專利名稱：：融合于堿性蛋白標(biāo)簽的加工酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及新的加工酶，其包含源于嗜熱細(xì)菌的堿性蛋白標(biāo)簽。
背景技術(shù)：
：重組蛋白在微生物宿主細(xì)胞中的表達(dá)廣泛用于人用治療性蛋白的工業(yè)生產(chǎn)。在目標(biāo)蛋白的N末端(或C末端)可以附著上融合伴倡以增加目標(biāo)蛋白的表達(dá)水平、溶解性或校正目標(biāo)蛋白的折疊，以及使下游加工時的純化趨于簡單。為保留目標(biāo)蛋白的生物活性，大多數(shù)情況下必須從目標(biāo)蛋白上去除融合伴倡。所述融合蛋白的加工可在表達(dá)后進(jìn)行，也可在一個或更多個純化步驟后進(jìn)行，其采用適當(dāng)?shù)哪芮懈钤撊诤习閭H的蛋白酶釋放目標(biāo)蛋白。含或不含融合伴侶的重組目標(biāo)蛋白在翻譯后也需要通過一個或更多個酶步驟進(jìn)行修飾以獲得特定的生物學(xué)功能。這些修飾包括除去不需要的甘露糖、海藻糖或木糖的糖基化，或引入糖基化。修飾也包括脫酰胺作用、酰胺化作用、曱基化作用、磷酸化作用、去磷酸化作用、硫酸化作用、乙酰化作用或轉(zhuǎn)氨作用。為了降低下游加工步驟的成本，這些加工酶能廉價生產(chǎn)就很重要，例如可大量表達(dá)，通過少量色譜步驟即可純化。此外，期望用于切割融合蛋白的加工酶可在加工完目標(biāo)蛋白后易于除去。所述加工酶能固定在純化柱上也是有利的。本發(fā)明提供了新的加工酶，其非常適于修飾目標(biāo)蛋白，包括從融合蛋白上切割融合伴侶。此外，所述新的加工酶在加工步驟之后易于從目標(biāo)蛋白中分離。發(fā)明概述本發(fā)明一方面涉及加工酶，其包含源于來自嗜熱細(xì)菌的強(qiáng)堿性核糖體蛋白質(zhì)的N末端附著的標(biāo)簽。一些所述標(biāo)簽公開于同時待決的專利申請PCT/EP2006/061493。所述標(biāo)簽利于可溶性帶標(biāo)簽的加工酶的高量表達(dá)。所述標(biāo)簽也使得在經(jīng)過單次陽離子交換色譜純化步驟后就能獲得高純度，以及使得帶標(biāo)簽的加工酶在目標(biāo)蛋白前體加工后易于去除。所述標(biāo)簽同樣使得帶標(biāo)簽的加工酶能利用陽離子交換色譜基質(zhì)作為固定劑進(jìn)行柱上加工。表述"強(qiáng)堿性的蛋白"表示具有高百分比堿性氨基酸殘基Lys和Arg的蛋白，例如至少占所述蛋白中總氨基酸殘基數(shù)目的約15%。"核糖體蛋白"表示在所有有機(jī)體中作為催化mRNA指引的蛋白合成的顆粒核糖體肽或多肽亞單位。核糖體蛋白通過如在結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫如InterPro和Prosite中報道的核糖體特征序列在它們序列的基礎(chǔ)上定義。采用核糖體蛋白的好處是其通常是帶正電的。本文中"嗜熱微生物，，表示最佳在約50。C至約100。C生長的微生物。其與中溫微生物相反，后者通常最佳在30-37。C生長。術(shù)語"嗜熱細(xì)菌"在本文中也包括超嗜熱細(xì)菌。在一個實(shí)施方案中，所述標(biāo)簽不含半胱氨酸殘基。在另一個實(shí)施方案中，所述標(biāo)簽包含約15至約250、約15至約225、15至約200、約15至約175、約15至約150、15至約75或約15至約50個氨基酸殘基。在一個實(shí)施方案中，所述標(biāo)簽具有約15至約250個氨基酸殘基。在一個實(shí)施方案中，所述標(biāo)簽具有約15至約200個氨基酸殘基。在一個實(shí)施方案中，所述標(biāo)簽具有約15至約150個氨基酸殘基。在一個實(shí)施方案中，所述標(biāo)簽具有約15至約IOO個氨基酸殘基。在一個實(shí)施方案中，所述標(biāo)簽具有約15至約50個氨基酸殘基。在另一個實(shí)施方案中，所述標(biāo)簽包含約20至約120、約20至約100、約20至約90、約20至約75個氨基酸殘基或約20至約50個氨基酸殘基。在一個實(shí)施方案中，所述標(biāo)簽具有約20至約120個氨基酸殘基。在一個實(shí)施方案中，所述標(biāo)簽具有約20至約IOO個氨基酸殘基。在一個實(shí)施方案中，所述標(biāo)簽具有約20至約90個氨基酸殘基。在一個實(shí)施方案中，所述標(biāo)簽具有約20至約75個氨基酸殘基。在一個實(shí)施方案中，所述標(biāo)簽具有約20至約50個氨基酸殘基。在一個實(shí)施方案中，所述標(biāo)簽具有約50至約250個氨基酸殘基。在一個實(shí)施方案中，所述標(biāo)簽具有約50至約225個氨基酸殘基。,所述標(biāo)簽具有約50至約200個氨基酸殘基。,所述標(biāo)簽具有約50至約175個氨基酸殘基。,所述標(biāo)簽具有約50至約150個氨基酸殘基。，所述標(biāo)簽具有約50至約125個氨基酸殘基。，所述標(biāo)簽具有約50至約100個氨基酸殘基。,所述標(biāo)簽具有約50至約75個氨基酸殘基。，所述標(biāo)簽具有約75至約250個氨基酸殘基。,所述標(biāo)簽具有約75至約225個氨基酸殘基。,所述標(biāo)簽具有約75至約200個氨基酸殘基。,所述標(biāo)簽具有約75至約175個氨基酸殘基。,所述標(biāo)簽具有約75至約150個氨基酸殘基。,所述標(biāo)簽具有約75至約125個氨基酸殘基。,所述標(biāo)簽具有約75至約100個氨基酸殘基。,所述標(biāo)簽具有約100至約250個氨基酸殘基。,所述標(biāo)簽具有約100至約225個氨基酸殘基。,所述標(biāo)簽具有約100至約200個氨基酸殘基。，所述標(biāo)簽具有約100至約175個氨基酸殘基。,所述標(biāo)簽具有約100至約150個氨基酸殘基。,所述標(biāo)簽具有約100至約125個氨基酸殘基。所述標(biāo)簽通常含有至少約15%的堿性氨基酸殘基，純化標(biāo)簽可含有約15%至約50%、約15%至約45%、約15%至約40%、約15%至約35%、約15%至約30%、約15%至約25%或約15%至約20%的堿性氨基酸殘基。在另一個實(shí)施方案中，所述標(biāo)簽包含約20%至約50%、約20%至約40%或約20%至約30%的堿性氨基酸殘基。在另一個實(shí)施方案中，所述標(biāo)簽包含約40%至約50%的堿性氨基酸殘基。在另一個實(shí)施方案中，所述標(biāo)簽包含約40%至約60%的堿性氨基酸殘基Lys和Arg。在一個實(shí)施方案中，所述標(biāo)簽包含15%至50%的堿性氨基酸殘基。在另一個實(shí)施方案中，所述標(biāo)簽包含15%至45%的堿性氨基酸殘基。在一個實(shí)施方案中在一個實(shí)施方案中在一個實(shí)施方案中在一個實(shí)施方案中在一個實(shí)施方案中在一個實(shí)施方案中在一個實(shí)施方案中在一個實(shí)施方案中在一個實(shí)施方案中在一個實(shí)施方案中在一個實(shí)施方案中在一個實(shí)施方案中在一個實(shí)施方案中在一個實(shí)施方案中在一個實(shí)施方案中在一個實(shí)施方案中在一個實(shí)施方案中在一個實(shí)施方案中在一個實(shí)施方案中在另一個實(shí)施方案中，所述標(biāo)簽包含15%至40%的堿性氨基酸殘基。在另一個實(shí)施方案中，所述標(biāo)簽包含15%至35%的堿性氨基酸殘基。在另一個實(shí)施方案中，所述標(biāo)簽包含15%至30%的堿性氨基酸殘基。在另一個實(shí)施方案中，所述標(biāo)簽包含15%至25%的堿性氨基酸殘基。在另一個實(shí)施方案中，所述標(biāo)簽包含15%至20%的堿性氨基酸殘基。在一個實(shí)施方案中，所述標(biāo)簽源于核糖體蛋白L9家族，如Prosite數(shù)據(jù)庫中所述(HuloN.,BairochA.,BulliardV.,CeruttiL.,DeCastroE.,Langendijk-GenevauxP.S.，PagniM.,SigristC丄A."ThePROSITEdatabase."NucleicAcidsRes.34:D227-D230(2006))。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，所述標(biāo)簽選自肽序列MSKTIVR匿SIDDALRRFKRAVSKTGTLQEVRKREFYEKPSVRR隨SEAARKRK(SEQIDNO:1);MGKKTVGVKKRLAKAY隨RRAP扁TVKTKRSVFGSPKRRHWRRSKLKV(SEQIDNO:2);MKRTYQPSRRKRKRTHGFLARKRTPGGRRVLKNRRRKGRWRLTV(SEQIDNO:3);MGKGDRRTRRG,RGTYGKYRPR隨(SEQIDNO:4);MAKVKMKTNRSAAKRFKVTAKGKIKRWKSGGAHYNTKKSSKRKRHLRKHTYVKDNMLKHVKALLKEF(SEQIDNO:5);MPKHSKRYLEARKLVDRTKYYDLDEA舊LVKKTATAKFDETIELHIQTGIDYRKPEQHIRGTIVLPHGTGKEVKVLVFAKGEKAKEALEAGADYVGAEDLVEKIEKEGFLDFDVAIATPDMMRIIGRLGKILGPRGLMPSPKSGTVTQEVAEAVKEFKKGRIEVRTDKTGNIHIPVGKRS回EKLKENIIAAIKQIMQMKPAGVKGQFIKKVVLASTMGPGIKLNLQSLLKE(SEQIDNO:6),MAQVDLLNVKGEKVGTLEISDFVFNIDPNYDVMWRYVDMQLSNRRAGTASTKTRGEVSGGGRKPWPQKHTGRARHGSIRSPIWRHGGVVHGPKPRDWSKKLNKKMKKLALRSALSVKYRENKLLVLDDLKLERPKTKSLKEILQNLQLSDKKTLIVLPWKEEGYMNVKLSGRNLPDVKVIIADNPNNSKNGEKAVRIDGLNVFDMLKYDYLVLTRDMVSK舊EVLGNEAGKALTA(SEQIDNO:7),MRYEYVPLKDQYEKEIVPALMKEFNYKNIHQVPKLVKIV國GIGEGSRNYDLIERHANELAKITGQKPIVTRARKSISNFKIRKGMPIGLKVTLRGARMYNFLYKLINIVLPKVRDFRGLDPNSFDGRGNYSFGLSEQLVFPELNPDEVRRIQGMDITIVTTAKTDQEARRLLELFGMPFKRG(SEQIDNO:8),MSRLAKKPIVLPQGVTVEIKD隨隨GPKGELSQEFLPYVKIEVEGNEVWVRPNEEQIIRKSDWRKVKMFQGTYWSLIRNMWGVTEGYKKELEIVGIGYRAQLQGNTLVMNLGYAHPVVYEIPSDVKIEVPAPNRIIVSGIDKQRVGQVAAEIRAFRPPNVYTGKGIRYVGEWRQKEGKKA(SEQIDNO:9),MKVILLRDVPKIGKKGEIKEVSDGYARNYLIPRGFAKEYTEGLERAIKHEKEIEKRKKEREREESEKILKELKKRTHWKVKAGEGGKIFGAVTAATVAEEISKTTGLKLDKRWFKLDKPIKELGEYSLEVSLPGGVKDTIKIRVEREE(SEQIDNO:10),MLTRQQKELIVKEMSEIFKKTSLILFADFLGFTVADLTELRSRLREKYGDGARFRW隱LLNLALKNAEYEGYEEFLKGPTAVLYVTEGDPVEAVKIIYNFYKDKKADLSRLKGGFLEGKKFTAEEVE陽KLPSKEELYAMLVGRVKAPITGLVFALSGILRNLVYVLNAIKEKKSE(SEQIDNO:11),MARYFPVQKTTMIKPEEVERKWYWDASGKVLGRLATRIAKILMGKHKPNYTPHVDTGDYVIWNADKWLTGKKLDQKVYYWHSGYPGGLKSLTARQMLEKHPERLIWLAVKRMLPKNRKGRKMLKRLKVYASPEHPHQAQKPEP舊L(SEQIDNO:12),MRLEDLRPTPGAMKKRKRVGRGPGSGHGKTSGRGHKGQKARGSGKV,FEGGQTPLQRRLPKRGFK國KKVYAWNVKVLEERFEANEEVTPEKLIERKIIKDLKDGVKILGDGELTKPLWKAHAFSKSAVEKIESAGGKAEVI(SEQIDNO:13),MRHRVKRHKLGRYGSHRKSLLRNLSREIVEHGSIVTTTAKAKALKTFMDKLVSKAIEAATTDDRARSVHLRRQINAVLGDRRLTNKLVDEIAKNYVGRRGGYVRVLRIGFRRGDAAEMSLVQLVEASSQEG(SEQIDNO:14),MDHLVKI舊KKYEKKEIPDFRPGDTVRVHVKV舊GDRERTQVFEGMAKRGSGINKTFTVRRIGSHGVGVERIFPVHSPWEKIEWRKGKVRRAKLYYLRNVRGKIRIKERRD(SEQIDNO:15),MRVKRAVHAKKKRKKYLKAAKGYRGALSRRYKLAKQMYVRSKWYSYVGRKQKKRDMRKLWITRINIAARNEGLKYSELIHGLKLAGVSINRKMLSELAVNDPEAFKEYVKIAKEALAS(SEQIDNO:16),MLYAIVETAGRQYRVEEGKILYTEKQKDYSPGDEIVFDRWFVRKDGEVLVGKPYVEGAKVVGKVLEHAKARKVKTVKYRPRKNSKVEKGHRQWYTAIK舊KIEL(SEQIDNO:17),MKQEKLSLHDVLIRPIITEKALILREQRKYVFEVNPLA畫LVKEAVEKLFNVKVEKVNILNMKPKPKRRGIFEGKTRSWKKAWTLKEGYTIKELEGEH(SEQIDNO:18)，MAHKKSGGVAKNGRDSLPKYLGVKVGDGQIVKAGNILVRQRGTRFYPGKNVGMGRDFTLFALKDGRVKFETKNNKKYVSVYEE(SEQIDNO:19),MKASELRNYTDEELKNLLEEKKRQLMELRFQLAMGQLKNTSLIKLTKRDIARIKTILRERELGIRR(SEQIDNO:20),MPKKLKIKLVKSPIGYSWDQKDTVKRLGLKK図WIKDDLPQIRGMIRKVKHLVEVEEIEEGGSNA(SEQIDNO:2",MPKVKTNRSAAKRFRITKNG國RNHAYRSHKTGKKRRNALRALRKKDWSSADKNRVLRLLGKK(SEQIDNO:22),MGQKVHPRGFRLGLSADWQAKWFNEKNYKEWLLEDEEIRKIIKNKYYHAGISEIYVERPDAERINITVKTARPGIIIGRKGSEITSLREELERKFNRRWINIE曰KTPELDAQLVAESIASRIEKRASYKVAMKRA國AMRKGAQGIKVMVAGRLGGAEIARREWYLRGRLPLQKI國DYGTATAWTKYGTIGIKVWIYKGDADI(SEQIDNO:23),METQGVMKEIQYEEFEEKHEIRRTSKVTKGGKNLSFRWAIVGNKNGKVGLGIGKAREVPEAIRKAISAAKRNIVEVPVINGTIPHEVIGRQDASKVLLKPAAPGTGIIAGGTVRAWELAGIQNILTKSLGSTNPLNLALATMNGL亂LDPRKVAKLRDISVEEVFKGVRRENNA(SEQIDNO:24),MVSLDPEKKNEIIKEFQ舊ENDTGSVEVQIALLTARIKHLTEHLRKHPKDFHSRRGLM國GRRRKMLKYLRHKKPEVYRELIAKLGIRK(SEQIDNO:25),MGRSRKKGPYVDRKLLEKIRKLNETGEKKVIKTWSRASMIIPEMVGHTIAVYNGMKHIPVYITE畫GHRLGEFAPTRRFGGHAD陽KKGELKK(SEQIDNO:26)和MPNIKSAKKRVRVSEKRRLRNKAYKTFFKNRIKEVLKAIENKEPKEWLELTRKAQAAIDKAVSKGVIHKNQGARRKARLFEKVNEYLRTLETTQE(SEQID:NO27).在另一個實(shí)施方案中，所述標(biāo)簽選自MKQEKLSLHDVLIRPIITEKALILREQRKYVFEVNPLANKNLVKEAVEKLFNVKVEKVNILNMKPKPKRRGIFEGKTRSWKKAWTLKEGYTIKELEGEH(SEQIDNO:18)和MAHKKSGGVAKNGRDSLPKYLGVKVGDGQIVKAGNILVRQRGTRFYPGKNVGMGRDFTLFALKDGRVKFETKNNKKYVSVYEE(SEQIDNO:19).在另一個實(shí)施方案中，所述標(biāo)簽選自MKVILLRDVPKIGKKGEIKEVSDGYARNYLIPRGFAKEYTEGLERAIKHEKEIEKRKKEREREESEKILKELKKRTHWKVKAGEGGKIFGAVTAATVAEEISKTTGLKLDKRWFKLDKPIKELGEYSLEVSLPGGVKDTIKIRVEREE(SEQIDNO:10);MDHLVKHEKKYEKKEIPDFRPGD-TVRVHVKVIEGDRERTQVFEGIVIAKRGSGINKTFTVRRIGSHGVGVERIFPVHSPWEKIEWRKGKVRRAKLYYLRNVRGKIRIKERRD(SEQIDNO:15)和MSKTIVRKNESIDDALRRFKRAVSKTGTLQEVRKREFYEKPSVRR薩SEAARKRK(SEQIDNO:1).在另一個實(shí)施方案中，所述標(biāo)簽選自MPKHSKRYLEARKLVDRTKYYDLDEAIELVKKTATAKFDET舊LHIQTGIDYRKPEQHIRGTIVLPHGTGKEVKVLVFAKGEKAKEALEAGADWGAEDLVEKIEKEGFLDFDVAIATPDMMRIIGRLGKILGPRGLMPSPKSGTVTQEVAEAVKEFKKGR舊VRTDKTGNIHIPVGKRSFDNEKLKENIIAAIKQIMQMKPAGVKGQFIKKWLASTMGPGIKLNLQSLLKE(SEQIDNO:6);MAQVDLLNVKGEKVGTLEISDFVFNIDPNYDVMWRYVDMQLSNRRAGTASTKTRGEVSGGGRKPWPQKHTGRARHGSIRSPIWRHGGWHGPKPRDWSKKLNKKMKKLALRSALSVKYRE亂LVLDDLKLERPKTKSLKEILQNLQLSDKKTLIVLPWKEEGYMNVKLSGRNLPDVKVIIADNPNNSKNGEKAVRIDGLNVFDMLKYDYLVLTRDMVSKIEEVLGNEAGKALTA(SEQIDNO:7),MSRLAKKPIVLPQGVTVEIKDNWKVKGPKGELSQEFLPYVK舊VEGNEVWVRPNEEQIIRKSDWRKVKMFQGTYWSLIRNMWGVTEGYKKELEIVGIGYRAQLQGNTLVMNLGYAHPWYEIPSDVKIEVPAPNRlIVSGIDKQRVGQVAAEIRAFRPPNVYTGKGIRYVGEWRQKEGKKA(SEQIDNO:9),MGQKVHPRGFRLGLSADWQAKWFNEKNYKEWLLEDE日RKIIKNKYYHAGISEIYVERPDAE圓TVKTARPGIIIGRKGSEITSLREELERKFNRRWINIEEIKTPELDAQLVAESIASRIEKRASYKVAMKRA圓AMRKGAQGIKVMVAGRLGGAEIARREWYLRGRLPLQKI固DYGTATAWTKYGTIGIKVWIYKGDADI(SEQIDNO:23)和METQGVMKEIQYEEFEEKIIEIRRTSKVTKGGKNLSFRWAIVGNKNGKVGLGIGKAREVPEAIRKAISAAKRNIVEVPVINGTIPHEVIGRQDASKVLLKPAAPGTGIIAGGTVRAWELAGIQNILTKSLGSTNPLNLALATMNGLKNLLDPRKVAKLRDISVEEVFKGVRRENNA(SEQIDNO:24),在另一個實(shí)施方案中，所述標(biāo)簽選自MKVILLRDVPKIGKKGEIKEVSDGYARNYLIPRGFAKEYTEGLERAIKHEKEIEKRKKEREREESEKILKELKKRTHWKVKAGEGGKIFGAVTAATVAEEISKTTGLKLDKRWFKLDKPIKELGEYSLEVSLPGGVKDT隨VEREE(SEQIDNO:10);MKVILLEPLENLGDVGQWDVKPGYARNYLLPRGLAVLATESNLKALEARIRAQAKRLAERKAEAERLKE旺NLTLTIPVRAGETKIYGSVTAKDIAEALSRQHGITIDPKRLALEKPIKELGEYVLTYKPHPEVPIQLKVSWAQE(SEQIDNO:41);MKVIFLKDVKGKGKKGEIKDVADGYANNFLFKQGLAIEATPANIKALEAQKQKEQRQAAEELANAKKLKEELEKLTVEIPAKAGEGGRLFGSITSKQIAEALQAQHGLKLDKRK舊LADAIRSLGYTNVPVKLHPEVTATLKVHVKEQK(SEQIDNO:42);MKWLLKDVSKIGKKGEIKNVSDGYARNYLIPKGLALEATPRVLKRLEAEKR-KKEEEKIQIKTQNEELLKMLKKFLYKIPVKAGESGKLFGALTNSDIAKAVEKIADVNIDKKFIVLEKPIKEIGMYDVLVRLPEGVSGKIKVEVIQEGKN(SEQIDNO:43)和MKLILTQEVAGLGGPGDWEVRDGYGRNYLLPKRLAMPASPGAVKQVALIKRAREVREIRDLDQARALRDQLEALPVTLPARAGSGGRLFGSVTPDDIAAAVHAAGGPKLDKRREISGPIKTIGSHQVTVRLHPEVSATVSVEWPAS(SEQIDNO:44).在又一個實(shí)施方案中，所述標(biāo)簽具有序列MKQEKLSLHDVLIRPIITEKALILREQRKYVFEVNPLAN亂VKEAVEKL隨KVE鬧ILNMKPKPKRRGIFEGKTRSW隨WTLKEGYTIKELEGEH(SEQIDNO:18).在又一個實(shí)施方案中，所述標(biāo)簽具有序列MAHKKSGGVAKNGRDSLPKYLGVKVGDGQIVKAGNILVRQRGTRFYPGKNVGMGRDFTLFALKDGRVKFETKNNKKYVSVYEE(SEQIDNO:19).在又一個實(shí)施方案中，所述標(biāo)簽具有序列MDHLVKIIEKKYEKKEIPDFRPGDTVRVHVKVIEGDRERTQVFEGMAKRGSGINKTFTVRRIGSHGVGVERIFPVHSPVVEK舊WRKGKVRRAKLYYLRNVRGKIRIKERRD(SEQIDNO:15).在又一個實(shí)施方案中，所述標(biāo)簽具有序列MKVILLRDVPKIGKKGEIKEVSDGYARNYLIPRGFAKEYTEGLERAIKHEK日EKRKKEREREESEKILKELKKRTHW隨AGEGGKIFGAVTAATVAEEISKTTGLKLDKRWFKLDKPIKELGEYSLEVSLPGGVKDTIKIRVEREE(SEQIDNO:10).在又一個實(shí)施方案中，所述標(biāo)簽具有序列MKVILLEPLENLGDVGQWDVKPGYARNYLLPRGLAVLATES阻ALEARIRAQAKRLAERKAEAERLKEILENLTLTIPVRAGETKIYGSVTAKDIAEALSRQHGITIDPKRLALEKPIKELGEYVLTYKPHPEVPIQLKVSWAQE(SEQIDNO:41).在又一個實(shí)施方案中，所述標(biāo)簽具有序列MKVIFLKDVKGKGKKGEIKDVADGYANNFLFKQGLA舊ATPANIKALEAQKQKEQRQAAEELA隨KLKEELEKLTVEIPAKAGEGGRLFGSITSKQIAEALQAQHGLKLDKRK舊LADAIRSLGYTNVPVKLHPEVTATLKVHVKEQK(SEQIDNO:42).在又一個實(shí)施方案中，所述標(biāo)簽具有序列MKVVLLKDVSKIGKKGEIKNVSDGYARNYLIPKGLALEATPRVLKRLEAEKRKKEEEKIQIKTQNEELLKMLKKFLYKIPVKAGESGKLFGALTNSDIAKAVEKIADVNIDKKFIVLEKPIKEIGMYDVLVRLPEGVSGKIKVEVIQEGKN(SEQIDNO:43).在又一個實(shí)施方案中，所述標(biāo)簽具有序列MKLILTQEVAGLGGPGDWEVRDGYGRNYLLPKRLAMPASPGAVKQVALIKRAREVR曰RDLDQARALRDQLEALPVTLPARAGSGGRLFGSVTPDDIAAAVHAAGGPKLDKRR舊SGPIKTIGSHQVTVRLHPEVSATVSVEWPAS(SEQIDNO:44).所述標(biāo)簽可直接或通過連接基團(tuán)附著于所述加工酶的N末端氨基酸。所述連接基團(tuán)可具有多種目的功能，即幫助所述標(biāo)簽與加工酶的附著，以及定位所述標(biāo)簽和加工酶的相對位置以保證加工酶正確的折疊。接頭也可用于以有利的方式將所述標(biāo)簽提供到用于純化帶標(biāo)簽加工酶的純化基質(zhì)。所述接頭可具有1-30、1-25、1-20、1-15、1-14、1-13、1-12、1-11、1-10、1-9、1-8、1-7、1-6、1-5、1-4或1-3個氨基酸殘基。在又一個實(shí)施方案中，所述接頭具有2-30、2-25、2-20、2-15、2-14、2-13、2-12、2-11、2-10、2-9、2-8、2-7、2-6、2-5或2-4個氨基酸殘基。在又一個實(shí)施方案中，所述接頭具有3-30、3-25、3-20、3-15、3-14、3-13、3-12、3-11、3-10、3-9、3-8、3-7、3-6、3-5或3-4個氨基酸殘基。在又一個實(shí)施方案中，所述接頭具有4-30、4-25、4-20、4-15、4-14、4-13、4-12、4-11、4-10、4-9、4-8、4-7、4-6或4-5個氨基酸殘基。在又一個實(shí)施方案中，所述接頭具有5-30、5-25、5-20、5-15、5-14、5-13、5-12、5-11、5-10、5-9、5-8、5-7或5-6個氨基酸殘基。在又一個實(shí)施方案中，所述接頭具有6-30、6-25、6-20、6-15、6-14、6畫13、6-12、6-11、6-10、6-9、6-8或6-7個氨基酸殘基。在又一個實(shí)施方案中，所述接頭具有7-30、7-25、7-20、7-15、7-14、7畫13、7-12、7-11、7-10、7-9或6-8個氨基酸殘基。在一個實(shí)施方案中，所述接頭具有20個氨基酸殘基。在另一個實(shí)施方案中，所述接頭具有15個氨基酸殘基。在另一個實(shí)施方案中，所述接頭具有12個氨基酸殘基。在另一個實(shí)施方案中，所述接頭具有10個氨基酸殘基。在另一個實(shí)施方案中，所述接頭具有9個氨基酸殘基。在另一個實(shí)施方案中，所述接頭具有8個氨基酸殘基。在另一個實(shí)施方案中，所述接頭具有7個氨基酸殘基。在另一個實(shí)施方案中，所述接頭具有6個氨基酸殘基。在另一個實(shí)施方案中，所述接頭具有5個氨基酸殘基。接頭中的氨基酸殘基可以是任何氨基酸殘基，依賴于接頭所需的功能可以相同或不同。在一個實(shí)施方案中，所述接頭包含使得接頭成為柔性結(jié)構(gòu)的氨基酸殘基例如交替的Ser和Gly殘基。其他氨基酸殘基形成剛性結(jié)構(gòu)即形成a螺旋結(jié)構(gòu)的氨基酸，例如Ala和Leu。此外，某些氨基酸殘基向接頭添加結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)角，例如Pro。連接基團(tuán)的非限制性例子有SSSGSSGSSGSS(SEQIDNO;28)、GGSSGGSS(SEQIDNO:29)、SSSGSGSG(SEQIDNO:30)、ALALALA(SEQIDNO:31)、ALALALAPA(SEQIDNO:32)、SSSALALALA(IDNO:33)、SGSGSGSGS(IDNO:34)、SSSGSGSGSG(SEQIDNO:47)和GSSGSGS(SEQIDNO:48)。在一個實(shí)施方案中，所述接頭具有序列SSSGSSGSSGSS(SEQIDNO;28)。在另一個實(shí)施方案中，所述接頭具有序列GGSSGGSS(SEQIDNO:29)。在另一個實(shí)施方案中，所述接頭具有序列SSSGSGSG(SEQIDNO:30)。在另一個實(shí)施方案中，所述接頭具有序列ALALALA(SEQIDNO:31)。在另一個實(shí)施方案中，所述接頭具有序列ALALALAPA(SEQIDNO:32)。在另一個實(shí)施方案中，所述接頭具有序列SSSALALALA(IDNO:33)。在另一個實(shí)施方案中，所述接頭具有序列SGSGSGSGS(IDNO:34)。在另一個實(shí)施方案中，所述接頭具有序列SSSGSGSGSG(SEQIDNO:47)。在另一個實(shí)施方案中，所述接頭具有序列GSSGSGS(SEQIDNO:48)。在一個實(shí)施方案中，上述標(biāo)簽可以是兩種相同或不同標(biāo)簽的組合。所述標(biāo)簽也可以是具體公開標(biāo)簽的類似物。"類似物，，表示與原始序列相比具有最高達(dá)10%的突變的序列。這類突變包括添加、缺失或添加或其任何組合，只要所述突變不改變標(biāo)簽的原始功能性即可。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明包括加帶標(biāo)簽的加工酶，其中所述標(biāo)簽是原始標(biāo)簽的截短類似物。表述"截短類似物"表示覆蓋原始標(biāo)簽序列，其中來自N末端或C末端的最高達(dá)10%的原始氨基酸殘基被缺失，條件是所述截短類似物保留了未修飾序列的功能性。如果所述標(biāo)簽包括兩種標(biāo)簽的組合，這些標(biāo)簽在一個實(shí)施方案中由接頭所連接。在一個實(shí)施方案中，所述連接兩種標(biāo)簽的接頭選自SSSGSSGSSGSS(SEQIDNO;28)、GGSSGGSS(SEQIDNO:29)、SSSGSGSG(SEQIDNO:30)、ALALALA(SEQIDNO:31)、ALALALAPA(SEQIDNO:32)、SSSALALALA(IDNO:33)、SGSGSGSGS(IDNO:34)、SSSGSGSGSG(SEQIDNO:47)和GSSGSGS(SEQIDNO:48)。本發(fā)明包括任何本文中所公開的標(biāo)簽、接頭和加工酶實(shí)施方案的組合。在一個實(shí)施方案中，所述帶標(biāo)簽的加工酶包含N末端延長，其包括標(biāo)簽和接頭的組合，選自下組SEQIDNO:l和SEQIDNO:28、SEQIDNO:3和SEQIDNO:28、SEQIDNO:6和SEQIDNO:28、SEQIDNO:9和SEQIDNO:28、SEQIDNO:IO和SEQIDNO:28、SEQIDNO:ll和SEQIDNO:28、SEQIDNO:12和SEQIDNO:28、SEQIDNO:13和SEQIDNO:28、SEQIDNO:15和SEQIDNO:28、SEQIDNO:16和SEQIDN〇:28、SEQIDNO:20和SEQIDNO:28、SEQIDNO:21和SEQIDNO:28、SEQIDNO:24和SEQIDNO:28、SEQIDNO:27和SEQIDNO:28、SEQIDNO:18和SEQIDNO:28、SEQIDNO:19和SEQIDNO:28、SEQIDNO:41和SEQIDNO:28、SEQIDNO:42和SEQIDNO:28、SEQIDNO:43和SEQIDNO:28，以及SEQIDNO:44和SEQIDNO:28。在一個實(shí)施方案中，所述帶標(biāo)簽的加工酶包含N末端延長，其包括標(biāo)簽和接頭的組合，選自下組SEQIDNO:l和SEQIDNO:47、SEQIDNO:3和SEQIDNO:47、SEQIDNO:6和SEQIDNO:47、SEQIDNO:9和SEQIDNO:47、SEQIDNO:10和SEQIDNO:47、SEQIDNO:l1和SEQIDNO:47、SEQIDNO:12和SEQIDNO:47、SEQIDNO:13和SEQIDNO:47、SEQIDNO:15和SEQIDNO:47、SEQIDNO:16和SEQIDNO:47、SEQIDNO:20和SEQIDNO:47、SEQIDNO:21和SEQIDNO:47、SEQIDNO:24和SEQIDNO:47、SEQIDNO:27和SEQIDNO:47、SEQIDNO:18和SEQIDNO:47、SEQIDNO:19和SEQIDNO:47、SEQIDN〇:41和SEQIDNO:47、SEQIDNO:42和SEQIDNO:47、SEQIDNO:43和SEQIDNO:47以及SEQIDNO:44和SEQIDNO:47。在一個實(shí)施方案中，所述帶標(biāo)簽的加工酶包含N末端延長，其包括標(biāo)簽和接頭的組合，選自下組SEQIDNO:l和SEQIDNO:48、SEQIDNO:3和SEQIDNO:48、SEQIDNO:6和SEQIDNO:48、SEQIDNO:9和SEQIDNO:48、SEQIDNO:IO和SEQIDNO:48、SEQIDNO:ll和SEQIDNO:48、SEQIDNO:12和SEQIDNO:48、SEQIDNO:13和SEQIDNO:48、SEQIDNO:15和SEQIDNO:48、SEQIDNO:16和SEQIDNO:48、SEQIDNO:20和SEQIDNO:48、SEQIDNO:21和SEQIDNO:48、SEQIDNO:24和SEQIDNO:48、SEQIDNO:27和SEQIDNO:48、SEQIDNO:18和SEQIDNO:48、SEQIDNO:19和SEQIDNO:48、SEQIDNO:41和SEQIDNO:48、SEQIDNO:42和SEQIDNO:48、SEQIDNO:43和SEQIDNO:48以及SEQIDNO:44和SEQIDNO:48。在一個實(shí)施方案中，所述標(biāo)簽選自由SEQIDNO:10、SEQIDNO:41、SEQIDNO:42、SEQIDNO:43和SEQIDNO:44組成的組，所述接頭選自由SEQIDNO:28、SEQIDNO:29、SEQIDNO:30、SEQIDNO:34、SEQIDNO:47和SEQIDNO:48組成的組。本發(fā)明的另一方面涉及制備帶標(biāo)簽加工酶的方法，所述方法包括i)在適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)宿主中表達(dá)包含任一本文中公開實(shí)施方案中所述N末端標(biāo)簽的加工酶，所述N末端標(biāo)簽源于來自嗜熱細(xì)菌的強(qiáng)堿性蛋白，ii)將表達(dá)的帶標(biāo)簽加工酶加載到陽離子交換柱上，iii)以及用適當(dāng)?shù)南疵撘合疵撍龅膸?biāo)簽加工酶。本發(fā)明的另一方面涉及修飾目標(biāo)蛋白前體的方法，包括將本發(fā)明的帶標(biāo)簽加工酶與目標(biāo)蛋白前體反應(yīng)，以及從加工酶中分離目標(biāo)蛋白。所述加工酶通常選自氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶、水解酶、裂解酶、異構(gòu)酶和連接酶。在一個實(shí)施方案中，所述加工酶為蛋白酶，用于切割融合蛋白。在一個實(shí)施方案中，所述加工蛋白酶選自由天冬氨酸蛋白酶、金屬蛋白酶、絲氨酸蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶組成的組。在另一個實(shí)施方案中，絲氨酸蛋白酶包括胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、腸激酶(EK)、凝血酶、因子Xa和激肽釋放酶。在一個實(shí)施方案中，半胱氨酸蛋白酶選自組3C蛋白酶和2A蛋白酶，其由冠狀病毒科(Coto""、小核并唐核酸病毒科(尸/comavz'r油e)、逆轉(zhuǎn)錄病毒科(Ae加v/r油e)、腺病毒科(^4A"ovzWd"e)或黃病毒科(F/"v/wWtfoe)的病毒基因組編碼。其他優(yōu)選的實(shí)施方案包括來自小核糖核酸病毒科(尸/cowa和冠狀病毒科(Coro"aWndae)的3C和2A蛋白酶。在另一個實(shí)施方案中，3C蛋白酶選自人鼻病毒(HumanRhinoVirus)3C蛋白酶，序列為GPNTEFALSLLRKNIMTITTSKGEFTGLG舊DRVCVIPTH-AQPGDDVLVNGQKIRVKDKYKLVDPE,LELTVLTLDRNEKFRDIRGFISEDLEGVDATLWHSNNFTNTILEVGPVTMAGLINLSSTPTNRMIRYDYATKTGQCGGVLCATGKIFGIHVGGNGRQGFSAQLKKQYFVEKQ(SEQIDNO:35);曱型肝炎菌林183C蛋白酶，序列為STLEIAGLV畫LVQFGVGEKNGCVRWVMNALGVKDDWLLVPSHAYKFE-KDYEMMEFYFNRGGTYYSISAGNVVIQSLDVGFQDVVLMKVPTIPKFRDITEHFIKKGDVPRALNRLATLVTTVNGTPMLISEGPLKMEEKATYVHKKNDGTTVDLTVDQAWRGKGEGLPGMCGGALVSSNQSIQNAILGIHVAGGNSILVAKLVTQEMFQNIDKKIESQ(SEQIDNO:45)或兔出血病病毒3C樣蛋白酶，序列為GLPGFMRHNGSGWMIHIGNGLYISNTHTARSSCSEIVTCSPTTDLCLVKGEAIRSVAQIAEGTPVCDWKKSPISTYGIKKTLSDSTKIDVLAYDGCTQ丌HGDCGLPLYDSSGKIVAIHTGKLLGFSKMCTLIDLTITKGVYE(SEQIDNO:46).在另一個實(shí)施方案中，所述蛋白酶來自植物病毒。所述蛋白酶典型地來自下列植物病毒科雀麥花葉病毒科(Bromoviridae)、Partitiviridae、雙粒病毒科(Geminiviridae)、馬鈴薯Y病毒科(Potyviridae)、蕃茄叢矮病毒科(Tombusviridae)、i工豆花葉病毒科(Comoviridae)、彈狀病毒科(Rhabdoviridae)、呼腸孤病毒科(Reoviridae)、馬鈴薯Y病毒禾牛(Potyviridae)、隨4半病毒牙+(Sequiviridae)和布尼亞病毒矛牛(Bimyaviridae)。在一個實(shí)施方案中，所述來自植物病毒的蛋白酶為成熟煙草蝕紋病毒(TEV)蛋白酶，氨基酸序列為GESLFKGPRDYNPISSTICHLTNESDGHTTSLYGIGFGPFIITNKHLFRRNNGTLLVQSLHGVFKVKNTTTLQQHLIDGRDMIIIRMPKDFPPFPQKLKFREPQREERICLVTTNFQTKSMSSMVSDTSCTFPSSDGIFWK圓QTKDGQCGSPLVSTRDGFIVG舊SASNFT畫NYFTSVPKNFMELLTNQEAQQWVSGWRLNADSVLWGGHKVFMVKPEEPFQPVKEATQLMN(SEQIDNO:38)可以由本發(fā)明的加工酶修飾的前體蛋白產(chǎn)生的目標(biāo)蛋白可選自人蛋白及其類似物，例如抑酶肽、組織因子途徑抑制劑或其他蛋白酶抑制劑、胰島素或胰島素類似物、人或牛生長激素、白細(xì)胞介素、胰高血糖素、GLP-1、GLP-2、IGF-I、IGF-II、組織纖溶酶原激活劑、轉(zhuǎn)化生長因子a或p、血小板衍生生長因子、GRF(生長激素釋放因子)、免疫球蛋白、EPO、TPA、蛋白質(zhì)C、血液凝固因子例如FVII、FVIII、FIV和FXIII、毒蜥外泌肽-3、exentidin-4以及酶或其功能性類似物。在本發(fā)明的另一方面，所述目標(biāo)蛋白選自胰島素拮抗劑或激動劑肽，例如S661，或肽激素例如淀粉狀蛋白毒素(amylin)或其功能性類似物。在本發(fā)明的另一方面，所述目標(biāo)蛋白選自與任何蛋白質(zhì)的修飾有關(guān)的酶，例如轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、轉(zhuǎn)移酶和消旋酶。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及采用本發(fā)明的帶標(biāo)簽加工酶從轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶原(proTGase)中除去前結(jié)構(gòu)域的方法。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及用帶標(biāo)簽的HRV143C蛋白酶、帶標(biāo)簽的HAV183C蛋白酶或帶標(biāo)簽的RHDV3C蛋白酶切割轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶原(proTGase)的方法。在該實(shí)施方案中，所述標(biāo)簽選自SEQIDNO:IO、SEQIDNO:41、SEQIDNO:42、SEQIDNO:43或SEQIDNO:44,接頭選自由SEQIDNO:28、SEQIDNO:29、SEQIDNO:30、SEQIDNO:34、SEQIDNO:47和SEQIDNO:48組成的組。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及用帶標(biāo)簽的HRV143C蛋白酶、帶標(biāo)簽的HAV183C蛋白酶、帶標(biāo)簽的TEV蛋白酶或帶標(biāo)簽的RHDV3C蛋白酶除去人生長激素或其類似物的融合伴侶的方法。在該實(shí)施方案中，所述標(biāo)簽選自SEQIDNO:IO、SEQIDNO:41、SEQIDNO:42、SEQIDNO:43或SEQIDNO:44,接頭選自由SEQIDNO:28、SEQIDNO:29、SEQIDNO:30、SEQIDNO:34、SEQIDNO:47和SEQIDNO:48組成的組。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及用帶標(biāo)簽的HRV143C蛋白酶、帶標(biāo)簽的HAV183C蛋白酶、帶標(biāo)簽的TEV蛋白酶或帶標(biāo)簽的RHDV3C蛋白酶除去人淀粉狀蛋白毒素或其類似物的融合伴侶的方法。在該實(shí)施方案中，所述標(biāo)簽選自SEQIDNO:IO、SEQIDNO:41、SEQIDNO:42、SEQIDNO:43或SEQIDNO:44，所述接頭選自由SEQIDNO:28、SEQIDNO:29、SEQIDNO:30、SEQIDNO:34、SEQIDNO:47和SEQIDNO:48組成的組。附圖簡述圖l公開了編碼pACSH238加工酶的源于pETlla的載體的載體圖譜，所述pACSH238加工酶由作為N末端純化標(biāo)簽的SEQIDNO:IO,作為接頭的SEQIDNO:28,以及作為HRV143C蛋白酶的SEQIDNO:35組成。圖中給出了Ndel、Xhol和BamHI克隆位點(diǎn)，以及l(fā)acl編碼序列、氨千西林(bla)編碼序列、pBR322復(fù)制起點(diǎn)、T7啟動子區(qū)域、T7終止子區(qū)域，以及圖2公開了pACSH294與pACSH239在25攝氏度下孵育過夜后提取和解析的質(zhì)譜圖。在i:100的酶底物比例下，可清楚的檢測到S661肽(4802.1Da)以及釋放的標(biāo)簽+接頭(10168.4Da)。未檢測到完整的融合蛋白，其表明所述融合蛋白已完全被切割成標(biāo)簽部和S661肽。Y軸表示測定的離子強(qiáng)度，X軸表示以道爾頓(Da)為單位的分子量。發(fā)明詳述本發(fā)明提供了新的加工酶，其可以用于修飾蛋白，例如切割微生物宿主細(xì)胞中表達(dá)的融合蛋白。此外，本發(fā)明提供了有效表達(dá)和純化所述帶標(biāo)簽力o工酶的方法。根據(jù)本發(fā)明的加工酶包括N末端融合的標(biāo)簽，以利于帶標(biāo)簽的加工酶高量可溶表達(dá)，并且保證利用單步陽離子交換色譜的有效純化，以及在使用后容易除去帶標(biāo)簽的加工酶。所述標(biāo)簽?zāi)茉黾訋?biāo)簽加工酶的溶解性和穩(wěn)定性。這是有利的，因?yàn)槿芙庑院懿畹拿感枰蟮姆磻?yīng)體積、更長的孵育時間以及更為特異性的反應(yīng)條件。所述標(biāo)簽同樣利于與陽離子柱的結(jié)合，從而使得帶標(biāo)簽的加工酶能利用陽離子交換色譜基質(zhì)作為固定劑進(jìn)行柱上切割。本發(fā)明某些使用的標(biāo)簽在同時待決的申請PCT/EP2006/061493中公開。這些標(biāo)簽源于嗜熱細(xì)菌的菌林，最適溫度為50。C至水的沸點(diǎn)以上。在很高溫度下能生存的菌抹稱為超嗜熱菌或嗜熱菌，其最適溫度為80。C(176。F)或更高。嗜熱細(xì)菌天然存在于溫泉、熱土、地?zé)崤艢饪诤推渌邷氐貐^(qū)。從嗜熱脂肪芽孢桿菌(Sa"〃wsWewoAem7o//7z〃w力(例如在許多土壤中在65°C以上生長)中克隆RS21—BACST(SEQIDNO:l)用作標(biāo)簽。為了在高溫下生存，這些有機(jī)體具有比中溫微生物更為穩(wěn)定的進(jìn)化蛋白。根據(jù)本發(fā)明，源于這些嗜熱細(xì)菌的標(biāo)簽通常是可溶的、極為穩(wěn)定的，并且由于在氨基酸序列中具有大量的Arg和Lys，其具有高堿性的PI值。所述標(biāo)簽的PI值通常為9-13.5。在一個實(shí)施方案中，所述標(biāo)簽的PI值高于約9。在另一個實(shí)施方案中，所述標(biāo)簽的PI值在約9-12.5之間。在另一個實(shí)施方案中，所述標(biāo)簽的PI值在約10-12.5之間，在又一個實(shí)施方案中，所述pl約10。溶解性被認(rèn)為源于蛋白的通常高的表面電荷數(shù)。本發(fā)明的加工酶可用于加工重組表達(dá)的蛋白，以獲得所需的修飾蛋白。所述加工酶選自下列酶組氧化還原酶，其可催化氧化/還原反應(yīng)；轉(zhuǎn)移酶，其可轉(zhuǎn)移官能團(tuán)(例如磷酸基)；水解酶，其催化不同鍵的水解(包括水解肽鍵的蛋白酶)；裂解酶，其通過水解和氧化以外的方式切割鍵；異構(gòu)酶，其催化單個分子內(nèi)的變化；或連接酶，其通過共價鍵連接2個分子。這些酶可以是野生型酶或其通過公知的誘變步驟修飾的變種或類會乂物。可用于從目標(biāo)蛋白上切割融合伴侶，或去除目標(biāo)蛋白的前結(jié)構(gòu)域或修剪目標(biāo)蛋白N末端或C末端氨基酸的帶標(biāo)簽蛋白酶的例子有天冬氨酸蛋白酶、金屬蛋白酶、絲氨酸蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶。絲氨酸蛋白酶的非限制性例子包括胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、腸激酶(EK)、凝血酶、因子Xa和激肽釋放酶。半胱氨酸蛋白酶的非限制性例子包括從冠狀病毒科(Cow"a、小核4唐核酸病毒牙牛(尸zcorwaw'n^fe)、逆4爭錄病毒牙牛(ie/yoWr油e)、腺病毒科(」tfe"owWc/"e)、杯狀病毒科(Ca/z'"'v/r油e)或黃病毒科(F/avz'v/n'^/e)的組中獲得的病毒蛋白酶。其他例子包括來自皰滲病毒、巨細(xì)J包病毒、A-D肝炎病毒、denque病毒、鼻病毒、脊骨4灰質(zhì)炎病毒、柯薩奇病毒、嚴(yán)重急性呼吸道綜合癥病毒(SARS)、mengo病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、口蹄疫病毒、人免疫缺陷病毒(HIV)、人T淋巴細(xì)胞病毒(HTLV)、人泡沫病毒和腺病毒的蛋白。其他非限制性的例子包^"來源于細(xì)菌例如利什曼原蟲屬(Leishmaniasp.)或真核孩炎生物例如錐蟲屬(Trypanosomasp.)的半胱氨酸蛋白酶。在一個實(shí)施方案中，所述半胱氨酸蛋白酶選自3C蛋白酶和2A蛋白酶，其由冠狀病毒科(Coraw"v/ndae)、小核糖核酸病毒科(尸/cor"avzWd"e)、逆轉(zhuǎn)錄病毒科(化加v&油e)、腺病毒科(J6fe"owW<i—或黃病毒科(F/aWv/nWae)的病毒基因組編碼。其他優(yōu)選的實(shí)施方案包括來自小核糖核酸病毒科(尸/cwmjfWn'(iae)和冠狀病毒科(Cora"av,Wdae)的3C和2A蛋白酶。其他半胱氨酸蛋白酶的例子包括胱天蛋白酶，例如人胱天蛋白酶1-10。3C蛋白酶的綜述見Krausslich,H.G.&Wimmer,E.,Viralproteinases,AnnualReviewofBiochemistry(1988)57,701-754。金屬蛋白酶的非限制性例子包括基質(zhì)金屬蛋白酶，例如基質(zhì)蛋白酶或膜結(jié)合金屬蛋白酶，例如MT1-MMP。其他實(shí)施方案包括天冬氨酸蛋白酶，例如胃蛋白酶和組織蛋白酶，例如組織蛋白酶D和凝乳酶。其他酶的例子包括脂肪酶、磷酸酶、糖基水解酶(例如甘露糖苷酶、木糖苷酶、巖藻糖苷酶)、激酶、單或雙氧化酶、過氧化物酶、轉(zhuǎn)氨酶、羧肽酶、酰胺酶、酯酶和4,酸酶?？刹捎盟鰩?biāo)簽加工酶修飾的目標(biāo)蛋白前體可以是任何蛋白，用作說明的例子有抑酶肽、組織因子途徑抑制劑或其他蛋白酶抑制劑、胰島素或胰島素前體、人或牛生長激素、白細(xì)胞介素、胰高血糖素、GLP-1、GLP-2、IGF-I、IGF-II、組織纖溶酶原激活劑、轉(zhuǎn)化生長因子a或卩、血小板衍生生長因子、GRF(生長激素釋放因子)、免疫球蛋白、EPO、TPA、蛋白質(zhì)C、血液凝固因子例如FVII、FVm、FIV和fxiii、毒蜥外泌肽-3、exentidin-4以及酶或其功能性類似物。目標(biāo)蛋白的其他例子有轉(zhuǎn)化生長因子a(TGF-a)、轉(zhuǎn)化生長因子卩(TGF-(3)、表皮生長因子(EGF)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、血小板生成素(TPO)、干擾素、尿激酶原、尿激酶、纖溶酶原激活物抑制物l、纖溶酶原激活物抑制物2、vonWillebmndt因子、細(xì)胞因子例如白介素，諸如白介素(IL)1、IL畫lRa、IL-2、IL陽4、IL畫5、IL國6、IL-9、IL畫ll、IL曙12、IL-13、IL國15、IL-16、IL-17、IL畫18、IL-20、IL國21、IL國21、IL國22,IL國23,IL畫24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28,IL-29、IL-30、IL-31、IL-32或IL-33,集落刺激因子(CFS)例如GM-CSF,干細(xì)胞因子、腫瘤壞死因子例如TNF-a、淋巴毒素-a、淋巴毒素-p、CD40L或CD30L,蛋白酶抑制劑例如抑酶肽，酶例如超氧化物歧化酶、天冬酰胺酶、精氨酸酶、精氨酸脫氨酶、腺苷脫氨酶、核糖核酸酶、過氧化氫酶、尿酸氧化酶、膽紅素氧化酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、堿性磷酸酶、卩-葡糖醛酸糖香酶(glucoronidase)、嘌呤核普磷酸化酶或巴曲酶，阿片樣物質(zhì)例如內(nèi)啡肽、腦啡肽或非天然阿片樣物質(zhì)，激素或神經(jīng)肽例如降鈣素、胰高血糖素、胃泌素、促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)、膽嚢收縮素、黃體生成素、促性腺激素釋放激素、絨毛膜促性腺激素、促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子、加壓素、催產(chǎn)素、抗利尿激素、促曱狀腺激素、促曱狀腺激素釋放激素、松弛素、催乳素、肽YY、神經(jīng)肽Y、胰多肽、瘦素、CART(可卡因和苯異丙胺調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄物)、CART相關(guān)肽、圍脂滴蛋白、黑皮質(zhì)素(促黑激素)例如MC-4、黑素濃縮激素、利尿納肽、腎上腺髓質(zhì)素、內(nèi)皮縮血管肽、胰泌素、淀粉狀蛋白毒素(amylin)、血管活性腸肽(VIP)、垂體腺苷酸環(huán)化酶活化多肽(PACAP)、鈴蟾肽、類鈴蟾肽、胸腺素、肝素結(jié)合蛋白、可溶性CD4、下丘腦釋放因子和褪黑激素(melanotonin)。在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，所述目標(biāo)蛋白可以是胰島素受體激動劑或拮抗劑肽，或其他設(shè)計與別的細(xì)胞膜受體作用的肽。本發(fā)明的一個實(shí)施方案包括本發(fā)明帶標(biāo)簽的加工酶和目標(biāo)蛋白前體的共表達(dá)，從而利于所述目標(biāo)蛋白前體的體內(nèi)加工，以及易于在起始純化步驟除去所述加工酶。根據(jù)本發(fā)明的方法制備的表達(dá)的帶標(biāo)簽加工酶可通過常規(guī)方法從培養(yǎng)基中回收，包括用離心或過濾從培養(yǎng)基中分離宿主細(xì)胞，機(jī)械法(例如超聲破碎或壓力)裂解細(xì)胞釋放帶標(biāo)簽的加工酶，鹽法(例如硫酸銨)沉淀上清液或?yàn)V液中的蛋白成分。本發(fā)明的方法可使用任何適當(dāng)?shù)纳逃藐栯x子交換基質(zhì)，非限制性的適當(dāng)陽離子交換柱材料有SPSepharoseFastFlow、SPSepharoseXL、StreamlineSPXL、StreamlineDirectCST、ObelixSP、S-SupportUnosphere、SPSepharoseHighPerformance、Source30S和ToyopearlSP650STosoHaas。加工步驟(例如切割融合蛋白)的后續(xù)步驟可包括作為第一步驟的陽離子交換柱純化。切割后的純化步驟也可包括其他的純化方法，例如陰離子交換色譜、疏水作用色譜和凝膠過濾色譜(例如參見Scopes,R.,ProteinPurification,Springer-Verlag,N.Y.,1982)。合適的編碼根據(jù)本發(fā)明的帶標(biāo)簽加工酶的核酸構(gòu)建體為基因組或cDNA來源，例如通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)制備基因組或cDNA文庫，用合成的寡核苷酸探針雜交篩選編碼部分或全部融合蛋白的DNA序列獲得(參見Sambrook等，MolecularCloning:ALaboratoryManual,2nd.Ed.ColdSpringHarborLabora-tory,ColdSpringHarbor,NewYork,1989)。編碼所述帶標(biāo)簽加工酶的核酸構(gòu)建體也可通過已有的標(biāo)準(zhǔn)方法合成制備,例如Beaucage和Caruthers,TetrahedronLetters22(1981),1859-1869中描述的亞磷酰胺(phosphoamidite)方法，或Matthes等，EMBOJournal3(1984),801-805描述的方法。才艮據(jù)亞4f酰胺方法，寡核苷酸在自動DNA合成儀上合成、純化、退火、連接并在合適的載體中克隆。編碼融合蛋白的DNA序列也可通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)諸如采用特異性引物重疊延伸PCR剪接制備，例如上面的US4,683,202,Saiki等.，Science239(1988),487-491或Sambrook等,中所述。此外，所述核酸構(gòu)建體可以是合成的、基因組或cDNA來源(適當(dāng)?shù)?片段按照標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)經(jīng)連接而成的合成-基因組、合成-cDNA或基因組-cDNA的混合來源，各片,爻相應(yīng)于整個核酸構(gòu)建體的不同部分。編碼帶標(biāo)簽加工酶的DNA序列通常插入到重組載體中，所述載體可以是任何便于進(jìn)行重組DNA操作的載體，載體的選擇通常依賴于其要引入的宿主細(xì)胞。因此，所述載體可以是自主復(fù)制載體，即在染色體外存在的載體，其復(fù)制不依賴于染色體復(fù)制，例如質(zhì)粒?；蛘咚鲚d體在引入宿主細(xì)胞時可與宿主基因組整合，與其整合的染色體一起復(fù)制。所述載體優(yōu)選為表達(dá)載體，其中編碼帶標(biāo)簽加工酶的DNA序列可操縱地連接DNA轉(zhuǎn)錄需要的其他片段。通常，所述表達(dá)載體來源于質(zhì)?；虿《綝NA,或可含有上述兩者的元件。術(shù)語"可操縱地連接"表示所述片段被排布成其功能可以達(dá)到預(yù)期目的的形式，例如轉(zhuǎn)錄在啟動子中起始，并穿過編碼融合蛋白的DNA序列進(jìn)行。用于表達(dá)所述帶標(biāo)簽加工酶的表達(dá)載體包括能指引克隆基因或cDNA轉(zhuǎn)錄的啟動子。所述啟動子可以是任何DNA序列，其在選定的宿主細(xì)胞中顯示出轉(zhuǎn)錄活性，可源于編碼宿主細(xì)胞同源或異源蛋白的基因。用于細(xì)菌宿主細(xì)胞中的適當(dāng)?shù)膯幼永影ㄊ葻嶂狙挎邨U菌(SacV/uyWeara^zwmo//n7t^)生麥芽糖淀粉酶基因的啟動子、地衣芽孢桿菌(Sa"'〃m//c/zem/ww^)a淀粉酶基因的啟動子、解淀粉芽胞桿菌(Sac/〃z^amy/o/~we/ac/era)BAN淀粉酶基因的啟動子、枯草芽孢桿菌(Sa"7/mw^7&)堿性蛋白酶基因的啟動子或短小芽孢桿菌(Sac/〃mpwm,7w句木糖苷酶基因的啟動子，或噬菌體人Pr或PL啟動子或用于在大腸桿菌(五.co/O中表達(dá)的啟動子，例如i^、trp、phoA、araBAD、^、噬菌體T7和cspA。所述載體也可包括可選擇標(biāo)記物，例如補(bǔ)充宿主細(xì)胞缺陷的基因產(chǎn)物，例如編碼二氫葉酸還原酶(DHFR)的基因，或賦予對藥物如氨節(jié)西林、卡那霉素、四環(huán)素、氯霉素、新霉素、潮霉素或氨甲喋呤的抗性的標(biāo)記物基因。如果需要的話，所述編碼帶標(biāo)簽加工酶的DNA序列也可與適當(dāng)?shù)慕K止子可操縱地連接，例如人生長激素終止子(Palmiter等，Science222,1983,pp.809-814)或TPI1(Alber和Kawasaki,J.Mol.Appl.Gen.1,1982,pp.419陽434)或ADH3(McKnight等,TheEMBOJ,4,1985,pp.2093-2099)終止子。表達(dá)載體也可含有一套RNA剪接位點(diǎn)，其位于啟動子下游和融合的多肽序列自身插入位點(diǎn)上游。所述RNA剪接位點(diǎn)可從腺病毒和/或免疫球蛋白基因中獲得。表達(dá)載體中在插入位點(diǎn)下游還包括多腺苷酸化信號。多腺苷酸化信號的例子包括來自SV40的早期和晚期多腺苷酸化信號(KaufmanandSharp,ibid.)，來自腺病毒5Elb區(qū)域的多腺苷酸化信號，人生長激素終止子(DeNoto等.Nucl.AcidsRes.9:3719-3730,1981)。所述表達(dá)載體也可包括非編碼病毒前導(dǎo)序列，例如腺病毒2三聯(lián)前導(dǎo)序列，其位于啟動子和RNA剪接位點(diǎn)之間；以及增強(qiáng)子序列，例如SV40增強(qiáng)子。引入編碼帶標(biāo)簽加工酶DNA構(gòu)建體的宿主細(xì)胞可以是任何細(xì)菌細(xì)胞，其能產(chǎn)生所述帶標(biāo)簽加工酶。細(xì)菌宿主細(xì)胞的例子有革蘭氏陽性菌，例如芽孢桿菌屬的菌抹，諸如枯草芽孢桿菌(凡^&z7&)、地衣芽孢桿菌(及/z'c/^m/onm力，遲緩芽孢桿菌(凡/ewfw)、短芽孢桿菌(凡^ew'力、嗜熱脂肪芽孢桿菌(5.We"n^/^w2op/n7z^)、嗜堿芽孑包桿菌(5.a/b/o/7/^7uy)、解淀粉芽孑包桿菌(5."my/o/z々wey^c/e"s)、凝結(jié)芽孑包桿菌(5.coagw/a"力、環(huán)狀芽孢桿菌(5.c^cw/o7w》火山》蘭芽孑包斥干菌(凡/awrtw)、巨大芽孑包斥干菌(5.megaAen'ww)或蘇云金芽孢桿菌OB.^mn力g/era&)菌林，或鏈霉菌屬菌抹，諸如變青鏈霉菌(51.//v,Wa"力或鼠灰鏈霉菌(51mwnm^)，或革蘭氏陰性菌，例如大腸桿菌菌林。所述細(xì)菌的轉(zhuǎn)化可通過原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，或使用感受態(tài)細(xì)胞通過已知的方式進(jìn)行(參見Sambrook等，上文)。當(dāng)在細(xì)菌例如大腸桿菌中表達(dá)蛋白時，所述蛋白通常以不溶性顆粒(稱為包涵體)的形式存在于細(xì)胞質(zhì)中，或被細(xì)菌分泌序列導(dǎo)入壁膜間隙。在第一種情況下，裂解細(xì)胞，顆粒物被回收和變性，之后通過稀釋變性劑重新折疊多肽。在第二種情況下，可利用強(qiáng)信號肽序列諸如phoA、degQ、degS、degP、OmpA、OmpF、OmpH、OmpP、OmpT、lamb或pe舊(來自Erwaniacarotovora)克隆目標(biāo)蛋白，所述多肽通過裂解細(xì)胞從壁膜間隙中收集，例如通過超聲處理或滲壓震擾釋放壁膜間隙中的成分，回收多肽。在允許帶標(biāo)簽加工酶表達(dá)的條件下，在適當(dāng)?shù)臓I養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞，隨后可從培養(yǎng)物中回收所有或部分的所得肽。用于培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基可以是適于生長宿主細(xì)胞的任何常規(guī)培養(yǎng)基，例如基本培養(yǎng)基或含有適當(dāng)補(bǔ)充成分的復(fù)合培養(yǎng)基。合適的培養(yǎng)基可從供應(yīng)商處獲得，或根據(jù)公開的方法制備(例如美國典型培養(yǎng)物保藏中心的目錄)。"施用品"表示加載到純化柱上的含有融合蛋白的樣品。"穿過，，表示含有宿主細(xì)胞蛋白和污染物的施用品中不與純化柱結(jié)合的部分。"主峰"指純化色譜圖中uv強(qiáng)度最高的峰，其含有融合蛋白。"mAU，，為毫吸收單位。"UV280強(qiáng)度"指波長280nm處的吸光度，此波長處蛋白有吸收，以毫吸收單位測定。"UV214"指波長214nm處的吸光度，此波長處蛋白有吸收，以毫吸收單位測定。"IPTG"為異丙基-13-D-硫代半乳糖吡喃糖苷。"TIC"為總離子量。"HPLC"為高效液相色譜。表述"蛋白"包括肽和多肽。"目標(biāo)蛋白前體，，是作為目標(biāo)蛋白前體的蛋白，其必須通過加工酶加工以獲得目標(biāo)蛋白。例子包括通過加工酶從其除去融合伴侶獲得目標(biāo)蛋白的融合蛋白，通過加工酶從其除去翻譯后修飾(例如糖基化)獲得目標(biāo)蛋白的蛋白，或必須通過加工酶添加翻譯后修飾的蛋白，或上述蛋白的組合。"目標(biāo)蛋白"是經(jīng)加工酶加工獲得所需要形式的蛋白。"SOEPCR"表示重疊延伸PCR剪接。"LC-MS"指液相色鐠-質(zhì)譜。"%溶解度，，定義為來自宿主細(xì)胞裂解物中可溶蛋白的量除以(來自宿主細(xì)胞裂解物的可溶+不溶蛋白的量)x100。"%純度"定義為感興趣蛋白的量除以(感興趣蛋白的量+宿主細(xì)胞污染物的量)x亂SDS-PAGE為十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳。本文中，氨基酸的三字母或單字母形式按其常規(guī)含義使用，如表1所示。如非特別說明，本文中所述氨基酸為L-氨基酸。此外，如非特別說明，肽的氨基酸序列的左端和右端分別為N末端和C末端。表1:氨基酸縮寫<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>本文中引用的所有參考文獻(xiàn)，包括出版物、專利申請和專利均全文通過援引并入本文，正如每篇參考文獻(xiàn)獨(dú)立并特別地指示全文通過援引并入本文一樣(以法律上允許的最大程度)。本文中使用的標(biāo)題和小標(biāo)題僅出于方便的目的，不能解釋為以任何方式限制本發(fā)明。如非特別說明，本文中使用的任何以及所有例子，或示例性文字(例如"例如")僅為了更好的解釋本發(fā)明，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。所有本說明書中的文字當(dāng)對本發(fā)明的實(shí)施必需時均不能認(rèn)為表示任何非請求的元素。本文中對專利文獻(xiàn)的引用與并入僅出于方便的目的，不表示任何關(guān)于所述專利文獻(xiàn)有效性、可專利性和/或可實(shí)施性的觀點(diǎn)。在相關(guān)法律允許的范圍內(nèi)，本發(fā)明包括所附權(quán)利要求中引用主題的所有修飾物和等同物。實(shí)施例實(shí)施例1成熟人類鼻病毒抹14(HRV14)3C蛋白酶的氨基酸序列如下GPNTEFALSLLRK國TITTSKGEFTGLGIHDRVCVIPTHAQPGDDVLVNGQKI隨DKYKLVDPE薩LELTVLTLDRNEKFRDIRGFISEDLEGVDATLWHSNNFTNTILEVGPVTMAGLINLSSTPTNRMIRYDYATKTGQCGGVLCATGKIFGIHVGGNGRQGFSAQLKKQYFVEKQ(SEQIDNO:35)制備編碼SEQIDNO:35的DNA序列和用于在大腸桿菌中表達(dá)的優(yōu)化密碼子。成熟HRV143C蛋白酶合成基因片段通過2步連續(xù)的PCR采用重疊延伸PCR剪接方法獲得。在第一步PCR反應(yīng)中，使用16種重疊的引物(8種正向和8種反向引物)產(chǎn)生全HRV14序列，包括編碼柔性接頭的5'端區(qū)域(SEQIDNO:28)。引物為-50bp大小，引物間的重疊為-20bp。在第二步PCR反應(yīng)中，末端正向和反向引物分別包括XhoI和Bamffl克隆位點(diǎn)，其采用第一步PCR反應(yīng)的產(chǎn)物作為模板擴(kuò)增全序列。使用PhusionPCR系統(tǒng)(Finnzymes)?；景凑债a(chǎn)品說明書，利用適量的所有16種引物如下建立第一步PCR反應(yīng)。第一步反應(yīng)的PCR條件^cr下98。C30秒(首次變性)98°C10秒(變性)50°C30秒(退火)72°C15秒(延伸)10個循環(huán)72°C5分鐘(最終延伸)第一步反應(yīng)的PCR產(chǎn)物采用GFXPCRDNA和GelBand純化試劑盒(GEHealthcare)直接從PCR溶液中純化。在第二步PCR反應(yīng)中，使用最末端正向和反向引物從第一步反應(yīng)的PCR產(chǎn)物擴(kuò)增HRV143C全編碼序列。除了退火溫度為55。C,用20個循環(huán)代替10個循環(huán)外，反應(yīng)條件與第一步反應(yīng)相同。第二步反應(yīng)的PCR產(chǎn)物大小為-600個堿基對，與預(yù)期一致，通過瓊脂糖凝膠電泳鑒定。切下瓊脂糖凝膠上的PCR條帶，根據(jù)產(chǎn)品說明書產(chǎn)物。根據(jù)產(chǎn)品說明使用現(xiàn)有的TOPO克隆系統(tǒng)(Invitrogen)將純化的PCR產(chǎn)物亞克隆至質(zhì)粒中，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至TOP10大腸桿菌細(xì)胞(Invitrogen)進(jìn)行質(zhì)粒擴(kuò)增(probagation)。從分離的TOP10克隆中得到質(zhì)粒的XhoI/BamHI插入物的正確序列通過DNA測序鑒定。/7五772fl4'沐—好及F^y^W^不/^趟潛;t減^蛋冷標(biāo)吝W遂凝從TOPO質(zhì)粒載體(Invitrogen)中切割含有HRV143C蛋白酶編碼區(qū)域的XhoI/BamHI片段，將XhoI/BamHI片段連接到pETlla載體(Novagen)中，這樣編碼不同N末端熱穩(wěn)定堿性標(biāo)簽的插入物與接頭和蛋白酶編碼區(qū)域的5'端連接。由此產(chǎn)生16種編碼與帶插入接頭的HRV143C蛋白酶N末端融合的不同標(biāo)簽的pETlla載體，如圖1所示。DNA序列的驗(yàn)證通過限制性酶切和/或DNA測序進(jìn)行。制備以下帶標(biāo)簽的酶<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>夢標(biāo)蕃好及K/4Jc:蛋冷婆好《迷通過熱休克方法或化學(xué)標(biāo)準(zhǔn)方法將編碼具有不同N末端標(biāo)簽的HRV143C蛋白酶序列的pET11a載體構(gòu)建體轉(zhuǎn)化至Rosetta(DE3)(Novagen)大腸桿菌菌林中。轉(zhuǎn)化細(xì)胞在LB(Luria-Bertani)培養(yǎng)基瓊脂平板上繁殖過夜，每毫升培養(yǎng)基含150微克氨節(jié)西林和34微克氯霉素。從培養(yǎng)板接種含氨節(jié)西林和氯霉素的液體LB培養(yǎng)基，在37攝氏度和240rpm下在搖瓶中培養(yǎng)。當(dāng)OD600到達(dá)~0.4-0.8時，降溫至30度。20-30分鐘后，通過向培養(yǎng)物培養(yǎng)基中添加0.5mMIPTG開始誘導(dǎo)蛋白。經(jīng)過3小時的誘導(dǎo)后最終OD600值在1.6-2.8。離心收獲細(xì)胞。對分(通過在由25mMNaP04pH7組成的緩沖液中超聲處理和離心獲得)進(jìn)行SDS-PAGE，評價HRV143C蛋白酶變體的表達(dá)水平和溶解性。盡管觀察到表達(dá)水平的差異，大多數(shù)帶標(biāo)簽的HRV143C蛋白酶(-80%或以上)具有很高的溶解性。iV^t裙用X五giVa'W^"》標(biāo)蕃W〃及FM3C蛋^4^/^4Cy好2"w趟《在含25mMNaP04pH7的緩沖液中超聲裂解pACSH239蛋白酶的細(xì)胞培養(yǎng)團(tuán)塊(來自40ml培養(yǎng)物)。10000g離心沉積細(xì)胞碎片。純化之前無菌過濾上清，采用AKTAexplorer100純化系統(tǒng)(GEHealthcare)純化。采用5ml柱體積的預(yù)裝SPSepharoseFFHiTrap柱(GEHealthcare)進(jìn)行分離，流速為3ml/分，使用下述緩沖液緩沖液A:50mM磷酸鈉，pH7+ImMEDTA緩沖液B:50mM磷酸鈉，pH7+1MNaCl+1mMEDTA起始用7倍柱體積的緩沖液A平衡柱，加載施用品后，用7倍柱體積的緩沖液A洗滌除去未結(jié)合的蛋白。使用20倍柱體積0-100%線性梯度的緩沖液B從柱上洗脫pACSH239蛋白酶。在0.4-0.5MNaCl鹽濃度時，該融合蛋白從柱上洗脫下來，一些蛋白在穿過液中損失，然而，HPLC和SDS-PAGE標(biāo)準(zhǔn)方法表明，一步陽離子交換色語就可將pACSH239蛋白酶純化至高純度(85-90%)，LC-MS也顯示洗脫的pACSH239蛋白酶具有預(yù)期的分子量。iV^t裙用S五2/D7VO:7tf作—》^^蕃^好及KM蛋^^^^4Cy好Z^《..如對于pACSH239所述，用于純化的上清液通過在25mMpH7的NaP04中超聲來自80ml細(xì)胞培養(yǎng)物的細(xì)胞培養(yǎng)團(tuán)塊制備。將施用品加至預(yù)裝SPSepharoseFF的5mlHiTrap柱(GEHealthcare)上，流速為3ml/min，用于純化的緩沖液為緩沖液A:50mM磷酸鈉，pH7緩沖液B:50mM磷酸鈉，pH7+lMNaCl起始用7倍柱體積的緩沖液A平衡柱，在洗滌步驟中用7倍柱體積的緩沖液A除去未結(jié)合的樣品，使用20倍柱體積0-100%線性梯度的緩沖液B從柱上洗脫pACSH239蛋白酶。在-0.2MNaCl鹽濃度時，pACSH238蛋白酶從柱上洗脫下來。不同于pACSH239蛋白酶，pACSH238蛋白酶的主要部分在這些純化條件下結(jié)合在柱上，LC-MS也證實(shí)洗脫的pACSH238蛋白酶具有預(yù)期的分子量。HPLC和SDS-PAGE分析表明，經(jīng)過第一步純化后其回收率是pACSH239蛋白酶的4倍，純度為~90%。^s五g//>iva'w#為標(biāo)多^〃及^<_^:蛋冷^f/^cs好w9)時活遂伊采用不同量的蛋白酶切割融合蛋白(pACSH294)以評價pACSH239蛋白酶的活性，所述融合蛋白包含具有N末端標(biāo)簽(SEQIDNO:19)的S661胰島素受體拮抗劑肽，以及具有修飾的HRV143C切割位點(diǎn)的插入接頭SSSGGSEVLFQ(SEQIDNO:36)。所述S661多肽具有以下序列IDNO:37).通過對HPLC色譜圖UV214nm吸收峰面積積分計算pACSH294融合蛋白底物和pACSH239蛋白酶的相對蛋白濃度。酶和底物混合于200uL反應(yīng)體積中，在25。C下，在含50mMTrisHClpH7.5,150mMNaCl的切割緩沖液中使用不同的酶一底物比例(根據(jù)濃度調(diào)整)孵育6或12小時。LC-MS研究表明，在用1:IOO的酶底物比例孵育12小時后，僅觀察到S661肽(SEQIDNO:37)和釋放的標(biāo)簽(SEQIDNO:19)+接頭(SEQIDNO:36)(圖2)。使用1:200的比例時，在12小時后僅剩余很少量的融合蛋白。因此，該結(jié)果表明1:100-1:200的酶/底物比例對于在過夜孵育中完成對pACSH294融合蛋白的加工是足夠的。消化液中釋放的S661肽隨后可采用陰離子交換色譜柱(HiTrapQsepharoseHighPerformance,1ml,GEHealthcare)純化至98%以上的純度。緩沖液和一般純化條件見pACSH239蛋白酶的純化中所述。然而S661肽與該柱結(jié)合，洗脫梯度內(nèi)任何鹽濃度下都無pACSH239蛋白酶從柱上洗脫，僅在穿過液中觀察到(LC-MS分析對穿過組分所鑒定)。因此，第二步純化有效除去了目標(biāo)蛋白中的pACSH239蛋白酶。^S五g//)iVa'7tf#力標(biāo)多好好及「"蛋冷4^^4CS"好23"在平行試驗(yàn)中，在由50mMpH7.5的TrisHCl、150mMNaCl組成的緩沖溶液中用等量的pACSH238或pACSH239蛋白酶處理pACSH294底物。評價的兩種酶的酶/底物比例為1:25或1:50。30。C下孵育3小時后，兩種酶從pACSH294融合蛋白中釋放出的S661胰島素受體拮抗肽的量恰好相同，表明盡管N末端附著的標(biāo)簽大小不同，其具有相同的特異性活性。與pACSH239蛋白酶一樣，pACSH238蛋白酶不結(jié)合陰離子交換柱，表明其可在目標(biāo)蛋白前體消化后通過適當(dāng)?shù)募兓襟E有效去除。實(shí)施例2帶標(biāo)簽煙草蝕紋病毒蛋白酶的克隆成熟煙草蝕紋病毒(TEV)蛋白酶具有以下氨基酸序列GESLFKGPRDYNPISSTICHLTNESDGHTTSLYGIGFGPFIITNKHLFRRNNGTLLVQSLHGVFKVKNTTTLQQHLIDGRDMIIIRMPKDFPPFPQKLKFREPQREERICLVTTNFQTKSMSSMVSDTSCTFPSSDGIFWK圓QTKDGQCGSPLVSTRDGFIVGIHSASNFTNTNNYFTSVPKNFMELLTNQEAQQWVSGWRLNADSVLWGGHKVFMVKPEEPFQPVKEATQLMN(SEQIDNO:38)通過標(biāo)準(zhǔn)PCR方法采用PhusionPCR系統(tǒng)(Finnzymes)獲得包含具有穩(wěn)定突變(S219V)的TEV序列的插入片段，正向和反向引物分別包含XhoI和BamHI克隆位點(diǎn)，才莫板為現(xiàn)有的TEV(Ser219Val)編碼質(zhì)粒。PCR產(chǎn)物的5，端包含編碼柔性接頭的序列(SEQIDNO:28)。PCR產(chǎn)物用GFX純化(GEHealthcare)，按照廠家(Invitrogen)說明和如實(shí)施例1所述在TOPO載體中亞克隆。通過DNA測序-驗(yàn)證來自TOPO質(zhì)粒的XhoI/BamHI插入物的正確TEV編碼序列。用XhoI/BamHI酶從TOPO質(zhì)粒中切割正確的插入物，在pETlla(Novagen)表達(dá)載體中將其與編碼熱穩(wěn)定堿性標(biāo)簽插入物的3，端融合。獲得以下構(gòu)建物產(chǎn)物名稱標(biāo)簽接頭力口工酶pACSH307SEQIDNO:10SEQIDNO:28SEQIDNO:38pACSH308SEQIDNO:18SEQIDNO:28SEQIDNO:38pACSH309SEQID:NO:19SEQIDNO:28SEQIDNO:38夢標(biāo)吝r五K蛋^雜賞伴的衷逸將編碼pACSH307、pACSH308和pACSH309蛋白酶的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至Rosetta(DE3)(Novagen)大腸桿菌菌抹中。轉(zhuǎn)化細(xì)胞在含150微克/毫升氨節(jié)西林和34微克/毫升氯霉素的LB(Luria-Bertani)培養(yǎng)基瓊脂平板中繁殖(probagate)過夜。從培養(yǎng)板接種含氨節(jié)西林和氯霉素的液體LB培養(yǎng)基，于37攝氏度和240rpm下在搖瓶中培養(yǎng)。當(dāng)OD600到達(dá)~0.4-0.5時，溫度下降至30。C。適應(yīng)該溫度30分鐘后，向培養(yǎng)基中加入0.5mMIPTG開始誘導(dǎo)蛋白。通過3小時的誘導(dǎo)后，最終獲得的OD60()在1.6范圍內(nèi)。離心收獲細(xì)胞，對含有誘導(dǎo)和未誘導(dǎo)細(xì)胞的沉淀裂解液以及誘導(dǎo)細(xì)胞的可溶和不溶性組分(通過在由10mMpH7的NaP04組成的緩沖液中超聲和離心獲得)進(jìn)行SDS-PAGE，以評價TEV蛋白酶變體的表達(dá)水平和溶解性。所有3種構(gòu)建物的表達(dá)水平類似。用SEQIDNO:10作為標(biāo)簽的TEV變體被評定具有最高的溶解性(70%)(pACSH307)。/l4CS丑307蛋冷雜W趟^通過使用AKTAExplorer100系統(tǒng)(GEHealthcare)從無菌過濾上清液中純化pACSH307蛋白酶，所述無菌過濾上清液由細(xì)胞團(tuán)塊(來自80ml培養(yǎng)物)在25mMpH7的NaP04溶液中超聲獲得，條件和緩沖液均如實(shí)施例1中對于pACSH238所述。當(dāng)使用HiTrapSPSepharoseFF5ml柱分離時，在約0.25MNaCl處洗脫出明顯的峰。峰尖部分的LC-MS分析得到與該構(gòu)建物預(yù)期完全一致的分子量，SDS-PAGE和HPLC分析表明，主峰的純度達(dá)到了~85-90%。^5"五g//)iva'^r五F蛋冷4^/L4cy好^7)w^遂申夢用不同量蛋白酶切割包含S661胰島素拮抗肽(SEQIDNO:37)的融合蛋白(pACSH248),以評價pACSH307蛋白酶的活性，如實(shí)施例1中所述，其具有同樣的N末端標(biāo)簽(SEQIDNO:19),但具有包含煙草蝕紋病毒切割識別位點(diǎn)的接頭SSSGGSENLYFQ(SEQIDNO:39)。消化試驗(yàn)在含有50mMpH8的TrisHC1、0.5mMEDTA的切割緩沖液中進(jìn)行。LC-MS研究顯示，在以酶底物1:l的比例下孵育8小時后，大部分S661肽從pACSH248融合蛋白中釋放出來。其證實(shí)了作為活性酶的帶標(biāo)簽TEV蛋白酶被表達(dá)和純化，可用于從pACSH248融合蛋白中除去SEQIDNO:19標(biāo)簽。實(shí)施例3谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶(tGASE)基因由信號肽和前結(jié)構(gòu)域，后面的成熟tGASE序列組成。采用標(biāo)準(zhǔn)方法從茂原鏈霉菌(&re^omycesmoZjarae似&)的基因組DNA中通過PCR制備protGASE(不含信號肽，但含N末端Met殘基)。前結(jié)構(gòu)域被改變，使得HRV143C切割位點(diǎn)剛好包括在成熟tGASE序列的Gly53-Pro54N-末端延伸之前。采用標(biāo)準(zhǔn)克隆技術(shù)將所述protGASE序列克隆至pETlla載體(pNNC130)中，由該質(zhì)粒編碼的蛋白具有以下序列(成熟tGASE序列從第55號殘基開始)MDNGAGEETKSYAETYRLTADDVA國ALNESAPAASSAGPSFRAPLEVLFQGPDSDDRVTPPAEPLDRMPDPYRPSYGRAETWNNYIRKWQQVYSHRDGRKQQMTEEQREWLSYGCVGVT雨NSGQYPTNRLAFASFDEDRFKNELKNGRPRSGETRAEFEGRVAKESFDEEKGFQRAREVASVMNRALENAHDESAYLDNLKKELANGNDALRNEDARSPFYSALRNTPSFKERNGGNHDPSRMKAVIYSKHFWSGQDRSSSADKRKYGDPDAFRPAPGTGLVDMSRDRNIPRSPTSPGEGFVNFDYGWFGAQTEADADKTVWTHGNHYHAPNGSLGAMHVYESKFR隨SEGYSDFDRGAYVITFIPKSWNTAPDKVKQGWP(SEQIDNO40).將pNNC130質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)(Novagen)中，在含有150微克/毫升氨千西林的LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)過夜。從過夜培養(yǎng)的瓊脂平板接種含氨千西林的液體LB培養(yǎng)基，在37。C和240rpm下培養(yǎng)，直至OD600到達(dá)~0.8。適應(yīng)30。C的溫度20分鐘后，用0.1mMIPTG誘導(dǎo)表達(dá)。通過4小時的蛋白誘導(dǎo)后，最終獲得的OD6oo約為2,收集細(xì)胞，SDS-PAGE分析顯示大部分的protGASE存在于上清液的可溶組分中，所述上清液在含10mMpH8的NaP04緩沖液中超聲并離心細(xì)胞碎片后獲得。將來自200ml誘導(dǎo)細(xì)胞培養(yǎng)物的細(xì)胞團(tuán)塊溶解于40mlpH8的10mMNaP04緩沖液中。超聲處理并10.000g離心之后，上清液進(jìn)行除菌過濾，最終施用品體積用pH8的10mMNaP04緩沖液調(diào)節(jié)至50ml。按照實(shí)施例1和2中所述的方法，使用3ml/分的流速和下述緩沖液進(jìn)行純化緩沖液A:25mMNaP04緩沖液，pH8.0緩沖液B:25mMNaP04緩沖液,pH8.0,0.5MNaCl用7倍柱體積(CV)的緩沖液A平衡5mlQSepharose高效(HP)HiTrap柱(GEHealthcare),將含有protGASE的施用品加載到柱上，通過10CV的緩沖液A洗脫未結(jié)合的樣品。采用30倍柱體積0-100%線性梯度的緩沖液B洗脫protGASE。在大約0.05MNaCl濃度下，含有protGASE的峰從柱上洗脫下來。采用SDSPAGE分析收集的組分，采用LC-MS分析鑒定protGASE的身份，其獲得的質(zhì)量與所述蛋白的預(yù)期理論質(zhì)量相當(dāng)接近。^^/L4Cm2M4>jcsmp蛋《雄4發(fā)#潛#鍵收集第一步純化中獲得的含protGASE的組分，釆用Vivaspin20(10000MWCO)(Satorius)滲濾將緩沖液改變?yōu)榍懈罹彌_液50mMpH7.5的TrisHC1,150mMNaCl和1mMDTT。根據(jù)HPLC色譜圖估計UV214nm處的吸收峰面積，調(diào)整純化的protGASE和pACSH239蛋白酶的量。在lmMDTT存在或不存在條件下，通過不同的酶/底物比例(1:10、1:50、1:100和l:200)在切割緩沖液中進(jìn)行切割試馬全，于25°C下反應(yīng)過夜。實(shí)驗(yàn)顯示，采用1:200的酶底物比例，在切割緩沖液中含1mMDTT的情況下，pACSH239蛋白酶能完全去除前結(jié)構(gòu)域(以獲得Gly-Pro延長的成熟tGASE)。使用LC-MS測定所釋放的成熟tGASE和protGASE的質(zhì)量。在類似的試驗(yàn)中，pACSH238蛋白酶同樣顯示能有效的從protGASE切除前結(jié)構(gòu)域。4\游/GAy五W^化pACSH239蛋白酶消化后得到的Gly-Pro延長的成熟tGASE在25mMpH6的NaP04、lmMDTT(緩沖液A)中稀釋至48ml，采用以下緩沖液于5mlSPSepharose高效(HP)HiTmp柱(GEHealthcare)上分離緩沖液A:25mMNaP04緩沖液，pH6.0，十lmMDTT緩沖液B:25mMNaP04緩沖液，pH6.0,+lmMDTT+0.5MNaCl純化使用3ml/分的流速、30倍柱體積的0-100%線性梯度洗脫緩沖液B進(jìn)行。純化的UV280色譜圖顯示，在約0.1MNaCl濃度下，有一個主峰從SPSepharoseHP柱上洗脫下來。LC-MS分析證實(shí)了洗脫的蛋白的身份為成熟的tGASE。由于N末端融合的SEQIDNO:19標(biāo)簽具有高電荷，pACSH239蛋白酶從柱上洗脫的時間要比成熟tGASE晚的多，因此可在第二步純化后從目標(biāo)蛋白中有效去除。實(shí)施例4耒,尸C及WWK/SJC蛋^絲碼力成熟曱型肝炎林18(HAV18)3C蛋白酶的氨基酸序列如下STLEIAGLVRKNLVQFGVGEKNGCVR術(shù)MNALGVKDDWLLVPSHAYKFEKDYEMMEFYFNRGGTYYSISAGNWIQSLDVGFQDWLMKVPTIPKFRDITEHFIKKGDVPRALNRLATLVTTVNGTPMLISEGPLKMEEKATYVHKKNDGTTVDLTVDQAWRGKGEGLPGMCGGALVSSNQSIQNAILGIHVAGGNSILVAKLVTQEMFQNIDKKIESQ(SEQIDNO:45).按照實(shí)施例1中所述用于HRV143C蛋白酶的兩步連續(xù)的PCR,采用重疊延伸PCR剪接方法獲得成熟HAV183C蛋白酶基因密碼子優(yōu)化的DNA片l殳。序列正確的最終片段含有5，端Xhol和3，端Bamhl位點(diǎn)，其允許連接到pETlla載體(Novagen)中，以便SEQIDNO:IO編碼部分與接頭和蛋白酶編碼區(qū)域的5-端連接。產(chǎn)物名稱標(biāo)簽接頭力口工酶pACSH362SEQIDNO:10SEQIDNO:47SEqIDNO:45^5^g/DiVa'i。JC蛋^^^4CS^6"辨或這在Rosetta(DE3)大腸桿菌菌抹中的表達(dá)基本上如實(shí)施例1中所述。表達(dá)水平與SEQIDNO:10帶標(biāo)簽的HRV143C蛋白酶類似，細(xì)胞裂解和離心后，至少80%的蛋白是可溶的。>^/DW^4蛋冷^^/l4CS^36"W趟^在含25mMpH7的NaP04緩沖液中超聲裂解pACSH362蛋白酶的細(xì)胞培養(yǎng)團(tuán)塊(來自80ml培養(yǎng)物)。10.000g離心沉淀細(xì)胞碎片。無菌過濾上清后采用AKTAexplorer100純化系統(tǒng)(GEHealthcare)純化。使用5ml柱體積的預(yù)裝SPSepharoseFFHiTrap柱(GEHealthcare)分離，流速為3ml/分，采用以下緩沖液緩沖液A:50mM磷酸鈉，pH7緩沖液B:50mM磷酸鈉，pH7，+lMNaCl起始用7倍柱體積的緩沖液A平衡柱，加載施用品后，使用7倍柱體積的緩沖液A洗滌除去未結(jié)合的蛋白。使用20倍柱體積0-100%線性梯度的緩沖液B從柱上洗脫pACSH362蛋白酶。在鹽濃度為0.2-0.3MNaCl時，pACSH362蛋白酶從柱上洗脫下來。在這些純化條件下，大部分pACSH362蛋白酶結(jié)合在柱上。HPLC和SDS-PAGE標(biāo)準(zhǔn)方法表明，一步陽離子交換色譜后將pACSH362蛋白酶純化至85-90%，LC-MS也證實(shí)洗脫的蛋白酶具有預(yù)期的分子量。^S五g/Z)iVa'70羋力標(biāo)吝Wa4F7S蛋冷^T/^C5^36"使用帶標(biāo)簽的HAV183C蛋白酶(pACSH362)處理pACSH360融合蛋白，其包括S661胰島素受體拮抗肽(SEQIDNO:37)和N末端標(biāo)簽(SEQIDNO:19),以及具有HAV183C蛋白酶切割位點(diǎn)的插入接頭SSSGGSELRTQ(SEQIDNO:49).在37。C孵育7小時后，使用LC-MS評價1:IO或I:50酶底物(pACSH362蛋白酶和pACSH360融合蛋白)的比例，兩個比例下均觀察到代表釋放的S661肽的片段，如實(shí)施例1中所示，顯示帶標(biāo)簽的HAV18酶是活性的。實(shí)施例5夢標(biāo)薟應(yīng)Ai病病善3C-脊蛋冷^w^;鏖只于來自p者#杰棲#杰菌(77zerwwsf/zermo//zz'/z^)、Geo6ac/〃ws^3組op/zz7z^、melanesiensis棲熱腔菌(77zer,s—o附e/朋ew'e腦、)、BI429和解纖維熱酸菌(爿c/c/W/^nwz^ce〃w/o"CM)11B的核糖體蛋白L9家族的純化蛋白標(biāo)簽進(jìn)行大腸桿菌表達(dá)的密碼子優(yōu)化，其作為合成基因從GENEARTGmbH，Regensburg,Germany獲得。編碼所述標(biāo)簽的基因片段具有5，端Ndel位點(diǎn)和3，端Xhol位點(diǎn)。同樣獲得了具有5，端Xhol位點(diǎn)和3，端Bamhl位點(diǎn)的編碼兔出血病病毒3C-樣蛋白酶(RHDV)的密碼子優(yōu)化的片段(GENEARTGmbH,Regensburg，Germany)。以下構(gòu)建物通過標(biāo)準(zhǔn)克隆技術(shù)裝配到pETlla大腸桿菌表達(dá)載體中，以產(chǎn)生下述RHDV蛋白酶變體。<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>夢標(biāo)吝名^j&^病善3C-脊蛋冷雜^^這BL21(DE3)大腸桿菌菌抹中的表達(dá)基本上如實(shí)施例1中所述，SDS-PAGE鑒定細(xì)胞裂解和離心后獲得的上清液和沉淀表明，所有4種構(gòu)建物獲得了極為類似的表達(dá)水平，可溶性范圍為約80%-卯％。^AE"g/Z)iVaU、"，^3斧^/^為標(biāo)吝Wft4F^3C蛋冷癉W磁^超聲裂解各種帶標(biāo)簽RHDV蛋白酶的細(xì)胞培養(yǎng)團(tuán)塊(來自80ml培養(yǎng)物)。獲得的上清液用預(yù)裝SPSepharoseFF的5ml柱(GEHealthcare)分離，使用的緩沖液和條件如前所述。比較捕獲步驟后回收的蛋白酶的量，包含SEQIDNO:41標(biāo)簽的pACSH433蛋白酶結(jié)果最佳，其在柱上結(jié)合的蛋白是其余變體的~2-3.5倍。實(shí)施例6夢標(biāo)吝好及K/43Cf^雜賞糸々/;n^a45^(^ViVC73^4/l4CMT2W嚴(yán)合蛋^)好#或迷pACYCDuet-l質(zhì)粒(Novagen)的拷貝數(shù)低于pETlla(Novagen)質(zhì)粒，由該質(zhì)粒產(chǎn)生蛋白的量應(yīng)當(dāng)?shù)陀趐ETlla質(zhì)粒。此外，該質(zhì)粒含有不同于pETlla的選擇性標(biāo)記(氯霉素抗性)，使得所述兩種質(zhì)?？梢栽谕凰拗髁种写嬖诤凸脖磉_(dá)。使用pACYCDuet-l載體表達(dá)pACSH238蛋白酶、pETlla載體表達(dá)可被pACSH238蛋白酶加工的protGASE(p麗C130)或S661融合蛋白(pACSH294),以評價釆用帶標(biāo)簽的加工酶加工目標(biāo)蛋白前體是否可行。用Mlul和BamHI限制酶切割來自pETlla質(zhì)粒編碼pACSH238蛋白酶(實(shí)施例1)的片段和起始密碼子上游部分載體骨架，連接至MluI/BamHI切割的pACYCDuet-l質(zhì)粒骨架(Novagen)中。將表達(dá)pACSH238蛋白酶的pACYCDuetl質(zhì)粒與編碼protGASE(pNNC130)或S661融合蛋白(pACSH294)的pETlla質(zhì)粒一同轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)中，這樣，一種菌抹共表達(dá)pACSH238蛋白酶(來自pACYC-Duet-l質(zhì)粒)和protGASE,另一菌抹表達(dá)pACSH238蛋白酶和S661融合蛋白(pACSH294)。在含有150微克/毫升氨節(jié)西林和34微克/毫升氯霉素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)共表達(dá)菌株，以單獨(dú)表達(dá)protGASE或S661融合蛋白的菌林作為平行對照。表達(dá)條件如實(shí)施例1對于pACSH238蛋白酶中所述。在30°C表達(dá)3小時后，收獲共表達(dá)菌抹及其對照物。從SDS-PAGE明顯看出，共表達(dá)誘導(dǎo)所得protGASE或S661融合蛋白與對照相比分子量較低。凝膠中消化之后的基于標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜的方法證實(shí)，所述SDS凝膠條帶中來自pACSH238蛋白酶/protGASE共表達(dá)菌林的截短了的誘導(dǎo)蛋白為tGASE。該結(jié)果說明共表達(dá)的pACSH238蛋白酶能從protGASE體內(nèi)切除前結(jié)構(gòu)域和從S661融合蛋白體內(nèi)切除SEQIDNO:19的純化標(biāo)簽。權(quán)利要求1.加工酶，其包含源于來自嗜熱細(xì)菌的強(qiáng)堿性核糖體蛋白質(zhì)的N末端附著的標(biāo)簽。2.權(quán)利要求l的加工酶，其中所述標(biāo)簽不包含半胱氨酸殘基。3.權(quán)利要求1-2的加工酶，其中所述標(biāo)簽包含約50至約250、或約75至約200、約100至約250或約100至200個氨基酸殘基。4.權(quán)利要求l-3的加工酶，其中所述標(biāo)簽中約15%至約50%、約200/0至約50%、約30%至約50%、約40%至約50%或約35%至約50%的氨基酸殘基為堿性氨基酸殘基Lys和Arg。5.權(quán)利要求l-4的加工酶，其中所述標(biāo)簽源于核糖體蛋白L9家族。6.權(quán)利要求5的加工酶，其中所述標(biāo)簽選自肽序列MKVILLRDVPKIGKKGEIKEVSDGYARNYLIPRGFAKEYTEGLERAIKHEKEIEKRKKEREREESEKILKELKKRTHWKVKAGEGGKIFGAVTAATVAEEISKTTGLKLDKRWFKLDKPIKELGEYSLEVSLPGGVKDT隨VEREE(SEQIDNO:10);MKVILLEPLENLGDVGQWDVKPGYARNYLLPRGLAVLATESNLKALEARIRAQAKRLAERKAEAERLKEILENLTLTIPVRAGETKIYGSVTAKDIAEALSRQHGITIDPKRLALEKPIKELGEWLTYKPHPEVPIQLKVSWAQE(SEQIDNO:41);MKVIFLKDVKGKGKKGEIKDVADGYA匿LFKQGLA舊ATPANIKALEAQKQKEQRQAAEELANAKKLKEELEKLTVEIPAKAGEGGRLFGSITSKQIAEALQAQHGLKLDKRK舊LADAIRSLGYTNVPVKLHPEVTATLKVHVKEQK(SEQIDNO:42);MKWLLKDVSKIGKKGEIKNVSDGYARNYLIPKGLALEATPRVLKRLEAEKR-KKEEEKIQIKTQNEELLKMLKKFLYKIPVKAGESGKLFGALTNSDIAKAVEKIADVNIDKKFIVLEKPIKEIGMYDVLVRLPEGVSGKIKVEVIQEGKN(SEQIDNO:43)和MKLILTQEVAGLGGPGDWEVRDGYGRNYLLPKRLAMPASPGAVKQVALIKRAREVREIRDLDQARALRDQLEALPVTLPARAGSGGRLFGSVTPDDIAAAVHAAGGPKLDKRR舊SGPIKTIGSHQVTVRLHPEVSATVSVEWPAS(SEQIDNO:44).7.權(quán)利要求l的加工酶，其中所述標(biāo)簽通過接頭序列與該加工酶附著。8.權(quán)利要求7的加工酶，其中所述接頭序列具有1至約30、1至約25、1至約20或1至約15個氨基酸殘基。9.權(quán)利要求7的加工酶，其中所述接頭選自SEQIDNO:28、SEQIDNO:29、SEQIDNO:30、SEQIDNO:34、SEQIDNO:47和SEQIDNO:48。10.權(quán)利要求1的加工酶，其選自氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶、水解酶、裂解酶、異構(gòu)酶和連接酶。11.制備權(quán)利要求l-10任一項(xiàng)所述的帶標(biāo)簽加工酶的方法，包括i)在適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)宿主中表達(dá)包含源于來自嗜熱細(xì)菌的強(qiáng)堿性蛋白質(zhì)的N末端標(biāo)簽的加工酶，ii)將表達(dá)的帶標(biāo)簽加工酶加載到陽離子交換柱上，iii)以及用適當(dāng)?shù)南疵撘合疵撍鰩?biāo)簽加工酶。12.權(quán)利要求ll的方法，其中所述加工酶為選自HRV143C蛋白酶、HAV183C、蛋白酶TEV或RHDV3C蛋白酶的蛋白酶。13.權(quán)利要求11或12的方法，其中所述標(biāo)簽選自MKVILLRDVPKIGKKGEIKEVSDGYARNYUPRGFAKEYTEGLERAIKHEKEIE隨K-EREREESEKILKELKKRTHWKVKAGEGGKIFGAVTAATVAEEISKTTGLKLDKRWFKLDKPIKELGEYSLEVSLPGGVKDT隱VEREE(SEQIDNO:10);MKVILLEPLENLGDVGQWDVKPGYARNYLLPRGLAVLATESNLKALEARIRAQAKRLAERKAEAERLKEILENLTLTIPVRAGETKIYGSVTAKDIAEALSRQHGITIDPKRLALEKPIKELGEWLTYKPHPEVPIQLKVSWAQE(SEQIDNO:41);MKVIFLKDVKGKGKKGEIKDVADGYANNFLFKQGLA舊ATPA隨ALEAQKQKEQRQAAEELANAKKLKEELEKLTVEIPAKAGEGGRLFGSITSKQIAEALQAQHGLKLDKRKIELADAIRSLGYTNVPVKLHPEVTATLKVHVKEQK(SEQIDNO:42);MKWLLKDVSKIGKKGEIKNVSDGYARNYLIPKGLALEATPRVLKRLEAEKR-KKEEEKIQIKTQNEELLKMLKKFLYKIPVKAGESGKLFGALTNSDIAKAVEKIADVNIDKKFIVLEKPIKEIGMYDVLVRLPEGVSGKIKVEVIQEGKN(SEQIDNO:43)和MKLILTQEVAGLGGPGDWEVRDGYGRNYLLPKRLAMPASPGAVKQVALIKRAREVREIRDLDQARALRDQLEALPVTLPARAGSGGRLFGSVTPDDIAAAVHAAGGPKLDKRR舊SGPIKTIGSHQVTVRLHPEVSATVSVEWPAS(SEQIDNO:44),14.修飾目標(biāo)蛋白前體的方法，其包括下述步驟將權(quán)利要求I-IO任一所述N末端帶標(biāo)簽的加工酶與目標(biāo)蛋白前體反應(yīng)，以及從所述加工酶中分離目標(biāo)蛋白。15.權(quán)利要求14的方法，其中所述N末端帶標(biāo)簽的加工酶和目標(biāo)蛋白前體在表達(dá)后能分離目標(biāo)蛋白的合適宿主中共表達(dá)。全文摘要本發(fā)明涉及加工酶，其包含源于來自嗜熱細(xì)菌的強(qiáng)堿性蛋白質(zhì)的N末端連接的標(biāo)簽。所述加工酶可用于修飾蛋白。其可以高量生產(chǎn)，并在使用后從修飾的蛋白中有效分離。文檔編號C07K1/00GK101563358SQ200780037756公開日2009年10月21日申請日期2007年10月12日優(yōu)先權(quán)日2006年10月13日發(fā)明者A·C·肖申請人:諾沃-諾迪斯克保健股份有限公司