專利名稱：：一種抗腫瘤的腺病毒制劑的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明屬于生物技術和醫(yī)學領域；更特別的，本發(fā)明涉及一種新的可用于腫瘤治療的制劑。
背景技術：
：惡性腫瘤是一類嚴重危害人類健康的重大疾病，目前藥物治療的主要障礙是缺少腫瘤治療的特異耙標和有效的體內藥物載體，即很多抗腫瘤藥物在殺死腫瘤細胞的同時也殃及正常細胞；有些特異的生物大分子抗腫瘤制劑，譬如反義核酸和siRNA等缺乏有效的體內釋放載體。因此，發(fā)展生物大分子抗腫瘤藥物，最關鍵的是發(fā)現(xiàn)腫瘤特異的靶標和發(fā)展有效的藥物載體。胰十二指腸同源盒基因-1(Pancreasduodenumhomeobox-1，PDX-1)是一種轉錄因子，對胚胎時期的胰腺發(fā)育和維持正常P細胞功能起著至關重要的作用。既往的研究認為，除胰島P細胞、S細胞和散在的十二指腸外分泌細胞外，機體其它組織均無PDX-l表達。然而，最近的研究發(fā)現(xiàn)，人體的多種腫瘤組織，如胰腺癌、乳腺癌、結腸癌、前列腺癌和腎癌中也出現(xiàn)有PDX-1的表達。然而，PDX-1在人腫瘤細胞中表達的確切機制和實際性意義尚不清楚。脂A干擾(RNAi)是近年來發(fā)展起來的一項新的有效的基因阻斷技術，不僅是研究基因功能和疾病機制的有效手段，同時具有臨床治療和發(fā)展基因特異的siRNA藥物的廣闊前景。目前化學合成的siRNA或質粒胞內釋放多采用陽離子脂質體轉染的方法，用陽離子脂質體在體外轉染是成功的，而在生物體內卻由于其轉導效率低及與劑量相關的毒副作用限制了它的體內應用。病毒被認為是體內外較非病毒載體高效的轉基因載體，然而，大多數(shù)病毒在用于體內轉染時存在安全性的問題?，F(xiàn)有技術中，對于PDX-1在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中的作用仍然是未知的，因此，本領域需要進一步研究PDX-1參與腫瘤發(fā)生與發(fā)展的機制，并且需要開發(fā)出新的針對腫瘤靶標的有效藥物，從而為腫瘤的治療提供新的途徑。
發(fā)明內容本發(fā)明的目的在于提供一種抗腫瘤的腺病毒制劑。在本發(fā)明的第一方面，提供一種可抑制PDX-1表達的構建物，所述的構建物具有以下式I結構Seq正向一X一Seq反向5^1，式I中，SeqM為可與PDX-1基因上任一區(qū)域基本互補且與PDX-1基因以外的人基因均不互補的核苷酸序列，Seq^為與Seq^基本互補的核苷酸序列，或者，Seq^為可與PDX-1基因上任一區(qū)域基本互補且與PDX-1基因以外的人基因均不互補的核苷酸序列，Seq^為與Seq^基本互補的核苷酸序列，X為位于Seq^和Seq反^之間的間隔序列，并且所述間隔序列與Seq正向禾口Seq反向不互補，式I所示的結構在轉入細胞后，形成式n所示的二級結構Seq正向S叫反向"^式工工，式II中，Seq正向、Seq反向和X的定義如上述，M表示在Seq^和Seqg^之間形成的氫鍵。在另一優(yōu)選例中，Seq正向具有14-30個核苷酸；Seq反向具有14-30個核苷酸；更優(yōu)選的，SeqM具有16-25個核苷酸；Seq^具有16-25個核苷酸；進一步優(yōu)選的，Seq正向具有18-22個核苷酸；Seq反向具有18-22個核苷酸。在另一優(yōu)選例中，X具有4-20個核苷酸，優(yōu)選的具有5-15個核苷酸，更優(yōu)選的具有6-9個核苷酸。在另一優(yōu)選例中，所述的Seq正向或Seq反向選自下組(a)具有SEQIDNo:3所示的核苷酸序列或其互補序列；(b)具有SEQIDNo:4所示的核苷酸序列或其互補序列；(c)具有SEQIDNo:5所示的核苷酸序列或其互補序列；或(d)具有SEQIDNo:6所示的核苷酸序列或其互補序列。在本發(fā)明的第二方面，提供一種重組載體，所述的載體中含有所述的構建物。在本發(fā)明的第三方面，提供一種重組的腺病毒，所述的腺病毒的基因組中含有一重組表達盒，所述的重組表達盒含有所述的構建物。在另一優(yōu)選例中，所述的腺病毒可感染腫瘤細胞，在細胞內生成可抑制PDX層1的siRNA。在另一優(yōu)選例中，所述的重組表達盒從5'至3'依次含有以下元件RNA聚合酶III啟動子；所述的構建物；和終止子。在另一優(yōu)選例中，所述的RNA聚合酶III啟動子選自(但不限于)U6啟動子，Hl啟動子；更優(yōu)選的，所述的RNA聚合酶III啟動子是U6啟動子(如人源U6啟動子(hU6))。在另一優(yōu)選例中，在脂A聚合酶III啟動子與所述的構建物之間還包括一多克隆位點。優(yōu)選的，所述的多克隆位點是BamHI酶切位點。在另一優(yōu)選例中，所述的構建物與所述的PolIII終止子之間還包括一多克隆位點。優(yōu)選的，所述的多克隆位點是HindIII酶切位點。在另一優(yōu)選例中，所述的終止子是PolyT終止子；例如，所述的終止子序列為TTTTTT。在另一優(yōu)選例中，所述的腺病毒為Ad5型腺病毒。更優(yōu)選的，所述Ad5型腺病毒為復制缺陷型病毒，缺失與病毒復制相關的基因E1或E3。進一步優(yōu)選的，所述的Ad5型腺病毒缺失與病毒復制相關的基因El，必須由宿主細胞(如293細胞)提供E1蛋白，才能復制出具有感染能力的病毒。在本發(fā)明的第四方面，提供所述的腺病毒的用途，用于制備治療PDX-l基因高表達相關疾病的藥物。在另一優(yōu)選例中，所述的PDX-1基因高表達相關疾病是腫瘤。在另一優(yōu)選例中，所述的腫瘤選自鱗狀細胞癌；基底細胞癌；移行細胞癌；腺癌；胃泌素瘤；膽管細胞癌；肝細胞腺瘤；肝細胞癌；腎細胞癌；黑色素瘤；纖維肉瘤；粘液肉瘤；脂肪肉瘤；平滑肌肉瘤；橫紋肌肉瘤；畸胎瘤；血管肉瘤；Kaposi肉瘤；淋巴管肉瘤；骨瘤；骨肉瘤；成骨肉瘤；軟骨肉瘤；腦脊膜瘤；非霍奇金淋巴瘤；霍奇金淋巴瘤；白血病。在本發(fā)明的第五方面，提供一種藥物組合物，所述的藥物組合物包含有效量的所述的腺病毒；和與所述腺病毒相容的載體。在另一優(yōu)選例中，所述的腺病毒在藥物組合物中的含量為103-102°pfu/ml;優(yōu)選的為10fi-10l5pfu/ml;更優(yōu)選的為10'°-10"pfu/ml。在本發(fā)明的第六方面，提供一種治療腫瘤的方法，所述方法包括給予腫瘤患者有效量的所述的腺病毒。另一方面，本發(fā)明還提供一種抑制腫瘤細胞的方法，包括用抗PDX-1試劑接觸腫瘤細胞，所述的抗PDX-1抑制PDX-1活性，從而抑制腫瘤細胞。在另一優(yōu)選例中，所述的抗PDX-1試劑抑制PDX-1的表達。在另一優(yōu)選例中，所述的抗PDX-1試劑為一雙鏈RNA復合物，它通過RNA千擾抑制PDX-1基因的表達。在另一優(yōu)選例中，所述的雙鏈RNA復合物包括大約28-60核苷酸，一有義鏈和一反義鏈，有義鏈和反義鏈都由14-30核苷酸組成，并且反義鏈至少有大約12-26核苷酸與有義鏈互補，同時有義鏈至少有大約12-26核苷酸與反義鏈互補。在另一優(yōu)選例中，雙鏈RNA復合物中，反義鏈與有義鏈通過一連接物相連。在另一優(yōu)選例中，所述連接物選自寡核苷酸，多聚核苷酸或非核苷酸。在另一優(yōu)選例中，所述的PDX-1選自抗體，適體，配體或抑制化合物。在另一優(yōu)選例中，所述的正義鏈或反義鏈與選自SEQIDNo:3，SEQIDNo:4，SEQIDNo:5，或SEQIDNo:6的核酸實質上互補。在另一優(yōu)選例中，所述的抗PDX-1試劑選自反義寡核苷酸或核酶。另一方面，本發(fā)明還提供一種抑制腫瘤細胞PDX-1表達的方法，包括將腫瘤細胞與用有效量的可與編碼PDX-1的RNA的特定區(qū)域互補的抗PDX-1試劑接觸，所述的抗PDX-1試劑與編碼PDX-1的特定RNA分子雜交，并在腫瘤細胞中阻滯PDX-1基因的表達。在另一優(yōu)選例中，作為雙鏈RNA的復合物的抗PDX-1試劑以RNA干擾的方式阻滯PDX-1基因的表達。另一方面，本發(fā)明還提供一種組合物，所述組合物包括所述的抗PDX-1試劑以及藥學上可接受的載體。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內容，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。圖1顯示了各種細胞中PDX-1mRNA的表達情況，所述細胞包括PANOl，UKPAN，BxBc3，MiaPaCa2，MCF-7，SK-BR-3，AU565，MDA-MB-231，H23，H460，H520,T24，Um-UC-3和AG5229-hT。圖2顯示了使用PDX-1siRNA651(圖中簡稱651)處理MiaPaCa-2胰腺癌細胞，收獲細胞并使用免疫印跡分析細胞內PDX-1的表達的情況，以未處理的細胞(-)作為對照。圖2B是免疫印跡結果，圖2A是量化結果。圖3顯示了流式細胞術分析由PDX-1siRNA引起的表達抑制導致癌細胞系的凋亡情況。圖4顯示了RT-PCR分析PDX-1siRNA590轉染的MiaPaCa2細胞的PDX-1表達的量化結果。圖5顯示了倒置顯微鏡下PDX-1siRNA處理的腫瘤細胞的凋亡。其中，左列為對照siRNA處理后的情況，右列為PDX-1siRNA590處理后的情況。圖6顯示了本發(fā)明所用的pRNAi-shuttle質粒的圖譜，該質粒中含有hU6啟動子，BaraHI酶切位點、HindIII酶切位點和終止子(TTTTTT)等。圖中所標記的各位點名稱之后的數(shù)字代表該位點處于載體中的位置，如BamHI1025表示BaniHI酶切位點起始于載體序列的第1025位。圖7顯示了pAd/BLOCK-iT-DEST載體(購自美國Invitrogen公司)的圖譜。圖8顯示了重組腺病毒表達載體的構建與克隆的基本流程。圖9顯示了利用PDX-1shRNA腺病毒制劑感染MiaPaCa2細胞、SK0V3細胞、Pane-l細胞后，細胞的凋亡情況，同時以表達無意義的shRNA((-)siControl)的腺病毒作為陰性對照。其中，A為MiaPaCa2感染第7日的情況(從左至右分別為空白對照孔，陰性對照孔，陽性感染孔)；B為SK0V3感染第10日的情況(從左至右分別為空白對照孔，陰性對照孔，陽性感染孔)；C為Pane-1感染第10的情況(從左至右分別為空白對照孔，陰性對照孔，陽性感染孔)。圖IO顯示了顯微鏡觀察利用PDX-1shRNA腺病毒制劑感染MiaPaCa2細胞、Pane-l細胞、SK0V3細胞后的細胞凋亡情況，同時以表達無意義的shRNA((-)siControl)的腺病毒作為陰性對照。其中，A為MiaPaCa2細胞感染后第7日陰性組(左)與陽性感染組(右)的情況；B為Pane-1細胞感染后第10日陰性組(左)與陽性感染組(右)的情況；C為SK0V3細胞感染后第10日陰性組(左)與陽性感染組(右)的情況。圖11顯示了顯微鏡觀察利用PDX-1shRNA腺病毒制劑感染SMMC7721人肝癌細胞、435s人乳腺癌細胞、SGC7901人胃癌細胞后的細胞凋亡情況，同時以表達無意義的shRNA((-)siControl)的腺病毒作為陰性對照。其中，A為SMMC7721細胞感染后第10日陰性組(左)與陽性感染組(右)的情況；B為435s細胞感染后第10曰陰性組(左)與陽性感染組(右)的情況；C為SGC7901細胞感染后第10日陰性組(左)與陽性感染組(右)的情況。圖12顯示了采用590腺病毒制劑和表達sh認A((-)siControl)的腺病毒分別感染乳腺癌MDA-MB-435S細胞(A)，前列腺癌pc-3細胞(B)，乳腺癌MDA-MB-231細胞(C)，肺癌A549細胞(D)，宮頸癌hela細胞(E)，肝癌7721細胞(F)后，倒置顯微鏡下觀察590腺病毒制劑組細胞的生長抑制情況。具體實施例方式本發(fā)明人經過廣泛而深入的研究，首次揭示PDX-1是對于腫瘤發(fā)生和發(fā)展起重要作用的因子，阻斷其基因表達或抑制其蛋白活性可達到抗腫瘤的作用。本發(fā)明人還基于PDX-l基因序列，找到了對于抑制PDX-1mRNA轉錄有用的作用靶點。本發(fā)明還提供一種具有通過抑制PDX-1表達、從而抑制腫瘤生長的小干擾RNA(siRNA)。本發(fā)明還提供了一種基于該小干擾RNA而設計的抗腫瘤的腺病毒制劑，所述腺病毒制劑產生滴度高、不整合到宿主基因組、安全性高。在此基礎上完成了本發(fā)明。如本發(fā)明所用，"腫瘤"一詞包含了廣泛的含義，包括但不限于鱗狀細胞癌；基底細胞癌；移行細胞癌；腺癌；胃泌素瘤；膽管細胞癌；肝細胞腺瘤；肝細胞癌；腎細胞癌；黑色素瘤；纖維肉瘤；粘液肉瘤；脂肪肉瘤；平滑肌肉瘤；橫紋肌肉瘤；畸胎瘤；血管肉瘤；Kaposi肉瘤；淋巴管肉瘤；骨瘤；骨肉瘤；成骨肉瘤；軟骨肉瘤；腦[脊]膜瘤；非霍奇金淋巴瘤；霍奇金淋巴瘤；白血病。如本文所用，術語"RNA干擾(RNAinterference,RNAi)"是指一些小的雙鏈RNA可以高效、特異地阻斷體內特定基因表達，促使mRNA降解，誘使細胞表現(xiàn)出特定基因缺失的表型，其也被稱為RNA干預或者RNA干涉。RNA干擾是高度特異的在mRNA水平上的基因沉默，它是體內抵御外在感染的重要保護機制之一。簡要地說，RNA干擾包含一個由小型干擾RNA(siRNA)所激發(fā)的機制，造成耙mRNA的降解。如本文所用，術語"小干擾RNA(smallinterfering歸，siRNA)"是指一種短片段雙鏈RNA分子，能夠以同源互補序列的mRNA為耙目標降解特定的mRNA，這個過程就是RNA干擾途徑(RNAinterferencepathway)。如本文所用，術i吾"小發(fā)夾RNA(SmallhairpinRNA，shRNA)"是指能夠形成發(fā)夾結構的非編碼小RNA分子，小發(fā)夾RNA能夠通過RNA干擾途徑來抑制基因的表達。如本文所用，術語"互補"指的是核苷酸之間的堿基配對，特別指核苷酸之間的氫鍵結合，胸腺嘧啶或尿嘧啶殘基通過2個氫鍵與腺嘌呤結合，胞嘧啶和鳥嘌呤殘基通過3個氫鍵結合?？傮w來講，一條核酸含有一對與另一特定的核苷酸序列擁有"互補百分率"的核苷酸序列。例如，一條核苷酸序列對于另一條特定的核苷酸序列可能有80%，90%或100%的互補性，提示這個核苷酸序列的10個核苷酸中有8個，9個，或10個與另一個特定的核苷酸序列互補。兩條互補的核苷酸序列含有一個正義鏈(sense)和一個反義鏈(antisense)。術語"基本互補"或"基本上互補"指的是一條核苷酸序列對于另一條特定的核苷酸序列有至少80%，較佳的90%，更佳的95%，最佳的100%的互補性。PDX-1胰十二指腸同源盒基因-l(Pancreasduode畫homeobox-l，PDX-1)是一種轉錄因子。盡管已有研究發(fā)現(xiàn)人體的多種腫瘤細胞中有PDX-1的表達，但現(xiàn)有技術對PDX-l人腫瘤細胞中表達的確切機制尚不清楚。本發(fā)明人的研究首次發(fā)現(xiàn)，PDX-l在許多腫瘤細胞中高表達，而在正常細胞(除胰島e細胞，5細胞和散在的十二指腸外分泌細胞外)中無明顯表達。進一步的，本發(fā)明人通過干擾PDX-1的表達來研究PDX-l在腫瘤細胞中的作用，從而證實了PDX-l是腫瘤發(fā)生和發(fā)展的重要性因子，抑制PDX-l的表達，可誘導腫瘤細胞的凋亡。因此可見，PDX-l是一種促進細胞增殖的去分化因子或是一種抗凋亡因子，其在腫瘤細胞中高表達是導致腫瘤發(fā)生和發(fā)展的關鍵所在。關于上述研究還可參見美國臨時專利申請?zhí)枮?0/889，808的專利申請。由于PDX-l在正常細胞中沒有明顯的表達，因此其可以作為一種良好的特異性抗腫瘤靶標，也就是減少或阻斷PDX-1的表達在抗腫瘤的同時，對正常細胞的沒有明顯影響。PDX-1的蛋白序列及其核苷酸序列是本領域人員所已知的。PDX-1的蛋白序列與SEQIDNO:2所示的序列基本上相同或完全相同；一種編碼PDX-1蛋白的核苷酸序列例如可與SEQIDNO:l所示的序列基本上相同或完全相同。抑制PDX-1的siRNA基于抑制PDX-1的表達可誘導腫瘤細胞的凋亡的特點，可針對PDX-1來設計siRNA序列，從而用于抑制細胞內PDX-1的表達。本發(fā)明人經過長期研究，根據PDX-1的序列，在該序列上找到了若干個對于抑制PDX-1mRNA轉錄有用的靶點，所述靶點的序列分別是5，AGTTCCTATTCAACAAGTA3，(SEQIDNo:3)，即人PDX-1核苷酸序列第590-608位。5，TTCCTATTCAACAAGTACA3，(SEQIDNo:4)，即人PDX-1核苷酸序列第592-610位。5，CTTGACCGAGAGACACATC3，(SEQIDNo:5)，即人PDX-1核苷酸序列第651-669位。5，TGACCGAGAGACACATCAA3，(SEQIDNo:6)，即人PDX-1核苷酸序列第653-671位。在篩選siRNA耙序列時，還需進行比對分析，從而排除任何與PDX-1以外的任何人類基因同源的靶序列，找出最佳的有效片段。任何經辨認屬于非特異性的耙序列被排除在本發(fā)明之外。靶序列與核酸數(shù)據庫中其它序列對比可通過目前已知的多種比較方法進行。一種常用的比較方法如BLAST(BasicLocalAlignmentSearchTool,http://www,ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)分析。經過本發(fā)明人大量的分析和比較，靶序列SEQIDNo:14、SEQIDNo:15、SEQIDNo:16和SEQIDNo:17與編碼人類PDX-1的核酸SEQIDNo:1的部分區(qū)域完全相同，與其它的人類核酸序列沒有顯著的同源性。并且經驗證，針對SEQIDNO:14-17任一所示的核苷酸序列設計的siRNA具有良好的干擾PDX-l表達的效果?；谏鲜霭尹c本發(fā)明提供了抑制腫瘤的siRNA，所述的siRNA可特異性地干擾PDX-1基因的轉錄。所述的siRNA為以人PDX-1基因序列為模板，根據siRNA設計原則獲得的siRNA。所述的siRNA可以被制備成一種包含正義鏈和反義鏈的雙鏈核酸，在其中正義鏈和反義鏈基本上互補，且每一條正義鏈或反義鏈包含14-30個核苷酸?；パa的正義鏈和反義鏈隨意地包含1-2個核苷酸懸突在一條或兩條鏈上的3'末端。作為一種優(yōu)選方式，所述的siRNA包含正義鏈和反義鏈，每條鏈有21-23個核苷酸，其中2個核苷酸懸突在每條鏈的3'末端，而剩余的19-21個核苷酸100%互補。如上所述，siRNA復合物的進一步細節(jié)在Engelke,D.R.，RNAInterference(RNAi):NutsandBoltsofRNAiTechnology,腿PressLLC,Eagleville，PA,2003—書中有描述。有關siRNA長度和成分的額外描述在Elbashir，S.M.等的GenesandDevel.,15:188-200,2001;and0'Toole,A.S.etal.，RNA,11:512-516，2005—書中可找到。本發(fā)明對siRNA的制備方法沒有特別的限制，包括但不限于化學合成法，本夕卜轉錄法、RnaseIII(女卩SilencersiRNAConstructionKit，Ambion公司)或Dicer酶消化dsRNA法等。應理解，本領域技術人員在得知了本發(fā)明所提供的siRNA的序列以后，可以以各種途徑方便地制備或表達所述的siRNA。例如，在本發(fā)明的一種優(yōu)選例中，所述的siRNA是化學合成的。siRNA可以制備成雙鏈核酸的形式，它含有一個正義鏈和一個反義鏈，這兩條鏈僅在雜交的條件下形成雙鏈，其它情況下不連接。一個雙鏈RNA復合物可以由相互分離的正義鏈和反義鏈來制備。因此，舉例來講，互補的正義鏈和反義鏈是化學合成的，其后可通過退火雜交，產生合成的雙鏈RNA復合物。此外，siRNA包含的正義鏈和反義鏈可通過一個或多個編碼正義鏈和反義鏈的表達盒來制備。當正義鏈和反義鏈由一個單獨的表達盒編碼時，它們可以從生成的轉錄物中斷裂形成分離的正義鏈和反義鏈，其后雜交生成雙鏈siRNA。在Engelke,D.R.寫的RNAInterference(腿i):NutsandBoltsofRNAiTechnology—書中，特別是第5和第6章，DNAPressLLC,Eagleville，PA，2003可以讀到制備siRNA的合成和重組方法。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，一種雙鏈"短發(fā)夾"RNA復合物(稱作"shRNA"或"發(fā)夾siRNA")包含一條反義鏈和一條正義鏈，通過一個間隔序列相連。shRNA可以化學合成，也可以通過一個重組核酸結構里的表達盒轉錄成單鏈RNA之后進行制備。shRNA有互補結構區(qū)，在雜交條件下形成"發(fā)夾"構象，在其中互補的正義鏈和反義鏈相連接，例如，通過一個l-20個核苷酸的核苷酸序列連接?？傮w來講，每一個互補的正義鏈和反義鏈有大約14-30個核苷酸。如上述，shRNA可以由編碼需要的轉錄物的雙鏈DNA模板來表達。編碼需要的轉錄物的雙鏈DNA模板被插進一個載體，例如質?；虿《据d體，然后在體外或體內連接到一個啟動子進行表達。shRNA在真核細胞內DICER酶的作用下，可被切割成小干擾RNA分子，從而進入RNAi途徑。"構建物"及"表達盒"在這里是指重組DNA分子，它包含預期的核酸編碼序列，這個序列編碼一個siRNA或shRNA;這個DNA分子還包含轉錄在體外或體內可操作的連接編碼序列所必需的或預期的適合的調控元件。"調控元件"在這里指的是可一定程度上控制核酸序列表達的核苷酸序列?？勺鳛榈浞兜恼{控元件包括增強子，內核糖體進入位點(IRES)，復制起點，多腺苷酸化信號，啟動子，轉錄終止序列，以及上游調節(jié)區(qū)，這些調控元件有助于核酸的復制、轉錄、轉錄后修飾等。重組腺病毒在獲得的可有效抑制PDX-1表達的siRNA后，需要通過特定的方法來將所述的siRNA特異性遞送到腫瘤細胞內或者使所述的siRNA在腫瘤細胞內被生成，從而使腫瘤細胞與所述的siRNA接觸。這種特異性遞送可通過多種不同的遞送方法來完成，例如直接在局部部位注射所述的siRNA。然而，研究遞送方法的同時還需要考慮對于人體的安全性問題。本發(fā)明人在研究中找到了一種特別有效的遞送方法，以腺病毒作為載體，將所述的siRNA或shRNA遞送到靶細胞中。以腺病毒作為遞送載體的優(yōu)點如下首先，大多數(shù)的腫瘤都是上皮細胞來源的，而腺病毒具有嗜上皮細胞性，因此采用腺病毒具有很好的選擇性；其次，腺病毒產生的滴度高，腺病毒DNA不整合到靶細胞基因組，對于人體有良好的安全性；再次，腺病毒的理化性質穩(wěn)定，易于制備、純化、濃縮。腺病毒(Ad)是一種無包膜的病毒，雙鏈DNA長約36Kb，基因組由九個區(qū)組成，四個表達較早(E1-E4)稱作早區(qū)，五個表達較晚(L1-L5)稱作晚區(qū)，表達受細胞轉錄因子和E1區(qū)控制，E2區(qū)主要調節(jié)DNA復制，E3區(qū)基因產物與病毒逃避宿主免疫系統(tǒng)的清除有關，而E4區(qū)的產物參與病毒DNA復制、晚區(qū)基因表達和轉錄本拼接等活動。目前己發(fā)現(xiàn)IOO余種腺病毒血清型，基因治療常用的人的2型(Ad2型)及5型(Ad5型)腺病毒，在DNA序列上有95。/。的同源性。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，采用復制缺陷型Ad5，缺失與病毒復制相關的基因E1，必須由宿主細胞(如293細胞)提供E1蛋白，才能復制出具有感染能力的病毒。腺病毒可通過受體介導的細胞內攝途徑進入細胞，核內體酸化后破裂，胞漿內病毒DNA于溶酶體降解之前釋出，然后進入細胞核而變成附著體狀態(tài)。本發(fā)明提供一種重組的腺病毒，所述的腺病毒的基因組中含有一重組表達盒，所述的重組表達盒含有如式I結構的構建物Seq正向一X一Seq反向《I，式I中，Seq正向、Seq反向、X的定義同前所述。在重組表達盒中，除了所述構建物以外，還包括與所述構建物操作性相連的其它元件，包括但不限于啟動子、終止子等。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，在所述構建物的5'端連接有RNA聚合物III啟動子，在所述構建物的3'端連接有Poiin終止子。在進入到細胞內后，所述的構建物在RNA聚合酶III啟動子(如U6)的作用下，形成式II所示的二級結構<formula>formulaseeoriginaldocumentpage14</formula>Seq正向__^~-n''XSeq反向"^式n。式II的二級結構在細胞內被諸如Dicer酶加工后，形成可抑制PDX-1轉錄的siRNA。優(yōu)選的，所述的Seq正M或Seq^選自下組(或與選自下組的序列互補)(a)具有SEQIDNo:3所示的核苷酸序列；(b)具有SEQIDNo:4所示的核苷酸序列；(c)具有SEQIDNo:5所示的核苷酸序列；或(d)具有SEQIDNo:6所示的核苷酸序列。此外，還可以使重組的腺病毒表達靶向元件或與靶向元件相結合，靶向元件例如可以是增強所述重組腺病毒穿越細胞膜屏障的。例如蛋白質，肽類，抗體，抗原結合抗體片段，激素，抗原，半抗原，碳水化物結合部分如凝集素，酶，酶底物，受體，受體配體，運載體的底物等，以及其它能夠與結合配偶體分子特異性相互作用的分子。更特別的，增強腺病毒到細胞內特定位置的遞送作用的靶向元件可以是不同的細胞器定位信號，例如核定位信號?；蛘撸蚁蛟膳c靶細胞的標記物發(fā)生相互作用。例如，特定的腫瘤表達可預示腫瘤細胞級別的腫瘤標記物。評估腺病毒將siRNA或sh認A引入細胞的有效量的效能的適合方法是已知的，包括測定PDX-1蛋白和/或PDX-1編碼mRNA的以下方法中的一種或多種RT-PCR，脂A印跡，免疫印跡，免疫沉淀作用以及ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測定)。此外還包括對接觸所述抑制制劑后誘導細胞凋亡進行測定，例如對特異性凋亡指示物測定包括基因組DNA碎片，細胞錨定蛋白標記，或活化Caspase-3水平測定。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，本發(fā)明人構建了pdx-lsiRNA克隆載體"pRNAi-shuttle"，并與pAd/BLOCK-iTTM-DEST載體(購于美國Invitrogen公司)實施LR重組反應，最終制備了PDX-1shRNA重組腺病毒載體。體外抗腫瘤篩選實驗證明其具有廣泛和近乎100%的高效抗腫瘤作用，表明可能為有效的體內藥物載體。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的腺病毒為Ad5型腺病毒。藥物組合物本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，所述的藥物組合物包括有效量的所述重組腺病毒以及與所述腺病毒相容的載體。所述與腺病毒相容的載體需在本質上對于人和/或動物無過度不良副反應(如毒性、刺激和變態(tài)反應)的，即有合理的效益/風險比的物質，并在本質上與腺病毒制劑、任何所用到的靶向元件以及其它成分無作用。所述"有效量"是指可對人和/或動物產生功能或活性的且可被人和/或動物所接受的量。所述"與腺病毒相容的載體"指用于治療劑給藥的載體，包括各種賦形劑和稀釋劑。該術語指這樣一些藥劑載體它們本身并不是必要的活性成分，且施用后沒有過分的毒性。合適的載體是本領域普通技術人員所熟知的。在Remington'sPharmaceuticalSciences(MackPub.Co.，N.J".1991)中可找到關于藥學上可接受的賦形劑的充分討論。在組合物中藥學上可接受的載體可含有液體，如水、鹽水、甘油和乙醇。另外，這些載體中還可能存在輔助性的物質，如填充劑、潤滑劑、助流劑、潤濕劑或乳化劑、pH緩沖物質等。本發(fā)明所述的重組腺病毒的有效量可隨給藥的模式和待治療的疾病的嚴重程度等而變化。優(yōu)選的有效量的選擇可以由本領域普通技術人員根據各種因素來確定(例如通過臨床試驗)。所述的因素包括但不限于所述的siRNA的藥代動力學參數(shù)例如生物利用率、代謝、半衰期等；患者所要治療的疾病的嚴重程度、患者的體重、患者的免疫狀況、給藥的途徑等。通常，當本發(fā)明的重組腺病毒制劑每天以約10M0"pfu/kg(優(yōu)選的為104-1012pfu/kg;進一步優(yōu)選的為1oMo'V"u/kg)動物體重的劑量給予，能得到令人滿意的效果，較佳地每天以2-4次分開的劑量給予，或以緩釋形式給藥?？烧{節(jié)此劑量方案以提供最佳治療應答。例如，由治療狀況的迫切要求，可每天給予若干次分開的劑量，或將劑量按比例地減少。任何適用的給藥途徑都是可以的，包括但不限于靜脈內注射、皮下注射、肌肉注射、經皮給予、局部給予、植入、緩釋給予、腫瘤內給予等；優(yōu)選的，所述給藥方式是非腸道給予的。本發(fā)明的主要優(yōu)點在于(1)首次揭示PDX-l是一種在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用的關鍵性因子，而在非腫瘤的細胞中則無明顯表達，其可作為一種新的腫瘤治療的靶標。(2)首次揭示可高效和特異地抑制PDX-l表達的siRNA片段，并采用RNA干擾技術驗證了PDX-1在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中的重要作用。(3)提供一種良好的抑腫瘤制劑，以腺病毒作為將所述siRNA或shRNA遞送到細胞內的載體。由于大多數(shù)的腫瘤都是上皮細胞來源的，而腺病毒具有嗜上皮細胞性，因此具有很好的選擇性；并且，腺病毒產生的滴度高，不整合宿主基因組，對于人體的安全性高；此外，腺病毒的理化性質穩(wěn)定，易于制備、純化、濃縮。下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室指南(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計算。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內容相似或均等的方法及材料皆可應用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。實施例l人有效PDX-1siRNA片段的設計、合成1.耙序列的確定人PDX-1siRNA耙點是由DharmaconsiDesign工具(美國Dharmacon公司)設計的，基于的序列是人PDX-lmRNA序列(GenBank登錄號為醒—000209)。選出帶有30-50%GC含量的幾個候選的人PDX-1siRNA靶點，并用NCBIBLAST檢索任何與人PDX-1以外的其他基因序列互補的PDX-1siRNA，排除與人PDX-1以外的其他基因序列互補的PDX-1siRNA靶點。經過反復的試驗和篩選，結果確定4個針對人PDX-1的siRNA靶序列，分別如下5，AGTTCCTATTCAACAAGTA3，(SEQIDNo:3)，即對應于核苷酸序列SEQIDNo:l的第590-608位。人PDX-l核苷酸序列見SEQIDNo:1，編碼的人PDX-l蛋白序列見SEQIDNo:2。5'TTCCTATTCAACAAGTACA3，(SEQIDNo:4)，即對應于核苷酸序列SEQIDNo:1的第592-610位。5'CTTGACCGAGAGACACATC3，(SEQIDNo:5)，即對應于核苷酸序列SEQIDNo:1的第651-669位。5，TGACCGAGAGACACATCAA3'(SEQIDNo:6)，即對應于核苷酸序列SEQIDNo:1的第653-671位。以Dharmacon提供的(-)siControl(靶序列是ACTACCGTTGTATAGGTG(SEQIDNo:7))作為陰性對照，該序列已被證實與小鼠，大鼠以及人基因組均缺乏序列同源性。2.siRNA的合成根據上述獲得的靶位點的序列，來合成siRNA。各siRNA均可通過常規(guī)方法合成5，AGUUCCUAUUCMCAAGUAUU3，(SEQIDNo:14，PDX-1siRNA590);5，UUCCUAUUCAACAAGUACAUU3'(SEQIDNo:15，PDX-1siRNA592);5'CUUGACCGAGAGACACAUCUU3，(SEQIDNo:16，PDX-1siRNA651);5，UGACCGAGAGACACAUCAAUU3'(SEQIDNo:17，PDX-1siRNA653)。并且，陰性對照(-)siControl對應的siRNA為:5，ACUACCGUUGUAUAGGUGUU3，(SEQIDNo:18)。實施例2Western印跡將對數(shù)生長期的細胞用RIPA裂解緩沖液裂解(由20mMTris-HC1，pH8.0，100mMNaCl，1mMEDTA和帶有蛋白抑制因子的混合物的1%NP-40組成)。在溶胞產物中的蛋白濃聚物用BSA蛋白測定試劑盒測定(購自Pierce,Rockford,IL)。每個樣本的50mg蛋白溶解物用5X加樣緩沖液(由0.25MTris-HCl，pH6.8，50%甘油，5%SDS，％52-巰基乙醇，和2.5%溴酚藍)混合。這些樣品在98。C下被孵育5分鐘，在冰上孵育5分鐘，后在室溫下在一小離心機上以最大速度離心。蛋白質在10y。SDS/聚丙烯酰胺凝膠溶解并轉移到PVDF膜上。膜在含有5%脫脂奶粉的TBST(由10mMTris-HCL，pH7.5,150mMNaCl，和0.1%Tween20組成)中阻滯1小時。被阻滯的膜由在TBST/5%脫脂奶粉中稀釋的第一抗體探測兩個小時。接著，膜用TBST中洗滌后在由辣根過氧化物酶標記的第二抗體孵育1小時。之后膜用TBST洗滌4次，抗體用化學發(fā)光試劑來檢測，如Amersham的ECLWesternblotting試劑。采用的一抗為兔多克隆anti-PDX-1抗體，其與從小鼠、大鼠及人中獲得的PDX-1可反應，購自Chemicon(目錄編號AB3243)。實施例3定量PCR利用常規(guī)的技術來提取細胞中的全部RNA，如用RNEASY試劑盒(Qiagen，Valencia,CA)。用常規(guī)技術來合成cDNA，如用HighCapacitycDNAArchivekit(Biosystems，F(xiàn)osterCity,CA)。使用如下引物5'-AGCCGGAGGAGAACAAGC-3，(SEQIDNo:8)和5，-TTCAACATGACAGCCAGCTC-3'(SEQIDNo:9)。擴增條件為95°C，10分鐘，之后在一個Mx3000P熱循環(huán)儀(Stratagene，LaJolla，CA)中進行40次30sec95°C/60sec6CTC。測量GAPDH在同樣擴增條件下的表達作為內部對照。實施例4通過測定AnnexinV來確認凋亡大約5X105細胞被放在60mm直徑的培養(yǎng)皿中并培養(yǎng)一個晚上。細胞接著不被處理，或用對照或抗PDX-1的siRNA轉染。72或96小時后，細胞被胰酶酶解，用1X結合緩沖液洗滌，然后用熒光標記的AnnexinV在黑暗中孵育15分鐘。然后，細胞迅速的用流式細胞儀分析。AnnexinV攝取的程度與PDX-1的表達的抑制誘導的凋亡程度成比例。實施例5人腫瘤細胞的PDX-1mRNA水平的測定人腫瘤細胞的PDX-1表達水平以PDX-1mRNA水平來呈現(xiàn)。人腫瘤細胞mRNA水平可由定量PCR來量化。許多人腫瘤細胞被評價，包括PANC-1，UKPAN(UK-PAN1),BxBc3，MiaPaCa2，MCF-7,SK-BR-3,AU565,MDA-MB-231，H23,H460，H520，T24，Um-UC-3和AG5229-hT(均購自ATCC)。這些細胞相對于人正常組織(不包括胰腺beta和delta細胞)都過量表達PDX-1mRNA。結果見圖1。總RNA通過常規(guī)技術從細胞中制備(RNAEASY，Qiagen,Valencia,CA)并合成cDNA(HighCapacitycDNAArchivekit,AppliedBiosystems，F(xiàn)osterCity,CA)。人PDX-1raRNA通過使用BrilliantSYBRGreen檢測試劑(Stratagene，LaJolla，CA)，使用引物5，-AGCCGGAGGAGAACAAGC-3，(SEQIDNo:10)和5'-TTCAACATGACAGCCAGCTC-3，(SEQIDNo:11)。擴增條件為95°C，10分鐘，之后在一個Mx3000P熱循環(huán)儀(Stratagene,LaJolla，CA)中進行40次30sec95°C/60sec60°C。以GAPDH在同樣的擴增條件下的表達作為內部對照。(AssaysonDemand,AppliedBiosystems,FosterCity,CA)。PDX1mRNA的水平依據一個正常人成纖維細胞系，AG5229-hT中PDX-1表達的水平來進行標準化。選擇不同的腫瘤細胞株來呈現(xiàn)不同組織來源的腫瘤的PDX-1表達情況胰腺癌(Panel,BxBC3，UKPAN，MiaPaCa-2)，乳腺癌(MCF-7，SK-BR-3，AU565,MDA-MB-231)，肺癌(H23,H460，H520)以及膀胱癌。所有這些細胞株都能夠在裸鼠體內形成異種嫁接腫瘤，從而進一步的在體內進行研究。實施例6siRNA對PDX-1表達的抑制使用前述合成的siRNA來阻止PDX-1表達和誘導培養(yǎng)的細胞凋亡。大約5X105MiaPaCa-2胰腺癌細胞被放在60mm直徑的培養(yǎng)皿中并在標準條件下培養(yǎng)過夜。接著細胞用SEQIDNo:16的siRNA(PDX-1siRNA651)或SEQIDNo:18的siControlsiRNA孵育。未處理的細胞被用作附加對照組。72-96小時后，收獲細胞并使用免疫印跡分析PDX-1表達。圖2顯示了通過上述步驟獲得的免疫印跡結果，顯示PDX-1siRNA651(簡稱651)顯著了抑制PDX-1表達。細胞放置為5X10s細胞/60國板。在過夜孵育之后細胞使用Dharmafect2siRNA轉染制劑轉染，為達到lOOnM的最終濃度，每板使用200ul的2uMsiRNA。72小時后收獲細胞，并通過免疫雜交來測定PDX-1蛋白的表達。以肌動蛋白(actin)的表達作為參照。實施例7由PDX-1siRNA誘導的多種腫瘤細胞凋亡以及使用流式細胞術測定ArmexinV的結合采用乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌相關的細胞株(MCF-7、T-47D(購自ATCC)、SK-BR-3、MiaPaCa-2、SK-OV-3、PC3(購自ATCC))以及使用端粒酶永生化的人胚胎成纖維細胞(BJ)。細胞被放置為5xl()5細胞/60mni板。在一夜的孵育之后使用Dharmafect2siRNA轉染制劑轉染，為達到lOOnM的最終濃度，每板使用200ii1的2uMsiRNA。在轉染后72小時收獲細胞，在黑暗環(huán)境中用FITC-標記的A皿exinV孵育15分鐘，然后進行流式細胞術分析。上述每種細胞株以及胰腺癌細胞(MiaPaCa-2)均被制備成未轉染、siControl以及PDX-lsiRNA590(siPDX-1-590;SEQIDNo:14)組。結果顯示在圖3中，上述各種腫瘤細胞由于高表達PDX-l，siRNA干擾PDX-l表達后細胞廣泛凋亡；只有成纖維細胞(BJ)顯示對PDX-1的抑制抵抗。實施例8直接觀察siRNA處理的細胞的死亡使用合成siRNA來抑制PDX-1的表達并誘導細胞凋亡。大約5X105的UKP緒-1，PANC-1，MiaPaCa-2或LN-CaP(人前列腺癌細胞)被放置在60ram直徑的培養(yǎng)皿中并在標準條件下培養(yǎng)一夜。使用DharraafectsiRNA轉染試劑，用SEQIDNo:14的2yMsiRNA600nL或SEQIDNo:18的siControl轉染細胞。最終的siRNA濃度為100nM。未處理的細胞培養(yǎng)株用作附加的對照。對使用合成si脂A來抑制PDX-1表達的細胞培養(yǎng)進行顯微鏡檢査和直接目測，發(fā)現(xiàn)細胞幾乎完全死亡。相反的，與對照siRNA孵育的細胞以及未處理的細胞卻沒有或僅有少量死亡。如果把siRNA轉染的當天作為第一天，在第四天(siRNA轉染后72小時)左右開始出現(xiàn)最初的細胞死亡。在第六天幾乎100%的細胞死亡。實施例9RT-PCR分析PDX-1siRNA590轉染的MiaPaCa2細胞PDX-1的表達前述合成的siRNA被用來阻止培養(yǎng)細胞的PDX-1表達。大約5X105MiaPaCa2細胞被放在60mm直徑的培養(yǎng)皿中并在標準條件下培養(yǎng)一夜。細胞接著被SEQIDNo:14的PDX-1siRNA或SEQIDNo:18的對照siRNA孵育轉染。在轉染后24，48以及96小時細胞溶解，總RNA被分離，并使用定量RT-PCR分析所述的PDX-1siRNA降低PDX-1mRNA水平的有效性，結果如圖4所示，在第2天和第4天，PDX-1mRNA水平有統(tǒng)計學意義的下降。實施例IO觀察PDX-1siRNA處理的腫瘤細胞的凋亡前述合成的siRNA被用來阻止培養(yǎng)細胞的PDX-1表達并誘導細胞凋亡。約5X105UK-PAN1胰腺癌細胞、LN-CAP前列腺癌細胞或非癌細胞3T3被放在60mm的直徑的培養(yǎng)皿中并在標準條件下培養(yǎng)一夜。接下來使用PDX-1siRNA590(SEQIDNo:14)或對照siRNA(SEQIDNo:18)對細胞進行轉染。未處理的細胞用作進一步的對照。結果如圖5A-C所示，胰腺癌細胞和前列腺癌細胞被所述PDX-1siRNA(見圖中右列)殺死，但不受對照siRNA(見圖中左列)的損害，非癌細胞幾乎不受PDX-1siRNA的影響。實施例11重組穿梭質粒的構建1.pRNAi-shuttle-shRNA的構建分別以實施例1中4個靶點序列為正義鏈(S叫M)，以其互補鏈為反義鏈(SeqM)，分別在正、反義鏈之間加入反向互補序列Loop(TTCAAGAGA)，形成5，-SeQ正向-Loop-Seq反向-3'的結構，并且分別在正義鏈5'端引入BamHI酶切位點，在反義鏈3，端引入RNApolIII終止子(polyT終止子，TTTTTT)禾QHindlll酶切位點，從而形成用于表達人PDX-1shRNA的寡核苷酸模板(DNAoligo)。上述的模板雙鏈經退火后雜交，形成shRNA結構，以BamHI和Hindlll酶切后克隆入載體pRNAi-shuttle(見圖6和圖13，原始質粒購自美國Invitrogen公司，采用常規(guī)方法加入了hU6(人源U6)啟動子，BamHI和Hindlll酶切位點)的BamHI和Hindlll酶切位點內(在hU6啟動子和PolIII終止子之間)，獲得含有目的基因的克隆載體。根據PDX-l靶基因位點的不同，制備的克隆載體分別被命名為pRNAi-shuttle-shRNA590、pRNAi-shuttle-shRNA592、p瞧i-shuttle-s國A651、pRNAi-shuttle-shRNA653、p畫i-shuttle-shRNA(-)siControl。2.重組腺病毒表達載體的構建與克隆重組腺病毒表達載體的構建與克隆的基本流程見圖8。將前述構建的含有目的基因的克隆載體pRNAi-shuttle-shRNA590、p腿i-shuttle-sh腿592、pRNAi-shuttle-s畫A651、pRNAi-shuttle-sh廳653、pRNAi-shuttle-s國A(-)siControl，分別與pAd/BLOCK-iT-DEST載體(見圖7，購自Invitrogen公司)進行LR重組反應，獲得攜帶相應sh脂A的重組載體。將所獲得的重組載體轉化入大腸桿菌TopIO(購自美國Invitrogen公司)，氨節(jié)青霉素陽性LB平板上篩選陽性克隆。從獲得的陽性克隆中抽提重組腺病毒表達載體。然后進行PCR鑒定，用于鑒定的引物為正向5，GGAACCAATTCAGTCGACGAATTC3，(SEQIDNo:12);反向5，GCTGGGTCTAGACCAAGCTTTTCC3，(SEQIDNo:13);經PCR和測序鑒定，獲得了正確的重組腺病毒表達載體。3.重組PDX-lshRNA腺病毒的產生及滴度的測定1)將重組腺病毒表達載體用PacI酶切，采用常規(guī)的DNA純化試劑盒利用酚氯仿提取法純化消化過的質粒DNA，并抽提純化質粒。2)采用LipofectamineTM2000將消化后的載體轉染293A細胞(購自ATCC);直到80Q/。CPE(細胞病變效應)出現(xiàn)時(一般在轉染后10-13天)收獲含病毒的細胞和培養(yǎng)液，反復凍融后離心獲得病毒原液。3)通過病毒原液感染293A細胞進行病毒擴增，收獲病毒原液后采用高速離心法濃縮純化病毒，并采用QuickTiterTM腺病毒滴度測定試劑盒(購于美國CellBiolabs公司)測定滴度。利用Lipofectaraine2000轉染293A細胞得到重組PDX-1shRNA腺病毒，通過病毒原液感染293A細胞進行病毒擴增，擴增病毒滴度經測定可達1X108—9噬菌體形成單位(plaque-formingunits,pfu)/ml，再經常規(guī)的高速離心方法可純化至1X1010—Vu/ml。分別獲得表達s麗A590、s函A592、sh腿651、shRNA653的腺病毒，以及對照攜帶shRNA((-)siControl)的腺病毒。實施例12重組PDX-1shRNA腺病毒制劑所述的重組PDX-1shRNA腺病毒制劑的配制如表1。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>實施例13重組PDX-1shRNA腺病毒體外抗腫瘤效應觀察采用含10%胎牛血清的畫EM培養(yǎng)液，按常規(guī)細胞培養(yǎng)法于5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)人胰腺癌Pane-1細胞和MiaPaca-2細胞，采用含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液培養(yǎng)人卵巢癌SK0V3細胞，人肝癌S廳C7721細胞，人乳腺癌MDA-MB-435s細胞和人胃癌SGC7901細胞(人卵巢癌SK0V3細胞、人胰腺癌MiaPaca-2、Panc-1細胞購自中科院上海細胞庫；人肝癌S顧C7721細胞、人胃癌SGC7901細胞購自中科院北京細胞中心；人乳腺癌高轉移MDA-MB-435s細胞購自鄭州大學。細胞培養(yǎng)所需高糖DMEM培養(yǎng)液，高糖1640培養(yǎng)液，非必需氨基酸，L-谷氨酰胺，雙抗(細胞培養(yǎng)用青霉素-鏈霉素)均購自Invitrogen公司)。將上述培養(yǎng)的細胞分別進行如下處理A)利用590腺病毒制劑分別感染上述6種細胞，同時以等量的表達無意義的shRNA((-)siControl)的腺病毒制劑作為陰性對照，感染后觀察細胞凋亡情況，結果見圖9，圖10和圖11。在圖9中，空白對照孔、陰性對照組由于腫瘤細胞生長旺盛，培養(yǎng)基顏色呈酸性改變(呈淺黃色)，而PDX-1基因阻斷組(陽性感染孔)因PDX-1基因阻斷導致細胞凋亡，因而培養(yǎng)基顏色呈正常培養(yǎng)基顏色(呈淺紅色)。圖IO和圖11顯微鏡觀察顯示當給予相同滴度病毒感染后，陰性對照組細胞生長旺盛，鋪滿平板。而PDX-1基因阻斷組(陽性感染組)腫瘤細胞大部分或近乎全部凋亡。上述體外實驗結果顯示，陽性組的腫瘤細胞近乎100%調亡，而對陰性組和空白組的腫瘤細胞影響很小。B)RT-PCR和WesternBlot分析PDX-1的表達阻斷效應。此外，發(fā)明人還培養(yǎng)乳腺癌MDA-MB-435S細胞，前列腺癌pc-3細胞，乳腺癌MDA-MB-231細胞，肺癌A549細胞，宮頸癌hela細胞，肝癌7721細胞，比較觀察采用590腺病毒制劑和shRNA((-)siControl)腺病毒處理后細胞的變化。結果見圖12。由圖12可見，對照shRNA((-)siControl)腺病毒處理組對于乳腺癌MDA-MB-435S細胞，前列腺癌pc-3細胞，乳腺癌MDA-MB-231細胞，肺癌A549細胞，宮頸癌hela細胞，肝癌7721細胞的生長無明顯抑制，而590腺病毒制劑處理組可顯著抑制乳腺癌MDA-MB-435S細胞，前列腺癌pc-3細胞，乳腺癌MDA-MB-231細胞，肺癌A549細胞，宮頸癌hela細胞，肝癌7721細胞的生長。實施例14重組PDX-1shRNA腺病毒體內抗腫瘤效應觀察6周齡雌性裸鼠，購自河南省動物實驗中心。5乂106個人胰腺癌細胞系MiaPaCa-2、卵巢癌細胞系SK0V3于PBS中在右側肋腹(flanking)皮下注射給裸鼠。腫瘤在數(shù)周內可達100-500mm3，表示模型建立成功。將荷瘤鼠隨機分三組，第一組為治療組，第二組為病毒對照組，第三組為PBS對照組，于腫瘤接種部位內分別注0.lml的lX109pfu590腺病毒制劑、0.lml的lX109pfu651腺病毒制劑、lX109pfushRNA((-)siControl)的腺病毒和PBS，測量腫瘤體積，計算抑瘤率以及相關機制研究。結果發(fā)現(xiàn)，在注射590腺病毒制劑和651腺病毒制劑后，治療組小鼠的腫瘤體積顯著減小，且對于小鼠未見有毒性影響；而病毒(-)siControl對照組以及PBS對照組小鼠的腫瘤體積非但沒有減小，還有一定的增加。在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。序列表<H0〉鄭州威瑞生物技術有限公司<120〉一種抗腫瘤的腺病毒制劑<130>056423<160〉18<170〉Patentlnversion3.3〈210>1〈2n〉1527〈212>DNA<213>智人(HomoSapies)<400〉1aaagcgagcaagctcccgactgaacggcgaagcgaggcccagcccccgccgccccccggaaccttcaccacggagggagcggatgaagtccggagccggatgg柳aggatcatgttgEiaggaaaaaggacggagcctgacgccgccccctgccgcctggaaccEicgatggagcagagggggcaattgcgcagttggggctttgtagtatcacatccctggctgggccgsggaMacagtggggtggcgctcccggctccggagcagtacggcgccggaggccgccgccgcatctccccgccacctcccgcgsgccgggctaccaaagctggagaacaaggttcctattccttgaccgagggaggacaaggcsggactgccggaggtgctccttagcgcg柳ggcaggacctaggaggagggcccacctcccgcgggtatggggccctcccctcctacagaaactgtacgtaccttaatgagtcctcctcgggagtgggcggctcccggtacgcggccattcagcgccacacccgttcctacgaggtgcgctcagctcggtcctggsggcacgcgtggacggscgcgcaaac犯gtacaagac3C3tcaaagcgcggcggccgtgacctgtgccgcccgtcgccacagcgctgctcctgccccgggcgttagaccgaaggatgccggcattttagtgatgcactccacccstacacattctgccataas3tgtUg3gtcttcctc犯cgccacacctcccggtgccgcagctttagcccccctgcctggcgccctcccccctcgccgctcccccaagcccaaccgaaggccagtgcggcctacactctcacggccagatctggUgcgggacagcccggcg鄉(xiāng)3ctgcccccgtcctccagcgtgctgaggggcggaccacccggggaaaacccggccUccggactggattggttgggacctgggaaggctccgccattcttaagtgccaaatccaatcccggcaaggacccagtgcctgtacgggcgcgctgcgacgacccccccgcccgcccgtccagctgggcaggcggcgcgcgcacaggcgccgggtgccsaaaccgctgtcgggggtgcttctggcgtgccgcccgacgcgcctcggttcaaccactccctggcagtgctctctcagcgttgtttgttttagagaagctaacacacactcgggcgaccccgtgaaatccccggctccgccgcagccatgcgcgttccatgggccgccgcggtggcgcgggcccttcccctttcccatgcctacgctgctgctagagcgagctggctgcgcatgaagtggcggggtcgctgccgccgcgagggccgcccggccgcaggcgccgaggagtgaatggggcgcgcatgtgcgccattggUggctgttgcgccggctxttccagcgggg犯ccctttaagttg3tgCC3gt60120180240300360420480540600660720780840900960102010801140120012601320腦144015001527〈210〉2<211〉283〈212〉PRT〈213〉智人(HomoSapies)<400>2MetAsnGlyGluGluGinTyrTyrAlaAlaThrGinLeuTyrLysAsp151015ProCysAlaPheGinArgGlyProAlaProGluPheSerAlaSerPro202530ProAlaCvsLeuTyrMetGlyArgGinProProProProProProHis354045ProPheProGlyAlaLeuGlvAlaLeuGluGinGlySerProProAsp505560lieSerProTyrGluValProProILeuAlaAspAspProAlaValAla65707580HisLeuHisHisHisLeuProAlaGinLeuAlaLeuProHisProPro859095AlaGlyProPheProGluGlyAlaGluProGlyValLeuGiuGluPro100105110AsnArgValGinLeuProPheProTrpMetLysSerThrLysAlaHis115120125AlaTrpLysGlyGinTrpAlaGlyGlyAlaTyrAlaAlaGluProGlu130135140GluAsnLysArgThrArgThrAlaTyrThrArgAlaGinLeuLeuGlu145150LeuGluLysGluPheLeuPheAsnLys165ValGluLeuAlaValMetLeuAsnLeu180185TrpPheGinAsnArgArgMetLysTrp195200ArgGlyGlyGlyThrAlaValGlyGly210215GinAspCysAlaValThrSerGlyGlu225230ProProProProGlyGlyAlsValPro245ArgGluGlyArgLeuProProGlyLeu260265SerValAlaProArgArgProGinGlu275280<210>3〈211〉19〈212>腿<213>智人(HomoSapies)<400〉3agttcctattcaacaagta<210>4<211>19<212>廳<213>智人(HomoSapies)<400>4agttcctattcaacaagta<210>5<211>19〈212>DNA<213>智人(HomoSapies)<400>5cttgaccgagagacacatc〈210〉6<211〉19<212〉腿〈213〉智人(HomoSapies)<400>6tgaccgagagacacatcaa<210>7〈211〉18<212〉腿〈213〉人工序列〈400〉7actaccgttgtataggtg<210>8<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><221〉misc_feature〈223〉引物—155160TyrlieSerArgProArgArg170175ThrGluArgHislieLyslie190LysLysGluGluAspLysLys205GlvGlyValAlaGluProGlu220GluLeuLeuAlaLeuProPro235240ProAlaAlaProValAlaAla250255SerAlsSerProGinProSer270ProArg19191919<400>8agccggaggagaacaagc<210>9<211>20〈212〉DNA<213>人工序列<220〉<221>miscfeature<223〉引物—<400>9ttcaacatgacagccagctc<210>10<211>18〈212〉DNA<213>人工序列〈220〉<221>raisefeature<223>引物—<400>10a.gccggaggagaacaagc<210〉11〈211〉20<212>DNA<213>人工序列<220〉<221>miscfeature<223>引物<400〉11ttcaacatgacagccagctc<210>12〈211>24<212〉腿<213>人工序列<220〉<221〉miscfeature<223>引物—<400〉12gga.a,ccaattcagtcgacga<210>13<211〉24<212〉DNA<213〉人工序列<220><221>miscfeature〈223〉引物一<400>13gctgggtctagaccaagctt<210>14〈211〉21<212>隨<213〉人工序列<220><221>miscfeature<223>小干玩RNA<400〉14ag叫ccuauucaacaaguauu21<210>15<211>21<212〉■<213>人工序列<220〉<221〉misc—feature<223>小干玩RNA<400〉15uuccuauucaacaaguacauu21<210>16<211>21〈212〉RNA<213〉人工序列<220〉<221〉raise—feature<223>小千玩RNA〈400〉16cuugaccgagagacacaucuu21<210>17<211>21〈212〉隨〈213〉人工序列<220><221〉misc—feature<223>小千玩RNA<400>17ugaccgagagacacaucaauu21<210〉18<211>20<212〉腿〈213〉人工序列〈220〉<221〉misc—feature<223>小+玩RNA〈400〉18acuaccguuguauagguguu20權利要求1.一種可抑制PDX-1表達的構建物，其特征在于，所述的構建物具有以下式I結構Seq正向-X-Seq反向式I，式I中，Seq正向為可與PDX-1基因上任一區(qū)域基本互補且與PDX-1基因以外的人基因均不互補的核苷酸序列，Seq反向為與Seq正向基本互補的核苷酸序列，或者，Seq反向為可與PDX-1基因上任一區(qū)域基本互補且與PDX-1基因以外的人基因均不互補的核苷酸序列，Seq正向為與Seq反向基本互補的核苷酸序列，X為位于Seq正向和Seq反向之間的間隔序列，并且所述間隔序列與Seq正向和Seq反向不互補，式I所示的結構在轉入細胞后，形成式II所示的二級結構式II中，Seq正向、Seq反向和X的定義如上述，||表示在Seq正向和Seq反向之間形成的氫鍵。2.如權利要求1所述的構建物，其特征在于，所述的Seq^或Seq^選自下組:(a)具有SEQIDNo:3所示的核苷酸序列或其互補序列；(b)具有SEQIDNo:4所示的核苷酸序列或其互補序列；(c)具有SEQIDNo:5所示的核苷酸序列或其互補序列；或(d)具有SEQIDNo:6所示的核苷酸序列或其互補序列。3.—種重組載體，其特征在于，所述的載體中含有權利要求l所述的構建物。4.一種重組的腺病毒，其特征在于，所述的腺病毒的基因組中含有一重組表達盒，所述的重組表達盒含有權利要求1所述的構建物。5.如權利要求4所述的腺病毒，其特征在于，所述的重組表達盒從5'至3'依次含有以下元件RNA聚合酶III啟動子；權利要求l所述的構建物；和終止子。6.權利要求4所述的腺病毒的用途，其特征在于，用于制備治療PDX-1基因高表達相關疾病的藥物。7.如權利要求6所述的用途，其特征在于，所述的PDX-1基因高表達相關疾病是腫瘤。8.如權利要求7所述的用途，其特征在于，所述的腫瘤選自鱗狀細胞癌；基底細胞癌；移行細胞癌；腺癌；胃泌素瘤；膽管細胞癌；肝細胞腺瘤；肝細胞癌；腎細胞癌；黑色素瘤；纖維肉瘤；粘液肉瘤；脂肪肉瘤；平滑肌肉瘤；橫紋肌肉瘤；畸胎瘤；血管肉瘤；Kaposi肉瘤；淋巴管肉瘤；骨瘤；骨肉瘤；成骨肉瘤；軟骨肉瘤；腦脊膜瘤；非霍奇金淋巴瘤；霍奇金淋巴瘤；白血病。9.一種藥物組合物，其特征在于，所述的藥物組合物包含有效量的權利要求4所述的腺病毒；和與所述腺病毒相容的載體。10.—種治療腫瘤的方法，其特征在于，所述方法包括給予腫瘤患者有效量的權利要求4所述的腺病毒。全文摘要本發(fā)明公開了一種可通過抑制PDX-1表達而抑制腫瘤的siRNA以及基于所述siRNA序列設計的重組腺病毒。本發(fā)明還提供了含有所述腺病毒的藥物組合物。本發(fā)明所述的重組腺病毒具有產生滴度高、不整合到宿主基因組、安全性高的優(yōu)點。文檔編號C07H21/04GK101348512SQ20071004409公開日2009年1月21日申請日期2007年7月20日優(yōu)先權日2007年7月20日發(fā)明者韓志強申請人:鄭州威瑞生物技術有限公司