專利名稱：：用于鑒定有毒中藥材馬錢子和鬼臼品種的多核苷酸及其使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及馬錢子和鬼臼品種的ITS序列和5SrDNAspacer序列，及基于所述序列鑒定某一植物是否屬于馬錢子或鬼臼品種的方法。
背景技術(shù)：
：在傳統(tǒng)中醫(yī)藥領(lǐng)域，因不認(rèn)識藥材真假而誤服有毒藥材，而導(dǎo)致中毒的個案屢見不鮮，媒體的報(bào)導(dǎo)引起了人們的恐慌，甚至不敢再服用中藥。要挽回中藥的聲譽(yù)示和人們對中藥的信心，必須先能準(zhǔn)確鑒定中藥品種并區(qū)分有毒藥材。兩種常用而毒性強(qiáng)烈的藥材-鬼臼及馬錢子均曾發(fā)生中毒事件。馬錢子為馬錢科植物馬錢(5^yc/z"wwmx-vow/ca)的種子(中國藥典2005年版)。全中國共有馬錢屬植物十一種，在個別地區(qū)，云南馬錢(S.wa///c/z/a"a)及傘花馬錢OS."m&〃We)亦會被用作馬錢子使用。馬錢子含有馬錢子堿(stiychnine)及番木鱉堿(bmcine),兩者皆有毒但同時亦是馬錢子的有效成份。不同品種馬錢的化學(xué)成份有異，故此要準(zhǔn)確鑒定馬錢子的來源植物，才能在用藥時控制馬錢子的有效成份。而鬼臼指小檗科桃兒七屬CS^op0&;7/^//Wm)及鬼臼屬(D;ww^)植物的干燥根。在香港，中藥桃兒七稱為鬼臼。桃兒七屬及鬼臼屬植物都含鬼臼毒素(podophyllotoxin)。由于藥材龍膽和威靈仙的外型和鬼臼十分相似，容易混淆。在香港，曾經(jīng)有市民誤以為鬼臼是龍膽和威靈仙，因而誤服鬼臼(桃兒七)中毒。故此準(zhǔn)確鑒定鬼臼(桃兒七)及外型相似的藥材可保障公眾健康。DNA技術(shù)已成為一種快速而準(zhǔn)確鑒定動植物品種的方法。真核生物的DNA含有大量的基因及功能不明的DNA片段，某些DNA片段可以用作分子標(biāo)簽，用來區(qū)別不同的物種。中草藥材多源自植物，故此也保存了DNA。利用分子生物學(xué)技術(shù)方法可以提取藥材的DNA，并將DNA片段進(jìn)行擴(kuò)增及測序，經(jīng)過DNA序列分析便可以鑒定出中草藥材的來源植物。植物的基因與內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔(internaltranscribedspacer,ITS)及核糖體5SrDNA基因間隔(5SrDNAspacer)是常用作分析種間關(guān)系的DNA片段?；蚺c內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔(ITS)是在主體RNA(18S-5.8S-28SrDNA)的核糖體rDNA基因間隔，在核糖體18SrDNA基因和核糖體5.8SrDNA基因中間的間隔稱為ITS1，在核糖體5.8SrDNA基因和核糖體28SrDNA基因中間的間隔稱為ITS2。核糖體5SrDNA基因間隔(5SrDNAspacer)是重復(fù)的核糖體5SrDNA基因之間的間隔。ITS和5SrDNAspacer都是串聯(lián)的多拷貝基因，而且它們都位于高度保守的rDNA轉(zhuǎn)錄區(qū)之間，而轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)有較大變異，這種高度保守性與變異性的統(tǒng)一，使得5SrDNA基因序列成為研究真核生物中多拷貝基因的分子形成和演化的有用標(biāo)記。但有毒藥材已知的DNA序列數(shù)據(jù)不多，因而造成了因缺乏對照而不能鑒定的困境。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供可用作參比序列的馬錢子和鬼臼的5SrDNA序列和ITS序列，以及利用所述序列鑒定中藥材的方法。本發(fā)明的第一方面提供了一種用于鑒別馬錢子品種的分離的多核苷酸，其具有選自SEQIDNO:l-34的序列。本發(fā)明的第二方面提供了一種用于鑒別鬼臼品種的分離的多核苷酸，其具有選自SEQIDNO:35-46和SEQIDNO:55-72的序列。本發(fā)明的第三方面提供了一種鑒別馬錢子品種的方法，該方法包括以下步驟(a)從植物樣品中提取DNA;(b)以步驟(a)提取的DNA為模板，使用通用引物，進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)，擴(kuò)增ITS和/或5SrDNA區(qū)段；(c)對步驟(b)中獲得的PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆測序；和(d)將步驟(c)測得的DNA序列與選自SEQIDNO:l-17所示的馬錢子ITS序列和/或選自SEQIDNO:18-34所示的馬錢子5SrDNAspacer序列進(jìn)行比較以確定相應(yīng)的植物品種。本發(fā)明的第四方面提供了一種鑒別鬼臼品種的方法，該方法包括以下步驟(a)從植物樣品中提取DNA;(b)以步驟(a)提取的DNA為模板，使用通用引物，進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)，擴(kuò)增ITS和/或5SrDNA區(qū)段；(c)對步驟(b)中獲得的PCR產(chǎn)物迸行克隆測序；和(d)將步驟(c)測得的DNA序列與選自SEQIDNO:35-46所示的鬼臼ITS序列禾口/或選自SEQIDNO:55-72所示的鬼臼5SrDNAspacer序列進(jìn)行比較以確定相應(yīng)的植物品種。本發(fā)明的第五方面提供了上述馬錢子或鬼臼的ITS序列或5SrDNAspacer序列在馬錢子或鬼臼中藥材的質(zhì)量控制，鑒定真?zhèn)沃械膽?yīng)用。本發(fā)明的第六方面提供了上述馬錢子或鬼臼的ITS序列或5SrDNAspacer序列在馬錢子或鬼臼中藥材資源調(diào)査中的應(yīng)用。本發(fā)明的第七方面提供了上述馬錢子或鬼臼的ITS序列或5SrDNAspacer序列在馬錢子或鬼臼中藥材的研究與開發(fā)中的應(yīng)用。本發(fā)明的第八方面提供了上述馬錢子或鬼臼的ITS序列或5SrDNAspacer序列在馬錢子或鬼臼商品藥材包括原藥材、飲片及粉末的鑒定中的應(yīng)用。本發(fā)明的第九方面提供了上述馬錢子或鬼臼的ITS序列或5SrDNAspacer序列在馬錢子或鬼臼中藥材種植業(yè)中的應(yīng)用。本發(fā)明的第十方面提供了上述馬錢子或鬼臼的ITS序列或5SrDNAspacer序列在馬錢子或鬼臼中藥材加工與制造業(yè)中的應(yīng)用。本發(fā)明正是利用ITS和5SrDNAspacer序列的差異進(jìn)行品種鑒定或辨別其真?zhèn)巍橛行Э刂圃蟻碓醇吧a(chǎn)過程中的不穩(wěn)定因素，從基因組學(xué)著手，以鑒定藥材的來源植物，有利于控制中成藥的產(chǎn)品質(zhì)量，從而為制藥行業(yè)提供科學(xué)合理的指導(dǎo)，提高藥品的安全有效性。具體實(shí)施方式為達(dá)到本發(fā)明的目的，發(fā)明人收集了38份樣品，包括4個馬錢屬C^7c/2W(W)品種、3個鬼臼屬(Z^soswc2)品種、1個桃兒七(5/"0/0(^;3/1;;//1^)、3個鐵線蓮屬(C7ewfl&)品種、5個龍膽屬(Ge""'a"")品種；按照Draper和Scott(DraperandScott，1988)所述大致相同的方法提取植物樣品的DNA;然后以所提取的DNA為模板，以寡核苷酸作為聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)的引物，分別擴(kuò)增ITS和減5SrDNA區(qū)段，所用的引物分別采自植物ITS和/或5SrDNA兩端的保守區(qū)段；應(yīng)用克隆測序技術(shù)對所獲得的ITS和/或5SrDNAspacerPCR產(chǎn)物進(jìn)行測序；并將所測得的序列進(jìn)行相似性比較。相似性是經(jīng)序列比對分析而確定的兩條序列間相同堿基的百分比。所測得的樣品的ITS及5SrDNAspacer序列如下A:4個馬錢品種17個樣品的ITS序列(1)牛眼馬錢(&7c/z"os""gusi/7ora)樣品(編號Maqianzi-SA3)的ITS序列SEQIDNO:l。(2)牛眼馬錢(&7c/mosa"gM^yZora)樣品(編號Maqianzi-SA5)的ITS序列SEQIDNO:2。(3)牛眼馬錢(&7c/mosa"gw^i/7ora)樣品(編號Maqianzi-SA2)的ITS序列SEQIDNO:3。(4)牛眼馬錢(&o;c/zwwa"gw"i/7ora)樣品(編號Maqianzi-SA1)的ITS序列SEQIDNO:4。(5)馬錢(&o^mw"ux-vom/c"樣品(編號Maqianzi-SN1)的ITS序歹ij:SEQIDNO:5。(6)馬錢(&o^"osww;c-vom/ca)樣品(編號M叫ianzi-SN2)的ITS序歹U:SEQIDNO:6。(7)馬錢(5^yc/z"oswMx-vo卵'ca)樣品(編號Maqianzi-SN3)的ITS序歹ij:SEQIDNO:7。(8)馬錢(5^7c/wos"wx-ww/c")樣品(編號M叫ianzi-SN4)的ITS序歹U:SEQIDNO:8。(9)馬錢(5*/oWz"ay"紅-vom/c力樣品(編號Maqianzi-SN6)的ITS序列SEQIDNO:9。(10)馬錢(&7c/woswM-vo肌'cfl)樣品(編號M叫ianzi-SN7)的ITS序列SEQIDNO:10。(11)馬錢(&o^/z"asma-ww/c")樣品(編號Maqianzi-SN9)的ITS序歹U:SEQIDNO:ll。(12)馬錢(&o^A"^ww;c-w/w'c")樣品(編號Maqianzi-SN16)的ITS序列SEQIDNO:12。(13)傘花馬錢(&7c/way"w&〃"to)樣品(編號Maqianzi-SU2)的ITS序列SEQIDNO:13。(14)傘花馬錢(&7c/"ay"w&〃"to)樣品(編號M叫ianzi-SU3)的ITS序列SEQIDNO:14。(15)傘花馬錢(&7W"ayww&〃flto)樣品(編號Maqianzi-SUl)的ITS序列SEQIDNO:15。(16)傘花馬錢(&7c/z"w樣品(編號Maqianzi-SU4)的ITS序列SEQIDNO:16。(17)華馬錢(5"^yc/woscflAflyera/"樣品(編號Maqianzi-SCl)的ITS序列SEQIDNO:17。B:4個馬錢品種17個樣品的5SrDNAspacer序列(18)牛眼馬錢CSfr7c/was""g"w;/7ora)樣品(編號Maqianzi-SA1)的5SrDNAspacer序列SEQIDNO:18。(19)牛眼馬錢(&o^/7"oy朋gw幼:/7ora)樣品(編號Maqianzi-SA2)的5SrDNAspacer序列SEQIDNO:19。(20)牛眼馬錢0S/77c/"os""gw幼:/tora)樣品(編號Maqianzi-SA3)的5SrDNAspacer序歹U:SEQIDNO:20。(21)牛眼馬錢(&o;c/z"osa"gw幼)ora)樣品(編號Maqianzi-SA5)的5SrDNAspacer序列SEQIDNO:21。(22)馬錢CS/o;c/z"oswwx-vom/ca)樣品(編號Maqianzi-SN1)的5SrDNAspacer序列SEQIDNO:22。(23)馬錢CS/ryc/woswi/x-ww/c")樣品(編號Maqianzi-SN2)的5SrDNAspacer序列SEQIDNO:23。(24)馬錢(5^yc/wos"mx-vo,m'ca)樣品(編號Maqianzi-SN3)的5SrDNAspacer序列SEQIDNO:24。(25)馬錢(5^yc/z"osma:-vom/ca)樣品(編號Maqianzi-SN5)的5SrDNAspacer序列SEQIDNO:25。(26)馬錢0S^7c/woyw肌-vow/c")樣品(編號Maqianzi-SN6)的5SrDNAspacer序列SEQIDNO:26。(27)馬錢(&o^wcw"ia-vom/ca)樣品(編號Maqianzi-SN7)的5SrDNAspacer序列SEQIDNO:27。(28)馬錢(&o;c/z"asma;-vom/ca)樣品(編號Maqianzi-SN9)的5SrDNAspacer序列SEQIDNO:28。(29)馬錢CSy/7cA"0s"wx-vomz'ca)樣品(編號M叫ianzi-SN16)的5SrDNAspacer序列SEQIDNO:29。(30)傘花馬錢(&o;c/moswm^〃ato)樣品(編號Maqianzi-SUl)的5SrDNAspacer序列SEQIDNO:30。(31)傘花馬錢(5^jv/7"ay樣品(編號Maqianzi-SU2)的5SrDNAspacer序列SEQIDNO:31。(32)傘花馬錢(S^yc/z"oswm6e〃flto)樣品(編號Maqianzi-SU3)的5SrDNAspacer序歹U:SEQIDNO:32。(33)華馬錢(&o;c/2"o;sca^^e"^)樣品(編號Maqianzi-SCl)的5SrDNAspacer序歹U:SEQIDNO:33。(34)華馬錢(5W7cA"ayc"/wj^w/j)樣品(編號Maqianzi-SC2)的5SrDNAspacer序列SEQIDNO:34。C.4個鬼臼品種13個樣品的ITS序列(35)六角蓮(Z)>wwwap/e/""^^)樣品(編號DP2)的ITS序列:SEQIDNO:35。(36)六角蓮(Z^www"http://e/""http://^)樣品(編號PD3)的ITS序歹!j:SEQIDNO:36。(37)六角蓮(D少mswfl//e/fl"Aw)樣品(編號PD4)的ITS序歹U:SEQIDNO:37。(38)六角蓮CPymswa;/e/a"to力樣品(編號DV5)的ITS序歹(J:SEQIDNO:38。(39)六角蓮(Z)>wwma戶/e/a"Aws)樣品(編號DV7)的ITS序歹U:SEQIDNO:39。(40)六角蓮(Z^ymsma//e/a"Aw)樣品(編號PD5)的ITS序歹U:SEQIDNO:40。(41)川八角蓮(Z)戸廳ve/fcto.)樣品(編號PD1)的ITS序列:SEQIDNO:4K(42)川八角蓮CC^o抓gve,/)樣品(編號PD2)的ITS序列:SEQIDNO:42。(43)八角蓮(~0謹(jǐn)v—樣品(編號DV6)的ITS序列:SEQIDNO:43。(44)桃兒七(&'"opocfop/^/ww/zexam/raw)樣品(編號SE2)的ITS序列SEQIDNO:44。(45)桃兒七CS/wopocfo;/z;;〃Mm/zejcam/nrnz)樣品(編號SE3)的ITS序列SEQIDNO:45。(46)桃兒七CS/"opo^>//7_y〃Mm/7exaw^"附)樣品(編號SE5)的ITS序列SEQIDNO:46。D.8個容易和鬼臼混淆的品種的ITS序列(47)山木通(C/ewatoy""/a"a)樣品(編號CF4)的ITS序列SEQIDNO:47。(48)柱果鐵線蓮(aew"/&"""'w"to)樣品(編號CU1)的ITS序列SEQIDNO:48。(49)威靈仙(C7麵toc/2/",》樣品(編號CC5)的ITS序列SEQIDNO:49。(50)條葉龍膽(Ge""a"awara/mn'ca)樣品(編號GM1)的ITS序列:SEQIDNO:50。(51)三花龍膽((^"http://"""/nyfom樣品(編號GT1)的ITS序列SEQIDNO:5h(52)龍膽((e油'a"a"a6ra)樣品(編號GS6)的ITS序列SEQIDNO:52。(53)堅(jiān)龍膽(Gew"a"aregescms)樣品(編號GR1)的ITS序列SEQIDNO:53。(54)紅花龍膽(C^"http://"""r/70^"http://7fl)樣品(編號GHH1)的ITS序列:SEQIDNO:54。E.4個鬼臼品種18個樣品的5SrDNAspacer序列(55)六角蓮(Z)>www"樣品(編號DP2)的5SrDNAspacer序列SEQIDNO:55。(56)六角蓮(Z)"oswap/e/朋Aws)樣品(編號DV5)的5SrDNAspacer序列SEQIDNO:56。(57)六角蓮(Z^msma;/e/a"Aw"樣品(編號DV7)的5SrDNAspacer序歹lj:SEQIDNO:57。(58)六角蓮(Z^www";/ez'""^w力樣品(編號PD3)的5SrDNAspacer序列SEQIDNO:58。(59)六角蓮CD^cwwa//e/a"&ws)樣品(編號PD4)的5SrDNAspacer序列SEQIDNO:59。(60)六角蓮(Z)ymsw";/e/a"Atw)樣品(編號PD5)的5SrDNAspacer序列SEQIDNO:60。(61)六角蓮CPvmywa樣品(編號PD6)的5SrDNAspacer序列SEQIDN0:61。(62)川八角蓮(々)aso柳"ve/fc/n'/)樣品(編號PD1)的5SrDNAspacer序列SEQIDNO:62。(63)川八角蓮(D>w^wvWc/Y)樣品(編號PD2)的5SrDNAspacer序歹U:SEQIDNO:63.(64)川八角蓮(爭o畫ve油》樣品(編號DVR1)的5SrDNAspacer序列SEQIDNO:64。(65)川八角蓮(D>ww/wavdcto')樣品(編號DV10)的5SrDNAspacer序列SEQIDNO:65。(66)八角蓮(Djwww"ve/w>e〃&)樣品(編號DV6)的5SrDNAspacer序列SEQIDNO:66。(67)八角蓮(D"oswave"&Wfo)樣品(編號SE1)的5SrDNAspacer序列SEQIDNO:67。(68)八角蓮(Z^msmavera)^fo)樣品(編號SE4)的5SrDNAspacer序歹J:SEQIDNO:68。(69)八角蓮CPymsw"verw》Wto)樣品(編號DP3)的5SrDNAspacer序歹ij:SEQIDNO:69。(70)八角蓮(Z^^cw/wavem)e〃&)樣品(編號SHDVS3)的5SrDNAspacer序列SEQIDNO:70。(71)桃兒七(iSV"o/0(io/7/^〃"m/zerawc/r,)樣品(編號SE2)的5SrDNAspacer序歹U:SEQIDNO:71。(72)桃兒七(5V"o;ocfop/^〃wwfexa/Wn/m)樣品(編號SE3)的5SrDNAspacer序列SEQIDNO:72。F.8個容易和鬼臼混淆的品種的5SrDNAspacer序列(73)山木通(C7e/w加i樣品(編號CF4)的5SrDNAspacer序列SEQIDNO:73。(74)柱果鐵線蓮(C/mato"打c/"ato)樣品(編號CU1)的5SrDNAspacer序列SEQIDNO:74。(75)烕靈仙(C7ema^c/z/wera/"樣品(編號CC5)的5SrDNAspacer序列SEQIDNO:75。(76)條葉龍膽(C7e""a"awara/mWca)樣品(編號GM1)的5SrDNAspacer序列SEQIDNO:76。(77)三花龍膽(Ge"http://a"a加;/7ora)樣品(編號GT1)的5SrDNAspacer序列SEQIDNO:77。(78)龍膽(Ge""'a""sca6ra)樣品(編號GS6)的5SrDNAspacer序列SEQIDNO:78。(79)堅(jiān)龍膽(Ge"http://a""hg^cem)樣品(編號GR1)的5SrDNAspacer序歹U:SEQIDNO:79。(80)紅花龍膽(Ge"^"ar/zo^"Aa)樣品(編號GHH1)的5SrDNAspacer序列SEQIDNO:80。本發(fā)明利用馬錢及鬼臼植物內(nèi)ITS和5SrDNA序列的差異進(jìn)行種內(nèi)和種間的比較，借此鑒定不同的馬錢及鬼臼藥材品種并辨別其真?zhèn)?。利用ITS序列鑒別馬錢或鬼臼藥材品種的方法包括下列步驟(1)收集植物樣品；(2)從步驟(l)選出的植物樣品中提取DNA;(3)以步驟(2)提取的DNA為模板，以寡核苷酸作為聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)的引物，擴(kuò)增ITS區(qū)段，所用的引物為通用引物，其分別采自植物ITS兩端的保守區(qū)段；(4)步驟(3)中所獲得的PCR產(chǎn)物直接進(jìn)行測序；和(5)將步驟(4)中測得的序列與選自SEQIDNO:l-17所示的馬錢子ITS序列或選自SEQIDNO:35-46所示的鬼臼ITS序列進(jìn)行比較以確定相應(yīng)的植物品種。利用5SrDNA序列鑒別馬錢或鬼臼藥材品種的方法包括下列步驟(1)收集植物樣品；(2)從步驟(1)選出的植物樣品中提取DNA;(3)以步驟(2)提取的DNA為模板，以寡核苷酸作為聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)的引物，分別擴(kuò)增5SrDNA區(qū)段，所用的引物為通用引物，其分別采自植物5SrDNA兩端的保守區(qū)段；(4)應(yīng)用克隆測序技術(shù)對步驟(3)中所獲得的5SrDNAspacerPCR產(chǎn)物進(jìn)行測序；和(5)將步驟(4)中測得的序列與選自SEQIDNO:18-34所示的馬錢子5SrDNA序列或選自SEQIDNO:55-72所示的鬼臼5SrDNA序列進(jìn)行比較以確定相應(yīng)的植物品種。上述所測得的四個馬錢品種，包括馬錢(&/7&"^"";c-vom/c")、牛眼馬錢(iSfryc/zwos""gz^i/7ora)、華馬錢(iSy/7c/z"ojc^/zaj^"w;y)及傘花馬錢CSVrjc/ww的ITS序列作比較。馬錢及牛眼馬錢在同一品種的樣品之間的相似性介于99.0%至100.0%，但兩者的相似性介于98.4%至99.3%，因此這兩個品種不能以ITS序列區(qū)分。比較馬錢，牛眼馬錢及傘花馬錢，在同一品種的樣品之間的相似性高于97.9%，品種之間的相似性為85.8%到94.0%，因此，當(dāng)樣本的ITS序列跟馬錢，華馬錢或傘花馬錢比較后，凡相似性高于97.9%的都鑒定為同一品種。上述所測得的四個馬錢品種，包括馬錢0S燈c/2"osma:-vow/c。)、牛眼馬錢(5^7c/7wosa"g她yZora)、華馬錢(5^c/2"osc^—醋/力及傘花馬錢(&o;c/zwwwm^//flto)的5SrDNA序列在同一品種的樣品之間的相似性介于91.4%至99.2%,而種間5SrDNAspacer序列的相似性為42.4-85.5%。因此，當(dāng)不知名樣本的5SrDNA序列跟馬錢、牛眼馬錢、華馬錢或傘花馬錢比較后，凡相似性高于91.4%的都鑒定為同一品種。四種鬼臼類藥材桃兒七(5V"o/o^p/^〃w附/7ex""^MW)、六角蓮(Z^wasmap/e/<3wZ/wf)、乂V角蓮(Z^sosmaverw》e〃/"及川乂V角蓮CP^osma的ITS序列作比較。在同一品種的樣品之間的相似性為98.7%-99.8%,品種之間的相似性為91.5%到95.6%，因此，當(dāng)樣本的ITS序列跟桃兒七、六角蓮、A角蓮及川八角蓮比較后，凡相似性高于98.7%的都鑒定為同一品種。兩個桃兒七(S/"o;x^o//^〃mw/ze;caw/raw)樣品之間的5SrDNA序列相似性是95%，而桃兒七跟六角蓮(Z)wo柳a;/e/a"Aa)、八角蓮(Z);^wmave^^e〃&)及川八角蓮(Z^sosmave/fcW/)相似性介于88.1%-92.0%,因此當(dāng)不知名樣本的5SrDNA序列跟桃兒七比較后，凡相似性等于或大于95.0%的都鑒定為桃兒七，而非六角蓮、八角蓮或川八角蓮。六角蓮，八角蓮及川八角蓮在同一品種的樣品之間的相似性介于93.7%-99.3%，而品種間的相似性為87.5%-96.1%，因此5SrDNA序列不能區(qū)分六角蓮、八角蓮及川八角蓮。此外，比較過鬼臼及容易混淆的威靈仙類藥材與龍膽類藥材的ITS及5SrDNAspacer序列。四種鬼臼類藥材與威靈仙類藥材山木通(C7emfl他yrte"a"a)、柱果鐵線蓮(C7ewafezmc/w"to)及威靈仙(C7e附"toc/z/"era/力的ITS序列相似性介于51.9。/。-54.1%。四種鬼臼類藥材與龍膽類藥材條葉龍膽(Ge""a加腦m^wn'—、三花龍膽(G^""a"(3哮ora)、龍膽(Ge""(3""sca6na)、堅(jiān)龍膽(G^""a""re/geseem)及紅花龍?jiān)碌?Ge""a""Wzo^"Aa)的ITS序列相似性為49.9。/。-55.8。/。，而桃兒七、六角蓮、八角蓮及川八角蓮在同一品種的樣品之間的相似性為98.7%-99.8%，因此當(dāng)不知名樣品對比鬼臼的ITS序列，凡相似性低于98.7%均是非鬼臼。四種鬼臼類藥材與威靈仙類藥材(山木通C/ema^sy"eto加)、柱果鐵線蓮(C7emafewwc/"ato)及威靈仙(C7e'wafec/h'"em&)的5SrDNAspacer序列相似性介于27.6%-31.7%。四種鬼臼類藥材與龍膽類藥材條葉龍膽(Ge""awaw(3"Ww7'ca)、三花龍?jiān)碌?Ge""(3"any/ora)、龍膽(Gew"a"asca6ra)、堅(jiān)龍膽(Gew"aware/gescera)及紅花龍?jiān)碌?C7ew"a"ar/zoifow/Zzfl)的5SrDNA序列相似性為24.1。/。-42.0。/。。而桃兒七、六角蓮、八角蓮及川八角蓮在同一品種的樣品之間的相似性為93.7%-99.3%，因此，當(dāng)不知名樣品對比鬼臼的5SrDNA序列，凡相似性低于93.7%均是非鬼臼。以下實(shí)施例僅用于舉例說明本發(fā)明，而不應(yīng)理解為以任何形式限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例實(shí)施例l:通過ITS或5SrDNAspacer序列鑒別不同來源的馬錢品種(1)DNA的提取植物的DNA提取方法與Draper和Scott(DraperandScott，1988)所述大致相同，簡述如下將牛眼馬錢(5Vo^/mosa"g附i/7om)(Maqianzi-SA1，Maqianzi-SA2，Maqianzi-SA3，Maqianzi-SA5),馬錢(5"^yc/moswwx-vow/ca)(Maqianzi-SN1，Maqianzi-SN2，Maqianzi-SN3，Maqianzi-SN4，Maqianzi-SN5，Maqianzi-SN6，Maqianzi-SN7，Maqianzi-SN9，Maqianzi-SN16)，傘花馬錢(/S^jc/zww,6e〃ato)(Maqianzi-SUl，Maqianzi-SU2，Maqianzi-SU3，Maqianzi-SU4)及華馬錢0S^yc/mwcaAayew&)(Maqianzi-SC1，Maqianzi-SC2)用70%乙醇的蒸餾水溶液沖洗，然后，與液氮混合并研磨成粉末。將所得的粉末樣品與6倍體積的CTAB提取緩沖液混勻，在56。C水浴中保溫30分鐘后，加入等量的氯仿-異戊醇(24:1)混合液抽提，離心，取上清液。向殘余物中加入0.1體積的10%CTAB溶液，室溫放置10分鐘后再用氯仿-異戊醇萃取一次，離心，取上清液并與前次的上清液混合。向所得上清液中加入等量的CTAB沉淀緩沖液產(chǎn)生沉淀，室溫放置l小時后以13000g離心15分鐘。將DNA沉淀物用乙醇純化后溶解于TE緩沖液(10mMTris-HCl，pH7.5，lmMEDTA)中備用。(2)PCR擴(kuò)增反應(yīng)ITS區(qū)段的DNA由PCR擴(kuò)增反應(yīng)獲得。反應(yīng)所用的通用引物為ITS4和ITS5:ITS4序列為5，-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3，ITS5序列為5，-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3'5SrDNA區(qū)段的DNA由PCR擴(kuò)增反應(yīng)獲得。反應(yīng)所用的通用引物為5S2F和5S2R:5S2F序列為5，-GTGCTTGGGCGAGAGTAGTA-3，5S2R序列為5，-TTAGTGCTGGTATGATCGCA-3'反應(yīng)溶液包括10ng植物DNA，1X7bg緩沖溶液(10mMTris-HCl，pH8.3，0.001%明膠)，0.2mMdNTPs，l|iM引物，以及l(fā)單位ra《DNA多聚酶(Promega，USA)。反應(yīng)條件為于94。C預(yù)處理5分鐘，然后進(jìn)行35個循環(huán)，循環(huán)條件是94°C、l分鐘；60°C、l分鐘；72°C、2分鐘；72°C、IO分鐘。(3)克隆測序技術(shù)將步驟(2)得到的PCR產(chǎn)物用DNA純化試劑盒GENCLEANIIIKit(Bio101,USA)進(jìn)行純化。取出l^d(約50ng)純化的PCR片段，用克隆試劑盒TAcloningKit(pGEM-TEasyVectorSystems,Promega,USA)將該P(yáng)CR片段克隆到TAcloningKit所提供的T/A載體上，然后轉(zhuǎn)化至E.coli細(xì)菌中，于攝氏37度培養(yǎng)16小時后，用質(zhì)粒純化試劑盒RapidPlasmidMiniprepSystem(MarligenBioscience,Germany)純化質(zhì)粒。測序通過反應(yīng)試劑盒ABIPrismBigDyeTerminatorCycleSequencingReadyReactionKit(PEBiosystems，USA)和遺傳分析儀Geneticanalyzer(ABIPrism3100，AppliedBiosystems,USA)進(jìn)行。(4)序列比對結(jié)果和結(jié)論使用Bio-Edit序列分析軟件(TomHallIsisPharmaceuticals,Inc)，將上述所測得的四個馬錢品種，包括馬錢(5^yc/2/my"";c-vow/a)、牛眼馬錢(iS"/;jc/w7051a"g融^7ora)、華馬錢OS^yc/mas加—譜/力及傘花馬錢CS^c/z"oswm^/Zato)的ITS序列作比較(表一)。馬錢及牛眼馬錢在同一品種的樣品之間的相似性介于99.0%至100.0%，但兩者的相似性介于98.4%至99.3%，因此這兩個品種不能以ITS序列區(qū)分。比較馬錢，牛眼馬錢及傘花馬錢，在同一品種的樣品之間的相似性高于97.9%，品種之間的相似性為85.8%到94.0%，因此，當(dāng)樣本的ITS序列跟馬錢，華馬錢或傘花馬錢比較后，凡相似性高于97.9%的都鑒定為同一品種。上述所測得的四個馬錢品種，包括馬錢(&o^/zmwma-vom!'cfl)、牛眼馬錢(iS^yc/z"osa"g她^7ora)、華馬錢(&，/z"osc勵，ra/力及傘花馬錢(5Vo^/wcwwm6e//ato^々5SrDNA序列在同一品種的樣品之間的相似性介于91.4%至99.2%，而種間5SrDNAspacer序列的相似性為42.4%-85.5%。因此，當(dāng)不知名樣本的5SrDNA序列跟馬錢、牛眼馬錢、華馬錢或傘花馬錢比較后，凡相似性高于91.4%的都鑒定為同一品種(表二)。實(shí)施例2:通過ITS或5SrDNAspacer序列鑒別不同的鬼臼品種(1)DNA的提取植物的DNA提取與實(shí)施例1中的方法相同，樣本為六角蓮("www";/e/a"AM力(DP2，PD3，PD4DV5，DV7，PD5，PD6)、川八角蓮(Z^mswave"c/n./)(PDl，PD2，DVR1，DVIO)、八角蓮(Z)jmymave"^e肌"(DV6，SE1，SE4，DP3,SHDVS3)及桃兒七(&."o/ocfop/^〃"w/zexaw^wm)(SE2，SE3，SE5)。(2)PCR擴(kuò)增反應(yīng)反應(yīng)的通用引物及方法與實(shí)施例1中的方法相同。(3)克隆測序技術(shù)方法與實(shí)施例l中的方法相同。(4)序列比對結(jié)果和結(jié)論使用Bio-Edit序列分析軟件(TomHallIsisPharmaceuticals,Inc)，將四種鬼臼類藥材桃兒七0S/"o/7oofop/yV/"m/^:ra"(ir"w)、六角蓮(D^osma;/e/a"Aa)、乂、角蓮(Z^sosmave"^e〃&)及川乂V角蓮(Z^soswave/fc/n7)的ITS序列作比較(表三)。在同一品種的樣品之間的相似性為98.7%-99.8%，品種之間的相似性為91.5%到95.6%，因此，當(dāng)樣本的ITS序列跟桃兒七、六角蓮、八角蓮及川八角蓮比較后，凡相似性高于98.7%的都鑒定為同一品種。兩個桃兒七CS/"o/c^op//wm/7exa"Aww)樣品之間的5SrDNA序列相似性是95%(表四)，而桃兒七跟六角蓮(Dwo^7Wp/e/a"http://7a)、八角蓮(Z)"osmavem》e〃&)及川八角蓮(D^osmave"cM)相似性介于88.1%-92.0%，因此當(dāng)不知名樣本的5SrDNA序列跟桃兒七比較后，凡相似性等于或大于95.0%的都鑒定為桃兒七，而非六角蓮、八角蓮或川八角蓮。六角蓮，八角蓮及川八角蓮在同一品種的樣品之間的相似性介于93.7%-99.3%，而品種間的相似性為87.5%-96.1%，因此5SrDNA序列不能區(qū)分六角蓮、八角蓮及川八角蓮。實(shí)施例3:通過ITS序列鑒別鬼臼及其易混淆品種(1)DNA的提取植物的DNA提取與實(shí)施例1中的方法相同，樣本為山木通(C/ema^/"e"a"a)(CF4)、柱果鐵線蓮(C7emW"""c/"ato)(CU1)、威靈仙(C/ema他c/z/"era&)(CC5)、條葉龍?jiān)碌?Gew"awawa"s/wn'ca)樣品(GM1)、三花龍膽(Ge""a"a的;/7ora)(GTl)、龍膽(Ge油'""a"Wra)(GS6)、堅(jiān)龍膽(Ge""a加regesce"s)(GR1)及紅花龍膽(Ge""ow"r/wcb"^za)(GHHl)。(2)PCR擴(kuò)增反應(yīng)反應(yīng)的通用弓I物及方法與實(shí)施例1中的方法相同。(3)克隆測序技術(shù)方法與實(shí)施例l中的方法相同。(4)序列比對結(jié)果和結(jié)論使用Bio-Edit序列分析軟件(TomHallIsisPharmaceuticals,Inc)，比較鬼臼及容易混淆的威靈仙類藥材與龍膽類藥材的ITS及5SrDNAspacer序列(表五)。四種鬼臼類藥材與威靈仙類藥材山木通(C/ema他/"幼'a加)、柱果鐵線蓮(C7ewafe""c/"ato)及威靈仙(C7em"^c/z/"e"w;s)的ITS序列相似性介于51.9%-54.1%。四種鬼臼類藥材與龍膽類藥材條葉龍膽(Gewgaw"w""Aw/ca)、三花龍膽(Gew/z'(3"a//"^/7ora)、龍膽(Ge""'a"a■sc"6—、堅(jiān)龍膽((7ew"'fitW(3m'gescera)及紅花龍膽(Ge"^awar/zoiia"^7a)的ITS序列相似性為49，/。-55.8。/。，而桃兒七、六角蓮、八角蓮及川八角蓮在同一品種的樣品之間的相似性為98.7%-99.8%，因此當(dāng)不知名樣品對比鬼臼的ITS序列，凡相似性低于98.7%均是非鬼臼。四種鬼臼類藥材與威靈仙類藥材(山木通C/ewafe/"^"朋)、柱果鐵線蓮(C/ewa他w"c/"ato)及威靈仙(C/e附atoc/2/"e"w》的5SrDNAspacer序列相似性介于27.6%-31.7%(表六)。四種鬼臼類藥材與龍膽類藥材條葉龍?jiān)碌?Ce""a"amaws/ran'ca)、三花龍?jiān)碌?Ge""a"amy/ora)、龍?jiān)碌?Gew"awasc"6ra)、堅(jiān)龍?jiān)碌?Ge""aw(3re/gescera)及紅花龍?jiān)碌?Ge""a"aAo^",/w)的5SrDNA序列相似性為24.1。/。-42.0Q/。。而桃兒七、六角蓮、八角蓮及川八角蓮在同一品種的樣品之間的相似性為93.7%-99.3%，因此，當(dāng)不知名樣品對比鬼臼的5SrDNA序列，凡相似性低于93.7%均是非鬼臼。因此，采用本發(fā)明提供的馬錢及鬼臼的ITS及5SrDNAspacer的DNA序列及鑒定方法，通過其DNA序列的比較，使得對中藥馬錢及鬼臼的鑒定更加方便和可靠。表三)鬼臼ITS序列相似性(百分比)六角蓮川八角蓮八角蓮桃兒七六角蓮98.7-99.892.2-93.294.7-95.691.5-92.7川八角蓮99.892.5-92.791.5-92.1八角蓮91.6-91.9桃兒七99.2-99.5表四)鬼臼5SrDNA序列相似性(百分比)六角蓮川八角蓮八角蓮桃兒七六角蓮93.7-98.989.5-96.187.5-93.788.1-91.9川八角蓮93.7-98.587.5-92.088.8-92.0八角蓮95.6-99.387.8-90,6桃兒七95.0表一)馬錢ITS序列相似性(百分比)牛眼馬錢馬錢傘花馬錢華馬錢牛眼馬錢99.0-99.698.4-99.386.2-87.787.4-服0馬錢99.0-100.085.8-87.287.1-87.2傘花馬錢97.9-99.593.6-94.0華馬錢表二)馬錢5SrDNA序列相似性(百分比)牛眼馬錢馬錢傘花馬錢馬錢93.5-98.580.7-85.545.3-47.791.4-99.244.4-51.5馬錢91.5-92.2華馬錢43.6-45.042.4-47.273.1-75.696.2眼錢花馬牛馬傘華表五)鬼臼及其偽品的ITS序列相似性(百分比)<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>表六)鬼臼及其偽品的5SrDNA序列相似性(百分比)<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>序列表<110>香港賽馬會中藥研究院有限公司<120>用于鑒定有毒中藥材馬錢子和鬼臼品種的多核苷酸及其使用方法<130>HKWIL0598<160>80<170>Patentlnversion3.3<210>1<211>639<212>DNA<213>Strychnosangustiflora<400>1tgcggaaggatcattgtcga3tcctgcsg3cgacccgcgaactcgtttctctccacgggc60gtcgggagggggcaaccccgcctcggccccgtctcgcgsgcggcccgstccctcgggtgc120cgggccgcgcgcaaacaacgaaccccggcgcggaaagcgctttc3cgg3t180sgcccgcccctcgtggccccgttcgcggtgcgcccgggggcgstcggcstCt3C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