一種復(fù)合抗體的肌紅蛋白測定試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)檢驗領(lǐng)域，具體涉及一種納米膠乳微粒型的肌紅蛋白測定試劑 盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 肌紅蛋白（Mbglobin，Mb)是一個具有153個氨基酸的多肽鏈和一個含鐵血紅素 輔基組成的亞鐵血紅素蛋白，相對分子質(zhì)量17500,主要分布于橫紋肌(心肌和骨骼肌)細胞 中。由于分子量小，當心肌細胞損傷時，Mb是進入血液的最佳早期標志物。Mb通過腎小球 濾過,從尿液中排出，因此測定血清和尿液中Mb的濃度可用于某些肌病和心臟病的診斷。 如急性心肌梗死、急慢性腎衰竭、嚴重的充血性心力衰竭、長時間休克，神經(jīng)肌肉病及各種 原因引起的肌病。
[0003] 急性心肌梗死(AMI)是臨床常見的一種高病死率的急性心肌損傷性疾病，在發(fā)病 初期，Mb最先被釋放入血液中，在癥狀出現(xiàn)約1~3小時后，血中Mb可超出正常上限，9~12小 時達到峰值，24~36小時后恢復(fù)正常，測定血清Mb可作為AMI診斷的早期最靈敏的指標。由 于Mb半衰期短（15min)，在胸痛發(fā)作后6?12小時不升高，則可排除AMI的診斷；Mb在AMI 后很快從腎臟清除，發(fā)病18?30小時內(nèi)可完全恢復(fù)到正常水平，故Mb的測定有助于在AMI 病程中觀察有無再梗死或者梗死再擴展，如果Mb頻繁出現(xiàn)增高，提示原有心肌梗死仍在延 續(xù)。
[0004]有關(guān)檢測血清肌紅蛋白的方法主要采用免疫學(xué)方法，以酶聯(lián)免疫吸附測定法 (enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)、放身寸免疫測定法（radioimmunoassay, RIA)、化學(xué)發(fā)光法（Chemiluminescence,CL)和顆粒增強透射免疫比池法 (particle-enhancedturbidimetricimmunoassay,PETIA)這幾種方法為主。ELISA方法 雖然在臨床上使用了近二十年，但它依然存在一些致命缺點，定量準確性差、操作時間長、 自動化程度低，一般只能用于定性檢測。RIA靈敏度高，但不穩(wěn)定，重復(fù)性比ELISA差，而且 存在放射性污染的危險。CL價格昂貴，需要專門的儀器和專業(yè)人員操作，不利于基層醫(yī)院 普及。PETIA是近年來出現(xiàn)的一種較為穩(wěn)定、快速、準確測定肌紅蛋白血清濃度的檢測方 法。PETIA的基本原理是在高分子膠乳微粒的表面交聯(lián)單克隆抗體，當交聯(lián)有抗體的微粒與 抗原結(jié)合后，在短時間內(nèi)會迅速聚集在一起，改變了反應(yīng)液的透光性能。而且，反應(yīng)液透光 性能（即吸光度）的改變與被測抗原的濃度有較強的相關(guān)性，即膠乳顆粒凝集越多，越會阻 礙光線的透光性，反應(yīng)液的吸光度就越大，在一定范圍內(nèi)與被測抗原的濃度成正比。PETIA 檢測方法反應(yīng)時間短，精密度好，檢測范圍寬，黃疸、溶血和脂血標本均不受影響，易于自動 化，是目前使用非常廣泛的一種檢測方法，但該方法的檢測靈敏度和線性范圍還有待進一 步提商。
[0005]目前，PETIA檢測試劑所采用的膠乳顆粒多為惰性微粒、羧基化微粒及氨基化微 粒。表面修飾的膠乳粒子與抗體的結(jié)合是通過其表面的羧基或氨基與抗體的氨基端共價結(jié) 合，在微粒與抗體之間有一個橋聯(lián)化學(xué)臂，降低了位阻效應(yīng)，不僅提高了抗體的結(jié)合率，而 且還為抗體提供合適的三維空間立體結(jié)構(gòu)，有效地保護了抗體與抗原結(jié)合的活性區(qū)域。國 內(nèi)外已有多家公司提供納米級表面修飾的微粒粒子原料，并廣泛應(yīng)用于PETIA。這些廠家提 供的粒子直徑在20nm~4iim，可以作為多克隆抗體和單克隆抗體的載體。納米級粒子的推 出解決了對單克隆抗體結(jié)合的能力不強，臨床檢測的線性范圍窄，靈敏度低，干擾因素多， 實驗穩(wěn)定性差等問題，大大促進了免疫比濁法在臨床上的廣泛應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是進一步提高檢測血清中肌紅蛋白含量的分析靈敏 度和檢測范圍；提供一種特異性好，靈敏度高，精密度好，準確度高的納米膠乳微粒型肌紅 蛋白測定試劑盒。
[0007] 本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是：一種復(fù)合抗體的肌紅蛋白測定試 劑盒，包括試劑R1和試劑R2,其中試劑R1和試劑R2的體積比為3 : 1。所述試劑R1為促 進抗體抗原特異性結(jié)合的反應(yīng)液，組分包括：10~30mmol/L的緩沖液、0. 01%~4% (w/v)的增 乳劑、0. 05%~2% (w/v)的穩(wěn)定劑、0. 1% (w/v)的防腐劑；所述試劑R2為結(jié)合有抗人肌紅蛋 白抗體納米膠乳微粒的緩沖液，組分包括：〇. 1%~〇. 5% (w/v)標記有抗人肌紅蛋白抗體的納 米膠乳微粒、〇. 〇2%~2% (w/v)的穩(wěn)定劑、10~30mmol/L的緩沖液、0. 1% (w/v)的防腐劑。
[0008] 所述緩沖液為三羥甲基氨基甲烷緩沖液、2-嗎啉乙橫酸（NES)緩沖溶液、磷酸鹽 緩沖液、硼酸鹽緩沖液、甘氨酸緩沖液、羥乙基哌嗪乙硫磺酸（ffiPES)緩沖液和三羥甲基氨 基甲烷（Tris)緩沖液中的一種或多種；所述緩沖液pH值為6~9。所述緩沖液可以為其他 具有相似特征的緩沖液。
[0009] 所述增乳劑為聚乙二醇2000、聚乙二醇4000、聚乙二醇6000、聚乙二醇辛基苯基 醚、NaCl、吐溫20或吐溫80。增乳劑主要作用是可以增加抗體抗原的反應(yīng)速率。本發(fā)明所 述的增乳劑優(yōu)選品種為聚乙二醇6000。
[0010] 所述防腐劑為疊氮化鈉、硫柳汞、苯酚中的一種或多種。本發(fā)明優(yōu)選品種為疊氮化 鈉。
[0011] 所述穩(wěn)定劑為牛血清白蛋白、聚乙二醇6000、乙二胺四乙酸鈉中的一種或多種。
[0012] 所述抗人肌紅蛋白抗體為單克隆抗體或多克隆抗體或單克隆抗體與多克隆抗體 的混合物。
[0013] 所述標記有抗人肌紅蛋白抗體的納米膠乳微粒的制備方法為：選擇不同粒徑的羧 基化聚苯乙烯納米膠乳微粒，通過活化劑1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基）碳化二亞胺鹽酸 鹽（EDAC)和N-羥基硫代琥珀酰亞胺（Sulfo-NHS)活化微粒表面的羧基，生成活性酯，再與 肌紅蛋白單克隆抗體或多克隆抗體上的伯氨基反應(yīng)，形成共價鍵，完成偶聯(lián)，制成不同粒徑 的肌紅蛋白單克隆抗體或多克隆抗體納米膠乳微粒偶聯(lián)物。所述不同粒徑的羧基化聚苯乙 烯納米膠乳微粒的直徑在50~300nm(為市售產(chǎn)品)。其中，小粒徑納米膠乳粒偶聯(lián)單克隆抗 體，可提高檢測的線性范圍；大粒徑納米膠乳微粒偶聯(lián)多克隆抗體，可提高檢測靈敏度。
[0014] 本發(fā)明的原理：本發(fā)明利用交聯(lián)了抗體的納米膠乳微粒偶聯(lián)物，與相應(yīng)標本中的 抗原發(fā)生免疫反應(yīng)后，形成聚集顆粒，在一定波長下，通過測定聚集物形成時所產(chǎn)生的濁 度，即可測出標本中被檢物的含量。進一步的，所述本發(fā)明中，血清中的肌紅蛋白與交聯(lián)在 納米膠乳微粒上的抗人肌紅蛋白抗體結(jié)合，產(chǎn)生抗體抗原反應(yīng)，使納米膠乳微粒形成聚集， 在500nm波長處測定反應(yīng)物吸光度，通過對照標準曲線可計算出標本中肌紅蛋白的含量。
[0015] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點： 1.本發(fā)明試劑盒的檢測靈敏度可以達到〇. 2Pg/L，線性范圍為10~1000l^g/L，二者均 高于同類產(chǎn)品的分析靈敏度和線性范圍。是一種靈敏度高、特異性好、準確性高、精密度好、 線性范圍寬的納米膠乳微粒型的肌紅蛋白測定試劑盒。
[0016] 2.本發(fā)明所涉及的納米膠乳微粒的粒徑在50~300nm;將不同粒徑的微粒分別與 肌紅蛋白單克隆抗體或肌紅蛋白多