專利名稱：：具有抗腫瘤和影響線粒體功能的錳配合物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及具有抗腫瘤和影響細(xì)粒體功能錳配合物及其制備方法。
背景技術(shù)：
：癌癥是嚴(yán)重危害人類健康的主要疾病之一，尋找高效低毒的抗腫瘤藥一直是人類不懈奮斗的目標(biāo)。合成和發(fā)現(xiàn)高效低毒的抗腫瘤藥物，研究其作用機(jī)制以及在分子和細(xì)胞水平上研究癌癥的起因，在醫(yī)學(xué)、生物學(xué)和化學(xué)等學(xué)科領(lǐng)域有著重要的意義。最早的有關(guān)金屬配合物在抗腫瘤活性中的報(bào)道可以追溯到16世紀(jì)，但直到20世紀(jì)60年代無(wú)機(jī)配合物順鉑的抗腫瘤活性被發(fā)現(xiàn)才引起人們對(duì)其他種類的非有機(jī)抑制細(xì)胞生長(zhǎng)藥的研究發(fā)生極大興趣(ClarkeMJ,ZhuF，F(xiàn)rascaDR,Chem.Rev.,1999,99(9):2511)?？茖W(xué)工作者在鉑類抗腫瘤藥物領(lǐng)域進(jìn)行了大量研究工作，這些研究工作大多是圍繞著經(jīng)典鉑類抗腫瘤藥物即以順鉑為模式的二價(jià)鉑類配合物進(jìn)行的，已有四項(xiàng)鉑類抗腫瘤專利報(bào)道(CN86106751抗腫瘤鉑配合物及其制備和應(yīng)用；CN87104027新順鉑鉻合物，其小鼠抗腫瘤組合物及其制備過(guò)程；中國(guó)專利CN89106648.9鉑-(IV)-二胺復(fù)合物；中國(guó)專利CN95103058.2新的抗腫瘤鉑絡(luò)合物，但鉑類抗腫瘤藥物具有毒副作用和交叉耐藥性等缺點(diǎn)(楊寧，國(guó)際泌尿系統(tǒng)雜志，2006，26(6)，849)。順鉑劑量依賴的腎毒性限制了其臨床治療腫瘤的效果。隨后許多非鉑族金屬的配合物，都顯示對(duì)人和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的腫瘤有效，如膦基-烴基VI族金屬絡(luò)合物具有良好在抗腫瘤方面的應(yīng)用(CN92104058.X制備膦基-烴基Vl族金屬絡(luò)合物及含有這些絡(luò)合物的抗腫瘤組合物方法其小鼠抗腫瘤組合物及其制備過(guò)程)。己報(bào)道的抗腫瘤配合物主要包括過(guò)渡金屬鈦、釩、鈮、鉬、錸、釕、銠、銥、鉑以及銅和金等重金屬元素配合物(DreicerR.，PropertK.J.,RothB.J.,etal,Caneer，1997,79(1):110.曲平，何華，化學(xué)進(jìn)展，2006，18(12)，1646。李風(fēng)華，吳紅星，林華寬，高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報(bào)，2006，27(10)，1800)。而具有抗腫瘤和對(duì)抗Ca2+誘發(fā)的線粒體的腫脹功能的錳配合物未見報(bào)道。肝組織內(nèi)線粒體豐富，由肝細(xì)胞制備的線粒體有一定的生物活性，可以反映化合物對(duì)線粒體的直接作用。線粒體腫脹是其中最直觀的一個(gè)指標(biāo)。鈣離子誘導(dǎo)下，線粒體發(fā)生腫脹，是線粒體自我調(diào)控功能的表現(xiàn)之一。對(duì)抗Ca2+誘發(fā)的線粒體腫脹的化合物在抗衰和治療缺血再灌注損傷方面有廣闊的應(yīng)用前景(李毅，黃永青，鄭民纓，楊海華，徐評(píng)議，劉焯霖，國(guó)際遺傳學(xué)雜志，2007,30G)，l卯)。我們發(fā)明的具有抗腫瘤活性和對(duì)抗〔&2+誘發(fā)的線粒體腫脹功能的錳配合物為高效低毒抗腫瘤藥的研制開辟了一條新途徑。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種具有抗腫瘤和影響線粒體功能的錳配合物及其制備方法。本發(fā)明用化學(xué)方法合成了一個(gè)新的錳配合物，并運(yùn)用物理手段確定了配合物的結(jié)構(gòu)。體外抗腫瘤活性測(cè)試研究了配合物對(duì)腫瘤細(xì)胞的影響，發(fā)現(xiàn)錳配合物對(duì)腫瘤細(xì)胞A549，Hela、H印G-2和Ecal09生長(zhǎng)均有強(qiáng)的抑制作用，能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡；配合物以劑量的方式對(duì)抗Ca2+誘發(fā)的線粒體的腫脹功能。所以錳配合物成為新的具有抗腫瘤活性和治療Ca2+誘發(fā)的線粒體的腫脹相關(guān)疾病的小分子藥用先導(dǎo)物。一種具有抗腫瘤和影響線粒體功能的錳配合物，其結(jié)構(gòu)式為上述抗腫瘤和影響線粒體功能的錳配合物的制備方法，其特征在于將N-烯丙基二吡啶甲基胺和MnCl2按摩爾比l:l溶于甲醇溶液中，控制在30-100°C;最佳反應(yīng)溫度為8(TC，反應(yīng)時(shí)間2-8小時(shí)，最佳反應(yīng)時(shí)間為4小時(shí)，去甲醇獲得淡黃色錳配合物二氯)二氯二(N-烯丙基二吡啶甲基胺)雙錳(II)[L2Mn2Cl4]。Yield:80%，分子式C30H34Cl4Mn2N6。元素分析實(shí)測(cè)值C，49.40%;H，4.53%;N，11.46;Mn，14.21%;計(jì)算值C，49.34%;H，4.69%;N，11.51;Mn,14.19%。紅外光譜數(shù)據(jù)(IR，era—1):2936，1615，1577，簡(jiǎn)寫為L(zhǎng)2Mn2Cl4，其中L代表:1498，1037，841，806，506。錳配合物的制備路線如下-"lMn"代表lpmolMn-ENP配合物，"Ca2+"為鈣離子，"Mn"代表只加藥物而不加鈣離子組，"BL"表示空白組，"Mn+Ca2+"表示先加不同濃度化合物孵育3min后再加鈣離子。本發(fā)明用化學(xué)方法合成了一個(gè)新的錳配合物，并運(yùn)用物理手段確定了配合物的結(jié)構(gòu)。研究了錳配合物體外抗腫瘤活性，MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示我們合成的錳配合物對(duì)腫瘤細(xì)胞A549，Hela、HepG-2和Ecal09生長(zhǎng)均有強(qiáng)的抑制作用，能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡；配合物以劑量的方式對(duì)抗C^+誘發(fā)的線粒體的腫脹功能。所以錳配合物成為新的具有抗腫瘤活性和治療Ca^誘發(fā)的線粒體的腫脹相關(guān)疾病的小分子藥用先導(dǎo)物。圖1錳配合物對(duì)50nmolC^+誘導(dǎo)的小鼠肝臟線粒體腫脹的影響具體實(shí)施方式1試劑和原料實(shí)驗(yàn)中所用試劑均為分析純，除特別注明外，未經(jīng)進(jìn)一步處理。元素分析用Carlo-Erba-l106型元素分析儀測(cè)定，紅外光譜用Fr-IR169(固體用KBr壓片)?？鼓[瘤試驗(yàn)試劑如下(1)RPMI1640培養(yǎng)基(RPMI1640+10%小牛血清+HEPES3.5g/l+NaHC032.2g/l+青霉素0.13g/l+鏈霉素0.15g/l)。(2)高糖DMEM培養(yǎng)基(DMEM+10%小牛血清+HEPES3.5g/l+NaHC032.2g/l+青霉素0.13g/l+鏈霉素0.15g/1)。(3)MTT(美國(guó)Amresco公司產(chǎn)品)。2、錳配合物的合成實(shí)施例l(最價(jià)反應(yīng)條件舉例)將N-烯丙基二吡啶甲基胺和MnCl2按摩爾比1:1溶于甲醇溶液中，控制反應(yīng)溫度為80°C，反應(yīng)時(shí)間4小時(shí)，冷至室溫，蒸去甲醇獲得淡黃色錳配合物二(p氯)二氯二(N-烯丙基二吡啶甲基胺)雙錳(II)[L2Mn2Cl4]。Yield:80%。分子式C3QH34Cl4Mn2N6。元素分析實(shí)測(cè)值c，49.40%;H，4.53%;N，11.46;Mn，14.21%;計(jì)算值C，49.34%;H，4.69%;N，11.51;Mn，14.19%。紅外光譜數(shù)據(jù)(IR，cm-l)2936，1615，1577，1498，1037，841，806，506。實(shí)施例2:將N-烯丙基二吡啶甲基胺和MnCl2按摩爾比h2溶于甲醇溶液中，控制反應(yīng)溫度為8CTC，反應(yīng)時(shí)間4小時(shí)，冷至室溫，蒸去甲醇獲得淡黃色錳配合物二(k氯)二氯二(N-烯丙基二吡啶甲基胺)雙錳(II)[L2Mn2Cl4]。Yield:40%。實(shí)施例3:將N-烯丙基二吡啶甲基胺和MnCl2按摩爾比1:1溶于甲醇溶液中，控制反應(yīng)溫度為4(TC,反應(yīng)時(shí)間8小時(shí)，冷至室溫，蒸去甲醇獲得淡黃色錳配合物二(p-氯)二氯二(N-烯丙基二吡啶甲基胺)雙錳(II)[L2Mn2Cl4〗。Yield:62%。3、抗腫瘤活性測(cè)定篩選的細(xì)胞株有人肝癌細(xì)胞株(A549，Hela、HepG-2和Ecal09)。測(cè)定采用溴化四氮唑藍(lán)(MTT)法?；罴?xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性溴化四氮唑藍(lán)還原為難溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶物(Formazan)并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無(wú)此功能。二甲基亞砜(DMSO)能溶解細(xì)胞中的紫色結(jié)晶物，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在570nm波長(zhǎng)處測(cè)定其光吸收值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。操作步驟如下3丄1接種取處于指數(shù)生長(zhǎng)期，狀態(tài)良好的細(xì)胞一瓶，加入適量胰蛋白酶消化液，消化使貼壁細(xì)胞脫落，用含12%小牛血清的RPMI1640(或DMEM)培養(yǎng)液配成細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)，并將細(xì)胞密度調(diào)整稀釋至2.2*104/ml.取細(xì)胞懸液接種于96孔板上，180ul/孔(含腫瘤細(xì)胞4000/孔)。3丄2培養(yǎng)將培養(yǎng)板轉(zhuǎn)入恒溫C02培養(yǎng)箱中，在37"C，5%032及飽和濕度條件下培養(yǎng)24小時(shí)。3丄3加藥受試化合物先用DMSO或超純水配制成0.1M濃度，再作4個(gè)稀釋度，濃度依次為10—4M，1(T5M，1(T6M，1(T7M。加入受試化合物，20ul/孔，培養(yǎng)48小時(shí)。每組設(shè)3個(gè)平行孔，并重復(fù)3次。3丄4染色3丄4.1將MTT加入96孔板(貼壁細(xì)胞)中，20ul/孔，置于培養(yǎng)箱中孵育4小時(shí)，吸棄孔內(nèi)上清液，加入DMSO100ul/孔，置平板搖床上震蕩5分鐘。3丄4.2將MTT加入96孔板中(懸浮細(xì)胞)，20ul/L，置于培養(yǎng)箱中孵育4小時(shí)，再加入20。/。SDS50ul/孔，置于培養(yǎng)箱中過(guò)夜。3丄5領(lǐng)iJ定酶標(biāo)儀設(shè)定波長(zhǎng)為570nm，參考波長(zhǎng)為630nm，測(cè)定96孔板每孔吸光值，記錄結(jié)果并計(jì)算細(xì)胞抑制率，以判斷受試藥物的抗腫瘤活性。3.3數(shù)據(jù)處理3.3.1細(xì)胞抑制率的計(jì)算對(duì)照組平均OD值-給藥組平均OD值抑制率=..............................................xl00%對(duì)照組平均OD值.IC50的計(jì)算:根據(jù)中國(guó)藥科大學(xué)新藥篩選中心提供的IC50軟件計(jì)算所得。MTT法測(cè)試結(jié)果示于表1。錳配合物體外抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)MTT法測(cè)試結(jié)果示于表1。表1錳配合物對(duì)癌鄉(xiāng)田胞抑制作用MTT實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>數(shù)據(jù)顯示在100umol/L濃度錳配合物對(duì)肝癌細(xì)胞抑制率超過(guò)50%，對(duì)宮頸癌細(xì)胞和細(xì)胞肺癌抑制率分別為85%和90%。對(duì)宮頸癌細(xì)胞Hela和細(xì)胞肺癌A549半數(shù)抑制率需要的化合物濃度IC50分別為9和18umol/L，對(duì)肝癌細(xì)胞半數(shù)抑制率需要的化合物濃度為IC50為61umol/L。而化合物MnCl2在小于100umol/L對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)沒(méi)有抑制作用。這說(shuō)明我們合成的錳配合物[L2Mn2CU]可作為抗癌藥用先導(dǎo)物。4化合物與線粒體作用實(shí)驗(yàn)?zāi)[脹程度根據(jù)線粒體懸液在波長(zhǎng)為540nm處的吸光值的變化進(jìn)行測(cè)定。制備的肝臟線粒體按0.51.0mg蛋白^r1重懸于線粒體緩沖液(125mmol-L—1sucrose,50mmol'L-1KC1,2mmol.L-1KH2PO4,5mmol'I/1succinateacid，5Hmol丄-1rotenone,10mmol.L懇1Hepes，pH7.4)中，加入50jamol'L"Ca2+(30。C)。檢測(cè)加入Ca"后5min內(nèi)吸光值的變化(AA)，AA值越大，表明線粒體腫脹度越高。在觀察化合物作用的實(shí)驗(yàn)中，化合物先加入線粒體懸液中，孵育3min,加入Ca2—，每30S測(cè)一次吸光值。最后以時(shí)間為橫坐標(biāo)，AA540nm為縱坐標(biāo)作圖。錳配合物對(duì)5(^molC^+誘導(dǎo)的小鼠肝臟線粒體腫脹的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果示于圖2，由圖2的結(jié)果可以看出BL組的吸光值下降較小(0.075)，說(shuō)明線粒體懸液較穩(wěn)定，但仍有一些自發(fā)腫脹。50pmoH/1C^+可以誘發(fā)線粒體明顯腫脹，AAs4o達(dá)0.32。5(Vmol.L—1配合物預(yù)處理可以明顯對(duì)抗50nmol.L"Ca"誘發(fā)的線粒體腫脹(AAs4o達(dá)0.062)、而80^unol丄"配合物幾乎可以完全對(duì)抗Ca^誘發(fā)的線粒體腫脹(AA54o與BL組接近)，100nmol.U1配合物甚至可以對(duì)抗線粒體懸液的自發(fā)腫脹。另外，濃度高于50pmol丄"的配合物單獨(dú)作用時(shí)能夠?qū)咕€粒體懸液的自發(fā)腫脹。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明配合物以劑量依賴方式對(duì)抗C^+誘發(fā)的線粒體腫脹功能，直接影響線粒體的作用。權(quán)利要求1、具有抗腫瘤和影響線粒體功能的錳配合物，其結(jié)構(gòu)式為id="icf0001"file="S2007101922285C00011.gif"wi="89"he="43"top="5"left="5"img-content="drawing"img-format="tif"orientation="portrait"inline="no"/>2、權(quán)利要求1所述的抗腫瘤和影響線粒體功能的掹配合物的制備方法，其特征在于將N-烯丙基二吡啶甲基胺和MnCl2按摩爾比1:l溶于甲醇溶液中，控制在30-10(TC;反應(yīng)2-8小時(shí)，去甲醇獲得錳配合物二(y-氯)二氯二(N-烯丙基二吡啶甲基胺)雙錳(II)。3、權(quán)利要求2所述的抗腫瘤和影響線粒體功能的錳配合物的制備方法，其特征在于反應(yīng)溫度為8(TC，反應(yīng)時(shí)間為4小時(shí)。4、權(quán)利要求1所述的具有抗腫瘤和影響線粒體功能的錳配合物在制備具有抗腫瘤活性和治療<^2+誘發(fā)的線粒體的腫脹相關(guān)疾病的小分子藥用先導(dǎo)物的應(yīng)用。全文摘要一種具有抗腫瘤和影響線粒體功能的錳配合物，其結(jié)構(gòu)式為將N-烯丙基二吡啶甲基胺和MnCl₂按摩爾比1∶1溶于甲醇溶液中，控制在30-100℃；最佳反應(yīng)溫度為80℃，反應(yīng)時(shí)間2-8小時(shí)，最佳反應(yīng)時(shí)間為4小時(shí)，去甲醇獲得淡黃色錳配合物。本發(fā)明的錳配合物對(duì)腫瘤細(xì)胞A549，Hela、HepG-2和Eca109生長(zhǎng)均有強(qiáng)的抑制作用，能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡；配合物以劑量的方式對(duì)抗Ca²⁺誘發(fā)的線粒體的腫脹功能。文檔編號(hào)C07F13/00GK101182332SQ200710192228公開日2008年5月21日申請(qǐng)日期2007年12月21日優(yōu)先權(quán)日2007年12月21日發(fā)明者郭文杰,陳秋云,靜高,娟黃申請(qǐng)人:江蘇大學(xué)