐劑、增溶劑、等滲劑、穩(wěn)定劑等。根據(jù)常規(guī)4支術(shù)對(duì)所迷組合物加以設(shè)計(jì)，如例如Remington,TheScienceandPracticeofPharmacy,第19版，Gennaro，編著，MackPublishingCo.,Easton,PA1995中所述，該文獻(xiàn)提供了醫(yī)師通常已知的配制技術(shù)的概覽?？墒褂脴?biāo)準(zhǔn)施用技術(shù)，包括靜脈內(nèi)、自內(nèi)、皮下、經(jīng)肺、經(jīng)皮、肌內(nèi)、鼻內(nèi)、經(jīng)頰、舌下或栓劑施用，將包含本發(fā)明的抗體的組合物施用給展示出本文描述的病理或障礙的受試者。施用本發(fā)明的抗體的途徑可以是腸胃外的。優(yōu)選地，本發(fā)明的抗體可被并入適合用于腸胃外施用的藥物組合物。術(shù)語腸胃外在本文中使用時(shí)包括靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、直腸、陰道或,內(nèi)施用。通過靜脈內(nèi)或腹膜內(nèi)或皮下注射的外周全身性遞送是優(yōu)選的。通常，組合物在提供的容器(包括，例如，密封小瓶或注射器)中在制備和儲(chǔ)藏條件下必須是無菌且穩(wěn)定的。因此，可在制備制劑之后對(duì)組合物進(jìn)行過濾滅菌，或者另外4吏其成為微生物學(xué)上可接受的。用于靜脈內(nèi)輸注的典型組合物可具有多達(dá)250-1000ml流體(例如，滅菌Ringer's溶液、生理鹽水、葡萄糖溶液和Hank's溶液)的體積和治療有效劑量(例如，1至100mg/mL或更多)的抗體濃度。劑量可才艮據(jù)疾病的類型和嚴(yán)重程度而變化。如醫(yī)學(xué)領(lǐng)域公知的，對(duì)于任何一個(gè)受試者而言的劑量取決于很多因素，包括患者的尺寸、體表面積、年齡、待施用的特定化合物、性別、施用途徑和時(shí)間、一般性健康狀況以及同時(shí)施用的其它藥物。典型的劑量可以是，例如，0.001至1000將的范圍內(nèi)，低于或高于該示例性范圍的劑量也是可以設(shè)想的，尤其是考慮到上文提到的因素的話。每日腸胃外劑量方案可以是大約0.1嗎/kg至大約100mg/kg總體重，優(yōu)選地，大約10嗎/kg至大約5mg/kg體重，更優(yōu)選地，每天大約10g/kg至大約3mg/kg總體重?？梢酝ㄟ^周期性評(píng)價(jià)來監(jiān)測(cè)*。對(duì)于數(shù)天或更長(zhǎng)的重復(fù)施用而言，才艮據(jù)病癥，重復(fù)進(jìn)行治療，直到想要的對(duì)疾病病狀的遏制出現(xiàn)。但是，其它劑量方案可能也是有用的，它們并不被排除在外?？梢酝ㄟ^單次推注施用、多次推注施用或連續(xù)輸注施用抗體，來遞送想要的劑量，這取決于醫(yī)師希望獲得的藥代動(dòng)力衰減模式。這些表明，抗體的量很大程度上受治療考慮的影響。選擇合適的劑量和日程的關(guān)鍵因素是獲得的結(jié)果。在這方面要考慮的因素包括被治療的特定障礙、被治療的特定哺乳動(dòng)物、個(gè)體患者的臨床病癥、病因、抗體遞送位點(diǎn)、抗體的特定類型、施用的方法、施用日程以及醫(yī)學(xué)醫(yī)師已知的其它因素。本發(fā)明的治療劑可被冷凍或凍干以儲(chǔ)藏起來，在使用前在合適的滅菌載體中對(duì)其進(jìn)行再構(gòu)成。凍干和再構(gòu)成(reconstitution)可能導(dǎo)致不同程度的抗體活性損失?？赡鼙仨氁獙?duì)劑量加以調(diào)節(jié)以做補(bǔ)償。通常，pH在6至8之間是優(yōu)選的。產(chǎn)品在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，提供了含有可用于治療上文所述障礙或病癥的材料的產(chǎn)品。產(chǎn)品包含容器和標(biāo)簽。合適的容器包括，例如，瓶、小瓶、注射器和試管。容器可由多種材料，例如玻璃或塑料制成。容器中裝納有有效于治療障礙或病癥的本發(fā)明組合物，并且可能具有無菌^口(例如，容器可以是靜脈注射溶液袋或者具有可被皮下注射針頭刺穿的塞子的小瓶)。組合物中的活性物質(zhì)是本發(fā)明的抗TGF-P抗體。容器上或與容器相關(guān)的標(biāo)簽指示出所述組合物用于治療所選的病癥。產(chǎn)品還可包含第二容器，其包含可藥用緩沖液，例如磷酸緩沖鹽溶液、Ringer's溶液和葡萄糖溶液。其還可以包括從經(jīng)濟(jì)學(xué)或使用者角度來說想要的其它材料，包括其它緩沖劑、稀釋劑、濾紙、針頭、注射器或帶有使用說明書的包裝插頁。下述實(shí)施例僅^L用于闡述目的，其不意欲以任何方式限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例l:抗體生產(chǎn)和純化為同時(shí)表達(dá)本發(fā)明抗體的輕鏈和重鏈，將編碼重鏈和輕鏈的基因都克隆，以形成雙基因載體，每個(gè)基因都處于分別的hCMV-MIE啟動(dòng)子控制下。通過對(duì)輕鏈和重鏈編碼序列進(jìn)行DNA測(cè)序來驗(yàn)證正確的編碼序列。通過單切割酶SalI對(duì)用于同時(shí)表達(dá)本發(fā)明抗體輕鏈和重鏈的表達(dá)質(zhì)粒線性化，用乙酸鈉和乙醇沉淀，用冰冷的70%乙醇洗，在滅菌生物安全拒中風(fēng)干。然后用轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基重新溶解DNA粒狀沉淀，并用其轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞。使用GenePulsar(百奧雷得公司(BioRad)，Hercules，CA)，設(shè)置在300V和1120uFd,通過對(duì)細(xì)胞-DNA混合物進(jìn)行電穿孔來進(jìn)行轉(zhuǎn)染。然后通過有限稀釋，產(chǎn)生表達(dá)本發(fā)明抗體的克隆，進(jìn)一步擴(kuò)展，以生產(chǎn)和純化抗體。按照本領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)流程來純化本發(fā)明的抗體，包括石危酸銨沉淀，離子交換，親和、反相、疏7JC相互作用柱層析，凝膠電泳等。實(shí)施例2:ELISA使用Costar3366包被的微量滴定板來進(jìn)行ELISA(4。C過夜，含有0.4Hg/ml的TGF-pi、TGF-P2或TGF-P3)。在向每孔加入(100jiL)封閉溶液(洗滌緩沖液中10mg/mlBSA)之前，對(duì)板加以洗滌(2x)。在經(jīng)包被的孔中溫育Fab稀釋物(1.5小時(shí)，22。C)。洗過之后，加入抗人K-堿性磷酸酶綴合物，并進(jìn)行溫育(l小時(shí)，22。C)。在廣泛洗滌后加入比色底物(colometricsubstrate),并測(cè)量吸光度(A560)。在另一實(shí)施例中，在竟?fàn)幮訣LISA測(cè)定中對(duì)結(jié)合組合物加以測(cè)試。通常，進(jìn)行溶液相測(cè)定，其中，首先將可能與抗原竟?fàn)幗Y(jié)合抗體的化合物(例如抗體)與溶液相中的抗體組合，然后測(cè)量抗體與抗原的結(jié)合程度。材料:碳酸鹽包被緩沖液(50mM碳酸鈉，pH9.6)。抗原TGF-pi(安迪系統(tǒng)公司(R&DSystems),貨號(hào)240畫B/CF，239ng/ml)、TGF-p2(RDI，貨號(hào)RDI-1035，50照/m)以及TGF-卩3(RDI，貨號(hào)RDI-1036/CF，50ng/ml)，在包被緩沖液中稀釋至0.4ng/mL。洗滌緩沖液(0.02MTrispH7.4,0.15MNaCl，0.1%Tween20，10mg/mlBSA(西格瑪(Sigma)A-4503)的封閉溶液，溶解于洗滌緩沖液中)。用作為陽性對(duì)照的蛋白質(zhì)是小鼠抗人TGF-pi、TGF-p2或TGF-卩3(安迪系統(tǒng)公司(R&DSystems),貨號(hào)1D11)、小鼠抗人TGF-卩2(安迪系統(tǒng)公司(R&DSystems),貨號(hào)BAF302)和小鼠抗人TGF-卩3(安迪系統(tǒng)公司(R&DSystems),貨號(hào)BAF243)，其在封閉緩沖液中被稀釋至l照/ml。檢測(cè)用抗體綴合物是抗小鼠K-過氧化物酶綴合物(南方生物技術(shù)公司(SouthernBiotech),貨號(hào)1050-05)，其工作濃度為封閉溶液中1:2000。顏色反應(yīng)底物是0-^胺(OPD)片(西格瑪公司(Sigma)貨號(hào)P-6912)，其溶解于底物緩沖液(O.lMNa2HP04,用0.05M檸檬酸調(diào)節(jié)至pH5.0)中。OPD工作溶液(即，對(duì)于一塊196孔板來說的體積)在對(duì)每塊板顯色之前新鮮制備，這是通過將1x5mg的OPD片溶解于12.5mL底物緩沖液然后加入5pl30%11202來制備的。絲用抗原(0.4ng/ml的TGF-卩1、TGF-卩2或TGF-P3，每孔放置50fil)包被單塊96孔板，膠帶密封并儲(chǔ)藏起來(16-20小時(shí)，4。C)。在加入(每孔100nl的洗滌緩沖液中的10mg/mlBSA)封閉溶液之前，在洗滌緩沖液中對(duì)板加以洗滌(2x)。溫育(l小時(shí)，22。C)之后，用洗滌緩沖液洗板(2x)，然后每孔加入IOOfil樣品(稀釋于緩沖液中)或?qū)φ?稀釋于PBS中)，并進(jìn)行溫育(1.5小時(shí)，22。C)。溫育之后，用洗滌緩沖液洗板(6x)，然后(IOOjil/孔)加入抗小鼠K-過氧化物酶綴合物(在封閉溶液中稀釋至l:2000)或SA-HRP(在封閉溶液中1:10,000稀釋)。在加入100jilOPD底物/孔之前，令測(cè)試樣品溫育(l小時(shí)，22。C)。顏色顯色后(大約IO分鐘)，測(cè)量96孔板490nm處的吸光度。實(shí)施例3:Fab的動(dòng)力學(xué)常數(shù)用KinExA3000設(shè)備(薩比戴恩公司(SapidyneInst.Inc.))來測(cè)量結(jié)合動(dòng)力學(xué)。簡(jiǎn)言之，將抗原與氮雜內(nèi)酯珠子共價(jià)偶聯(lián)，在設(shè)備上檢測(cè)本發(fā)明的游離Fab與珠子的結(jié)合。為測(cè)量Kd，對(duì)含有20pMFab(對(duì)抗體而言200pM)以及遞減的連續(xù)稀釋的抗原(0-250nM)的各管進(jìn)行溫育(在含有1%BSA、0.02%疊氮化物和0.01%Tween20的PBS中，于25。C，l隱6天)。溫育之后，按照廠商說明書，在KinExA3000上測(cè)定每份經(jīng)平衡樣品中的游離Fab。使用KinExA3000軟件來測(cè)定Kd值。為測(cè)量kon，將2nM的各Fabs與0-240nM的抗原混合，這使用注射方法按照廠商說明書來進(jìn)行，并且檢測(cè)未結(jié)合的Fab。用KinExA3000軟件，用得到的數(shù)據(jù)來計(jì)算k^。使用式Kd-koff/kon來計(jì)算koff。下表1顯示了在KinExA條件下針對(duì)Fab實(shí)施方案與TGF(51的結(jié)合獲得的親和性數(shù)據(jù)。表l<table>complextableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>類似地，在KinExA條件下針對(duì)TGF+2的親和性結(jié)合的Fab數(shù)據(jù)顯示Kd<35pM。實(shí)施例4:針對(duì)抗體的動(dòng)力學(xué)常數(shù)測(cè)量動(dòng)力學(xué)常數(shù)的備選方法是已知的，例如，通過BIAcore2000來測(cè)量本發(fā)明的抗體針對(duì)TGF-pi(安迪系統(tǒng)公司(R&DSystems),貨號(hào)240-B/CF)、TGF-卩2(RDI，貨號(hào)RDI-1035)和TGF-p3(RDI，貨號(hào)RDI-1036/CF)的親和性。使用Biacore來測(cè)定本發(fā)明的全長(zhǎng)單克隆抗體的結(jié)合親和性測(cè)量。除特別說明的之外，所有試劑和材料都購自BIAcoreAB(烏普薩拉(Upsala)，Sweden)。所有測(cè)量都在室溫下進(jìn)行。將樣品溶解于HBS-EP緩沖液(150mM氯化鈉、3mMEDTA、0.01。/。(w/v)表面活性劑P畫20和10mMHEPES，pH7.4)中。使用胺偶聯(lián)試劑盒，以400-450應(yīng)答單位(RU)的水平，在CM4傳感器芯片全部四個(gè)流動(dòng)池(flowcell)上固定重組A蛋白。使用多分析循環(huán)來評(píng)價(jià)結(jié)合。每個(gè)循環(huán)以50pL/分鐘的流速進(jìn)行，其由下述步驟構(gòu)成注射0.5jig/mL的12jiL抗體，注射250jiLTGF-(31(開始是5nM，對(duì)每次循環(huán)而言，使用兩倍連續(xù)稀釋直至0.13nM，每種濃度采用兩次注射)，接著進(jìn)行短(5分鐘)或長(zhǎng)(120分鐘)時(shí)間延遲以解離，并且使用兩次注射50jiL10mM鹽酸甘氨酸(pH1.5)來進(jìn)行再生(regeneration),使用ClampXP(分子生物學(xué)相互作用分析中心(CenterforBiomolecularInteractionAnalysis),Univ.ofUtah),通過擬合來自簡(jiǎn)單結(jié)合模型的生物傳感器數(shù)據(jù)產(chǎn)生每個(gè)循環(huán)的締合和解離速率，提取出k^和koff速率常數(shù)；從Kd=koff/kon來計(jì)算平衡結(jié)合常數(shù)Kd。使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，通過與IgG4Fc區(qū)域有效相連的Fab來構(gòu)建本發(fā)明的全長(zhǎng)單克隆抗體mAb3,A，其包含SEQIDNO:76的LC和SEQIDNO:77的HC;mAb4.17，SEQIDNO:84的LC和SEQIDNO:85的HC;mAbl2.4，SEQIDNO:78的LC和SEQIDNO:79的HC;mAb12.7，SEQIDNO:80的LC和SEQIDNO:81的HC;以及mAb12.8，SEQIDNO:82的LC和SEQIDNO:83的HC。當(dāng)使用上述測(cè)定來測(cè)量mAb時(shí)，結(jié)果如下表2所示。表2<table>complextableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>實(shí)施例5:特異性BIAcore;陂用于評(píng)測(cè)抗體針對(duì)下述存在的特異性，例如，TGF-卩1、TGF-P2或TGF-P3的潛在形式。所有測(cè)量都在室溫進(jìn)行。將樣品溶解于HBS-EP緩沖液(150mM氯化鈉、3mMEDTA、0.01。/。(w/v)表面活性劑P-20和10mMHEPES,pH7.4)中。使用胺偶聯(lián)試劑盒，以400-450應(yīng)答單位(RU)的水平，在CM4傳感器芯片全部四個(gè)流動(dòng)池上固定重組A蛋白。使用多分析循環(huán)來評(píng)價(jià)結(jié)合。每個(gè)循環(huán)以100nL/分鐘的流速進(jìn)行，其由下述步驟構(gòu)成注射15jiL1照/mL的抗體結(jié)合組合物，注射250pL的5nMTGF-pi、5nM潛在的TGF-卩2或5nMTGF畫卩3，接著進(jìn)行短(5分鐘)延遲以解離，使用兩次注射50nL10mM鹽酸甘氨酸(pH1.5)來進(jìn)行再生。使用設(shè)備控制軟件來測(cè)定捕獲抗體然后配體之后信號(hào)的量。鑒于信號(hào)與捕獲的蛋白的質(zhì)量呈正比，因此易于計(jì)算出捕獲的配體的化學(xué)計(jì)量。在此類*下，本發(fā)明的抗體的數(shù)據(jù)沒有顯示出對(duì)潛在TGF同種型的顯著的特異性結(jié)合。實(shí)施例6:HT-2細(xì)胞中和測(cè)定為測(cè)試抗體中和TGF-P生物學(xué)活性的能力，可以對(duì)Tsang，等人，(1995Cytokine7:389-97)的HT-2細(xì)胞增殖測(cè)定加以改動(dòng)。HT-2測(cè)定評(píng)定抗體對(duì)于TGF-P生物活性的中和特征，所述中和是通過抑制和/或顯著減少IL4依賴型HT2細(xì)胞系的細(xì)胞增殖來實(shí)現(xiàn)的。簡(jiǎn)言之，HT-2細(xì)胞通過IL-4以劑量依賴型方式增殖，但通過TGF-p經(jīng)歷凋亡。加入抗TGF-p抗體能阻止TGF-P對(duì)增殖的抑制。人HT-2細(xì)胞應(yīng)答于IL-4增殖，但TGF-卩1、TGF-p2或TGF-p3抑制IL-4誘導(dǎo)的增殖。隨后，如果抗體阻止了TGF-卩對(duì)IL-4誘導(dǎo)的HT-2細(xì)胞的正常抑制作用，那么抗體即是中和。因此，如果向含有細(xì)胞增殖抑制量的TGF-pi、TGF-P2或TGF+3的HT-2細(xì)胞混合物中加入足夠量的TGF-pi、TGF-P2或TGF-P3特異性結(jié)合組合物，那么IL-4誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖將不受控制地進(jìn)行。在存在特定TGF-p同種型和IL-4增殖信號(hào)時(shí)，使用HT-2測(cè)定iM^測(cè)劑量應(yīng)答中和能力。4吏用商業(yè)細(xì)胞增殖測(cè)定(例如，來自普羅米加7>司(Promega)的CellTiter96AQueousOneSolutionCellProliferationAssay)來測(cè)定細(xì)胞增殖的程度。將HT-2細(xì)胞保持于補(bǔ)充有10%FBS、青霉素/鏈霉素(分別為100U/ml和100jig/ml)、50jiM卩-巰基乙醇和10ng/mlhlL-2(安迪系統(tǒng)公司(R&DSystems》的RPMI1640中。在JouvanCR422離心機(jī)中以1000RPM對(duì)細(xì)胞進(jìn)行離心，將其重新懸浮于PBS中。用PBS洗過(2x)之后，最終將細(xì)胞重新懸浮(0.15xl06個(gè)細(xì)胞/ml，在測(cè)定培養(yǎng)基(不含酚紅的RPMI1640,補(bǔ)充有2%FBS、青霉素/鏈霉素(分別為100U/ml和100照/ml)和50jiMp-巰基乙醇)中)。向96孔板的每個(gè)孔中加入50nl處于測(cè)定培養(yǎng)基中的細(xì)胞。將不同濃度的本發(fā)明抗體與重組TGF-pi、TGF-P2或TGF-p3(300pg/ml，在測(cè)定培養(yǎng)基中)預(yù)溫育。30分鐘預(yù)溫育之后，向HT-2細(xì)胞中加入50jilTGF-p/抗體混合物，接著立即加入50^1含有6.0ng/ml鼠IL-4(最終2.0ng/ml)的測(cè)定培養(yǎng)基。在與測(cè)定培養(yǎng)基溫育(20-48小時(shí)，37。C，在濕潤(rùn)的5%C02大氣下進(jìn)行)之后，加入35nlCellTiter96Aqueous溶液(普羅米加公司(PromegaCorp))。再溫育(2-3小時(shí)，如上文所述)之后，通過^f吏用CellTiter96@比色測(cè)定(通過490nm吸光度的量測(cè)得的甲Ji脊產(chǎn)物的量與活細(xì)胞數(shù)量直接呈正比)，于490nM在ELISA板讀數(shù)儀上進(jìn)行分析，來對(duì)測(cè)定加以定量。較之1D11.16而言，本發(fā)明的抗體ATCC-HB9849展示出提高的對(duì)TGF-pi、TGF-P2和TGF+3誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡的中和以及提高的中和效力(例如，IC5(X0.1mg/mL或〈25pM)，如下表3所示。<table>complextableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>實(shí)施例7:異種移植中和測(cè)定在結(jié)合TGF-PRI和TGF-PRII受體時(shí)，TGF-卩配體能激活信號(hào)^:放大，其中，Smad-2蛋白質(zhì)被磷酸化，產(chǎn)生下游生物學(xué)影響，例如，在癌癥中。對(duì)Smad2磷酸化的抑制和/或顯著減少證明了通過轉(zhuǎn)錄活化對(duì)TGF-P生物學(xué)活性的中和(見，例如，Li，等人，2005WorldJSurg29(3):306-11)。為評(píng)測(cè)抗體的體內(nèi)中和效力，在暴露給本發(fā)明的抗體后，檢測(cè)異種移植體模型和/或多種器官或組織中的磷酸-Samd2水平，以提供其在細(xì)胞增殖性病癥(例如癌癥)中的中和效力。通過使用高度血管化的U87MG人腫瘤異種移植體模型(見，例如，Plowman,等人，1997"Humantumorxenograftmodels"inAnticancerDrugDevelopmentGuide:PreclinicalScreening,ClinicalTrials,andApproval;TeicherB(編著)第101-25頁。HumanaPress:TotowaNJ)，測(cè)量磷酸-Smad2抑制程度，來評(píng)定測(cè)試體內(nèi)效力。在實(shí)驗(yàn)操作前，隔離并保持(7天，隨意獲得食物和7jC)雌性無胸腺mi/nii棵小鼠(CharlesRiver,~22-24g)。通過側(cè)注射(皮下(s.c.))分匯合的人U87MG成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞(5xl(^/每只動(dòng)物，處于與基質(zhì)膠(Matrigel)(BD生物科學(xué)^^司(BDBiosciences),1:1v/v)混合的0.2ml培養(yǎng)基中)以促進(jìn)肺瘤生長(zhǎng)，來開始測(cè)試。然后監(jiān)測(cè)異種移植體，直到胂瘤體積達(dá)到300mm3，然后將動(dòng)物隨才幾分為處理組(10只/組)，開始給藥。當(dāng)mAbl2.7以不同劑量(例如1、10、100ng/動(dòng)物)在鹽水媒介物中按一周兩次(q4d)持續(xù)兩周給藥施用(腹腔內(nèi)注射(i.p.))時(shí)，腫瘤后植入療法就開始了。平行施用鹽水和人IgG4對(duì)照(100照)。最后一次給藥后48小時(shí)，處死動(dòng)物，收集腫瘤和肺的樣品，快速凍于液氮中。IC^磨碎樣品，裂解，用于通過ELISA來進(jìn)行Smad2磷酸化分析，其中使用針對(duì)磷酸化的或總Smad2的抗體。還通過心臟穿刺將血液收集到EDTA處理過的管中。離心血樣，以獲得血漿樣品(800rpm，4。C，30分鐘；然后3000rpm，4°C，IO分鐘)，其被儲(chǔ)藏于(-80。C)，直到進(jìn)行分析。使用JMP5.1(SAS研究所(SASInstitute))來進(jìn)行對(duì)Smad2磷酸化的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。還使用帶對(duì)照的單向ANOVA和Duniiett，s檢驗(yàn)。對(duì)磷酸-Smad2水平加以測(cè)定，以評(píng)估被本發(fā)明組合物處理誘導(dǎo)的乾抑制。將磷酸-Smad2水平相對(duì)于總Smad(或總蛋白質(zhì))標(biāo)準(zhǔn)化，以4吏得組織大小和加工操作導(dǎo)致的變化最小化。來自該U87MG異種移植體才莫型的數(shù)據(jù)顯示了對(duì)Smad2磷酸化的劑量依賴性抑制，由此展示出調(diào)節(jié)TGF-P對(duì)細(xì)胞增殖的影響中的體內(nèi)中和效力。數(shù)據(jù)顯示，10嗎劑量將Smad2磷酸化降低了60%(p=0.012)，而IOO峰劑量則達(dá)到了72。/o的抑制(p0.0001)。此外，在用IOO嗎劑量的本發(fā)明組合物時(shí)，在肺組織中觀察到Smad2磷酸化降低了75%(p<0.001)。在磷酸-Smad2水平中也存在劑量依賴性減少(相對(duì)于總-Smad(T-Smad))，以及在肺組織中也存在減少的磷酸-Smad2水平(IOO照劑量時(shí))。當(dāng)將磷酸-Smad水平相對(duì)于總Smad水平或者相對(duì)于總Smad(tSmad)水平的平方才艮被標(biāo)準(zhǔn)化時(shí)，獲得了類似的數(shù)據(jù)，這由此進(jìn)一步表明，對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的百分比抑制與本發(fā)明的結(jié)合組合物增加的劑量遞送相關(guān)。序列表SEQIDNO:1是TGF-卩1氨基酸序列的人成熟鏈。SEQIDNO:2是TGF-卩2氨基絲列的人成熟鏈。SEQIDNO:3是TGF畫卩3氨基絲列的人成熟鏈。SEQIDNO:4是一種本發(fā)明抗體的VHCDR1M酸序列。SEQIDNO:5是一種本發(fā)明抗體的VHCDR2^J^酸序列。SEQIDNO:6是一種本發(fā)明抗體的VHCDR3^J^酸序列。SEQIDNO:7是一種本發(fā)明抗體的VLCDR1氨基酸序列。SEQIDNO:8是一種本發(fā)明抗體的VLCDR2氨基酸序列。SEQIDNO:9是一種本發(fā)明抗體的VLCDR3氨基酸序列。SEQIDNO:10是數(shù)種本發(fā)明抗體的VHCDR1^J^絲列。SEQIDNO:11是數(shù)種本發(fā)明抗體的VHCDR2#^紗列。SEQIDNO:11是數(shù)種本發(fā)明抗體的VHCDR3^J^酸序列。SEQIDNO:13是數(shù)種本發(fā)明抗體的VLCDR1^J^酸序列。SEQIDNO:14是數(shù)種本發(fā)明抗體的VLCDR2^J^酸序列。SEQIDNO:15是數(shù)種本發(fā)明抗體的VLCDR3^J^酸序列。SEQIDNO:16是一種人HCVRFR1構(gòu)架^J^酸序列。SEQIDNO:17是一種人HCVRFR2構(gòu)架4J^酸序列。SEQIDNO:18是一種人HCVRFR3構(gòu)架^J^酸序列。SEQIDNO:19是一種人HCVRFR4構(gòu)架^J^酸序列。SEQIDNO:20是一種人LCVRFR1構(gòu)架^J^酸序列。SEQIDNO:21是一種人LCVRFR2構(gòu)架^J^酸序列。SEQIDNO:22是一種人LCVRFR3構(gòu)架^J^酸序列。SEQIDNO:23是一種人LCVRFR4構(gòu)架^J^酸序列。SEQIDNO:24是一種人重鏈恒定區(qū)M酸序列。SEQIDNO:25是另一種人重鏈恒定區(qū)M酸序列。SEQIDNO:26是一種人輕鏈恒定區(qū)M酸序列。SEQIDNO:27-50是針對(duì)本發(fā)明數(shù)種特定抗體的人源化輕鏈可變區(qū)(LCVR)絲紗列。SEQIDNO:51-75是針對(duì)本發(fā)明數(shù)種特定抗體的人源化重鏈可變區(qū)(HCVR)氨基絲列。SEQIDNO:76-85是針對(duì)本發(fā)明數(shù)種特定抗體的人源化重鏈和輕鏈(HC&LC)#J^f列。SEQIDNO:86-87是針對(duì)本發(fā)明數(shù)種特定抗體的人源化重鏈和輕鏈(HC&LC)^J^紗列。SEQIDNO:88-102是針對(duì)本發(fā)明數(shù)種優(yōu)選抗體的重鏈和輕鏈CDR的SEQIDNO:103-112是編碼本發(fā)明數(shù)種優(yōu)選LCVR和HCVR的DNA序列。權(quán)利要求1.人源化單克隆抗體，其中和成熟的人TGF-β1、成熟的人TGF-β2和成熟的人TGF-β3，并且具有針對(duì)成熟的人TGF-β1而言，4.0×10-12M或更小的Kd，針對(duì)成熟的人TGF-β2而言，8.0×10-12M或更小的Kd，以及針對(duì)成熟的人TGF-β3而言，4.0×10-12M或更小的Kd。2.抗TGF-P單克隆抗體，在體外HT-2細(xì)胞中和測(cè)定中，其中和成熟的人TGF-pi、成熟的人TGF-(52和成熟的人TGF-P3，并且具有針對(duì)成熟的人TGF-pi而言，小于或等于大約100pM的ICsq，針對(duì)成熟的人TGF-p2而言，小于或等于大約400pM的IC5q，以及針對(duì)成熟的人TGF-卩3而言，小于或等于大約200pM的ICso。3.權(quán)利要求1或2的單克隆抗體，其中，所述抗體包含重鏈可變區(qū)(HCVR)和輕鏈可變區(qū)(LCVR)，其中，所述HCVR包含CDRH1處，具有SEQIDNO:96或SEQIDNO:100所示的序列的肽，CDRH2處，具有SEQIDNO:97、SEQIDNO:99、SEQIDNO:101或SEQIDNO:102所示的序列的肽，以及CDRH3處，具有SEQIDNO:98所示的序列的肽；以及其中，所述LCVR包含CDRL1處，具有SEQIDNO:88、SEQIDNO:91、SEQIDNO:92或SEQIDNO:93所示的序列的肽，CDRL2處，具有EQIDNO:89或SEQIDNO:94所示的序列的肽，以及CDRL3處，具有SEQIDNO:90或SEQIDNO:95所示的序列的肽。4.權(quán)利要求2的單克隆抗體，其還包含人構(gòu)架區(qū)。5.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任意一項(xiàng)所述的單克隆抗體，其包含具有選自SEQIDNO:64、68、69、70和74的序列的HCVR和具有選自SEQIDNO:41、43、45、46和50的序列的LCVR。6.權(quán)利要求4的單克隆抗體，其包含具有SEQIDNO:69所示的序列的HCVR和具有SEQIDNO:45所示的序列的LCVR。7.單克隆抗體，其包含具有選自SEQIDNO:77、79、81、83和85的序列的重鏈和具有選自SEQIDNO:76、78、80、82和84的序列的輕鏈。8.權(quán)利要求7的單克隆抗體，其包含具有SEQIDNO:81所示的序列的重鏈和具有SEQIDNO:80所示的序列的輕鏈。9.組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求1至8中任意一項(xiàng)的所述抗體和可藥用載體。10.根據(jù)權(quán)利要求1至8中任意一項(xiàng)所述的單克隆抗體，其用作為藥物。11.根據(jù)權(quán)利要求1至8中任意一項(xiàng)的所述抗體在制備下述藥物中的用途，所述藥物用于在需要其的受試者中治療細(xì)胞增殖性障礙。全文摘要本發(fā)明提供了非常高親和性的抗體或其抗原結(jié)合片段，其中和成熟人TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3。本發(fā)明的抗體可用于治療哺乳動(dòng)物中的細(xì)胞增殖性障礙。文檔編號(hào)C07K16/22GK101346394SQ200680048551公開日2009年1月14日申請(qǐng)日期2006年12月20日優(yōu)先權(quán)日2005年12月23日發(fā)明者B·E·瓊斯,J·D·潘庫克,S·W·羅林森申請(qǐng)人:伊萊利利公司