專利名稱：：亞血紅素短肽化合物及在抗白內(nèi)障藥物制備中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明提供一種亞血紅素短肽化合物，同時(shí)還提供了其在治療白內(nèi)障疾病中的醫(yī)藥用途，屬于生物制藥
技術(shù)領(lǐng)域：
。本發(fā)明所涉及的亞血紅素短肽化合物，是以鐵卟啉為輔基的微過氧化物酶，包括由細(xì)胞色素C(CytC)水解而來的八肽(簡稱MP-8)、九肽(簡稱MP-9)、十一肽(簡稱MP-11)。它們均含有共價(jià)結(jié)合的亞血紅素，并在肽段中含有一個(gè)組氨酸殘基，人們發(fā)現(xiàn)它們是一類很好的過氧化物酶模擬物。它們具有較好的抗氧化活性。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明公開了一種亞血紅素短肽化合物，是一種新的化合物。本發(fā)明還提供了亞血紅素短肽化合物在抗白內(nèi)障藥物制備中的用途。本發(fā)明所說的亞血紅素短肽化合物包括亞血紅素(Deuterohemin，用Dh表示)、短肽(用e-Ala-His-X-Lys表示)；其中，X可以是Thr-Val-Glu或其中的任意一個(gè)氨基酸用其相應(yīng)的e-氨基酸、Y-氨基酸代替的氨基酸序列。亞血紅素與短肽間的連接方式是亞血紅素上的羧基與肽鏈上的氨基以酰胺鍵相連。上述結(jié)構(gòu)可以是單體，即亞血紅素上的兩個(gè)羧基之一與肽鏈連接，兩種單體形式為同分異構(gòu)體，結(jié)構(gòu)如A.、B所示；本發(fā)明中化合物的制備方法以本領(lǐng)域技術(shù)人員所通常的Fmoc固相肽合成法合成。原料及試劑接肽樹脂為RinkAmideMBHA樹脂。氨基酸衍生物為Fmoc-P-Ala-0H、
背景技術(shù)：
CO-0-Ala-扭s-x-LysFmoc-His(Trt)_0H、Fmoc-Thr(But)-OH、Fmoc-P-Thr(But)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Glu(otBu)-0H、Fmoc-Y-Glu(otBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-0H。偶聯(lián)反應(yīng)縮合劑為苯駢三唑-1-氧-三(二甲氨基)磷六氟磷酸鹽(B0P)、1-羥基苯駢三氮唑(HOBT)、N-甲基嗎啉(N麗)。脫保護(hù)劑為20。/。哌啶/DMF溶液。切割試劑為三氟乙酸。樹脂用DMF溶脹30分鐘，然后脫保護(hù)20分鐘，用DMF洗滌，反應(yīng)器中加入氨基酸衍生物及縮合劑，室溫反應(yīng)2小時(shí)，洗滌，再脫保護(hù)，加入氨基酸衍生物及縮合劑，重復(fù)進(jìn)行至接上所有的氨基酸。反應(yīng)器中再加入切割試劑，室溫反應(yīng)l小時(shí)，后過濾，濾液在乙醚中沉淀，得粗品。粗產(chǎn)品的純化采用高效液相色譜法進(jìn)行純化。洗脫液為三氟乙酸水溶液，乙腈。流速為20ml/min,監(jiān)測波長為214咖。本發(fā)明的化合物具有清除自由基抑制白內(nèi)障形成的活性，按照常規(guī)的制藥技術(shù)，可以將其制備成任何一種常規(guī)藥劑，例如片劑、丸劑、膠囊劑、沖劑、噴霧劑、口服液、混懸液、透皮吸收劑、注射劑等。做為含有本發(fā)明化合物組合藥，其組成為含有治療有效量的本發(fā)明化合物，所說的化合物在藥物組合物當(dāng)中可以是單獨(dú)使用，也可以與其他藥物配合使用。本發(fā)明的藥物組合物除了含有上述化合物之外，還含有常規(guī)的藥物賦形劑，例如粘合劑、崩解劑、填充劑、潤滑劑、調(diào)味劑、增溶劑、溶劑、防腐劑等。以下藥理實(shí)驗(yàn)證明本發(fā)明具有治療白內(nèi)障的藥理活性和醫(yī)療效果實(shí)驗(yàn)例1、亞血紅素短肽化合物D廣D4對(duì)大鼠晶狀體細(xì)胞體外抗白內(nèi)障的保護(hù)作用據(jù)統(tǒng)計(jì)，在60歲以上的老年群體中，不同程度的老年性白內(nèi)障眼病發(fā)病率接近100%。老年性白內(nèi)障是晶狀體在老化過程當(dāng)中逐漸發(fā)生蛋白質(zhì)變性，使晶體由透明狀態(tài)變成渾濁或不透明狀態(tài)的結(jié)果。老年性白內(nèi)障的發(fā)病機(jī)理非常復(fù)雜，為多種因素共同作用的結(jié)果。目前多數(shù)研究認(rèn)為氧自由基損傷是老年性白內(nèi)障形成的首位危險(xiǎn)因素，許多實(shí)驗(yàn)表明氧化損傷發(fā)生在晶狀體渾濁之前。硒模型是簡單快速、可重復(fù)的通過氧化損傷而致晶狀體渾濁的白內(nèi)障模型。0stadaiova等于1978年首先報(bào)道了給大鼠乳鼠一次注射亞硒酸鈉溶液可誘發(fā)大鼠產(chǎn)生間歇性核性白內(nèi)障，此后亞硒酸鈉逐漸成為誘導(dǎo)老年性白內(nèi)障模型的典型藥物，用硒模型模擬老年性白內(nèi)障，探討老年性白內(nèi)障的發(fā)病機(jī)理和防治方法。正常人晶狀體房水中仏02的濃度為23-30剛ol/L，而幾乎所有白內(nèi)障患者的房水HA均高于正常人，平均值為82Wiiol/L，最高可達(dá)663Mmol/L。實(shí)驗(yàn)表明高濃度的過氧化氫能夠100%的誘導(dǎo)培養(yǎng)晶狀體發(fā)展為白內(nèi)障。用亞硒酸鈉和過氧化氫作為誘導(dǎo)劑，建立了亞硒酸鈉體外誘導(dǎo)白內(nèi)障模型和過氧化氫體外誘導(dǎo)白內(nèi)障模型，觀察D廣D4的抗氧化效果，同時(shí)進(jìn)一步探討白內(nèi)障的發(fā)病機(jī)理和防治途徑。1.DlD4對(duì)亞硒酸鈉誘導(dǎo)白內(nèi)障的保護(hù)作用在60幽亞硒酸鈉條件下，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長，晶狀體最終發(fā)展成為白內(nèi)障，而空白對(duì)照組和給藥組晶狀體仍然透明澄清。表1亞硒酸鈉誘導(dǎo)晶狀體持續(xù)培養(yǎng)的形態(tài)觀察結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>2.Dl~D4對(duì)過氧化氫誘導(dǎo)白內(nèi)障的保護(hù)作用在100MM過氧化氫條件下，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長，晶狀體最終發(fā)展成為白內(nèi)障，而空白對(duì)照組和給藥組晶狀體仍然透明澄清。表2過氧化氫亞硒酸鈉誘導(dǎo)晶狀體持續(xù)培養(yǎng)的形態(tài)觀察結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>D4IIIII實(shí)驗(yàn)例2、本實(shí)驗(yàn)通過大鼠半乳糖白內(nèi)障模型，以白內(nèi)停為陽性對(duì)照藥，探討亞血紅素短肽化合物D1D4抗白內(nèi)障的作用，為其開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。1.材料與方法1.l動(dòng)物Wistar大鼠，雄性，體重250280g，由吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)SCXK-2002-0001。1.2藥物、試劑亞血紅素短肽化合物D1D4，吉林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院研制提供，以生理鹽水配制所需濃度使用；超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MM)、蛋白質(zhì)(雙縮脲法)測定試劑盒，為南京建成生物工程所產(chǎn)品，批號(hào)分別為20060618、20060622、20060624。1.3實(shí)驗(yàn)方法1.3.1實(shí)驗(yàn)分組將雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為組,每組10只。分別為空白組、模型組(半乳糖白內(nèi)障組)、給藥組(亞血紅素短肽化合物D1D4)、陽性藥組(白內(nèi)停組)。其中空白對(duì)照組、模型組腹腔注射生理鹽水20ml/kg，給藥組按9.0、6.0、3.0ug/眼劑量滴眼給藥。2.結(jié)果2.1亞血紅素短肽化合物D1D4滴眼給藥對(duì)大鼠白內(nèi)障晶狀體混濁的發(fā)生時(shí)間。結(jié)果見表1。D1D4按9.0、6.0、3.0ug/眼劑量滴眼給藥能明顯延緩大鼠晶狀體混濁的發(fā)生時(shí)間，延遲大鼠白內(nèi)障的發(fā)生，并且藥效強(qiáng)于陽性藥(白內(nèi)停)。表lD1D4對(duì)大鼠晶狀體混濁發(fā)生時(shí)間的影響_組別_眼數(shù)(只)混濁發(fā)生時(shí)間(天)對(duì)照組20模型組20Dl高劑量組20Dl中劑量組20Dl低劑量組20D2高劑量組20D2中劑量組20D2低劑量組20D3高劑量組207.80±0.699.02±0.97*'8.85±0.85"8.61±0.78*9.13±0.93*'8.74土0.8r8.53±0.76*9.34±0.95"D3中劑量組D3低劑量組D4高劑量組D4中劑量組D4低劑量組白內(nèi)停2020202020208.91±0.88*8.72±0.69*9.69±0.91*8.87±0.83*8.63±0.71*8.94±0.92**與模型組比較卞〈0.05,"P<0.012.2亞血紅素短肽化合物D1D4滴眼給藥對(duì)大鼠白內(nèi)障晶狀體混濁程度的影響觀察記錄實(shí)驗(yàn)第22天各組大鼠晶狀體混濁情況。結(jié)果見表2，D1D4按9.0、6.0、3.0ug/眼劑量滴眼給藥，能明顯抑制大鼠白內(nèi)障晶狀體混濁度的發(fā)生的發(fā)展，藥效優(yōu)于對(duì)照藥(白內(nèi)停)。表2D1D4對(duì)大鼠白內(nèi)障晶狀體混濁程度的影響組別眼數(shù)(只)晶狀體混濁程度0III對(duì)照組Dl高劑量組Dl中劑量組Dl低劑量組D2高劑量組D2中劑量組D2低劑量組D3高劑量組D3中劑量組D3低劑量組D4高劑量組D4中劑量組D4低劑量組白內(nèi)停20202020202020202020202020202020010761066108597590410111010121010101111101070**:16(f2*'4*2*氺4*2*4*0*3*5*與模型組比較*P<0.05，**P<0.01,***P<0.001，2.4亞血紅素短肽化合物D1D4腹腔注射對(duì)大鼠白內(nèi)障晶狀體混濁的發(fā)生時(shí)間。結(jié)果見表4。D1D4按9.0、6.0、3.0"g/只劑量腹腔注射能明顯延緩大鼠晶狀體混濁的發(fā)生時(shí)間，延遲大鼠白內(nèi)障的發(fā)生，并且藥效強(qiáng)于陽性藥(白內(nèi)停)(表4D1D4腹腔注射對(duì)大鼠晶狀體混濁發(fā)生時(shí)間的影響組別眼數(shù)(只)混濁發(fā)生時(shí)間(天)對(duì)照組模型組Dl高劑量組Dl中劑量組Dl低劑量組D2高劑量組D2中劑量組D2低劑量組D3高劑量組D3中劑量組D3低劑量組D4高劑量組D4中劑量組D4低劑量組白內(nèi)停2020202020202020202020202020207.80±0.698.99±0.94**8.92±0.80材8.87±0.71*9.03±0.56"8.94±0.76**8.85±0,68*9.18±0.46**9.04±0.63**8.96±0.71*9.09±0,376:8.86±0.58林8.48±0.58*8.94±0.92*:與模型組比較*P〈0.05，"P〈0.012.5亞血紅素短肽化合物D1D4腹腔注射對(duì)大鼠白內(nèi)障晶狀體混濁程度的影響觀察記錄實(shí)驗(yàn)第22天各組大鼠晶狀體混濁情況。結(jié)果見表5，D1D4按9.0、6.0、3.0ug/只劑量腹腔注射能明顯抑制大鼠白內(nèi)障晶狀體混濁度的發(fā)生的發(fā)展，藥效優(yōu)于對(duì)照藥(白內(nèi)停)。表5D1D4腹腔注射對(duì)大鼠白內(nèi)障晶狀體混濁程度的影響組別眼數(shù)(只)晶狀體混濁程度0III對(duì)照組20200模型組200416Dl高劑量組20128***Dl中劑量組20910l科Dl低劑量組208102*D2高劑量組20119D2中劑量組D2低劑量組D3高劑量組D3中劑量組D3低劑量組D4高劑量組D4中劑量組D4低劑量組白內(nèi)停202020202020202020981198109891010910910910712*3*(T2*2*4*與模型組比較*P〈0.05，**P〈0.01，，〈0.001，2.6亞血紅素短肽化合物D1D4腹腔注射對(duì)大鼠白內(nèi)障晶狀體SOD、GSH-Px活性及GSH、MDA含量的影響結(jié)果見表6，D1D4按9.0、6.0、3.0ug/只劑量腹腔注射能明顯能明顯降低大鼠白內(nèi)障晶狀體脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物一丙二醛(MM)的含量，明顯提高白內(nèi)障晶狀體超氧化物歧化酶(S0D)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性，及谷胱甘肽(GSH)的含量。并且作用強(qiáng)于陽性藥(白內(nèi)停)。表6D1D4腹腔注射對(duì)大鼠白內(nèi)障晶狀體S0D、GSH-Px活性及GSH、MDA含量的影響組別動(dòng)物數(shù)(只)S0DGSH-PxGSHMDA(NU/g蛋白)(U/g蛋白)(utnol/g蛋白)(nmol/g蛋白)對(duì)照組10281.21±11.25**1.84士0.29"模型組10201.28±16.870.84±0.092Dl高劑量組10326.54±17.01***2.94土0.40'Dl中劑量組10313.25±15.l(T2.81±0.45***Dl低劑量組10301.21±13.14**D2高劑量組10328.67±16.89D2中劑量組10309.35±15.77*D2低劑量組10301.54±13.74**D3高劑量組10319.63±16.57D3中劑量組10309.39±15.41*D3低劑量組10302.31±14.12**D4高劑量組10331.45±17.24**D4中劑量組10323.36±15.14*2.68±0.4廣*3.01±0.36*2.76±0.25林2.59±0.37****2.89±0.37*:2.82土0.52**2.57±0.51w3.06±0.54林*:2.89±0.55**2.78±0.42w08±0.4320."4.21±0.61'4.02±0.46"3.97±0.41w'4.39±0.5『3.98±0.52"3.86±0.38*"'4.36±0.58糊4.15±0.39*'3.86±0.58**'4.22±0.53***4.13±0.38*'7.87±1.08w13±1.94**10.12±1.42*:*12.13±1.23**13.10±1.4『*10.36±1.22****12.35士1.76科13.24±1.67*料10.35±1.282**12.04.22***13.46±1.38w10.24±1.362w*12.03±1.32**D4低劑量組10310,35±14.29w2.63±0.38***3.93±0.15***13.15±1.33***白內(nèi)停10214.52土15.120.95±0.122.25±0.6718.14±2.84與模型組比較*P〈0.05,，<0.O廣IXO.001結(jié)論試驗(yàn)結(jié)果證明D1D4按9.0、6.0、3.0yg/眼劑量滴眼給藥，以及按9.0、6.0、3.0ug/只劑量腹腔注射。1.能明顯延緩大鼠白內(nèi)障晶狀體混濁的發(fā)生時(shí)間。2.能明顯減輕白內(nèi)障晶狀體混濁程度。3.能明顯降低白內(nèi)障晶狀體脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物一丙二醛(MDA)的含量。4.可明顯提高白內(nèi)障晶狀體超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性，及谷胱甘肽(GSH)的含量。表明D1D4能顯著延遲大鼠白內(nèi)障的發(fā)生，抑制白內(nèi)障晶狀體混濁程度的發(fā)展，藥效優(yōu)于對(duì)照藥(白內(nèi)停)。D1D4可通過降低白內(nèi)障晶狀體脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA，提高抗氧化酶(S0D、GSH-Px)活性，及谷胱甘肽的含量，達(dá)到防治白內(nèi)障的目的。圖1為本發(fā)明化合物D1D4的質(zhì)譜圖，分子量為1227.1。具體實(shí)施例方式下面的實(shí)施例，可以更詳細(xì)地說明本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。實(shí)施例1Dl(Dh-Ala-His-e-Thr-Val-Glu-Lys)的固相合成原料Fmoc-P-Ala-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Thr(But)-OH、Fmoc-e-Val-OH、Fmoc-Glu(otBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-0H偶聯(lián)反應(yīng)縮合劑為苯駢三唑-1-氧-三(二甲氨基)磷六氟磷酸鹽(BOP)、卜羥基苯駢三氮唑(HOBT)、N-甲基嗎啉(N醒)。脫保護(hù)劑為20。/。哌啶/DMF溶液。切割試劑為三氟乙酸。反應(yīng)稱取RinkAmideMBHA樹脂，樹脂在DMF中室溫溶脹30分鐘，用DMF洗滌三次。加入20。/。哌啶/DMF溶液，室溫反應(yīng)1小時(shí)脫保護(hù)。再用DMF洗滌三次，加入Fmoc-e-Ala-0H，室溫反應(yīng)3小時(shí)，后用DMF洗滌三次，加入20。/。哌啶/DMF溶液，室溫反應(yīng)l小時(shí)脫保護(hù)。再用DMF洗滌三次，再加入Fmoc-His(Trt)-0H，室溫反應(yīng)3小時(shí)，后用DMF洗滌三次，加入20。/。哌啶/DMF溶液，室溫反應(yīng)1小時(shí)脫保護(hù)，再用DMF洗滌三次。加入Fmoc-Thr(But)-0H，室溫反應(yīng)3小時(shí)，后用DMF洗滌三次，加入20%哌啶/函卩溶液，室溫反應(yīng)l小時(shí)脫保護(hù)，再用DMF洗滌三次。加入Fmoc-P-Val-0H,室溫反應(yīng)3小時(shí)，后用DMF洗滌三次，加入2(W哌啶/DMF溶液，室溫反應(yīng)1小時(shí)脫保護(hù)，再用DMF洗滌三次。加入Fmoc-Glu(otBu)-0H，室溫反應(yīng)3小時(shí)，后用DMF洗滌三次，加入20。/。哌啶/DMF溶液，室溫反應(yīng)1小時(shí)脫保護(hù)，再用DMF洗滌三次。加入Fmoc-Lys(Boc)-0H，室溫反應(yīng)3小時(shí)，后用DMF洗滌三次，加入2(m哌啶/DMF溶液，室溫反應(yīng)1小時(shí)脫保護(hù)，再用DMF洗滌三次。切割上述反應(yīng)的樹脂干燥后加入切割試劑三氟乙酸，室溫反應(yīng)2小時(shí)，過濾，濾液在乙醚中沉淀，干燥，得到粗產(chǎn)品。純化將粗品溶于水中，用Cw反相柱進(jìn)行純化，洗脫液為A相為0.WTFA水溶液，B相為乙腈，流速為20ml/min，檢測波長為214nm，收集主峰，凍干，得到純品。經(jīng)質(zhì)譜鑒定分子量為1227.1，與D1理論分子量相符(圖l)。實(shí)施例2D2(Dh-e-Ala-His-Thr-e-Val-Glu-Lys)的固相合成原料Fmoc-P-Ala-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-P-Thr(But)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Glu(otBu)-0H、Fmoc-Lys(Boc)-OH偶聯(lián)反應(yīng)縮合劑為苯駢三唑-l-氧-三(二甲氨基)磷六氟磷酸鹽(BOP)、1-羥基苯駢三氮唑(HOBT)、N-甲基嗎啉(NMM)。脫保護(hù)劑為20。/。哌啶/DMF溶液。切割試劑為三氟乙酸。反應(yīng)稱取RinkAmideMBHA樹脂，樹脂在DMF中室溫溶脹30分鐘，用DMF洗滌三次。加入20。/。哌啶/DMF溶液，室溫反應(yīng)1小時(shí)脫保護(hù)。再用DMF洗滌三次，加入Fmoc-e-Ala-0H，室溫反應(yīng)3小時(shí)，后用DMF洗滌三次，加入20。/。哌啶/DMF溶液，室溫反應(yīng)1小時(shí)脫保護(hù)。再用DMF洗滌三次，再加入Fmoc-His(Trt)-0H，室溫反應(yīng)3小時(shí)，后用DMF洗滌三次，加入20。/。哌啶/DMF溶液，室溫反應(yīng)1小時(shí)脫保護(hù)，再用DMF洗滌三次。加入Fmoc-Thr(But)-0H，室溫反應(yīng)3小時(shí)，后用DMF洗滌三次，加入20%哌啶/DMF溶液，室溫反應(yīng)l小時(shí)脫保護(hù)，再用DMF洗滌三次。加入Fmoc-Val-0H，室溫反應(yīng)3小時(shí)，后用DMF洗滌三次，加入20。/。哌啶/DMF溶液，室溫反應(yīng)1小時(shí)脫保護(hù)，再用DMF洗滌三次。加入Fmoc-Glu(otBu)-0H，室溫反應(yīng)3小時(shí)，后用DMF洗滌三次，加入20。/。哌啶/DMF溶液，室溫反應(yīng)1小時(shí)脫保護(hù)，再用DMF洗滌三次。加入Fraoc-Lys(Boc)-0H，室溫反應(yīng)3小時(shí)，后用DMF洗滌三次，加入20。/。哌啶/DMF溶液，室溫反應(yīng)1小時(shí)脫保護(hù)，再用DMF洗滌三次。切割上述反應(yīng)的樹脂干燥后加入切割試劑三氟乙酸，室溫反應(yīng)2小時(shí)，過濾，濾液在乙醚中沉淀，干燥，得到粗產(chǎn)品。純化將粗品溶于水中，用ds反相柱進(jìn)行純化，洗脫液為A相為O.P/。TFA水溶液，B相為乙腈，流速為20ml/min，檢測波長為214nm,收集主峰，凍干，得到純品。經(jīng)質(zhì)譜鑒定分子量為1227.1，與D2理論分子量相符(圖1)。實(shí)施例3D3(Dh-Ala-His-Thr-Val-Glu-Lys)的固相合成原料Fmoc-P-Ala-0H、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Thr(But)-OH、Fmoc-Val-OH、Fraoc-Y-Glu(otBu)-0H、Fmoc-Lys(Boc)-OH偶聯(lián)反應(yīng)縮合劑為苯駢三唑-l-氧-三(二甲氨基)磷六氟磷酸鹽(BOP)、1-羥基苯駢三氮唑(H0BT)、N-甲基嗎啉(NMM)。脫保護(hù)劑為20。/。哌啶/DMF溶液。切割試劑為三氟乙酸。反應(yīng)稱取RinkAmideMBHA樹脂，樹脂在DMF中室溫溶脹30分鐘，用DMF洗滌三次。加入20W底啶/DMF溶液，室溫反應(yīng)1小時(shí)脫保護(hù)。再用函F洗滌三次，加入Fmoc-e-Ala-OH，室溫反應(yīng)3小時(shí)，后用DMF洗滌三次，加入20。/。哌啶/DMF溶液，室溫反應(yīng)l小時(shí)脫保護(hù)。再用DMF洗滌三次，再加入Fmoc-His(Trt)-0H，室溫反應(yīng)3小時(shí)，后用DMF洗滌三次，加入20y。哌啶/DMF溶液，室溫反應(yīng)1小時(shí)脫保護(hù)，再用DMF洗滌三次。加入Fmoc-Thr(But)-0H，室溫反應(yīng)3小時(shí)，后用DMF洗滌三次，加入20。/。哌啶/DMF溶液，室溫反應(yīng)1小時(shí)脫保護(hù)，再用DMF洗滌三次。加入Fmoc-Val-0H，室溫反應(yīng)3小時(shí)，后用DMF洗滌三次，加入20。/。哌啶/DMF溶液，室溫反應(yīng)1小時(shí)脫保護(hù)，再用DMF洗滌三次。加入Fmoc-y-Glu(otBu)-0H，室溫反應(yīng)3小時(shí)，后用匿F洗滌三次，加入20。/。哌啶/DMF溶液，室溫反應(yīng)1小時(shí)脫保護(hù)，再用DMF洗滌三次。加入Fmoc-Lys(Boc)-0H，室溫反應(yīng)3小時(shí)，后用DMF洗滌三次，加入20n/。哌啶/DMF溶液，室溫反應(yīng)1小時(shí)脫保護(hù)，再用DMF洗滌三次。切割上述反應(yīng)的樹脂干燥后加入切割試劑三氟乙酸，室溫反應(yīng)2小時(shí)，過濾，濾液在乙醚中沉淀，干燥，得到粗產(chǎn)品。純化將粗品溶于水中，用〔18反相柱進(jìn)行純化，洗脫液為A相為O.P/。TFA水溶液，B相為乙腈，流速為20ml/min，檢測波長為214nra,收集主峰，凍干，得到純品。經(jīng)質(zhì)譜鑒定分子量為1227.1，與D3理論分子量相符(圖1)。實(shí)施例4D4(Dh-P-Ala-His—P-Thr-Val-y-Glu-Lys)的固相合成原料Fmoc-e-Ala-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-P-Thr(But)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-y-Glu(otBu)-0H、Fmoc-Lys(Boc)-OH偶聯(lián)反應(yīng)縮合劑為苯駢三唑-l-氧-三(二甲氨基)磷六氟磷酸鹽(B0P)、l-羥基苯駢三氮唑(H0BT)、N-甲基嗎啉(NMM)。脫保護(hù)劑為20。/。哌啶/DMF溶液。切割試劑為三氟乙酸。反應(yīng)稱取RinkAmideMBHA樹脂，樹脂在而F中室溫溶脹30分鐘，用DMF洗滌三次。加入20。/。哌啶/DMF溶液，室溫反應(yīng)1小時(shí)脫保護(hù)。再用DMF洗滌三次，加入Fmoc-e-Ala-0H，室溫反應(yīng)3小時(shí)，后用DMF洗滌三次，加入20。/。哌啶/DMF溶液，室溫反應(yīng)1小時(shí)脫保護(hù)。再用DMF洗滌三次，再加入Fmoc-His(Trt)-0H，室溫反應(yīng)3小時(shí)，后用簡F洗滌三次，加入20。/。哌啶/DMF溶液，室溫反應(yīng)l小時(shí)脫保護(hù)，再用DMF洗滌三次。加入Fmoc-f3-Thr(But)-0H，室溫反應(yīng)3小時(shí)，后用DMF洗滌三次，加入20%哌啶/DMF溶液，室溫反應(yīng)l小時(shí)脫保護(hù)，再用函F洗滌三次。加入Fmoc-Val-0H，室溫反應(yīng)3小時(shí)，后用DMF洗滌三次，加入20。/。哌啶/DMF溶液，室溫反應(yīng)1小時(shí)脫保護(hù)，再用DMF洗滌三次。加入Fraoc-y-Glu(otBu)-0H，室溫反應(yīng)3小時(shí)，后用DMF洗滌三次，加入20。/。哌啶/DMF溶液，室溫反應(yīng)1小時(shí)脫保護(hù)，再用DMF洗漆三次。加入Fmoc-Lys(Boc)-0H,室溫反應(yīng)3小時(shí)，后用DMF洗滌三次，加入20。/。哌啶/DMF溶液，室溫反應(yīng)1小時(shí)脫保護(hù)，再用DMF洗滌三次。切割上述反應(yīng)的樹脂干燥后加入切割試劑三氟乙酸，室溫反應(yīng)2小時(shí)，過濾，濾液在乙醚中沉淀，千燥，得到粗產(chǎn)品。純化將粗品溶于水中，用ds反相柱進(jìn)行純化，洗脫液為A相為O.WTFA水溶液，B相為乙腈，流速為20ml/mim檢測波長為214nm,收集主峰，凍干，得到純品。經(jīng)質(zhì)譜鑒定分子量為1227.1,與D4理論分子量相符(圖l)?；衔顳1D4是一種抗壞血酸過氧化物酶的模擬物，通過體外測活實(shí)驗(yàn)，該組化合物的酶活力與
背景技術(shù)：
中提到的MP-9相比較如下表1過氧化物酶活性測定<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>表1中數(shù)據(jù)表明，化合物D1D4與MP-9的活力相當(dāng)。但在預(yù)防白內(nèi)障方面的研究，MP-9來源于細(xì)胞色素C的水解物，雖然具有很高的過氧化物酶活性，但該類物質(zhì)制備困難，特別是純化手續(xù)復(fù)雜，產(chǎn)品純度較差。而化合物D廣D4的制備方法基于肽合成方法，因此工藝簡便易行。得到的產(chǎn)品產(chǎn)率較高、純度較高?？拱變?nèi)障效果也很明顯。實(shí)施例5稱取Dl.Dh-e-Ala-His-P-Thr-Val-Glu-Lys;D2.Dh_e-Ala-His-P-Thr-Val-Glu-Lys;D3.Dh-P-Ala-His-Thr-Val-Y-Glu-Lys;D4.Dh-P-Ala-His-0-Thr-Val-Y-Glu-Lys的其中一種lOOmg，溶于1000ml0.9%氯化鈉溶液，混合均勻后，分裝成0.1呢/ml/支濃度的注射液于藥瓶中密封，滅菌制成產(chǎn)品。實(shí)施例6稱取Dl.Dh-P-Ala-His-P-Thr-Val-Glu-Lys;D2.Dh-P-Ala-His-P-Thr-Val-Glu—Lys;D3.Dh-P—Ala-His-Thr—Val—Y—Glu—Lys;D4.Dh-P-Ala-His-Thr-Val-Y-Glu-Lys的其中一種100mg，溶于IOOOml水中制成水溶液，混合均勻后，分裝成O.lmg/ml/支濃度的注射液于藥瓶中密封，滅菌，凍干制成成品。實(shí)施例7稱取Dl.Dh-3-Ala-His-P-Thr-Val-Glu-Lys;D2.Dh-P-Ala-His-P-Thr-Val-Glu-Lys;D3.Dh-P-Ala-His-Thr-Val-Y-Glu-Lys;D4.Dh-P-Ala-His-e-Thr-Val-Y-Glu-Lys的其中一種100mg,藥用淀粉O.5kg,按公知的膠囊制備技術(shù)和裝備制成膠囊,每粒10mg。其它項(xiàng)目應(yīng)符合中華人民共和國藥典2000年版膠囊項(xiàng)下要求。實(shí)施例8Dl.Dh-g-Ala-His-0-Thr-Val-Glu-Lys;D2.Dh-P-Ala-His-P-Thr-Val-Glu-Lys;D3.Dh-P-Ala-His-Thr-Val-y-Glu-Lys;D4.Dh-P-Ala-His-P-Thr-Val-y-Glu-Lys的其中一種100mg，微晶纖維素560g,無水乳糖380g,硬脂酸鎂200g，氧化硅30g，按公知的制片技術(shù)和裝備制成片劑,每片10mg。其它項(xiàng)目應(yīng)符合中華人民共和國藥典2000年版片劑項(xiàng)下要求。權(quán)利要求1、一種亞血紅素短肽化合物，包括亞血紅素Dh、短肽β-Ala-His-X-Lys；其中，X可以是Thr-Val-Glu或其中的任意一個(gè)氨基酸用其相應(yīng)的β-氨基酸、γ-氨基酸代替的氨基酸序列；亞血紅素與短肽間的連接方式是亞血紅素上的羧基與肽鏈上的氨基以酰胺鍵相連；上述結(jié)構(gòu)可以是單體，即亞血紅素上的兩個(gè)羧基之一與肽鏈連接，兩種單體形式為同分異構(gòu)體，結(jié)構(gòu)下所示；2、權(quán)利要求1所述的亞血紅素短肽化合物在抗白內(nèi)障藥物制備中的用途。全文摘要本發(fā)明公開一種亞血紅素短肽化合物，包括亞血紅素Dh、短肽β-Ala-His-X-Lys；其中，X可以是Thr-Val-Glu或其中的任意一個(gè)氨基酸用其相應(yīng)的β-氨基酸、γ-氨基酸代替的氨基酸序列；亞血紅素與短肽間的連接方式是亞血紅素上的羧基與肽鏈上的氨基以酰胺鍵相連；上述結(jié)構(gòu)可以是單體，即亞血紅素上的兩個(gè)羧基之一與肽鏈連接，兩種單體形式為同分異構(gòu)體。本發(fā)明還提供了其在抗白內(nèi)障藥物制備中的用途。文檔編號(hào)C07K14/795GK101157726SQ20071005631公開日2008年4月9日申請日期2007年11月14日優(yōu)先權(quán)日2007年11月14日發(fā)明者惟李,王麗萍申請人:惟李