專(zhuān)利名稱(chēng)：：用于提高抗體產(chǎn)量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及提高抗體產(chǎn)量的方法。更具體地說(shuō)，涉及基因工程重新改造抗體的方法，以使得在寄主細(xì)胞中產(chǎn)生的基因工程再造抗體的產(chǎn)量相比基因工程再造抗體的親代抗體產(chǎn)量更大。
背景技術(shù)：
：?jiǎn)慰寺】贵w具有各種各樣的應(yīng)用，包括體外診斷、實(shí)驗(yàn)室試劑、以及治療。當(dāng)前，有至少200種經(jīng)歷臨床試驗(yàn)的抗體或抗體片段(Morrow,K.J.,Jr.,單克隆抗體生產(chǎn)技術(shù)，Gen.Eng.News,2002,20(14):21)。在CHO細(xì)胞中高水平表達(dá)抗體要求從轉(zhuǎn)錄到轉(zhuǎn)譯和分泌的最佳效力。通過(guò)使用有潛力的病毒增強(qiáng)子如hCMV立即早期基因增強(qiáng)子(immediate&arlygeneenhancer)和啟動(dòng)子序列與轉(zhuǎn)錄穩(wěn)定的聚腺苷酸化信號(hào)如SV40polyA位點(diǎn)一起，哺乳動(dòng)物表達(dá)質(zhì)粒主要地l皮設(shè)計(jì)成能達(dá)到較高的mRNA水平。合成的cDNA構(gòu)建體能夠被設(shè)計(jì)成能通過(guò)刪去抗體編碼序列內(nèi)隱蔽剪接位點(diǎn)及其他潛在的不利的順式元件來(lái)更進(jìn)一步增強(qiáng)mRNA水平。此外，通過(guò)最佳的密碼子使用并且通過(guò)最小化mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)能量，合成的構(gòu)建體可以增強(qiáng)基因翻譯機(jī)(TrinhR，GurbaxaniB，MorrisonSL，SeyfzadehM，在(GGGGS)3連結(jié)物序列內(nèi)密碼子對(duì)使用的優(yōu)化導(dǎo)致提高的蛋白質(zhì)表達(dá)，MolImmunol.,2004年1月；40(10):717-22)。然而，即使使用這樣優(yōu)化的表達(dá)系統(tǒng)，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)水平在不同的抗體當(dāng)中也能夠發(fā)生顯著變化。從表達(dá)質(zhì)粒中合成抗體分子所需的不同細(xì)胞階段的分析導(dǎo)致抗體可變區(qū)性狀能夠影響給定抗體表達(dá)水平的觀念。然而，人們很少知道序列特性和可變區(qū)結(jié)構(gòu)不論轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)譯效率如何都能夠影響基因表達(dá)。許多來(lái)源于特定次級(jí)的可變區(qū)基因的抗體是生物物理學(xué)地傾向于可能導(dǎo)致低基因表達(dá)的很小的穩(wěn)定性。根據(jù)人類(lèi)scFv噬菌體文庫(kù)的分析，人類(lèi)輕鏈和重鏈可變區(qū)能夠被分類(lèi)成具有不同程度結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的亞組(EwertS，HoneggeA，PlilckthuA，用可歸納的方法進(jìn)行的免疫球蛋白VH結(jié)構(gòu)域生物物理學(xué)性狀的基于結(jié)構(gòu)的改進(jìn)，Biochemistry,2003年2月18日；42(6):1517-28)。屬于具有很小穩(wěn)定性的成員的亞群的抗體或片段可以具有聚集傾向，并且由于無(wú)效的折疊或裝配而可能難以表達(dá)。進(jìn)一步的，在一些過(guò)程如折疊和分泌中扮演關(guān)鍵角色的殘基經(jīng)常在種系序列中高度保守，但是在最初抗體庫(kù)的傳代以及經(jīng)過(guò)體細(xì)胞突變的親和力成熟期間可以被改變。這可能會(huì)導(dǎo)致穩(wěn)定性很小并且低表達(dá)的抗體。單一殘基變化能夠顯著地改變陪伴結(jié)合性或輕鏈/重鏈裝配并且導(dǎo)致最終被降解的胞內(nèi)未配對(duì)重鏈的增加(DulJL,ArgonY.在輕鏈可變區(qū)中單一氨基酸置換尤其會(huì)阻斷免疫球蛋白分泌。ProcNatlAcadSciUSA.1990年10月；87(20):8135-9;WiensGD,LekkerkerkerA，VeltmanI,RittenbergMB,在VH互補(bǔ)性確定區(qū)2中單一保守殘基的突變導(dǎo)致嚴(yán)重的Ig分泌缺陷。JImmunol.,2001年8月15日；167(4):2179-86)。其他的去穩(wěn)定化突變包括導(dǎo)入隱蔽的疏水殘基或表面疏水殘基。無(wú)變化的核心填充殘基如Glu6/Gln6的重鏈也對(duì)鄰近位置如H7和H10的殘基變化敏感(HoneggerA，PlUckth皿A，在第6位隱蔽的谷氨酰胺或谷氨酸鹽殘基對(duì)免疫球蛋白可變區(qū)結(jié)構(gòu)的影響。JMolBiol.，2001年6月8日；309(3):687-99)。只要體細(xì)胞突變不與關(guān)鍵的結(jié)構(gòu)性閾值界限交叉，許多不符合生物物理學(xué)需要的序列能夠在天然產(chǎn)生的抗體中被發(fā)現(xiàn)。多數(shù)抗體的穩(wěn)定性和表達(dá)潛力能夠用合理的序列基因工程再造方法增強(qiáng)。最簡(jiǎn)單的實(shí)現(xiàn)基因工程再造抗體的方法之一是，利用存在于有數(shù)千個(gè)抗體序列的數(shù)據(jù)庫(kù)中的信息(參見(jiàn)，例如，JohnsonG,WuTT.Kabat數(shù)據(jù)庫(kù)及其應(yīng)用未來(lái)的方向，2001年1月1日；29(1):205-6.)。仔細(xì)的分析或許可以識(shí)別可能有問(wèn)題的殘基。舉例來(lái)說(shuō)，在給定位置很少被發(fā)現(xiàn)的個(gè)別殘基能夠被改變以匹配用于該位置的共有序列殘基從而提高穩(wěn)定性(SteipeB，SchillerB，PliickthunA，SteinbacherS.序列統(tǒng)計(jì)學(xué)可靠地預(yù)測(cè)在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域中穩(wěn)定化的突變體，JMolBiol.，1994年7月15日;240(3):188-92.)以及在哺乳動(dòng)物細(xì)胞系中的表達(dá)(WhitcombEA，MartinTM，RittenbergMB,Ig分泌物的復(fù)原在T15L鏈中種系編碼的殘基的變異導(dǎo)致游離輕鏈的分泌以及承受有損分泌物的重鏈的裝配的抗體絡(luò)合物，JImmunol.,2003年2月15日；170(4):1903-9)。生物物理學(xué)攻擊性的殘基例如疏水表面殘基的識(shí)別和逆轉(zhuǎn)也會(huì)導(dǎo)致提高的表達(dá)(NiebaL，HorieggerA，KrebberC，PlfickthunA，疏水小塊在抗體可變/恒定結(jié)構(gòu)域界面處的斷裂基因工程scFv片段的改進(jìn)的體內(nèi)折疊和物理特性，ProteinEng，1997年4月；10(4):435-44)。目前可用于支撐生物物理學(xué)穩(wěn)定的抗體的合理再設(shè)計(jì)的大多數(shù)數(shù)據(jù)已經(jīng)隨著在細(xì)菌性表達(dá)的噬菌體展7示系統(tǒng)中的抗體片段而產(chǎn)生(EwertS，HoneggerA，PKickthunA.用于胞外和胞內(nèi)應(yīng)用的抗體的穩(wěn)定性提高對(duì)穩(wěn)定的構(gòu)架和基于結(jié)構(gòu)的構(gòu)架基因工程的CDR嫁接，Methods,2004年10月；34(2):184-99，綜述)。在任何可能的情況下通過(guò)簡(jiǎn)單地從更穩(wěn)定的種系亞群之一挑選人類(lèi)供體可變區(qū)構(gòu)架，通過(guò)CDR嫁接技術(shù)進(jìn)行的人源化能夠固定或者避免這些穩(wěn)定性問(wèn)題(Ewert等，2004，參見(jiàn)前述)。WO2004/065417提供了一種進(jìn)一步改進(jìn)的方法，其通過(guò)將抗體可變域的高變區(qū)l(HVR1)和/或高變區(qū)2(HVR2)氨基酸序列與每一人類(lèi)可變域亞群共有氨基酸序列中相應(yīng)的HVR1和/或HVR2氨基酸序列相比較，并且選擇與可變域的HVR1和/或HVR2氨基酸序列具有大多數(shù)序列一致性的亞群共有序列，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物中以更高產(chǎn)率來(lái)生產(chǎn)這種抗體和/或抗原結(jié)合片段。在WO2004/065417中，共有序列源自于具有最相同的HVR1和域HVR2的抗體，并且被應(yīng)用于嫁接CDR的抗體，其中所有的構(gòu)架序列是完全的人類(lèi)序列。其他的人源化方法，例如嚙齒動(dòng)物抗體表面重修(resurfacing)方法(美國(guó)專(zhuān)利No.5,639,641;RoguskaMA，PedersenJT，KeddyCA，HenryAH，SearleSJ，LambertJM，GoldmacherVS，BlattlerWA，ReesAR，GuildBC.通過(guò)可變域表面重修的鼠科單克隆抗體的人源化。ProcNatlAcadSciUSA.，1994年2月1日；91(3):969-73;PedersenJT,HenryAH，SearleSJ，GuildBC，RoguskaM，ReesAR.表面可以接近的殘基在人類(lèi)和鼠科的免疫球蛋白Fv結(jié)構(gòu)域中的比較，對(duì)于鼠科抗體的人源化的暗示。JMolBiol.，1994年1月21曰;235(3):959-73)、抗體鑲飾(veneering)方法(美國(guó)專(zhuān)利No.6,797,492;PadlanE.A.1991，Mol，Immunolgy，28:489-498)、以及抗體去免疫化(deimmunizing)方法(申請(qǐng)公開(kāi)WO98/52976)，可以維持鼠科可變區(qū)的疏水核心。最終，這種在來(lái)源于具有較少生物物理學(xué)特性的鼠科種系的可變區(qū)具有鼠科核心結(jié)構(gòu)的人源化抗體將可能繼承這些特性。因此需要提供一種能夠改善這種人源化抗體的生物物理學(xué)特性的方法。這些方法應(yīng)產(chǎn)生較高的來(lái)自哺乳動(dòng)物細(xì)胞的表面重修抗體的表達(dá)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供了一種總體方法，用以改善導(dǎo)致抗體產(chǎn)量提高的抗體(在下文中稱(chēng)為"親代抗體")的生物物理學(xué)特性。該方法可以識(shí)別親代抗體的可變區(qū)構(gòu)架中一個(gè)以上非共有序列氨基酸殘基，并且優(yōu)選用一個(gè)以上共有序列殘基代替它們。任選地，出于生物物理學(xué)考慮，一個(gè)以上氨基酸可以用非共有序列殘基替代。[11]通過(guò)比對(duì)(aligning)來(lái)自根據(jù)假定的天然關(guān)系與親代起源抗體所屬相同的同種(例如，鼠科)、或者同屬(例如，小鼠屬和大鼠屬)跨種、或者跨屬或者其他系統(tǒng)分類(lèi)的抗體的抗體可變區(qū)構(gòu)架序列的集合，可以識(shí)別共有序列殘基。[12]更具體地講，本發(fā)明包含一種方法，用于通過(guò)序列基因工程再造來(lái)提高在寄主細(xì)胞中親代抗體或其表位結(jié)合片段的產(chǎn)量。該序列基因工程再造包括a)比對(duì)來(lái)自根據(jù)假定的天然關(guān)系與親代起源抗體所屬相同的同種(例如，鼠科)、或者同屬(例如，小鼠屬和大鼠屬)跨種、或者跨屬或者其他系統(tǒng)分類(lèi)的抗體的抗體可變區(qū)構(gòu)架序列的集合，其中，這種比對(duì)可識(shí)別在構(gòu)架中各個(gè)位置處最頻繁地出現(xiàn)的氨基酸殘基；b)將共有序列殘基與親代抗體可變區(qū)構(gòu)架序列中的相應(yīng)殘基相比較；c)在親代抗體中識(shí)別可變區(qū)構(gòu)架序列中一個(gè)以上非共有序列氨基酸殘基；以及d)在親代抗體或其片段中用在等效位置處的共有序列殘基取代一個(gè)以上非共有序列氨基酸殘基，從而產(chǎn)生變異抗體，其中，在寄主細(xì)胞中以相比親代抗體更高的產(chǎn)率來(lái)生產(chǎn)變異抗體。[13]任選地，出于生物物理學(xué)考慮，一個(gè)以上氨基酸可以用非共有序列殘基替代。[14]本發(fā)明通常還提供了一種方法，用以改善導(dǎo)致提高抗體產(chǎn)量的人源化抗體的生物物理學(xué)特性。該方法可以識(shí)別人源化抗體可變區(qū)構(gòu)架的核心中一個(gè)以上非共有序列氨基酸殘基，并且用一個(gè)以上共有序列殘基代替它們。任選地，出于生物物理學(xué)考慮，一個(gè)以上氨基酸可以用非共有序列殘基替代。通過(guò)比對(duì)來(lái)自根據(jù)假定的天然關(guān)系與親代起源抗體所屬相同的同種(例如，鼠科)、或者來(lái)自同屬(例如，小鼠屬和大鼠屬)跨種、或者來(lái)自跨屬或者其他系統(tǒng)分類(lèi)的抗體的抗體可變區(qū)構(gòu)架序列集合，可以識(shí)別共有序列殘基。[15]因此，本發(fā)明包含一種方法，用于通過(guò)序列基因工程再造(sequencereengineering)來(lái)提高寄主細(xì)胞中的人源化抗體或其表位結(jié)合片段的產(chǎn)量。該序列基因工程再造包括a)比對(duì)來(lái)自根據(jù)假定的天然關(guān)系與人源化抗體起源所屬相同的同種(例如，鼠科)、或者同屬(例如，小鼠屬和大鼠屬)跨種、或者跨屬或者其他系統(tǒng)分類(lèi)的抗體的抗體可變區(qū)構(gòu)架序列的集合，其中，這種比對(duì)可識(shí)別在構(gòu)架中各個(gè)位置處最頻繁地出現(xiàn)的氨基酸殘基(共有序列殘基)；b)將共有序列殘基與人源化抗體可變區(qū)構(gòu)架序列中的相應(yīng)殘基相比較；c)在人源化抗體中識(shí)別可變區(qū)構(gòu)架序列中一個(gè)以上非共有序列殘基；以及d)在人源化抗體或其片段中用在等效位置處的共有序列殘基取代所述一個(gè)以上非共有序列殘基，從而產(chǎn)生變異抗體，其中，在細(xì)胞中以相比人源化抗體更高的產(chǎn)率來(lái)生產(chǎn)變異抗體。[16]任選地，出于生物物理學(xué)考慮，一個(gè)以上氨基酸可以用非共有序列殘基替代。[17]在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種方法，用以改善導(dǎo)致提高抗體產(chǎn)量的人源化鼠抗體的生物物理學(xué)特性。該方法可以識(shí)別人源化抗體的可變區(qū)構(gòu)架中一個(gè)以上非共有序列氨基酸殘基，并且用一個(gè)以上共有序列殘基代替它們。任選地，出于生物物理學(xué)考慮，一個(gè)以上氨基酸可以用非共有序列殘基替代。通過(guò)比對(duì)來(lái)自鼠抗體的抗體可變區(qū)構(gòu)架序列的集合，可以識(shí)別共有序列殘基。[18]更具體地講，本發(fā)明包含一種方法，用于通過(guò)序列基因工程再造來(lái)提高寄主細(xì)胞中的人源化鼠抗體或其表位結(jié)合片段的產(chǎn)量。該序列基因工程再造包括a)比對(duì)鼠抗體可變區(qū)構(gòu)架序列的集合，其中，這種比對(duì)可以識(shí)別在構(gòu)架中各個(gè)位置處最頻繁地出現(xiàn)的氨基酸殘基(共有序列殘基)；b)將共有序列殘基與人源化抗體可變區(qū)構(gòu)架序列中的相應(yīng)殘基相比較；C)在人源化抗體中識(shí)別可變區(qū)構(gòu)架序列中一個(gè)以上非共有序列氨基酸殘基；以及d)在人源化抗體或其片段的可變區(qū)構(gòu)架序列中用在等效位置處的共有序列殘基取代所述一個(gè)以上非共有序列殘基，從而產(chǎn)生變異抗體，其中，在細(xì)胞中以相比人源化抗體更高的產(chǎn)率來(lái)生產(chǎn)變異抗體。[19]任選地，出于生物物理學(xué)考慮，一個(gè)以上氨基酸可以用非共有序列殘基替代。[20]本發(fā)明還包含編碼變異抗體的分離的核酸。[21]圖1顯示了IgG抗體和重鏈及輕鏈可變區(qū)的示意圖。重鏈和輕鏈可變區(qū)的草圖被顯示為右邊，其中構(gòu)架殘基呈灰色，而CDR呈黑色。給出用于可變區(qū)端點(diǎn)以及用于各個(gè)CDR的分界線的Kabat抗體殘基序列號(hào)。[22]圖2顯示了在用含有huC242基因的質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染幾小時(shí)后，293T細(xì)胞的較低的huC242產(chǎn)量。用于人源化抗體A、B和huC242的質(zhì)粒的濃度被歸一化，并且平行地以2yg/mL被導(dǎo)入293T細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染14hr、22hr和48hr后從培養(yǎng)基中收集分泌的抗體。通過(guò)使用抗hulgGIELISA確定抗體濃度。[23]圖3顯示了在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞中huC242HC和LC的mRNA水平。huC242及其它表面重修抗體A、B、C、D、E、F被平行地導(dǎo)入293T細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染72hr后從各個(gè)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞樣本中分離總的mRNA，隨后將樣本逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。[24]圖4顯示了具有條帶的凝膠，包括裝配完整的抗體、標(biāo)簽H2L2、以及來(lái)自可產(chǎn)生huC242或表面重修Ab.A的CHO細(xì)胞的重鏈、標(biāo)簽H。Ab.A和huC242克隆1及克隆2的表達(dá)和裝配被比較。用于Ab.A和兩個(gè)C242克隆的CHO細(xì)胞系被平行地培養(yǎng)，并且溶解細(xì)胞。對(duì)整個(gè)細(xì)胞裂解液進(jìn)行蛋白質(zhì)A純化。將分離出的IgG在不變性凝膠上進(jìn)行分離并且用考馬斯亮藍(lán)染色。[25]圖5A顯示了huC242抗體的重鏈可變區(qū)序列(SEQIDNO:1)與Kabat數(shù)據(jù)庫(kù)中鼠抗體的各自共有序列(SEQIDNO:3)比對(duì)的情況。CDR的序列加有下劃線并且用粗體標(biāo)明。在序列間不同的殘基用灰色背景以高亮度顯示，而優(yōu)選的在此詳細(xì)論述的殘基用黑色背景高亮度顯示。表面殘基在其下用星號(hào)"*"標(biāo)明。[26]圖5B顯示了huC242抗體的輕鏈可變區(qū)序列(SEQIDNO:2)與Kabat數(shù)據(jù)庫(kù)中鼠抗體的各自共有序列(SEQIDNO:4)比對(duì)的情況。CDR的序列加有下劃線并且用粗體標(biāo)明。在序列間不同的殘基用灰色背景以高亮度顯示，而優(yōu)選的在本專(zhuān)利中詳細(xì)論述的殘基用黑色背景高亮度顯示。表面殘基在其下用星號(hào)"*"標(biāo)明。[27]圖5C顯示了huC242抗體的輕鏈可變區(qū)序列(SEQIDNo:5)與來(lái)自免疫原的四個(gè)表面重修的人源化鼠抗體的各自共有序列(huMy96LC，SEQIDNO:6;rB4LC，SEQIDNO:7;huEM164LC，SEQIDNO:8;huN901LC，SEQIDNO:9;共有序列，SEQIDNO:10)進(jìn)行比對(duì)的情況，其顯示，在四個(gè)人源化抗體中，氨基酸R對(duì)于在huC242中發(fā)現(xiàn)的非共有序列Q而言是保守氨基酸殘基。在鼠的數(shù)據(jù)庫(kù)中，R被最保守的氨基酸殘基K取代。該情況下，由于兩個(gè)氨基酸類(lèi)似的特性，K可用R替換。盡管如此，Q用K置換的情況被包含在本發(fā)明范圍內(nèi)。比對(duì)以Kabat為基礎(chǔ)。[28]圖6顯示了在huC242HC或LC構(gòu)架中單個(gè)氨基酸置換引起的IgG產(chǎn)量的適度提高。將具有單一構(gòu)架氨基酸置換的huC242變體的生產(chǎn)率與親代huC242和抗體B的生產(chǎn)率相比較。相等含量的質(zhì)粒被轉(zhuǎn)染入293T細(xì)胞。在72hr后，用ELISA確定分泌的IgG水平。通過(guò)FACS測(cè)量變異的huC242對(duì)表達(dá)抗原的Colo205細(xì)胞的結(jié)合。[29]圖7顯示了通過(guò)在293T瞬時(shí)表達(dá)實(shí)驗(yàn)對(duì)象中兩個(gè)或三個(gè)huC242HC和LC變種的組合使IgG產(chǎn)量顯著提高。將原始huC242的生產(chǎn)率設(shè)定為1.0。在轉(zhuǎn)染72hr后從培養(yǎng)基中收集分泌的IgG。11[30]圖8顯示了huC242HC和LC變體的mRNA水平保持未變。通過(guò)qPCR確定具體變異的huC242的mRNA水平，并且歸一化成新mRNA。圖9通過(guò)在變性凝膠上整體細(xì)胞裂解液的電泳，顯示了胞內(nèi)LC的蓄積量因HC構(gòu)架殘基取代而提高。293T細(xì)胞在轉(zhuǎn)染72hr后被裂解。HC和LC分別用抗huIgGl抗體和抗huK抗體檢測(cè)。'圖10(a)和10(b)顯示了huC242變體導(dǎo)致在細(xì)胞中提高的HC和LC合成、以及整體抗體(H2L2)的提高的裝配。圖10(a):293T細(xì)胞在轉(zhuǎn)染72hr后被裂解。將裂解產(chǎn)物在凝膠上分離并且轉(zhuǎn)印到薄膜上面，其被探測(cè)用于裝配的和未裝配的IgGHC和LC(在不變性的條件下進(jìn)行電泳)。印跡被剝離并且用抗微管蛋白抗體再探測(cè)以顯示樣本加載水平。圖10(b):通過(guò)使用蛋白質(zhì)A親合磁珠，將IgG從如圖10(a)所述制備的細(xì)胞裂解液中分離。然后將分離的樣品在不變性凝膠上進(jìn)行電泳，隨后用考馬斯亮藍(lán)染色。圖1l(a)顯示了huC242和huC242變體與Colo205細(xì)胞的結(jié)合性的FACS分析。AbB是非結(jié)合性對(duì)照抗體。圖ll(b)顯示了huC242和huC242變體的DM4接合物與Colo205細(xì)胞的結(jié)合性的FACS分析。AbB是非結(jié)合性對(duì)照抗體。圖1l(c)顯示了通過(guò)使用FACS分析得到的在Colo205細(xì)胞上親代huC242抗體和變異的huC242抗體與FITC標(biāo)記的親代huC242競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合的結(jié)果?？贵wB用作非結(jié)合性、非競(jìng)爭(zhēng)對(duì)照物。圖12顯示了huC242的重鏈(A組；SEQIDNOs:11和12)和輕鏈(B組；SEQIDNOs:13和14)的氨基酸和核酸序列。在C組中還顯示了huC242的重鏈可變域序列(SEQIDNO:15)和輕鏈可變域序列(SEQIDNO:16)，描述了編碼在huC242中被識(shí)別的氨基酸變化的密碼子。具體實(shí)施例方式以下參考人源化的鼠抗體，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行描述。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將會(huì)理解，基因工程再造(reengineering)方法能夠被應(yīng)用于任何有足夠大的數(shù)據(jù)庫(kù)的抗體，由該數(shù)據(jù)庫(kù)可衍生出重鏈和/或輕鏈可變區(qū)的共有序列。對(duì)于人類(lèi)抗原，產(chǎn)生單克隆抗體的標(biāo)準(zhǔn)途徑是，用抗原免疫另一種動(dòng)物種類(lèi)，產(chǎn)生與動(dòng)物免疫B細(xì)胞的雜交瘤，并且選擇可分泌能結(jié)合于人類(lèi)抗原的抗體的雜交瘤克隆。最常用的動(dòng)物是小鼠或者大鼠，因此產(chǎn)生的抗體是鼠抗體。在人類(lèi)體內(nèi)使用對(duì)于人類(lèi)抗原的單克隆抗體，用于各種疾病比如癌癥、自身免疫疾病、炎癥、以及感染的診斷目的或者治療目的。然而在人類(lèi)身上鼠源單克隆抗體的應(yīng)用受到限制，因?yàn)樵摽贵w會(huì)被認(rèn)為是異種蛋白并且引起經(jīng)常稱(chēng)為HAMA反應(yīng)(humananti-mouseantibodyresponse,人類(lèi)抗小鼠抗體反應(yīng))的免疫反應(yīng)。為防止HAMA反應(yīng)，人們已經(jīng)開(kāi)發(fā)了多種用于鼠抗體人源化的方法。所有方法是用人類(lèi)恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域替換鼠科恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域(對(duì)于IgG的結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)，請(qǐng)參見(jiàn)圖l)，不同的是抗體可變區(qū)結(jié)構(gòu)域的人源化策略。CDR嫁接的方法將6個(gè)CDR結(jié)構(gòu)域從鼠的可變區(qū)通過(guò)代替人類(lèi)CDR結(jié)構(gòu)域而轉(zhuǎn)移至同源的人類(lèi)可變區(qū)，因此鼠的可變域構(gòu)架區(qū)域被同源的人類(lèi)構(gòu)架區(qū)域完全替代。其他的人源化方法，比如嚙齒動(dòng)物抗體表面重修的方法(美國(guó)專(zhuān)利No.5,639,641;Roguskaetal.，1994，Proc.Natl.Acad,Sci.USA.91:969-973，參見(jiàn)前述；Pedersenetal.，1994,J.Mol.Biol.，235:969-973,參見(jiàn)前述)、抗體鑲飾的方法(美國(guó)專(zhuān)利No.6,797,492;PadlanEA1991，MolImunolgy，28:489-498，參見(jiàn)前述)、以及抗體去免疫化的方法(國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)WO98/52976)維持了鼠的可變域構(gòu)架區(qū)域的疏水核心，并且僅用人類(lèi)殘基改變構(gòu)架區(qū)域中表面暴露的殘基。例如，通過(guò)使用表面重修技術(shù)進(jìn)行人源化的抗體在每種溶劑可接近的可變區(qū)構(gòu)架位置中都含有人類(lèi)殘基，同時(shí)在CDR和隱蔽的可變區(qū)構(gòu)架位置中保留鼠的殘基。這些人源化抗體保持了原始鼠抗體的結(jié)合親合力，該結(jié)合親合力在其他的人源化方法比如CDR嫁接中當(dāng)疏水核心被代替時(shí)經(jīng)常會(huì)喪失。人源化抗體典型地通過(guò)使它們的基因在哺乳動(dòng)物寄主細(xì)胞比如CHO(中國(guó)地鼠卵巢)細(xì)胞或T293細(xì)胞(人類(lèi)腎細(xì)胞系)中表達(dá)而被生產(chǎn)出來(lái)。我們觀察到通過(guò)表面重修技術(shù)制備的不同的人源化抗體在相同的哺乳動(dòng)物寄主細(xì)胞中以不同的量被生產(chǎn)出來(lái)(圖2)，雖然產(chǎn)生了類(lèi)似量的用于抗體的mRNA(圖3)。我們推斷，可變區(qū)的初級(jí)氨基酸序列影響了抗體生產(chǎn)。因此，我們開(kāi)發(fā)了一種提高在哺乳動(dòng)物寄主細(xì)胞中人源化單克隆抗體生產(chǎn)率的方法，該抗體在可變域區(qū)域構(gòu)架中具有隱蔽的鼠的氨基酸的核心。縮寫(xiě)和定義Mab單克隆抗體CH重鏈的恒定區(qū)(結(jié)構(gòu)域)CH1、CH2、CH3重鏈的恒定區(qū)l、2、和3CL輕鏈的恒定區(qū)VH重鏈的可變區(qū)(結(jié)構(gòu)域)VL輕鏈的可變區(qū)(結(jié)構(gòu)域)CDR互補(bǔ)性確定區(qū)域CDRL1、CDRL2、CDRL3輕鏈的互補(bǔ)性確定區(qū)域1、2、禾口3CDRH1、CDRH2、CDRH3重鏈的互補(bǔ)性確定區(qū)域1、2、禾口3FR可變域的構(gòu)架區(qū)域(結(jié)構(gòu)域)FRL1、FRL2、FRL3、FRL4輕鏈可變域的構(gòu)架區(qū)域1、2、3、禾口4FRH1、FRH2、FRH3、FRH4重鏈可變域的構(gòu)架區(qū)域1、2、3、禾口4qPCR定量聚合酶鏈反應(yīng)抗體的描述和定義如圖1所示，抗體典型地包含兩條通過(guò)二硫鍵連接在一起的重鏈和兩條輕鏈。每一條輕鏈通過(guò)二硫鍵被連接于各自的重鏈上。每一條重鏈依序包含從N-末端開(kāi)始，可變域(區(qū)域)、恒定結(jié)構(gòu)域(區(qū)域)1、鉸合區(qū)、以及恒定結(jié)構(gòu)域(區(qū)域)2和3。各條輕鏈具有在N-末端的可變域(區(qū)域)和在C-末端的恒定結(jié)構(gòu)域。輕鏈可變域與重鏈的可變域排列在一起。輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域與重鏈的恒定結(jié)構(gòu)域1排列在一起。在輕鏈和重鏈中的恒定結(jié)構(gòu)域都不i:接涉及抗原結(jié)合性。各對(duì)輕鏈和重鏈的可變域形成抗原結(jié)合位點(diǎn)。在輕鏈和重鏈上的結(jié)構(gòu)域具有相同的普通結(jié)構(gòu)，并且各個(gè)結(jié)構(gòu)域包含具有四個(gè)區(qū)域的構(gòu)架，這四個(gè)區(qū)域的序列相對(duì)保守，通過(guò)三個(gè)互補(bǔ)性確定區(qū)域(CDR)相連接。各個(gè)LC和HC的這四個(gè)構(gòu)架區(qū)域主要采用e折疊構(gòu)型，并且CDR形成環(huán)連接(loopsconnecting)，并且有時(shí)形成P折疊結(jié)構(gòu)的一部分?？贵w可變區(qū)的這6個(gè)CDR(來(lái)自LC和HC的各3個(gè))被保持得非常接近于彼此和構(gòu)架區(qū)域，并且形成抗原結(jié)合位點(diǎn)。通過(guò)參考Kabat，可以確定抗體的CDR和構(gòu)架區(qū)域("免疫學(xué)興趣的蛋白質(zhì)序列"。健康和人類(lèi)服務(wù)美國(guó)部，美國(guó)政府印刷局，1987)。[44]來(lái)自免疫球蛋白成熟重鏈和輕鏈可變區(qū)的氨基酸分別被標(biāo)示為Hx和Lx，其中x是根據(jù)Kabat圖表標(biāo)示氨基酸位置的編號(hào)(參見(jiàn)前述)。Kabat列出了許多用于各個(gè)亞群(例如，小鼠、人類(lèi)、大鼠等)抗體的氨基酸序列。Kabat使用了一種方法，用于對(duì)列出的序列中的各個(gè)氨基酸指定殘基編號(hào)，并且用于指定殘基編號(hào)的該方法已經(jīng)變成本領(lǐng)域中的標(biāo)準(zhǔn)。通過(guò)參考保守的氨基酸，將所討論的抗體與Kabat中共有序列之一進(jìn)行比對(duì)，Kabat的圖表可延伸至其他未包括在該綱要內(nèi)的抗體。Kabat編號(hào)系統(tǒng)的使用可輕易地識(shí)別在不同抗體中的等效位置處的氨基酸。例如，在人類(lèi)抗體Ln(n是任何整數(shù)，例如，5)位置處的氨基酸占據(jù)小鼠抗體第L5位的氨基酸的等效位置。通過(guò)使用Kabat(參見(jiàn)前述)中的14編號(hào)方案，任何兩個(gè)抗體序列僅能夠以一種途徑進(jìn)行比對(duì)。因此，對(duì)于抗體，百分比一致性具有唯一性和定義明確的意義。在此使用的術(shù)語(yǔ)"構(gòu)架區(qū)域"，指的是免疫球蛋白輕鏈和重鏈可變區(qū)的那些部分，所述可變區(qū)是在包含一個(gè)以上種類(lèi)的屬中不同免疫球蛋白間相對(duì)保守的區(qū)域(即，除CDR以外的區(qū)域)，正如Kabat等所定義的那樣，參見(jiàn)前述。在此使用的術(shù)語(yǔ)"變異抗體"或"變體"，指的是氨基酸序列與親代抗體氨基酸序列有區(qū)別的的抗體。這樣的變體必要地與親代抗體具有小于100%的序列一致性或者相4以性。在一種優(yōu)選實(shí)施方式中，變體的氨基酸序列將與親代抗體重鏈或輕鏈可變域的氨基酸序列具有從約75%至小于100%的氨基酸序列一致性或者相似性；更優(yōu)選一致性或者相似性為從約80%至小于100%、更優(yōu)選從約85%至小于100%、更優(yōu)選從約90%至小于100%、并且最優(yōu)選從約95%至小于100%。相對(duì)于該序列的一致性或者相似性在此被定義為在比對(duì)序列、以及必要時(shí)為取得最大百分比的序列一致性而導(dǎo)入的缺口染色體后，候選序列中與親代抗體殘基相同的氨基酸殘基(即相同的殘基)的百分比。N-末端、C-末端、或內(nèi)部延伸部、缺失、或者插入可變域的抗體序列外側(cè)之中的任一情況將不會(huì)被理解為影響序列一致性或者相似性?？贵w變體通常是指，與親代抗體對(duì)應(yīng)的可變區(qū)相比在其可變區(qū)具有氨基酸取代(被一個(gè)以上氨基酸殘基取代；例如，被至少一個(gè)至大約二十五個(gè)氨基酸殘基、并且優(yōu)選被大約一個(gè)至大約十個(gè)氨基酸殘基取代)的抗體變體。在此使用的術(shù)語(yǔ)"親代"抗體，包括由在自然群體中起主要作用的基因所產(chǎn)生的抗體。還包括自然突變體形式的抗體。進(jìn)一步包括已經(jīng)由抗體的這種自然群體或者由它們的自然突變體產(chǎn)生、或者很可能被生產(chǎn)出來(lái)的抗體。這樣的抗體包括，但是不限于，人源化或表面重修的抗體、完全人源的抗體、或嵌合抗體、或者任何能夠按照本發(fā)明的教導(dǎo)被產(chǎn)生或操控的抗體。這種抗體通常具有結(jié)合專(zhuān)一性或者具有原始抗體的抗原結(jié)合性殘基，但是在有些情況下，這種抗體還可以具有不同的結(jié)合專(zhuān)一性。例如，抗體可以顯示出提高的對(duì)于抗原的結(jié)合專(zhuān)一性，所述抗原是部分地與原始抗原相關(guān)或者與原始抗原無(wú)關(guān)。[48]親代抗體的一個(gè)非限制性實(shí)施例是"親代C242抗體"，指的是具有屬于、或來(lái)源于鼠源C242抗體的抗原結(jié)合性殘基的抗體(美國(guó)專(zhuān)利No.5,552,293)或其衍生物。例如，單克隆抗體C242可以是鼠源單克隆抗體或人源化的鼠源單克隆抗體、嵌合體鼠源單克隆抗體、完全人源的鼠源單克隆抗體、具有鼠源單克隆抗體C242抗原結(jié)合性殘基的C242。[49]靶向療法比如抗體定向療法優(yōu)于非靶向療法，非靶向療法例如是經(jīng)口服或靜脈注射進(jìn)行藥物給藥的系統(tǒng)療法、或者全身療法例如外部輻射療法(XRT)?？贵w定向療法的優(yōu)點(diǎn)、尤其是通過(guò)使用單克隆抗體(MAb)的療法的優(yōu)點(diǎn)是有能力將治療劑的劑量釋藥至腫瘤，使正常組織更不受治療劑影響的破壞。該定向療法使用無(wú)保護(hù)的MAb或接合于細(xì)胞結(jié)合劑的MAb，所述細(xì)胞結(jié)合劑例如是藥物、抗菌素或其他毒素、放射性核素、以及中子捕獲試劑比如硼附加物。術(shù)語(yǔ)"表位"包括任何能夠特異性結(jié)合于免疫球蛋白'的蛋白質(zhì)決定簇。表位決定簇通常包含分子的化學(xué)活性表面基團(tuán)例如氨基酸或糖類(lèi)側(cè)鏈，并且通常具有特定的三維結(jié)構(gòu)特性、以及特定的荷電特性。如果在該位置處發(fā)現(xiàn)小于10%的在鼠抗體的大數(shù)據(jù)庫(kù)中的所有抗體序列，則氨基酸殘基被稱(chēng)作在構(gòu)架區(qū)域序列中給定位置處的稀有可變區(qū)構(gòu)架殘基。大數(shù)據(jù)庫(kù)的例子是Kabat抗體數(shù)據(jù)庫(kù)(參見(jiàn)，例如，JohnsonG，WuTT.Kabat數(shù)據(jù)庫(kù)及其應(yīng)用未來(lái)的方向。NucleicAcidsRes.2001年1月1日；29(1):205-6)。大的抗體數(shù)據(jù)庫(kù)含有至少1000個(gè)單個(gè)抗體可變區(qū)序列。使用上述定義，在不受限于特定實(shí)施方式的情況下，提供下述討論以便于理解本發(fā)明。在一個(gè)非限制性方面，本發(fā)明提供一種增強(qiáng)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中人源化抗體產(chǎn)量的方法，該抗體具有鼠的可變區(qū)核心結(jié)構(gòu)。該方法可以識(shí)別鼠的可變區(qū)構(gòu)架核心中的非共有序列氨基酸殘基，并且用鼠的共有序列的氨基酸殘基代替它們。因此，在一種實(shí)施方式中，本發(fā)明包括抗體變體或其片段的制造，其中，通過(guò)用來(lái)自共有序列可變區(qū)構(gòu)架序列的對(duì)應(yīng)殘基取代一個(gè)以上親代抗體中的氨基酸殘基來(lái)制造變體。這種取代的結(jié)果是，當(dāng)被導(dǎo)入寄主細(xì)胞中時(shí)，與親代抗體相比，變異的抗體或其片段顯示出增強(qiáng)的抗體合成性。在親代抗體中，取代優(yōu)選是用對(duì)應(yīng)的共有序列氨基酸殘基取代一個(gè)以上非共有序列氨基酸而進(jìn)行，所述非共有序列氨基酸是通過(guò)將親代抗體的每一重鏈和輕鏈可變域構(gòu)架區(qū)域的序列與重鏈和輕鏈可變域構(gòu)架區(qū)域的共有序列進(jìn)行比對(duì)而識(shí)別的。[57]在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，親代抗體中氨基酸殘基的取代是在重鏈中進(jìn)行的。在另一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，這種氨基酸取代是在輕鏈中進(jìn)行的。在親代抗體重鏈或輕鏈中的這種取代能夠獨(dú)立地或者同時(shí)地進(jìn)行。共有序列源自于抗體亞群的序列，所述抗體屬于根據(jù)假定的天然關(guān)系與親代起源抗體所屬相同的同種(例如，鼠科)、或者同屬跨種(例如，小鼠屬和大鼠屬)、或者跨屬或者其他系統(tǒng)分類(lèi)。[58]在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供一種方法，用于在寄主細(xì)胞中與親代抗體相比可提高變異抗體或其片段的產(chǎn)量，該方法包含a)將親代抗體的每一重鏈和輕鏈可變域構(gòu)架區(qū)域序列與重鏈和輕鏈可變域構(gòu)架區(qū)域的共有序列進(jìn)行比對(duì)，其中共有序列的重鏈或輕鏈序列源自于鼠抗體可變域的數(shù)據(jù)庫(kù)；b)用鼠的重鏈共有序列殘基取代親代抗體可變域構(gòu)架區(qū)域中的一個(gè)以上重鏈殘基，或者用鼠的共有序列輕鏈殘基取代親代抗體可變域構(gòu)架區(qū)域中的一個(gè)以上輕鏈殘基，其中，當(dāng)被導(dǎo)入寄主細(xì)胞中時(shí)，該取代會(huì)以相比親代抗體更高的產(chǎn)率來(lái)產(chǎn)生變異抗體或其片段；c)在親代抗體中識(shí)別輕鏈中的選自于Q45或者A70的一個(gè)以上氨基酸殘基、或者重鏈中的選自于E16、D26、K46或T89的一個(gè)以上氨基酸殘基，所述氨基酸殘基通過(guò)Kabat抗體殘基編號(hào)方案確定；以及d)用下述殘基取代親代抗體中的一個(gè)以上氨基酸殘基輕鏈中分別選自于K45(任選地，出于生物物理學(xué)考慮，K可以被非共有序列殘基R替代)或D70的一個(gè)以上氨基酸殘基；或重鏈中分別選自于A16、G26、E46或S46或V89的一個(gè)以上氨基酸殘基，其中，當(dāng)被導(dǎo)入寄主細(xì)胞中時(shí)，該取代會(huì)以相比親代抗體更高的產(chǎn)率來(lái)產(chǎn)生變異抗體或其片段。[59]在重鏈或輕鏈中的取代能夠獨(dú)立地或者同時(shí)地進(jìn)行。'在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，在變異抗體輕鏈中，Q45被K45(任選地，出于生物物理學(xué)考慮，K可以被非共有序列殘基R替代)取代并且A70被D70取代，而在變異抗體重鏈中，E16被A16取代；D26被G26取代；K46被E46或S46取代；并且T89被V89取代。這種取代優(yōu)選可以將變異抗體產(chǎn)率提高至少約100%或約200%。在一種優(yōu)選實(shí)施方式中，產(chǎn)率是至少約300%或更大。在一種更優(yōu)選的實(shí)施方式中，產(chǎn)率是約400%或更大。在一種最優(yōu)選的實(shí)施方式中，產(chǎn)率是約500%或更大。變體蛋白質(zhì)產(chǎn)率的提高還依賴(lài)于其他的因素，比如，但不限于，生長(zhǎng)因子的應(yīng)用或者用無(wú)血清培養(yǎng)基來(lái)培養(yǎng)細(xì)胞。[61]本發(fā)明還包括分離的核酸，該核酸包含全長(zhǎng)的鼠的或人的、人源化的或嵌合的C242編碼序列，該序列在用于編碼重鏈可變區(qū)或輕鏈可變區(qū)的序列區(qū)域中具有氨基酸密碼子中的至少一個(gè)變種，其中，所述至少一個(gè)變種可以提高被C242基因編碼的蛋白質(zhì)的產(chǎn)率，并且其中該蛋白質(zhì)包括被所述至少一個(gè)密碼子變種編碼的至少一個(gè)氨基酸變種。[62]在輕鏈中，取代選自于下述構(gòu)架位置(Kabat編號(hào)方案)Q45至K45;任選地，出于生物物理學(xué)考慮，K可以用非共有序列殘基R替代。A70至D70[63]在重鏈中，取代選自于下述構(gòu)架位置(Kabat編號(hào)方案)E16至A16D26至G26K46至E46T89至V89這種序列取代可以編碼作為變異抗體的變體C242基因產(chǎn)物。本發(fā)明還包括用于提高抗體產(chǎn)率的方法，該抗體是親代抗體的變體，來(lái)自通過(guò)在親代抗體中取代SEQIDNO:1(重鏈)或SEQIDNO:2(輕鏈)上的一個(gè)以上氨基酸殘基的寄主細(xì)胞培養(yǎng)物，該方法包括a)將SEQIDNO:1(重鏈)與共有序列重鏈序列進(jìn)行比對(duì)，或者將SEQIDNO:2(輕鏈)與共有序列輕鏈序列進(jìn)行比對(duì)，其中，通過(guò)使用氨基酸序列分析軟件比如VectorNTI(Invitrogen公司)比對(duì)重鏈和輕鏈免疫球蛋白可變區(qū)構(gòu)架，由鼠抗體序列數(shù)據(jù)庫(kù)(例如，Kabat數(shù)據(jù)庫(kù)-Johnson和Wu，2001)得到共有序列重鏈或輕鏈序列；b)在親代抗體中識(shí)別一個(gè)以上氨基酸殘基，該殘基選自于SEQIDNO:1中的E16、D26、K46或T89、以及SEQIDNO:2中的Q45或A70，氨基酸殘基由Kabat方案確定；以及c)分別地，用選自于來(lái)自共有序列的SEQIDNO:1中的A16、G26、E46、S46或V89的氨基酸殘基取代SEQIDNO:1中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基E16、D26、K46或T89;并且用選自于來(lái)自共有序列的SEQIDNO:2中的K45(任選地，出于生物物理學(xué)考慮，K可以用非共有序列殘基R替代)或D70的氨基酸殘基取代SEQIDNO:2中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基Q45或A70，其中，取代會(huì)導(dǎo)致變異抗體的產(chǎn)生，并且其中當(dāng)變異抗體被導(dǎo)入寄主細(xì)胞時(shí)，變體的產(chǎn)率大于親代抗體產(chǎn)率。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明包括一種變異抗體或其表位結(jié)合片段比如huC242變體，其中，該變體在親代抗體中有一個(gè)以上氨基酸取代，所述親代抗體具有包含SEQIDNO:1的重鏈[huC242重鏈]和SEQIDNO:2的輕鏈[huC242輕鏈]的可變區(qū)；并且當(dāng)被導(dǎo)入單一寄主細(xì)胞中時(shí)，與親代抗體相比，該變體顯示出提高的重鏈和/或輕鏈合成量、以及提高的重鏈/輕鏈裝配量，其中，所述取代是在選自于SEQIDNO:1中第16、26、46、或89位的一個(gè)以上重鏈可變區(qū)位置進(jìn)行，或者是在SEQIDNO:2中的第45位或70位輕鏈可變區(qū)位置、或在這兩個(gè)位置處進(jìn)行，所述位置通過(guò)Kabat編號(hào)方案確定。更優(yōu)選變異抗體具有選自下組的氨基酸取代輕鏈殘基Q45至K45(任選地，出于生物物理學(xué)考慮，K18可以用非共有序列殘基R替代)或者A70至D70;重鏈殘基E16至A16、D26至G26、K46至E46、或者T89至V89，并且該取代位于重鏈或輕鏈的構(gòu)架區(qū)域。[67]在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的細(xì)胞結(jié)合劑還可特異性地識(shí)別配體比如C242抗原(CD44/CanAg)，使得接合物將與靶細(xì)胞接觸足夠的時(shí)間周期，以允許接合物的細(xì)胞毒試劑部分作用于細(xì)胞，和/或允許接合物有足夠的時(shí)間被細(xì)胞內(nèi)在化。在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，細(xì)胞毒性接合物包含抗C242抗體的變體作為細(xì)胞結(jié)合劑，更優(yōu)選細(xì)胞毒性接合物包括選自于下組的變體A70D;Q45K/R;D26G;K46E;K46E/T89V;K46E/K82S;K46E/E16A7D26G;A70D/K46E/T89V;K46E/D26G;K46E/K82S/D26G;K46E/T89V/D26G;A70D/K46E;Q45K(R)/K46E/T89V;A70D/D26G;Q45K(R)/K46E;A70D/K46E/D26G;Q45K(R)/D26G;Q45K(R)/K46E/D26G抗體或其表位結(jié)合片段。這些抗體能夠特異性地識(shí)別C242抗原(CD44/CanAg)，并且以靶向方式將細(xì)胞毒試劑定向至異常的細(xì)胞或組織例如癌細(xì)胞。本發(fā)明的細(xì)胞毒性接合物的第二組成部分是細(xì)胞毒試劑。在此使用的術(shù)語(yǔ)"細(xì)胞毒試劑"指的是可以降低或者阻斷細(xì)胞的功能或生長(zhǎng)和/或引起細(xì)胞消亡的物質(zhì)。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，細(xì)胞毒試劑是紫杉醇、美登木素生物堿(maytansinoid)比如DM1或者DM4、CC-1065或CC-1065類(lèi)似物。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的細(xì)胞結(jié)合劑直接地、或者經(jīng)由可分裂的或不可分裂的連接物而被共價(jià)附接于細(xì)胞毒試劑。在另一個(gè)實(shí)施方式中，通過(guò)將藥物靶向于配體比如C242抗原(CD44/CanAg)，人源化抗體或其表位結(jié)合片段能夠被接合于藥物比如美登木素生物堿，從而形成具有針對(duì)抗原表達(dá)細(xì)胞的特異性細(xì)胞毒性的前體藥物。包含這些抗體和較小的、高毒性的藥物(例如，美登木素生物堿、紫杉垸(taxanes)、以及CC-1065類(lèi)似物)的細(xì)胞毒性接合物可以用作治療劑而被用于腫瘤比如乳腺癌和卵巢腫瘤的治療。因此，在一種實(shí)施方式中，按照本發(fā)明的教導(dǎo)生產(chǎn)的親代抗體的抗體變體可以作為無(wú)保護(hù)的抗體或者作為起細(xì)胞結(jié)合劑作用的抗體而被用于耙向療法。細(xì)胞毒試劑在本發(fā)明的細(xì)胞毒性接合物中使用的細(xì)胞毒試劑可以是任何可導(dǎo)致細(xì)胞死亡的、或誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的、或以某種方式降低細(xì)胞成活力的化合物。優(yōu)選的細(xì)胞毒試劑包括例如，如下限定的美登木素生物堿和美登木素生物堿類(lèi)似物、紫杉醇類(lèi)(toxoids)、CC-1065和CC-1065類(lèi)似物、海兔毒素(dolastatin)和海兔毒素類(lèi)似物。這些細(xì)胞毒試劑被接合于在此公開(kāi)的抗體、抗體片段、功能等價(jià)物、改進(jìn)的抗體和它們的類(lèi)似物。[74]通過(guò)體外方法可以制備細(xì)胞毒性接合物。為了將藥物或前體藥物連接于抗體，連接基團(tuán)被使用。合適的連接基團(tuán)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，并且包括二硫基、硫醚基團(tuán)、對(duì)酸不穩(wěn)定基團(tuán)、對(duì)光不穩(wěn)定的基團(tuán)、對(duì)肽酶不穩(wěn)定的基團(tuán)和對(duì)酯酶不穩(wěn)定的基團(tuán)。優(yōu)選的連接基團(tuán)是二硫基和硫醚基團(tuán)。例如，通過(guò)使用二硫化物交換反應(yīng)、或者通過(guò)在抗體和藥物或者前體藥物之間形成硫醚鍵，能夠構(gòu)建出接合物。美登木素生物堿在可以在本發(fā)明中使用從而形成細(xì)胞毒性接合物的細(xì)胞毒試劑中，有美登木素生物堿和美登木素生物堿類(lèi)似物。合適的美登木素生物堿的例子包括美登木醇和美登木醇類(lèi)似物。美登木素生物堿是可抑制微小管形成并且對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞是高毒性的藥物。[76]合適的美登木醇類(lèi)似物的例子包括具有修飾的芳香環(huán)的那些類(lèi)似物以及在其他位置處具有修飾物的那些類(lèi)似物。在美國(guó)專(zhuān)利No.4,424,219;4,256,746;4,294,757;4,307,016;4,313,946;4,315,929;4,331,598;4,361,650;4,362,663;4,364,866;4,450,254;4,322,348;4,371,533;6,333,410;5,475,092;5,585,499;以及5，846，545中公開(kāi)了一些合適的美登木素生物堿的例子。具有修飾的芳香環(huán)的合適的美登木醇類(lèi)似物的具體例子包括(1)C-19-脫氯(美國(guó)專(zhuān)利No.4,256,746)(通過(guò)安沙霉素(ansamytocin)P2的LAH還原反應(yīng)制備)；(2)C-20-羥基(或C-20-脫甲基)+/-019-脫氯(美國(guó)專(zhuān)利No.4,361,650和4,307,016)(通過(guò)使用鏈霉菌或放線菌經(jīng)過(guò)脫甲基化反應(yīng)制備或者通過(guò)使用LAH經(jīng)過(guò)脫氯反應(yīng)制備)；以及(3)C-20-去甲氧基、C-20-酰氧基(-OCOR)、+/-脫氯(美國(guó)專(zhuān)利No.4,294,757)(通過(guò)使用酰氯經(jīng)過(guò)?；饔弥苽?。具有其他位置的修飾物的合適的美登木醇類(lèi)似物的具體例子包括C-9-SH(美國(guó)專(zhuān)利No.4,424,219)(通過(guò)美登木醇與H2S或P2S5的反應(yīng)制備)；C-14-烷氧基甲基(去甲氧基/CH20R)(美國(guó)專(zhuān)利No.4,331,598);C-14-羥甲基或者酰氧基甲基(CH2OH或CH2OAc)(美國(guó)專(zhuān)利No.4,450,254)(由諾卡氏菌制備)；C-15-羥基/酰氧基(美國(guó)專(zhuān)利No.4,364,866)(通過(guò)鏈霉菌轉(zhuǎn)化美登木醇而制備)；C-15-甲氧基(美國(guó)專(zhuān)利No.4,313,946和4，315，929)(從滑桃樹(shù)分離出來(lái))；C-18-N-脫甲基(美國(guó)專(zhuān)利No.4,362,663和4,322,348)(通過(guò)鏈霉菌對(duì)美登木醇進(jìn)行脫甲基化而制備)；以及4，5-脫氧(美國(guó)專(zhuān)利Na4,371,533)(通過(guò)美登木醇經(jīng)三氯化鈦/LAH還原反應(yīng)而制備)。[79]在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的細(xì)胞毒性接合物利用含有硫醇的美登木素生物堿DM1作為細(xì)胞毒試劑，DM1的正式名稱(chēng)為N、脫乙?；?N2-(3-巰基-l-氧代丙基)-美登素。DM1由下述結(jié)構(gòu)式(I):L(I)表示。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的細(xì)胞毒性接合物利用含有硫醇的美登木素生物堿DM4作為細(xì)胞毒試劑，DM4的正式名稱(chēng)為N、脫乙酰基-N2-(4-甲基-4-巰基-1-氧代戊基)-美登素。DM4由下述結(jié)構(gòu)式(II)表示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage21</formula>在本發(fā)明的另一種實(shí)施方式中，可以使用其他的美登素，包括含有硫醇和二硫化物的在連接硫原子的碳原子上進(jìn)行單垸基取代或二烷基取代的美登木素生物堿。這些物質(zhì)包括在C-3、C-14羥甲基、C-15羥基、或C-20去甲基處具有連接有位阻硫氫基的?；鶊F(tuán)的酰化氨基酸側(cè)鏈的美登木素生物堿。其中，連接有硫醇官能團(tuán)的?；鶊F(tuán)的碳原子具有一個(gè)或兩個(gè)取代基，所述取代基是具有110個(gè)碳原子的線性垸基或者烯基、具有3~10個(gè)碳原子的支鏈狀或環(huán)狀烷基或烯基、苯基、經(jīng)取代的苯基、或雜環(huán)芳香族或雜環(huán)烷基基團(tuán)。進(jìn)一步地，取代基之一能夠是H，并且其中酰基基團(tuán)在羰基官能團(tuán)和硫原子之間具有至少三個(gè)碳原子的直鏈長(zhǎng)度。這些額外的美登素包括結(jié)構(gòu)式(III)表示的化合物g中Y'代表(CR7RsMCRfCRK))p(C^QqAo(CR5R6)mDu(CRnK:Ri2)r(feC)sBt(CR3R4)nCRiR2SZ其中-R!和R2各自獨(dú)立地是具有1~10個(gè)碳原子的線性的垸基或烯基、具有3~10個(gè)碳原子的支鏈狀或環(huán)狀的垸基或烯基、苯基、經(jīng)取代的苯基或者雜環(huán)芳香族或雜環(huán)烷基基團(tuán)，并且另外R2能夠是H;A、B、D是具有310個(gè)碳原子的環(huán)烷基或者環(huán)烯基、簡(jiǎn)單的或取代的芳基或雜環(huán)芳香族或雜環(huán)垸基基團(tuán)；R3、R4、R5、R6、R7、Rs、R9、R10、Rn、以及R!2各自獨(dú)立地是H、具有1~10個(gè)碳原子的線性的烷基或烯基、具有3~10個(gè)碳原子的支鏈狀或環(huán)狀的烷基或烯基、苯基、經(jīng)取代的苯基或者雜環(huán)芳香族或雜環(huán)垸基基團(tuán)；1、m、n、o、p、q、r、s、t和u各自獨(dú)立地是0或者1到5的整數(shù)，只要1、m、n、o、p、q、r、s、t和u中的至少兩個(gè)不同時(shí)為零；并且Z是H、SR或-COR，其中R是具有110個(gè)碳原子的線性的烷基或烯基、具有3~10個(gè)碳原子的支鏈狀或環(huán)狀的烷基或烯基、或者簡(jiǎn)單的或取代的芳基或雜環(huán)芳香族或者雜環(huán)烷基基團(tuán)。結(jié)構(gòu)式(III)的優(yōu)選實(shí)施方式包括結(jié)構(gòu)式(III)所示的化合物，其中Ri是甲基、R2是H并且Z是H。Rj和R2是甲基，并且Z是H。Ri是甲基、R2是H、并且Z是-SCH3。R4和R2是甲基、并且Z是-SCH3。[83]這些額外的美登素還包括結(jié)構(gòu)式(IV-L)、(IV-D)、或者(IV-D,L)代表的化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage23</formula>其中Y代表(CR7R8MCR5R6)m(CR3R4)nCRiR2SZ其中Ri和R2各自獨(dú)立地是具有1~10個(gè)碳原子的線性的烷基或烯基、具有3~10個(gè)碳原子的支鏈狀或環(huán)狀的烷基或烯基、苯基、經(jīng)取代的苯基、或者雜環(huán)芳香族或雜環(huán)烷基基團(tuán)，并且另外R2能夠是H;R3、R4、R5、R6、R7和Rs各自獨(dú)立地是H、具有1~10個(gè)碳原子的線性的垸基或烯基、具有3~10個(gè)碳原子的支鏈狀或環(huán)狀的烷基或烯基、苯基、經(jīng)取代的苯基、或者雜環(huán)芳香族或雜環(huán)烷基基團(tuán)；1、m和n各自獨(dú)立地是l到5的整數(shù)，并且另外n能夠是0;Z是H、SR或-COR，其中R是具有1~10個(gè)碳原子的線性的烷基或烯基、具有3~10個(gè)碳原子的支鏈狀或環(huán)狀的烷基或烯基、或者簡(jiǎn)單的或取代的芳基或雜環(huán)芳香族或雜環(huán)烷基基團(tuán)；并且May代表在C-3、C-14羥甲基、C-15羥基或者C-20去甲基處連接側(cè)鏈的美登木素生物堿。結(jié)構(gòu)式(IV-L)、(IV-D)和(IV-D，L)的優(yōu)選實(shí)施方式還包括結(jié)構(gòu)式(IV-L)、(IV-D)和(IV-D,L)代表的化合物，其中Ri是甲基，R2是H，R5、R6、R7、以及Rs各自是H，l和m各自是l，n是0，并且Z是H。Ri和R2是甲基，R5、R6、R7、Rs各自是H，l和m各自是l，n是0，并且Z是H。R!是H，R2是甲基，R5、R6、R7、以及R8各自是H，l和m各自是l，n是0,并且Z是-SCH3。R^和R2是甲基，R5、R6、R7、Rs各自是H，l和m是l，n是0，并且Z是-SCH3。[85]優(yōu)選細(xì)胞毒試劑由結(jié)構(gòu)式(IV-L)表示。[86]這些額外的美登素還包括分子式(V)表示的化合物其中，Y代表(CR7R8MCRsR6:UCR3R4)nCR!R2SZ其中R!和R2各自獨(dú)立地是具有1~10個(gè)碳原子的線性的烷基或烯基、具有3~10個(gè)碳原子的支鏈狀或環(huán)狀的烷基或烯基、苯基、經(jīng)取代的苯基或雜環(huán)芳香族或雜環(huán)垸基基團(tuán)，并且另外R2能夠是H;R3、R4、R5、R6、R7和Rs各自獨(dú)立地是H、具有1~10個(gè)碳原子的線性的烷基或烯基、具有3~10個(gè)碳原子的支鏈狀或環(huán)狀的烷基或烯基、苯基、經(jīng)取代的苯基、或者雜環(huán)芳香族或雜環(huán)烷基基團(tuán)；1、m和n各自獨(dú)立地是1到5的整數(shù)，并且另外n能夠是0;并且Z是H、SR或-COR，其中R是具有1~10個(gè)碳原子的線性的烷基或烯基、具有3~10個(gè)碳原子的支鏈狀或環(huán)狀的烷基或烯基、或者簡(jiǎn)單的或取代的芳基或雜環(huán)芳香族或雜環(huán)垸基基團(tuán)。結(jié)構(gòu)式(V)的優(yōu)選實(shí)施方式包括結(jié)構(gòu)式(V)所示的化合物，其中24R!是甲基；R2是H;R5、R6、R7、以及Rg各自是H;l和m各自是l;n是O;并且Z是H。Ri和R2是甲基；R5、R6、R7、Rs各自是H;l和m是l;n是O;并且Z是H。Ri是甲基，R2是H，R5、R6、R7、以及Rs各自是H，l和m各自是l，n是0，并且Z是-SCH3。R1和R2是甲基，R5、&、R7、Rs各自是H，l和m是l,n是O，并且Z是-SCH3。[88]這些額外的美登素進(jìn)一步包括結(jié)構(gòu)式(VI-L)、(VI-D)、或者(VI-D，L)代表的化合物(Vl-L)(VI-D)(Vl-D,L,)其中Y'代表(CR7R8MCR9《RK))p(C^QqAo(CR5R6VDu(CR4尸CR!2)r(feC諷(CR3R4、CR4R2SZ，其中Rj和R2各自獨(dú)立地是具有1~10個(gè)碳原子的線性的烷基或烯基、具有3~10個(gè)碳原子的支鏈狀或環(huán)狀的垸基或烯基、苯基、經(jīng)取代的苯基或雜環(huán)芳香族或雜環(huán)烷基基團(tuán)，并且另外R2能夠是H;A、B、D是具有3~10個(gè)碳原子的環(huán)垸基或者環(huán)烯基、簡(jiǎn)單的或取代的芳基或雜環(huán)芳香族或雜環(huán)垸基基團(tuán)；R3、R4、R5、Re、R7、R8、R9、R10、Ru、以及Ru各自獨(dú)立地是H、具有110個(gè)碳原子的線性的烷基或烯基、具有3~10個(gè)碳原子的支鏈狀或環(huán)狀的垸基或烯基、苯基、經(jīng)取代的苯基或者雜環(huán)芳香族或雜環(huán)烷基基團(tuán)；1、m、n、o、p、q、r、s、t和u各自獨(dú)立地是0或者1到5的整數(shù)，只要1、m、n、o、p、q、r、s、t和u中的至少兩個(gè)不同時(shí)為零；Z是H、SR或-COR,其中R是具有1~10個(gè)碳原子的線性的垸基或烯基、具有3~10個(gè)碳原子的支鏈狀或環(huán)狀的烷基或烯基、或者簡(jiǎn)單的或取代的芳基或雜環(huán)芳香族或雜環(huán)垸基基團(tuán)；并且May是美登木素生物堿。[89]結(jié)構(gòu)式(VI)的優(yōu)選實(shí)施方式包括結(jié)構(gòu)式(VI)所示的化合物，其中R!是甲基、R2是H并且Z是H。P^和R2是甲基，并且Z是H。Ri是甲基、R2是H、并且Z是-SCH3。Ri和R2是甲基，并且Z是-SCH3。[90]上述美登木素生物堿能夠被接合于變異的抗C242抗體A70D;Q45K/R;D26G;K46E;K46E/T89V;K46E/K82S;K46E/E16A/D26G;A70D/K46E/T89V;K46E/D26G;K46E/K82S/D26G;K46E/T89V/D26G;A70D/K46E;Q45K(R)/K46E/T89V;A70D/D26G;Q45K(R)/K46E;A70D/K46E/D26G;Q45K(R)/D26G;Q45K(R)/K46E/D26G或其同系物或片段；其中，通過(guò)使用硫醇或二硫化物官能團(tuán)，抗體被連接于美登木素生物堿，其中，硫醇或二硫化物官能團(tuán)存在于?；被醾?cè)鏈的?；鶊F(tuán)上，該?；鶊F(tuán)在美登木素生物堿的C-3、C-14羥甲基、C-15羥基或C-20去甲基處被發(fā)現(xiàn)；并且其中，?；被醾?cè)鏈的?；鶊F(tuán)具有位于其上有一個(gè)或兩個(gè)取代基的碳原子上的硫醇或者二硫化物官能團(tuán)，所述取代基是具有1~10個(gè)碳原子的線性的烷基或烯基、具有3~10個(gè)碳原子的支鏈狀或環(huán)狀的垸基或烯基、苯基、經(jīng)取代的苯基或雜環(huán)芳香族或雜環(huán)烷基基團(tuán)，并且另外的取代基之一能夠是H，并且其中，?；鶊F(tuán)在羰基官能團(tuán)和硫原子之間具有至少三個(gè)碳原子的直鏈長(zhǎng)度。本發(fā)明的接合物的一種優(yōu)選實(shí)施方式是，其包括下述結(jié)合于結(jié)構(gòu)式(VIII)所示美登木素生物堿的變體A70D;Q45K/R;D26G;K46E;K46E/T89V;K46E/K82S;K46E/E16A/D26G;A70D/K46E/T89V;K46E/D26G;K46E/K82S/D26G;K46E/T89V/D26G;A70D/K46E;Q45K(R)/K46E/T89V;A70D/D26G;Q45K(R)/K46E;A70D/K46E/D26G;Q45K(R)/D26G;Q45K(R)/K46E/D26G或其同系物或片段。(V川)其中-Y,'代表其中Ri和R2各自獨(dú)立地是CH3、C2Hs、具有1~10個(gè)碳原子的線性的垸基或烯基、具有3~10個(gè)碳原子的支鏈狀或環(huán)狀的烷基或烯基、苯基、經(jīng)取代的苯基或雜環(huán)芳香族或雜環(huán)烷基基團(tuán)；并且另外R2能夠是H;A、B、以及D各自獨(dú)立地是具有310個(gè)碳原子的環(huán)垸基或環(huán)烯基、簡(jiǎn)單的或取代的芳基、或者雜環(huán)芳香族或雜環(huán)烷基基團(tuán)；R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、Rio、Ru、以及Ri2各自獨(dú)立地是H、具有110個(gè)碳原子的線性的垸基或烯基、具有3~10個(gè)碳原子的支鏈狀或環(huán)狀的烷基或烯基、苯基、經(jīng)取代的苯基或雜環(huán)芳香族或雜環(huán)烷基基團(tuán)；并且1、m、n、o、p、q、r、s、t和u各自獨(dú)立地是0或者1到5的整數(shù)，只要1、m、n、o、p、q、r、s、t和u中的至少兩個(gè)不同時(shí)為零。[92]優(yōu)選R!是甲基、R2是H，或者R!和R2都是甲基。本發(fā)明的接合物更優(yōu)選的實(shí)施方式是，其包括下述結(jié)合于結(jié)構(gòu)式(IX-L)、(IX-D)、或者(IX-D，L)所示美登木素生物堿的變異的抗C242抗體A70D;Q45K7R;D26G;K46E;K46E/T89V;K46E/K82S;K46E/E16A/D26G;A70D/K46E/T89V;K46E/D26G;K46E/K82S/D26G;K46E/T89V/D26G;A70D/K46E;Q45K(R)/K46E/T89V;A70D/D26G;Q45K(R)/K46E;A70D/K46E/D26G;Q45K(R)/D26G;Q45K(R)/K46E/D26G或其同系物或片段。IX-LX-DIX-D丄其中，Y！代表(CR7R8),(CR5R6)m(CR3R4)nCR!R2S-，其中Ri和R2各自獨(dú)立地是具有1~10個(gè)碳原子的線性的烷基或烯基、具有3~10個(gè)碳原子的支鏈狀或環(huán)狀的烷基或烯基、苯基、經(jīng)取代的苯基、雜環(huán)芳香族或雜環(huán)烷基基團(tuán)，并且另外R2能夠是H;R3、R4、R5、R6、R7和Rs各自獨(dú)立地是H、具有110個(gè)碳原子的線性的烷基或烯基、具有3~10個(gè)碳原子的支鏈狀或環(huán)狀的烷基或烯基、苯基、經(jīng)取代的苯基或者雜環(huán)芳香族或雜環(huán)垸基基團(tuán)；1、m和n各自獨(dú)立地是l到5的整數(shù)，并且另外n能夠是O;并且May代表在C-3、C-14羥甲基、C-15羥基或者C-20去甲基處連接側(cè)鏈的美登木醇。[94]結(jié)構(gòu)式(IX-L)、(IX-D)和(IX-D,L)的優(yōu)選實(shí)施方式包括結(jié)構(gòu)式(IX-L)、(IX-D)和(IX-D,L)代表的化合物，其中Ri是甲基、Rz是H，或者Ri和R2都是甲基，R!是甲基；Rz是H;R5、R6、R7和Rg各自是H;l和m各自是l;n是O，Ri和R2是甲基；R5、Re、R7和Rg各自是H;l和m是l;n是O。[95]優(yōu)選細(xì)胞毒試劑由結(jié)構(gòu)式(IX-L)表示。本發(fā)明的接合物進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方式是，其包括下述結(jié)合于結(jié)構(gòu)式(X)所示美登木素生物堿的變異的抗C242抗體A70D;Q45K/R;D26G;K46E;K46E/T89V;K46E/K82S;K46E/E16A/D26G;A70D/K46E/T89V;K46E/D26G;K46E/K82S/D26G;K46E/T89V/D26G;A70D/K46E;Q45K(R)/K46E/T89V;A70D/D26G;Q45K(R)/K46E;A70D/K46E/D26G;Q45K(R)/D26G;Q45K(R)/K46E/D26G或其同系物或片段。28<formula>formulaseeoriginaldocumentpage29</formula>(X)其中，取代基是為用于上述結(jié)構(gòu)式(IX)而限定的取代基。[97]本發(fā)明的接合物進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方式是，其包括下述結(jié)合于結(jié)構(gòu)式(XI)所示美登木素生物堿的變異的抗C242抗體A70D;Q45K/R;D26G;K46E;K46E/T89V;K46E/K82S;K46E/E16A/D26G;A70D/K46E/T89V;K46E/D26G;K46E/K82S/D26G;K46E/T89V/D26G;A70D/K46E;Q45K(R)/K46E/T89V;A70D/D26G;Q45K(R)/K46E;A70D/K46E/D26G;Q45K(R)/D26G;Q45K(R)/K46E/D26G或其同系物或片段。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage29</formula>其中，取代基是為用于上述結(jié)構(gòu)式(vni)而限定的取代基。尤其優(yōu)選是上述化合物的任何一種，其中R!是H，R2是甲基，R5、R6、R和Rs各自是H，l和m各自是l，并且n被是O。進(jìn)一步優(yōu)選是上述化合物的任何一種，其中R,和R2是甲基，R5、Re、R7、Rs各自是H，l和m各自是l,并且n是0。進(jìn)一步地，L-氨?；Ⅲw異構(gòu)體是優(yōu)選的。具有110個(gè)碳原子的線性烷基或烯基的例子包括，但不限于，甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、丙烯基、丁烯基和己烯基。具有3~10個(gè)碳原子的支鏈烷基或烯基的例子包括，但不限于，異丙基、異丁基、仲丁基、叔丁基、異戊基、1-乙基-丙基、異丁烯基和異戊烯。具有3~10個(gè)碳原子的環(huán)狀垸基或烯基的例子包括，但不限于，環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基、環(huán)戊烯、以及環(huán)己烯基。簡(jiǎn)單的芳基包括具有6~10個(gè)碳原子的芳基。取代芳基包括具有6~10個(gè)碳原子的芳基，該芳基連接有至少一個(gè)含有14個(gè)碳原子的烷基取代基，或者烷氧基取代基比如甲氧基、乙氧基，或者鹵素取代基或硝基取代基。含有6~10個(gè)碳原子的簡(jiǎn)單芳基的例子包括苯基和萘基。取代芳基的例子包括硝基苯基、二硝基苯基。雜環(huán)芳基包括具有含有一個(gè)或兩個(gè)選自N、O或S的雜原子的3至10元環(huán)的基團(tuán)。[108]雜環(huán)烷基基團(tuán)包括環(huán)狀化合物，其包含含有一個(gè)或兩個(gè)選自N、O或S的雜原子的3至IO元環(huán)體系。雜環(huán)芳基的例子包括吡啶基、硝基-吡啶基、吡咯基、惡唑基、噻吩基、噻唑基、以及呋喃基。雜烷基基團(tuán)的例子包括二氫呋喃基、四氫呋喃基、四氫吡咯基、哌啶基、哌嗪基、以及嗎啉基。也可以在本發(fā)明的細(xì)胞毒性接合物中使用美國(guó)專(zhuān)利No.7,276,497公開(kāi)的每一種美登木素生物堿。將美國(guó)專(zhuān)利No.7，276，497全部的公開(kāi)內(nèi)容引入本發(fā)明作為參考。含有二硫化物的連接基團(tuán)[112]為了將美登木素生物堿連接至抗體，比如變異的抗C242抗體A70D;Q45K/R;D26G;K46E;K46E/T89V;K46E/K82S;K46E/E16A/D26G;A70D/K46E/T89V;K46E/D26G;K46E/K82S/D26G;K46E/T89V/D26G;A70D/K46E;Q45K(R)/K46E/T89V:A70D/D26G;Q45K(R)/K46E;A70D/K46E/D26G;Q45K(R)/D26G;Q45K(R)/K46E/D26G，美登木素生物堿包含連接部分。該連接部分含有允許在特定位點(diǎn)處釋放全活性的美登木素生物堿的化學(xué)鍵。合適的化學(xué)鍵為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，并且包括二硫鍵、對(duì)酸不穩(wěn)定的鍵、對(duì)光不穩(wěn)的鍵、對(duì)肽酶不穩(wěn)定的鍵和對(duì)酯酶不穩(wěn)定的鍵。優(yōu)選是二硫鍵。該連接部分還包含反應(yīng)性的化學(xué)基團(tuán)。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，反應(yīng)性的化學(xué)基團(tuán)能夠經(jīng)由二硫鍵連接部分而被共價(jià)結(jié)合于美登木素生物堿。尤其優(yōu)選的反應(yīng)性化學(xué)基團(tuán)是N-琥珀酰亞胺酯和N-硫代琥珀酰亞胺酯。尤其優(yōu)選的包含含有反應(yīng)性化學(xué)基團(tuán)的連接部分的美登木素生物堿是美登木醇的C-3酯及其類(lèi)似物。其中連接部分含有二硫鍵，并且化學(xué)反應(yīng)基團(tuán)包含N-琥珀酰亞胺酯或30者N-硫代琥珀酰亞胺酯。在美登木素生物堿上的許多位置能夠用作化學(xué)連接連接部分的位置。例如，具有羥基的C-3位置、用羥甲基修飾的C-14位置、用羥基修飾的C-15位置和具有羥基的C-20位置全部被預(yù)期是有用的。然而優(yōu)選是C-3位置，并且尤其優(yōu)選美登木醇的C-3位置。[117]雖然具有連接部分的美登木醇酯的合成在關(guān)于含有二硫鍵的連接部分中進(jìn)行了描述，但本領(lǐng)域的技術(shù)人員將會(huì)理解，具有其他化學(xué)鍵(如上所述)的連接部分也可以被用于本發(fā)明，如同能夠使用其他的美登木素生物堿那樣。其他化學(xué)鍵的具體例子包括對(duì)酸不穩(wěn)定的鍵、對(duì)光不穩(wěn)定的鍵、對(duì)肽酶不穩(wěn)定的鍵和對(duì)酯酶不穩(wěn)定的鍵。在此并入本文的美國(guó)專(zhuān)利No.5,208,020的公開(kāi)教導(dǎo)了連接有這些鍵的美登木素生物堿的生產(chǎn)。[118]具有連接有反應(yīng)基團(tuán)的二硫化物部分的美登木素生物堿及美登木素生物堿衍生物的合成在引入本文以供參考的美國(guó)專(zhuān)利No.6,441,163和6,333,410、以及美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)No.2003-0055226A1中被描述。使含有反應(yīng)基團(tuán)的美登木素生物堿例如DM1與下述變異的抗C242抗體起反應(yīng)，從而產(chǎn)生細(xì)胞毒性接合物A70D;Q45K/R;D26G;K46E;K46E/T89V;K46E/K82S;K46E/E16A/D26G;A70D/K46E/T89V;K46E/D26G;K46E/K82S/D26G;K46E/T89V/D26G;A70D/K46E;Q45K(R)/K46E/T89V:A70D/D26G;Q45K(R)/K46E;A70D/K46E/D26G;Q45K(R)/D26G;Q45K(R)/K46E/D26G。這些接合物可以通過(guò)高效液體色譜(HPLC)或者通過(guò)凝膠過(guò)濾進(jìn)行純化。在其全部?jī)?nèi)容并入本文的美國(guó)專(zhuān)利No.6,333,410、6,411,163和6,716,821以及美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)No.2003-0055226Al中提供了數(shù)種出色的用于生產(chǎn)這種抗體-美登木素生物堿接合物的方案。通常，可以將緩沖水溶液中的抗體溶液與過(guò)量摩爾的具有連接反應(yīng)基團(tuán)的二硫化物部分的美登木素生物堿一起孵育。通過(guò)添加過(guò)量的胺類(lèi)(比如乙醇胺、?；撬岬?，反應(yīng)混合物能夠被抑制。然后美登木素生物堿-抗體接合物能夠通過(guò)凝膠過(guò)濾進(jìn)行純化。[122]每抗體分子結(jié)合的美登木素生物堿分子的數(shù)量能夠通過(guò)分光光度法測(cè)量在252nm和280nm處吸光度的比率而確定。優(yōu)選1-10個(gè)美登木素生物堿分子/抗體分子的平均值。[123]能夠評(píng)估抗體與美登木素生物堿藥物的接合物在體外抑制各種不希望有的細(xì)胞系增殖的能力。例如，細(xì)胞系比如人類(lèi)表皮樣癌細(xì)胞系A(chǔ)-431、人類(lèi)小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系SW2、人類(lèi)乳腺腫瘤細(xì)胞系SKBR3以及伯基特氏淋巴瘤細(xì)胞系Namalwa能夠容易地用于這些該化合物的細(xì)胞毒性的評(píng)定。待被評(píng)估的細(xì)胞能夠暴露于化合物24小時(shí)，并且通過(guò)已知的方法直接測(cè)定受測(cè)細(xì)胞的殘存部分。然后能夠由測(cè)定的結(jié)果計(jì)算出ICso值。含有PEG的連接基團(tuán)通過(guò)使用PEG連接基團(tuán)，也可以將美登木素生物堿連接于抗體，如同在美國(guó)專(zhuān)利No.6,716,821中的闡述。這些PEG連接基團(tuán)在水中和非水溶劑中都是可溶的，并且能夠被用于將一個(gè)以上細(xì)胞毒試劑連接于細(xì)胞結(jié)合劑。例舉的PEG連接基團(tuán)包括異型雙功能的PEG連接物，其在連接物的兩端位置可通過(guò)在一個(gè)端部的功能性巰基或二硫基、以及在另一端部的活性酯而結(jié)合細(xì)胞毒試劑和細(xì)胞結(jié)合劑。作為通過(guò)使用PEG連接基團(tuán)合成細(xì)胞毒性接合物的普通例子，請(qǐng)?jiān)俅螀⒖济绹?guó)專(zhuān)利No.6,716,821的詳述。該合成開(kāi)始于一個(gè)以上連接有反應(yīng)性PEG部分的細(xì)胞毒試劑與抗體的反應(yīng)，導(dǎo)致各個(gè)反應(yīng)性PEG部分的末端活性酯被抗體的氨基酸殘基置換，從而產(chǎn)生細(xì)胞毒性接合物，該細(xì)胞毒性接合物包含一個(gè)以上通過(guò)PEG連接基團(tuán)共價(jià)結(jié)合于抗體的細(xì)胞毒試劑。其他的連接基團(tuán)包含不可分裂的連接物的美登木素生物堿接合物在美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)No.2005-0169933A1中被描述，將其全部的公開(kāi)內(nèi)容引入本發(fā)明作為參考。紫杉烷在根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞毒性接合物中使用的毒性劑也可以是紫杉垸或其衍生物。[128]紫杉烷是一個(gè)化合物家族，其包括作為細(xì)胞毒的天然產(chǎn)物的紫杉醇(Taxol)、以及作為半合成衍生物的紫杉萜(Taxotere)，這兩個(gè)化合物在癌癥治療中被廣泛使用。紫杉垸是有絲分裂紡錘體毒物，其可抑制微管蛋白的解聚，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。雖然紫杉萜和紫杉醇在癌癥治療中是有用的試劑，但由于它們針對(duì)正常細(xì)胞的非專(zhuān)一性毒性，它們的抗癌活性受到限制。另外，化合物比如紫杉醇和紫杉萜本身沒(méi)有充足的潛力用于細(xì)胞結(jié)合劑的接合物。優(yōu)選用于細(xì)胞毒性接合物的制備的紫杉烷是結(jié)構(gòu)式(XI)所示的紫杉烷[130]用于合成可以在本發(fā)明的細(xì)胞毒性接合物中使用的示例性紫杉烷的方法，以及用于將紫杉烷接合至細(xì)胞結(jié)合劑比如抗體的方法，在美國(guó)專(zhuān)利No.5,416,064、5,475,092、6,340,701、6,372,738、6,436,931、6,596,757、6,706,708和6,716,821以及美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)No.2004-0024049A1中被詳細(xì)描述。CC-1065類(lèi)似物在根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞毒性接合物中使用的毒性劑也可以是CC-1065或其衍生物。[132]CC-1065是從鏈絲菌(Streptomyceszelensis)培養(yǎng)肉湯中分離的有潛力的抗腫瘤抗生素。CC-1065的體外效力比通常使用抗癌癥藥物比如阿霉素、氨甲蝶呤和長(zhǎng)春新堿的效力高約1000倍(B.K.Bhuyanetal.,CancerRes.，42,3532-3537(1982))。用于本發(fā)明的合適的CC-1065及其類(lèi)似物的非限制性的例子在美國(guó)專(zhuān)利No.6,372,738、6,340,701、5,846,545和5,585,499中被公開(kāi)。CC-1065的細(xì)胞毒效力與其烷基化活性及其DNA結(jié)合活性或者DNA插入活性有關(guān)。這兩種活性在于分子中的分離部分。因此，垸基化活性被包含在環(huán)丙基吡咯并吲哚(cyclopropapyrroloindole，CPI)亞基中，而DNA結(jié)合活性在于兩個(gè)吡咯并吲哚亞基。[134]雖然CC-1065作為細(xì)胞毒試劑具有特定的有吸引力的特征，但其在治療用途中有限制。將CC-1065給藥小鼠會(huì)引起遲滯的肝臟毒性，導(dǎo)致在12.5Ug/kg的單個(gè)靜脈注射劑量后第50天死亡(V.L.Reynoldsetal.JAntibiotics,XXIX,319-334(1986)}。這激發(fā)人們努力開(kāi)發(fā)不會(huì)引起緩發(fā)毒性的類(lèi)似物，并且模擬CC-1065的更簡(jiǎn)單的類(lèi)似物的合成已經(jīng)被描述(M.A.Waipehoskietal,J.Med.Chem,，31,590-603(1988)}。在本發(fā)明中有用的另一系列的類(lèi)似物中，CPI部分被環(huán)丙基苯并吲哚(cyclopropabenzindole，CBI)部分替代p.L.Bogeretal"J.Org.Chem"55，5823-5833，(1990)，D.L.Bogeretal.,BioOrg.Med.Chem.Lett.,1，115-120(1991))。這些化合物維持較高的親本藥物的體外效力，沒(méi)有引起小鼠體內(nèi)緩發(fā)毒性。類(lèi)似于CC-1065，這些化合物是以共價(jià)方式結(jié)合于DNA小溝從而引起細(xì)胞死亡的烷基化試劑。然而，最有前途的類(lèi)似物阿多來(lái)新(Adozelesin)和卡折來(lái)新(Carzelesin)的臨床評(píng)估導(dǎo)致了令人失望的結(jié)果(B.F.Fosteretal.,InvestigationalNewDrugs,13,321-326(1996);I.Wolffetal.,Clin.CancerRes.,2，1717-1723(1996)}。由于它們較高的系統(tǒng)毒性，這些藥物顯示出很差的治療效果。[136]通過(guò)經(jīng)由靶向釋藥至腫瘤位點(diǎn)來(lái)改變體內(nèi)分配，導(dǎo)致對(duì)非靶向組織的較低泰性、從而導(dǎo)致較低的系統(tǒng)毒性，CC-1065類(lèi)似物的治療效能能夠被大大地提高。為了實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)，特異性地靶向腫瘤細(xì)胞的類(lèi)似物和CC-1065衍生物與細(xì)胞結(jié)合試劑的接合物已經(jīng)被描述(美國(guó)專(zhuān)利No.5,475,092;5,585,499;5,846,545}。這些接合物典型地顯示出較高的體外靶向特異性的細(xì)胞毒性，以及在小鼠體內(nèi)的人腫瘤異種移植模型中異常的抗腫瘤活性(R.V.JChadetal.,CancerRes.，55,4079-4084(1995)}。用于合成可以在本發(fā)明的細(xì)胞毒性接合物中使用的CC-1065類(lèi)似物的方法，以及用于將這些類(lèi)似物接合至細(xì)胞結(jié)合劑比如抗體的方法，在美國(guó)專(zhuān)利No.5,475,092、5,846,545、5,585,499、6,534,660、6，586，618和6,756,397以及美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)No.2003-0195365A1中被詳細(xì)描述。其他藥物藥物比如氨甲蝶呤、道諾紅菌素、阿霉素、長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春花堿、米爾法蘭、自力霉素、苯丁酸氮芥、加里剎霉素(calicheamicin)、微管利辛(tubulysin)和微管利辛類(lèi)似物、多卡霉素(duocarmycin)和多卡霉素類(lèi)似物、海兔毒素和海兔毒素類(lèi)似物、比如奧里絲定(auristatins)和類(lèi)似物也適合于本發(fā)明的接合物的制備。這些藥物分子還可以通過(guò)中間載體分子比如血清白蛋白被連接于抗體分子。例如，在美國(guó)申請(qǐng)序列No.09/740991中描述的道薩比辛(Doxarubicin)和達(dá)諾比辛(Danorubicin)化合物也可以是有用的細(xì)胞毒試劑。這些藥物還可以用于如下所述的共同療法(co-therapy)。共同療法術(shù)語(yǔ)"組合療法"(或"共同療法")意思是指變異抗體比如huC242抗體的變體、化學(xué)治療劑、或免疫毒素的應(yīng)用，并且包括各個(gè)試劑以將提供有利的藥物組合效果的依序攝入的方式給藥。共同療法同樣包括這些試劑以基本同時(shí)的方式的共同給藥，比如攝取比率固定的這些活性試劑的單個(gè)劑量劑、或者對(duì)于各個(gè)試劑攝取多個(gè)分離的藥物。"組合療法"還包括同時(shí)的或者依序的通過(guò)靜脈注射、肌內(nèi)注射或其他腸胃外途徑進(jìn)入身體的給藥，包括通過(guò)粘膜組織的定向吸收，比如在鼻竇通道中發(fā)現(xiàn)的給藥。依序的給藥還包括藥物組合，其中單個(gè)元素可以在不同的時(shí)間、和/或通過(guò)不同的途徑給藥，但是其在組合中起作用從而提供有利的效果。術(shù)語(yǔ)"治療性有效的"是指使用于組合療法的各個(gè)試劑的量合格，將會(huì)實(shí)現(xiàn)減小或抑制腫瘤例如抑制腫瘤擴(kuò)散的改進(jìn)目標(biāo)，同時(shí)避免典型地與各個(gè)試劑有關(guān)的不良副作用。[141]優(yōu)選的組合療法將基本上包含兩個(gè)以上活性試劑，g卩，變異的1mC242無(wú)保護(hù)的抗體或其接合物，以及其他不同于變異抗體的選自免疫毒素、化學(xué)治療劑、免疫調(diào)節(jié)劑或抗體的試劑。這些試劑將在組合中以如下重量比使用無(wú)保護(hù)的抗體或其接合物:其他試劑中的任何一個(gè)為約0.5:120:1。最終取決于抗體或接合物以及其他試劑中的任何一個(gè)的選擇，這兩種試劑優(yōu)選的范圍將是約1':1至約15:1;更優(yōu)選的范圍將是約1:1至約5:1。取決于病人需要，抗體或其接合物對(duì)其他試劑的比率還可以是相反的。例如，在最初治療后，如果發(fā)現(xiàn)病人對(duì)其他試劑之一的較高劑量與變異的無(wú)保護(hù)抗體或其接合物相比更敏感，這種給藥方法的提供者能夠轉(zhuǎn)換比率，以使得治療更有效。免疫毒素的制備是本
技術(shù)領(lǐng)域：
眾所周知的(參見(jiàn)，例如，引入本發(fā)明作為參考的美國(guó)專(zhuān)利No.4,340,535)。進(jìn)一步將每一個(gè)下述專(zhuān)利和專(zhuān)利申請(qǐng)引入本發(fā)明作為參考，用于更進(jìn)一步補(bǔ)充關(guān)于免疫毒素產(chǎn)生、純化和使用的現(xiàn)有教導(dǎo)的目的美國(guó)專(zhuān)利No.5,855,866;5,776,427;5,863,538;6,004,554;5,965,132;6,051,230以及5,660,827和美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)系列No.07/846,349。[142]還可以將變異的抗體比如huC242變體直接或間接地結(jié)合于免疫調(diào)節(jié)劑。在能夠以某些方式通過(guò)本發(fā)明的抗體增加腫瘤消亡的生物反應(yīng)調(diào)節(jié)物(比如免疫調(diào)節(jié)劑)中，包括淋巴激活素，例如腫瘤壞死因子、巨噬細(xì)胞活化因子、集落刺激因子、干擾素等。[143]當(dāng)共同療法涉及可注射的復(fù)合物時(shí)，其可以進(jìn)一步包含選自下組的治療劑激素、免疫抑制劑、抗生素、細(xì)胞抑制劑、利尿劑、腸胃病藥、心血管的試劑、消炎劑、止痛藥、局部麻醉劑、以及神經(jīng)藥理學(xué)試劑，其中，給藥這些試劑以降低任何副作用的風(fēng)險(xiǎn)。治療劑組合物本發(fā)明還涉及一種用于治療哺乳動(dòng)物高增生性紊亂(hyperproliferativedisorder)的治療劑組合物，其包含治療有效量的本發(fā)明的變異抗體和藥學(xué)可接受的載體。在一種實(shí)施方式中，藥物組合物被用于治療肺、乳房、結(jié)腸、前列腺、腎、胰腺、卵巢、宮頸以及淋巴器的癌癥、骨肉瘤、滑液癌、肉瘤或其中CanAg被表達(dá)的癌、以及其他還有待于確定其中CanAg被主要表達(dá)的癌癥。在另一個(gè)實(shí)施方式中，藥物組合物涉及治療其他的紊亂，例如自身免疫疾病，比如系統(tǒng)的狼瘡、變形性關(guān)節(jié)炎、以及多發(fā)性硬化；移植排斥，比如腎移植排斥、肝臟移植排斥、肺移植排斥、心臟移植排斥、以及骨髓移植排斥；對(duì)抗宿主移植疾??；病毒感染，比如mV感染、HIV感染、AIDS等；以及寄生蟲(chóng)感染，比如賈第鞭毛蟲(chóng)病、阿米巴病、血吸蟲(chóng)病、以及其它被本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員確定的感染。[145]本發(fā)明提供藥物組合物，其包含有效量的本發(fā)明的變異抗體或其表位結(jié)合片段、或者細(xì)胞毒試劑與變異抗體或其表位結(jié)合片段的接合物，以及藥學(xué)可接受的載體，其可以是惰性的或生理學(xué)活性的載體。[146]在此使用的術(shù)語(yǔ)"藥學(xué)可接受的載體"包括任選的溶劑、分散介質(zhì)、涂層、抗細(xì)菌劑和抗真菌劑、及其生理學(xué)相容的類(lèi)似物。合適的載體、稀釋劑和/或賦形劑的例子包括水、鹽水、磷酸鹽緩沖鹽水、葡萄糖、甘油、乙醇、及其類(lèi)似物、以及其組合中的一種或多種。許多情況下，優(yōu)選在組合物中包括等滲試劑，比如糖類(lèi)、多元醇或氯化鈉。特別地，有關(guān)的合適的載體的例子包括:(l)Dulbecco磷酸鹽緩沖鹽水，pH7.4，含有或者不含約1mg/ml至25mg/ml的人血清白蛋白；(2)0.9%鹽水(0.9。/。w/v氯化鈉(NaCl));以及(3)5M(w/v)葡萄糖；還可以含有抗氧化劑比如色胺、以及穩(wěn)定劑例如吐溫(Tween)20。[147]在此組合物也可以進(jìn)一步含有為治療中的特定紊亂所必需的治療劑。優(yōu)選本發(fā)明的變異抗體或其表位結(jié)合片段或者細(xì)胞毒試劑與變異抗體或其表位結(jié)合片段的接合物、以及補(bǔ)充的活性化合物將具有不會(huì)不利地影響彼此的互補(bǔ)的活性。在一種優(yōu)選實(shí)施方式中，進(jìn)一步的治療劑是成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)拮抗劑、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)、組織因子(TF)、蛋白質(zhì)C、蛋白質(zhì)S、血小板源性生長(zhǎng)因子(PDGF)、或HER2受體。[148]本發(fā)明的組合物可以呈多種形式。這些形式包括，例如，液體、半固體、以及固體劑型，但優(yōu)選的形式取決于想要的給藥和治療性應(yīng)用模式。典型的優(yōu)選的組合物是呈可注射的或能注入的溶液形式。優(yōu)選的給藥模式是腸胃外給藥(例如靜脈注射、肌內(nèi)注射、腹膜內(nèi)注射、皮下注射)。在一種優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明的組合物是作為丸劑(bohis)的靜脈內(nèi)給藥，或者通過(guò)在一段時(shí)期內(nèi)的連續(xù)輸注給藥。在另一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，它們通過(guò)肌內(nèi)注射、皮下注射、關(guān)節(jié)內(nèi)注射、滑膜內(nèi)注射、腫瘤內(nèi)注射、腫瘤周?chē)⑸洹⒉≡顑?nèi)注射、或病灶周?chē)⑸涞耐緩阶⑷耄园l(fā)揮局部的以及系統(tǒng)的治療效果。[149]通過(guò)在適當(dāng)?shù)娜軇┲幸砸蟮暮亢喜⒈景l(fā)明的變異抗體或其表位結(jié)合片段、或者細(xì)胞毒試劑與變異抗體或其表位結(jié)合片段的接合物，接著通過(guò)微過(guò)濾滅菌，能夠制備出用于腸胃外給藥的無(wú)菌組合物。作為溶劑或媒介物，可以使用水、鹽水、磷酸鹽緩沖鹽水、葡萄糖、甘油、乙醇、及其類(lèi)似物、以及其組合。許多情況下，優(yōu)選在組合物中包括等滲試劑，比如糖類(lèi)、多元醇或氯化鈉。這些組合物也可以含有輔助劑，尤其是潤(rùn)濕劑、等滲劑、乳化劑、分散劑和穩(wěn)定劑。用于腸胃外給藥的無(wú)菌組合物也可以以無(wú)菌的固體組合物形式被制備，其可以在無(wú)菌水或任何其他的可注射的無(wú)菌培養(yǎng)基中使用時(shí)被溶解。[150]本發(fā)明的變異抗體或其表位結(jié)合片段、或者細(xì)胞毒試劑與變異抗體或其表位結(jié)合片段的接合物也可以被口服給藥。作為用于口服的固體組合物，可以使用藥片、藥丸、粉末(膠囊、香粉)或者顆粒。在這些組合物中，在氬氣保護(hù)下將根據(jù)本發(fā)明的活性成分與一種以上惰性稀釋劑比如淀粉、纖維素、蔗糖、乳糖或二氧化硅相混合。這些組合物也可以包含除稀釋劑之外的物質(zhì)，例如一種以上潤(rùn)滑劑比如硬脂酸鎂或滑石粉、顏料、涂層(糖衣片劑)或光滑面。而用于口服的液體組合物，可以使用藥學(xué)可接受的溶液、懸浮液、乳劑、糖漿和含有惰性稀釋劑比如水、乙醇、甘油、植物油或石蠟油的酏劑。這些組合物可以包含除稀釋劑之外的物質(zhì)，例如潤(rùn)濕劑、甜味劑、增稠劑、調(diào)味劑或穩(wěn)定化產(chǎn)品。劑量取決于預(yù)期效果、治療的持續(xù)時(shí)間和釆用的給藥途徑；對(duì)于成年人口服，它們通常是5mg1000mg每天，活性物質(zhì)單位劑量范圍為lmg250mg。一般來(lái)講，取決于具體的被治療主體的年齡、體重和任何其他因素，醫(yī)生將確定適當(dāng)?shù)膭┝?。[153]本發(fā)明的改進(jìn)的或者變異的抗體或其接合物能夠作為激動(dòng)劑或拮抗劑而被用于治療劑型，通過(guò)把具有期望純度的變體或其接合物與任選的生理學(xué)可接受的載體、賦形劑或穩(wěn)定劑混和起來(lái)，這些劑型呈水溶液或者凍干劑型形式被制備以用于存放[Remington藥物科學(xué)，第16版，Osol,A.Ed.(1980);美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)No.10/846,129]?？山邮艿妮d體、賦形劑、或穩(wěn)定劑在使用的劑量和濃度下對(duì)受體是無(wú)毒的，并且包括緩沖液，比如磷酸鹽、檸檬酸鹽、以及其他有機(jī)酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸和蛋氨酸；防腐劑(比如十八基二甲基苯基氯化銨；氯化六烴季銨；氯化苯甲烴銨、氯化芐乙氧銨；苯酚、丁基或苯甲醇；烷基對(duì)羥苯甲酸比如甲基或?qū)αu苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環(huán)己醇；3-戊醇；以及間甲酚)；低分子量(小于約10個(gè)殘基)的多肽；蛋白質(zhì)，比如血清白蛋白、明膠、或免疫球蛋白；親水聚合物，比如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，比如甘氨酸、谷氨酰胺、天門(mén)冬酰胺、組氨酸、精氨酸、或賴(lài)氨酸；單糖；二糖；以及其他的碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合劑，比如EDTA;糖類(lèi)，比如蔗糖、甘露醇、海藻糖或者山梨糖醇；形成鹽的平衡離子，比如鈉；金屬絡(luò)合物(例如，鋅-朊絡(luò)合物)；和/或非離子型表面活性劑，例如吐溫t^(Tween)、普盧蘭尼克頂(PluronicTM)、或聚乙二醇(PEG)。[154]也可以在脂質(zhì)體中配制變體。通過(guò)本
技術(shù)領(lǐng)域：
已知的方法制備含有所研究分子的脂質(zhì)體，這些方法比如在文獻(xiàn)Epsteinetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:3688(1985);Hwangetal,Proc.NatlAcad.Sci.USA77:4030(1980)以及美國(guó)專(zhuān)利No.4,485,045和4,544,545中有描述。具有增強(qiáng)的循環(huán)時(shí)間的脂質(zhì)體在美國(guó)專(zhuān)利No.5,013,556中被公開(kāi)。[155]特別有用的免疫脂質(zhì)體(immunoliposomes)能夠通過(guò)反相蒸發(fā)方法(reversephaseevaporatkmmethod)用脂類(lèi)組合物產(chǎn)生，所述脂類(lèi)組合物包括磷脂酰膽堿、膽固醇以及PEG衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)。脂質(zhì)體通過(guò)限定孔徑大小的過(guò)濾器被擠出，從而產(chǎn)生具有期望直徑的脂質(zhì)體。本發(fā)明的抗體的Fab'片段能夠經(jīng)由二硫化物交換反應(yīng)而被結(jié)合于如文獻(xiàn)Martinetal.,J.Biol.Chem.257:286-288(1982)中所述的脂質(zhì)體。化學(xué)治療劑(比如阿霉素)任選地被包含在脂質(zhì)體內(nèi)部。參見(jiàn)Gabizonetal.,J.NationalCancerInst.81(19):1484(l卿)。在此劑型也可以含有一種以上為治療中的特定適應(yīng)癥所必需的活性化合物，優(yōu)選這些活性化合物具有互補(bǔ)的不會(huì)彼此不利地影響的活性。這些分子以對(duì)于預(yù)定目標(biāo)有效的含量適當(dāng)?shù)亟M合存在。例如，C242變體或其接合物可以與共同治療劑例如化學(xué)治療劑組合。[157]活性成分也可以例如通過(guò)凝聚技術(shù)或者通過(guò)界面聚合而被包含在制備的微膠囊中，例如分別包含在羥甲基纖維素或明膠微膠囊和聚(甲基甲基丙烯酸酯)微膠囊中，包含在膠態(tài)藥物發(fā)送系統(tǒng)(例如脂質(zhì)體、白蛋白微球體、微乳液、納米顆粒和納米膠囊劑)中，或者包含在粗滴乳狀液(macroemulsion)中。這些技術(shù)在文獻(xiàn)Remington藥物科學(xué)第16版，Osol，A.Ed.(1980)中被公開(kāi)。將用于體內(nèi)給藥的劑型必須是無(wú)菌的。這可以通過(guò)上述討論的無(wú)菌過(guò)濾膜的過(guò)濾而輕易地完成?？梢灾苽渚忈屩破贰：线m的緩釋制品的例子包括半透性的含有拮抗劑的固體疏水性聚合物基質(zhì)，其中基質(zhì)呈成型物品例如薄膜、或微膠囊的形態(tài)。緩釋基質(zhì)的例子包括聚酯，水凝膠[例如，聚(2-羥乙基-甲基丙烯酸酯)、或聚乙烯醇]，聚交酯(美國(guó)專(zhuān)利No.3,773,919)，L-谷氨酸和乙基-L-谷氨酸的共聚物，不可降解的乙烯-醋酸乙烯酯，可降解的乳酸-羥基乙酸共聚物比如LupronDepot(由乳酸-羥基乙酸共聚物和亮丙瑞林醋酸酯(Leuprolideacetate)組成的可注射的微球體)，以及聚-D-(-)-3-羥丁酸。雖然聚合物比如乙烯-醋酸乙烯酯和乳酸-羥基乙酸能使分子的釋放超過(guò)100天，但特定的水凝膠在更短的時(shí)間周期內(nèi)釋放蛋白質(zhì)。當(dāng)用微囊封裝的抗體在身體內(nèi)長(zhǎng)時(shí)間保持時(shí)，由于37。C下暴露于濕環(huán)境，它們可能會(huì)變性或者聚集，導(dǎo)致生物活性的損失和免疫原性可能的改變。取決于有關(guān)的機(jī)制，能夠設(shè)計(jì)合理的策略用于穩(wěn)定化。例如，如果發(fā)現(xiàn)聚集機(jī)制是通過(guò)硫代二硫化物交換而形成的分子間S-S鍵，那么通過(guò)修飾巰基殘基、從酸性溶液凍干、控制含濕量、使用適當(dāng)?shù)奶砑觿?、以及開(kāi)發(fā)特定的聚合母體組合物，可以實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定化。采用的治療方法在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供一種方法，用于通過(guò)將可以對(duì)抗抗CD44/CanAg(抗原)功能的抗體給藥于需要其的病人來(lái)抑制C242抗原活性?？梢灾委熜缘厥褂萌魏伪景l(fā)明的變異抗體或其表位結(jié)合片段、或者細(xì)胞毒試劑與變異抗體或其表位結(jié)合片段的接合物。在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的變異抗體或其表位結(jié)合片段、或者細(xì)胞毒試劑與變異抗體或其表位結(jié)合片段的接合物被用于治療哺乳動(dòng)物高增生性紊亂。在更優(yōu)選的實(shí)施方式中，上述公開(kāi)的含有本發(fā)明的變異抗體或其表位結(jié)合片段、或者細(xì)胞毒試劑與變異抗體或其表位結(jié)合片段的接合物的藥物組合物之一，被用于治療哺乳動(dòng)物高增生性紊亂。優(yōu)選地，該紊亂是肺、乳房、結(jié)腸、前列腺、腎、胰腺、卵巢、宮頸以及淋巴器的癌癥、骨肉瘤、滑液癌、肉瘤或其中CanAg被表達(dá)的癌、以及其他還有待于確定其中CanAg被主要表達(dá)的癌癥。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述藥物組合物涉及治療其他的紊亂，例如自身免疫疾病，比如系統(tǒng)的狼瘡、變形性關(guān)節(jié)炎、以及多發(fā)性硬化；移植排斥，比如腎移植排斥、肝臟移植排斥、肺移植排斥、心臟移植排斥、以及骨髓移植排斥；對(duì)抗宿主移植疾病；病毒感染，比如mV感染、HIV感染、AIDS等；以及寄生蟲(chóng)感染，比如賈第鞭毛蟲(chóng)病、阿米巴病、血吸蟲(chóng)病、以及其它被本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員確定的感染。[162]類(lèi)似地，本發(fā)明提供一種方法，用于通過(guò)單獨(dú)地、或者與其他的細(xì)胞毒試劑或治療劑組合地使用有效量的本發(fā)明的變異抗體或其表位結(jié)合片段、或細(xì)胞毒試劑與變異抗體或其表位結(jié)合片段的接合物；或者包含變異抗體或其表位結(jié)合片段、或者細(xì)胞毒試劑與變異抗體或其表位結(jié)合片段的接合物的治療劑，來(lái)抑制被選擇的包括接觸性耙細(xì)胞的細(xì)胞群的生長(zhǎng)、或抑制含有表達(dá)CanAg的靶細(xì)胞的組織的生長(zhǎng)。用于抑制被選擇的細(xì)胞群的生長(zhǎng)的方法能夠在體外、在體內(nèi)、或體表外實(shí)踐。這里使用的術(shù)語(yǔ)"抑制生長(zhǎng)"是指，減慢細(xì)胞的生長(zhǎng)、降低細(xì)胞成活力、引起細(xì)胞死亡、溶解細(xì)胞和誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，而不論周期長(zhǎng)短。體外使用的例子包括在其移植入同一病人體內(nèi)之前處理自體的骨髓，以便殺死病態(tài)的或惡性的細(xì)胞；在其移植之前處理骨髓，以便殺死有競(jìng)爭(zhēng)性的T細(xì)胞并且抑制移植對(duì)抗宿主病(graft-versus-host-disease,GVHD);處理細(xì)胞培養(yǎng)物，以便殺死除不表達(dá)靶抗原的期望變體之外的所有細(xì)胞；或者殺死表達(dá)不希望有的抗原的變體。術(shù)人員容易確定非臨床的體外使用的條件。臨床的體表外使用的例子是在癌癥治療中或者在自身免疫病治療中的自體移植之前，從骨髓中除去腫瘤細(xì)胞或淋巴樣細(xì)胞；或者在移植之前，從自體的或異體的骨髓或組織中除去T細(xì)胞及其他淋巴樣細(xì)胞，以便防止移植對(duì)抗宿主病(GVHD)。治療能夠按如下進(jìn)行。從病人或其他個(gè)體體內(nèi)收集骨髓，然后在含有血清的培養(yǎng)基中孵育，該血清內(nèi)加入了本發(fā)明的變異抗體或其表位結(jié)合片段、或者細(xì)胞毒試劑與變異抗體或其表位結(jié)合片段的接合物。濃度范圍為IOymlpm，在約37。C下保溫約30分鐘至約48小時(shí)。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以輕易地確定孵育時(shí)濃度和時(shí)間的精確條件，S卩，劑量。在孵育后，用含有血清的培養(yǎng)基洗滌骨髓細(xì)胞，并且根據(jù)己知的方法通過(guò)靜脈內(nèi)注射將其返回到病人體內(nèi)。病人在收集骨髓和再輸注處理后細(xì)胞之間的時(shí)間內(nèi)接受其他治療、比如一系列使人虛弱的化療或全身輻射的情形中，通過(guò)使用標(biāo)準(zhǔn)醫(yī)療器械，將處理的骨髓細(xì)胞在液氮中冷凍儲(chǔ)存。對(duì)于臨床的體內(nèi)使用，本發(fā)明的變異抗體或其表位結(jié)合片段、或者細(xì)胞毒試劑與變異抗體或其表位結(jié)合片段的接合物將被作為用于無(wú)菌測(cè)試和內(nèi)毒素水平測(cè)試的溶液供應(yīng)。細(xì)胞毒性接合物給藥的合適方案的例子如下所述。每周接合物被作為靜脈內(nèi)注射丸劑給藥，持續(xù)4周。丸劑劑量在50^100mL的生理鹽水中給藥，該生理鹽水中可以加入5~10mL的人血清白蛋白。劑量將是每次靜脈內(nèi)給藥10yg至1g(每天100ng至10mg/kg的范圍)。更優(yōu)選，劑量將為50Ug至30mg。最優(yōu)選劑量將是1mg至20mg。在治療四周后，病人能夠繼續(xù)接受基于每周的治療。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可根據(jù)臨床狀態(tài)確定關(guān)于給藥途徑、賦形劑、稀釋劑、劑量、時(shí)間等的具體臨床方案。診斷本發(fā)明的抗體或抗體片段還可以被用于體外或者在體內(nèi)檢測(cè)生物樣品中的C242抗原(抗CD44/CanAg)。在一種實(shí)施方式中，本發(fā)明的變異的C242抗體被用于確定組織中或者來(lái)源于組織的細(xì)胞中的抗CD44/CanAg水平。在一種優(yōu)選實(shí)施方式中，組織是有病的組織。在該方法的一種優(yōu)選實(shí)施方式中，組織是腫瘤或其活檢樣本。在該方法的一種優(yōu)選實(shí)施方式中，組織或其活檢樣本首先從病人身上切除，然后能夠在使用本發(fā)明的抗體或抗體片段的免疫測(cè)定中確定組織或活檢樣本中的抗CD44/CanAg水平。組織或其活檢樣本能夠被冷凍或者固定。該相同的方法能夠被用于確定抗CD44/CanAg的其他餘性，比如轉(zhuǎn)譯修飾(例如，乙二醇化(glycolation))、細(xì)胞表面水平、或者細(xì)胞定位。[169]上述方法能夠被用于診斷已知或懷疑患有癌癥的主體的癌癥，其中，將在所述病人體內(nèi)測(cè)量的CanAg水平與正常的參考主體或者標(biāo)準(zhǔn)相比較。然后所述方法能夠被用于確定腫瘤是否表達(dá)CanAg，這可以建議腫瘤將較好地應(yīng)答本發(fā)明的抗體、抗體片段或抗體接合物的治療。優(yōu)選地，該腫瘤是肺、乳房、結(jié)腸、前列腺、腎、胰腺、卵巢、宮頸以及淋巴器的癌癥、骨肉瘤、滑液癌、肉瘤或其中CanAg被表達(dá)的癌、以及其他還有待于確定其中CanAg被主要表達(dá)的癌癥。本發(fā)明進(jìn)一步提供被進(jìn)一步標(biāo)記的變異的單克隆抗體、變異的人源化抗體及其表位結(jié)合片段，用于研究或者診斷應(yīng)用。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，標(biāo)簽是放射性同位素示蹤、熒光團(tuán)、生色團(tuán)、顯影劑或金屬離子。本發(fā)明還提供了一種診斷方法，其中所述標(biāo)記的抗體或其表位結(jié)合片段將被給藥于懷疑患有癌癥的主體，并且在主體體內(nèi)的標(biāo)簽分布被測(cè)量或者監(jiān)控。試劑盒本發(fā)明還包括試劑盒，例如，其包含描述的細(xì)胞毒性接合物和關(guān)于使用細(xì)胞毒性接合物殺死特定細(xì)胞類(lèi)型的說(shuō)明書(shū)。該說(shuō)明書(shū)可以包括體外、在體內(nèi)或者體表外使用細(xì)胞毒性接合物的指導(dǎo)。典型地，試劑盒將具有包含細(xì)胞毒性接合物的分隔室。該細(xì)胞毒性接合物可以呈凍干形式、液體形式、或者其它可修正成被包含于試劑盒中的形式。該試劑盒也可以包含額外的為實(shí)踐試劑盒中說(shuō)明書(shū)上描述的方法所需要的組成部分，比如用于重新構(gòu)成凍干粉的無(wú)菌溶液、用于在給藥于病人之前與細(xì)胞毒性接合物組合的附加的試劑、以及有助于將接合物給藥于病人的工具。共有序列的設(shè)計(jì)通過(guò)標(biāo)記在Kabat鼠抗體序列數(shù)據(jù)庫(kù)中各個(gè)位置出現(xiàn)的殘基，產(chǎn)生共有序列。用序列分析和數(shù)據(jù)管理軟件"VectorNTI"(Invitrogen公司的產(chǎn)品)中的ClustalW模塊比對(duì)數(shù)千個(gè)輕鏈和重鏈可變區(qū)序列。同時(shí)請(qǐng)參見(jiàn)LuG,MoriyamaENVectorNTI，平衡的歸一化(all-in-one)序列分析程序組，BriefBioinform，2004年12月;5(4):378-88。將比對(duì)結(jié)果輸進(jìn)MicrosoftExcel電子數(shù)據(jù)表，以計(jì)算哪些殘基是最頻繁地出現(xiàn)在鼠的輕鏈和重鏈可變區(qū)數(shù)據(jù)庫(kù)中各個(gè)位置處，然后輸出結(jié)果，作為"共有"序列。必要時(shí)，能夠在兩個(gè)氨基酸殘基間將共有序列分開(kāi)，其中，將兩個(gè)保守氨基酸中的較小出現(xiàn)者挑選出來(lái)，以增強(qiáng)所考慮的抗體的生物物理學(xué)特性或者人源化。例如，在本案中，輕鏈中的Q45被R替代，R不會(huì)取代具有鼠的共有序列殘基K的非共有序列殘基。這些觀測(cè)結(jié)果對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)，從而無(wú)需過(guò)度的實(shí)驗(yàn)或者提供這些具體細(xì)節(jié)。通過(guò)購(gòu)買(mǎi)許可證，可在市場(chǎng)上買(mǎi)到Kabat序列數(shù)據(jù)庫(kù)。另外，數(shù)千個(gè)鼠抗體序列被公布，可在NCBI網(wǎng)址上下載，并且能夠被用于產(chǎn)生類(lèi)似的數(shù)據(jù)。所有在此引用和在下述實(shí)施例中引用的參考文獻(xiàn)的全部?jī)?nèi)容被以參考形式并入本文。參考下述實(shí)施例，可以透徹地理解本發(fā)明的保護(hù)范圍，但不應(yīng)將本發(fā)明限定為具體的實(shí)施方式。實(shí)施例材料通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的CsCl2純化技術(shù)，制備出pSynC242和對(duì)照質(zhì)粒制品。由Stratagene公司得到了QuikChange定位誘變體系(#200518)。RNeasy微型試劑盒(#74104)購(gòu)自Qiagen公司。用于逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)的SuperscriptFirstStrandSynthesisSystem(#11904-418)購(gòu)自GibcoBRL公司。從APPLYBIOSYSTEM公司得到了CyberGreen實(shí)時(shí)PCRMasterMix(斜309155)。熒光接合物鏈霉抗生物素蛋白(FlourescenceinConjugatedStreptavidin)(#016-010-0841mg/mL)來(lái)自JacksonImmunoResearch。從FALCON公司購(gòu)得96孔的U底平板(#3077)。EZ-LinkSulfo-NHS-LC-Biotin(#21335)來(lái)自Pierce公司。方法通過(guò)定點(diǎn)誘變的huC242HC和LC構(gòu)架上的氨基酸取代引物設(shè)計(jì)用于突變反應(yīng)的互補(bǔ)的PCR引物對(duì)長(zhǎng)度為30個(gè)堿基，并且在引物當(dāng)中包含期望的核苷酸置換。其中引物經(jīng)PAGE純化并且以150ng/wL的濃度進(jìn)行重構(gòu)。PCR突變反應(yīng)PCR反應(yīng)按如下方式進(jìn)行5uL的10x反應(yīng)緩沖液(購(gòu)自Stratagene)、20ng的dsDNA模板、0.85nL(125ng)的正向引物、0.85uL(125ng)的反向引物、1PL的400mMdNTP(購(gòu)自Stratagene)，以及ddH20在薄壁的epidorf管中被加至50uL的最終體積。最后，將lUL的PfUTurboDNA聚合酶(2.5U/pL，購(gòu)自Stratagene)加入反應(yīng)混合物中，并且將epidorf管置于MJResearch熱循環(huán)控制器中。反應(yīng)條件如下所述95。C下l個(gè)循環(huán)，30秒；95。C下12個(gè)循環(huán)，30秒；接著55。C下1分鐘；并且68°C下11分鐘(l分鐘/kb，共llkb模板)；當(dāng)兩個(gè)堿基將被改變時(shí)，將循環(huán)數(shù)增加到14;在68。C下l個(gè)循環(huán)，8分鐘；4。C下保持。競(jìng)爭(zhēng)性細(xì)胞的轉(zhuǎn)化按如下進(jìn)行通過(guò)用甲基化依賴(lài)性限制性內(nèi)切酶Dpnl(購(gòu)自Stratagene)消化，中和PCR模板DNA。用直接加入到PCR反應(yīng)物中并且在27。C下保溫1小時(shí)的1yL的Dpnl進(jìn)行限制性消化。然后通過(guò)將3uL經(jīng)Dpnl消化的PCR產(chǎn)物加入至50PL的XL-1競(jìng)爭(zhēng)性細(xì)胞(購(gòu)自Stratagene)、在冰上保溫30分鐘、接著42。C下加熱脈動(dòng)45秒、返回到冰上2分鐘、然后加入0.5mL的SOC緩沖液用于在37。C和225rpm轉(zhuǎn)速搖動(dòng)下最終孵育1小時(shí)，來(lái)轉(zhuǎn)化該反應(yīng)物。將轉(zhuǎn)化的細(xì)胞平鋪在LB/Amp平板(300uL每個(gè)平板)上，并且在37。C下保溫過(guò)夜。突變的確認(rèn)使用Qiagen微型制品柱從轉(zhuǎn)化菌落中分離質(zhì)粒DNA并且通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳篩選。通過(guò)VH和VL區(qū)域測(cè)序，對(duì)維持同一電泳遷移率而作為模板DNA的質(zhì)粒做進(jìn)一步分析，以便確認(rèn)期望的突變產(chǎn)品。測(cè)序反應(yīng)通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的自動(dòng)測(cè)序技術(shù)(SterkyF，LundebergJ?；蚝突蚪M的序列分析。JBiotechnol.2000年1月7日；76(1):1-31)進(jìn)行。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染用Qiagen公司的Superfection試劑盒進(jìn)行使用抗體表達(dá)質(zhì)粒的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。為確保測(cè)試質(zhì)粒間的轉(zhuǎn)染等效性，DNA濃度通過(guò)OD26o進(jìn)行測(cè)量，并且通過(guò)在瓊脂糖凝膠上的顯象進(jìn)行確認(rèn)。在轉(zhuǎn)染之前，3Xl()5個(gè)293T細(xì)胞被鋪入6孔盤(pán)上的每個(gè)孔中。用2ug的質(zhì)粒DNA將轉(zhuǎn)染混合物補(bǔ)至每孔0.6mL(或用于空白對(duì)照的TE)，接著將其與15ul的Superfect(購(gòu)自Qiagen)相混合，并且在RT下保溫10min。該混合物被加至293T細(xì)胞，然后將其置于37。C、5Q/。C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2hr。接著，用細(xì)胞培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞，并且最后置于lml培養(yǎng)基中，在37。C、5。/。CO2的培養(yǎng)箱中保溫0hr、14hr、22hr和48hr，以允許抗體產(chǎn)生。在轉(zhuǎn)染0hr、14hr、22hr和48hr后，從培養(yǎng)基中收集分泌的抗體。通過(guò)抗huIgGl定量ELISA(QE)測(cè)量抗體濃度。定量ELISA在涂敷有抗羊人類(lèi)IgG抗體(TheBindingSite有限公司，英國(guó)，產(chǎn)品代碼AU0006)的96孔板中于室溫下進(jìn)行定量ELISA1小時(shí)。該孔板然后用PBS中1%新生山羊血清在室溫下封閉1小時(shí)。轉(zhuǎn)染上清液進(jìn)行連續(xù)的稀釋?zhuān)⑶冶煌扛灿诜忾]的平板，接著在室溫下再孵育1hr。該ELISA平板然后用PBS/0.05%Teen-20洗滌4次，加入二次抗體(過(guò)氧化物酶結(jié)合的抗人Kappa抗體(TheBindingSite有限公司，英國(guó)，產(chǎn)品代碼AP015)，并且平板再次在室溫下被孵育1小時(shí)。最后，用PBS/0.05%Teen-20洗滌平板4次，并且加入ABTS(0.5mg/mlABTS、0.1M擰檬酸鹽緩沖液中0.03%H202)。在OD4()5處讀取ELISA平板吸光度，并且相對(duì)于內(nèi)標(biāo)吸光度計(jì)算出人類(lèi)IgGl濃度。原始huC242和突變huC242的mRNA和胞內(nèi)HC/LC水平的定量比較總RNA分離物試劑盒操作之后用QiagenRNeasy旋轉(zhuǎn)柱(spincolumns)從6乂106個(gè)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞中分離總的RNA。細(xì)胞進(jìn)行胰蛋白酶化、用PBS洗滌、以及團(tuán)?；?xì)胞，除去上清液，并且細(xì)胞團(tuán)在-80°C下冷凍過(guò)夜。細(xì)胞團(tuán)在500uL的含有l(wèi)。/。(v/v)e-巰基乙醇的RLT緩沖液中進(jìn)行破裂，徹底地混合，然后通過(guò)20號(hào)針(20-gaugeneedle)進(jìn)行均質(zhì)化5次。將500uL的70。/。乙醇加入各個(gè)勻漿產(chǎn)物中，混合試管，然后將700uL的樣本施加于RNeasy微型柱，并且將試管在10,000rpm下旋轉(zhuǎn)15秒。棄去流經(jīng)物，并且用350uL緩沖液RWl洗滌柱子，接著再在10,000rpm下旋轉(zhuǎn)15秒。用80uL加至柱膜中心的脫氧核糖核酸酶I(Dnasel)溶液(70yL緩沖液RDD中的10uL脫氧核糖核酸酶I)除去細(xì)胞的DNA、在RT(20-30。C)下保溫15min，然后將350nL緩沖液RW1加入柱中，并且將試管在10,000rpm下旋轉(zhuǎn)15秒。棄去流經(jīng)物，并且將柱子轉(zhuǎn)移入新的2mL接收管，用500UL緩沖液RPE進(jìn)行如下兩次附加的洗滌第一次洗滌，在10,000rpm下旋轉(zhuǎn)15秒第二次洗滌，在10,000rpm下旋轉(zhuǎn)2分鐘。該柱被置于新的2mL接收管，并且全速旋轉(zhuǎn)l分鐘，以便使柱子完全干燥。最后，將柱子轉(zhuǎn)移至新的1.5mL接收管，并且用30yL無(wú)核糖核酸酶的水洗脫RNA，并且在10，000rpm下旋轉(zhuǎn)l分鐘。通過(guò)00260測(cè)量RNA濃度，然在-80。C下儲(chǔ)存后樣本。cDNA合成試劑盒操作之后使用SuperscriptII逆轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen公司)進(jìn)行第一條cDNA鏈的合成反應(yīng)。用3ng總RNA、3ixL任意六聚體(randomhexamer)、1yL的10mMdNTP制備反應(yīng)混合物，接著用DEPC處理過(guò)的水使體積達(dá)到10UL。該混合物在65°C下保溫5分鐘，然后放在冰上至少1分鐘。將2yL的10xRT緩沖液、4uL的25mMMgCl2、2uL的0.1MDTT、以及1yL的RNaseOUT核糖核酸酶抑制劑加入各個(gè)反應(yīng)物中，混合，并且在25°C下保溫2min。接著，將1yL(50U)SuperscriptII逆轉(zhuǎn)錄酶加入各個(gè)試管，混合，并且在25。C下保溫10分鐘、42。C下保溫50min、70。C下保溫15min，然后在冰上冷卻。通過(guò)短暫旋轉(zhuǎn)收集反應(yīng)物，并且在進(jìn)行定量PCR之前，用核糖核酸酶H(將lyL核糖核酸酶H加入各個(gè)試管，并且在37。C下保溫20分鐘)除去RNA。定量PCR的進(jìn)行通過(guò)使用CyberGreenRealTimePCRMasterMix試劑盒(AppliedBiosystems公司)，在96孔平板中進(jìn)行定量PCR反應(yīng)。按1:500稀釋逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)物，并且將10uL的各個(gè)樣本一式三份鋪入孔中。對(duì)于各個(gè)引物對(duì)，通過(guò)使用10UL的按1:100、1:200、1:400、1:800和1:1600比例稀釋的一種RNA樣本，產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線(4-5個(gè)點(diǎn))。對(duì)于各個(gè)樣本，使用對(duì)各個(gè)質(zhì)粒上出現(xiàn)的新霉素抗性基因特異的引物對(duì)，還一式三份地進(jìn)行內(nèi)部轉(zhuǎn)染對(duì)照。對(duì)于各個(gè)樣本，通過(guò)使用肌動(dòng)蛋白特異性引物，還進(jìn)行分離的細(xì)胞數(shù)量對(duì)照。將15yL的反應(yīng)混合物(各為0.05uL的100PM引物、12.5uL的2XCyberGreenPCRMasterMix和2.4ii1的ddH20)加入各個(gè)實(shí)驗(yàn)孔和對(duì)照孔。在被置于ABIprism7000實(shí)時(shí)熱循環(huán)器之前，平板被密封并旋轉(zhuǎn)，以便收集內(nèi)容物。按如下進(jìn)行反應(yīng)在95。C下10分鐘；接著95。C下15秒，40個(gè)循環(huán)；60。C下l分鐘。用ABIprism7000軟件分析原始數(shù)據(jù)。胞內(nèi)重鏈和輕鏈水平的分析[188]將細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)的IgG或者細(xì)胞瞬時(shí)表達(dá)的IgG在RIPA緩沖液中裂解，并且將蛋白質(zhì)濃度歸一化。對(duì)細(xì)胞裂解產(chǎn)物在變性或不變性條件下進(jìn)行電泳。在電泳之前，視需要通過(guò)蛋白質(zhì)A沉淀技術(shù)對(duì)裂解產(chǎn)物中的IgG進(jìn)行純化或濃縮。使用抗人IgG抗體和抗人LCK抗體，通過(guò)Westernblotting技術(shù)分析了丙烯酰胺凝膠以便分別地顯現(xiàn)重鏈和輕鏈條帶。huC242對(duì)抗原陽(yáng)性細(xì)胞的結(jié)合親合力的測(cè)量非競(jìng)爭(zhēng)性的結(jié)合用FACS緩沖液(RPMI培養(yǎng)基中2.5。/。NGS)將huC242和變異的抗體歸一化為1-2Ug/ml。將兩份50uL樣本施加于96孔平板，并且在FACS緩沖液中按1:1進(jìn)行連續(xù)的稀釋。將Colo205細(xì)胞再懸浮于FACS緩沖液，至4X1()S個(gè)細(xì)胞/mL，并且以50UL加入各個(gè)孔中。將平板孵育2小時(shí)，然后用每孔200yLFACS緩沖液洗滌2次，接著在4°C、1200rpm下旋轉(zhuǎn)5分鐘。除去上清液，并且將50nL的FITC標(biāo)記的二次抗體(在FACS緩沖液中按1:100稀釋)加入各個(gè)孔，并且將平板在4。C下保溫30分鐘。最后，按如上所述洗滌平板，并且用200uL/孔的PBS中1%甲醛固定細(xì)胞。在BDFACScalliber流式細(xì)胞儀上通過(guò)熒光分析了相對(duì)的抗體對(duì)靶細(xì)胞的結(jié)合。競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合[190]使用在室溫下保溫1小時(shí)的1mg/mL的EZ-LinkSulfo-NHS-LC-生物素(Pierce#21335)將huC242生物素化。用?；撬嵋种品磻?yīng)，然后用IXPBS在4°C下透析過(guò)夜。將生物素化huC242稀釋至1.6X10—9M，最終的反應(yīng)物濃度為4X10"QM。[191]未標(biāo)記huC242和變異抗體按1:2的比例由4X10—8M連續(xù)稀釋至1X10—11M，并且將50ixL的各個(gè)樣本加至平板。接著，通過(guò)上下吸動(dòng)3次，每孔混入50yL的生物素化huC242。Colo205細(xì)胞用FACS緩沖液洗滌兩次，以2X1()S個(gè)細(xì)胞/ml再懸浮，并且以100yL混入含有抗體混合物的各個(gè)孔中。該平板在冰上保溫2小時(shí)，用FACS緩沖液洗滌2次，然后加入50UL按1:100稀釋的結(jié)合熒光素的鏈霉抗生物素蛋白。接著，平板在冰上保溫1小時(shí)，用FACS緩沖液洗滌2次，并且用每孔200liL的PBS中1%甲醛固定細(xì)胞。在BDFACScalliber流式細(xì)胞儀上分析競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合。發(fā)現(xiàn)了在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后數(shù)小時(shí)內(nèi)較低的huC242產(chǎn)量[192]在293T細(xì)胞中進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)化，從而將huC242的表達(dá)與對(duì)照抗體相比較，已知該對(duì)照抗體具有中等至高表達(dá)的潛力。并行地將編碼兩個(gè)對(duì)照物人源化抗體以及huC242的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入293T細(xì)胞，并且在轉(zhuǎn)染0hr、14hr、22hr和48hr后從培養(yǎng)基中收集分泌的抗體。早在轉(zhuǎn)染14個(gè)小時(shí)后，分泌的huC242已經(jīng)遠(yuǎn)低于兩個(gè)對(duì)照物抗體(圖2)，并且該差異隨時(shí)間逐漸增大。在48小時(shí)時(shí)，累積的huC242產(chǎn)率僅為對(duì)照物A的約7%和對(duì)照物B的12%。在293T瞬時(shí)轉(zhuǎn)染中huC242重鏈和輕鏈mRNA水平顯得正常[193]為了檢査低的huC242產(chǎn)量是否是起因于低的IgG信使RNA水平，將huC242的重鏈和輕鏈mRNA與免疫原庫(kù)中的其他人源化抗體相比較。將huC242和對(duì)照物抗體平行地轉(zhuǎn)染入293T細(xì)胞，并且在72hr以后由細(xì)胞中分離出mRNA。通過(guò)定量RT-PCR技術(shù)分析了這些樣本，并且結(jié)果(圖3)表明huC242的mRNA水平是可以與對(duì)照物抗體相比的。歸一化的huC242重鏈mRNA稍高于抗體的最大值，但是類(lèi)似于對(duì)照物C。huC242輕鏈mRNA低于對(duì)照物A的mRNA，但是類(lèi)似于對(duì)照物A和C的mRNA。總的來(lái)看，研究發(fā)現(xiàn)huC242重鏈和輕鏈這兩者的細(xì)胞的mRNA水平可與能夠具有高產(chǎn)量的數(shù)種其他的抗體相比較。在穩(wěn)定的CHO細(xì)胞系中裝配的huC242(H2L2)對(duì)于HC(H)的相對(duì)比率明顯低于huB4比率以qPCR結(jié)果為基礎(chǔ)，低產(chǎn)率的huC242很可能是轉(zhuǎn)錄后的產(chǎn)率。為了分析轉(zhuǎn)錄后的發(fā)生，在對(duì)照物A和huC242之間比較重鏈和輕鏈肽的胞內(nèi)表達(dá)和裝配。將穩(wěn)定的CHO細(xì)胞系表達(dá)的對(duì)照物A與兩個(gè)穩(wěn)定的CHO細(xì)胞系表達(dá)的huC242相比較。對(duì)所有的細(xì)胞裂解液進(jìn)行蛋白質(zhì)A純化，并且將分離出的IgG在不變性凝膠上進(jìn)行分離，并用考馬斯亮藍(lán)染色(圖4)。在huC242與對(duì)照抗體相比較后，huC242多個(gè)不完全裝配的種類(lèi)的存在表明，效率低的重鏈和輕鏈裝配可能是huC242抗體低表達(dá)的根本原因，該效率低的裝配或許可歸因于在肽之間很小的兼容性、或者不足的輕鏈供應(yīng)。多個(gè)huC242重鏈和輕鏈構(gòu)架殘基與共有序列不一致[195]通過(guò)將huC242可變區(qū)氨基酸序列與已知能夠在穩(wěn)定的CHO細(xì)胞系中高水平表達(dá)的對(duì)照物表面重修的抗體進(jìn)行比對(duì)，初始實(shí)現(xiàn)非共有序列殘基在huC242重鏈和輕鏈構(gòu)架中的存在。因?yàn)閷?dǎo)致低表達(dá)的殘基本質(zhì)上不大可能占優(yōu)勢(shì)，分別將huC242重鏈和輕鏈可變區(qū)構(gòu)架與由全部的Kabat鼠IgG1和Kappa輕鏈數(shù)據(jù)庫(kù)產(chǎn)生的共有序列進(jìn)行比對(duì)(圖5)。因?yàn)樵诒砻嬷匦薜目贵w比如huC242中隱蔽的殘基保持了原始鼠親本抗體所有的鼠殘基，并且通常認(rèn)為人抗體表面殘基不會(huì)被取代，故使用鼠的共有序列。如圖5所示的殘基26(D)對(duì)于作為隱蔽的殘基是個(gè)例外，因?yàn)槠浔槐┞对诒砻嫔稀埢肎取代，因?yàn)槭紫绕?D)是鼠的殘基，并且通常鼠的殘基可以被取代，即使它們?cè)陔[蔽的殘基外側(cè)被發(fā)現(xiàn)。來(lái)自鼠的共有序列的G殘基在該情況下碰巧與用于C242人源化的人的序列一致。[196]不與小集合的重組抗體匹配的相同huC242構(gòu)架位置也不與來(lái)自很大的數(shù)據(jù)庫(kù)的共有序列相匹配。另外，這些huC242殘基中有許多被發(fā)現(xiàn)在Kabat數(shù)據(jù)庫(kù)中相同的位置中是極稀有的，它們?cè)谑蟮目贵w中的存在為從16%到僅僅0.8%(參見(jiàn)下表)。這些稀有的、隱蔽的構(gòu)架殘基被挑選出來(lái)，用于進(jìn)一步調(diào)查是否對(duì)huC242抗體的低表達(dá)潛力做出任何貢獻(xiàn)。表在huC242可變區(qū)構(gòu)架中的稀有氨基酸殘基以及它們?cè)贙abat抗體數(shù)據(jù)庫(kù)中出現(xiàn)的頻率。為了比較，共有序列中對(duì)應(yīng)的氨基酸殘基和它們的給定的頻率I。<table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>通過(guò)在1mC242或輕鏈構(gòu)架中進(jìn)行單一氨基取代的IgG產(chǎn)量的適度提高[197]為研究在huC242重鏈和輕鏈構(gòu)架中被識(shí)別的罕有的殘基是否可以消極地影響抗體產(chǎn)量，通過(guò)使用定點(diǎn)突變，這些殘基被對(duì)應(yīng)的共有序列殘基取代。通過(guò)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，將huC242的單一氨基酸變體的抗體表達(dá)與huC242和對(duì)照物抗體相比較。將各自的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入293T細(xì)胞，并且在72小時(shí)以后、通過(guò)定量ELISA確定分泌的IgG的水平。通過(guò)在huC242的重鏈或者輕鏈構(gòu)架區(qū)域中的單一氨基酸取代，實(shí)現(xiàn)了IgG產(chǎn)量的適度提高(圖6)。[198]為確保殘基取代不會(huì)改變抗體結(jié)合活性，通過(guò)抗原陽(yáng)性的Colo205細(xì)胞上的FACS評(píng)估huC242變體。結(jié)果顯示，氨基酸取代不會(huì)改變結(jié)合分布型(圖6)。通過(guò)在hiiC242重鏈和輕鏈構(gòu)架中兩個(gè)至三個(gè)殘基改變的組合，實(shí)現(xiàn)了抗體產(chǎn)率的顯著提高將huC242氨基酸取代擴(kuò)大至包括多個(gè)構(gòu)架殘基改變。變體重鏈和輕鏈構(gòu)造還被混合搭配，以便構(gòu)建huC242變體配對(duì)的陣列，各個(gè)陣列含有兩個(gè)以上殘基取代。按如上所述在293T瞬時(shí)轉(zhuǎn)染中比較huC242變體的相對(duì)產(chǎn)率。各種殘基取代的組合導(dǎo)致不同的產(chǎn)率水平，在huC242重鏈和輕鏈可變區(qū)構(gòu)架兩者之間含有兩種或三種變化的組合中可看到最大的提高(圖7)。huC242變體重鏈和輕鏈的mRNA水平保持不變。所見(jiàn)huC242產(chǎn)率隨著變體序列的提高可能起因于提高的抗體的轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)譯或轉(zhuǎn)譯后特性。為了研究提高的huC242表達(dá)的源由，進(jìn)行qPCR實(shí)驗(yàn)，評(píng)估huC242的mRNA水平和在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞中表達(dá)的huC242序列變體。結(jié)果表明，與huC242相比，huC242變體對(duì)重鏈和輕鏈這兩者產(chǎn)生了類(lèi)似的的mRNA水平(圖8)。這顯示，提高的1mC242變體的抗體產(chǎn)量不是由于提高的轉(zhuǎn)錄或mRNA穩(wěn)定性，而或許是由于提高的轉(zhuǎn)錄后的特性。研究發(fā)現(xiàn)胞內(nèi)輕鏈肽的提高是重鏈變化的結(jié)果[202]為了進(jìn)一步研究與通過(guò)可變區(qū)構(gòu)架殘基取代而提高的huC242產(chǎn)率有關(guān)的可能機(jī)制，比較了胞內(nèi)的重鏈肽和輕鏈肽水平。將huC242和序列變體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染入被裂解72小時(shí)后的293T細(xì)胞中，并且通過(guò)Westernblotting技術(shù)在變性條件下評(píng)估所有的細(xì)胞裂解液。抗huIgGl和抗huK二次抗體被用于在同一凝膠上顯現(xiàn)重鏈和輕鏈條帶。有趣的是，在重鏈可變區(qū)構(gòu)架中的殘基取代不會(huì)影響重鏈表達(dá)，而是提高了不包含殘基取代的huC242輕鏈的胞內(nèi)蓄積量(圖9)。這些結(jié)果表明，huC242重鏈變體或許是通過(guò)增強(qiáng)的重鏈與輕鏈的相容性來(lái)保護(hù)huC242輕鏈不被降解，從而導(dǎo)致提高的抗體裝配和最終提高的抗體產(chǎn)量。這些結(jié)果還顯示，huC242變體的產(chǎn)率大致與它們的胞內(nèi)輕鏈水平、而不是重鏈水平成比例。hiiC242殘基取代導(dǎo)致提高的重鏈和輕鏈裝配[203]在不變性的條件下進(jìn)行的Westernblot，為huC242變體中提高的轉(zhuǎn)譯后特性提供了進(jìn)一步證據(jù)。通過(guò)不變性Westernblotting技術(shù)評(píng)估了來(lái)自用huC242和變體構(gòu)建體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞的所有細(xì)胞裂解液(圖IO)。在這些實(shí)驗(yàn)中，不變性的完全地裝配的抗體能夠被與未裝配的重鏈和輕鏈以及中間裝配產(chǎn)品一起顯現(xiàn)。作為氨基酸取代的結(jié)果，完全裝配的IgG(H2L2)對(duì)中間裝配產(chǎn)品(H2、H2L1等)的胞內(nèi)比例明顯地被提高(圖10(a))。另外，這些結(jié)果顯示，當(dāng)重鏈和輕鏈變體被組合使用時(shí)，兩種鏈的胞內(nèi)水平得到提高。這提示，重鏈和輕鏈變體序列之間改善的交互作用導(dǎo)致免于降解的交互鏈內(nèi)保護(hù)。[204]在考馬斯亮藍(lán)染色凝膠上評(píng)估huC242和變體構(gòu)建體，以避免潛在的與Westernblotting技術(shù)有關(guān)的人為因素(圖10(b))。對(duì)來(lái)自瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞的所有細(xì)胞裂解液進(jìn)行蛋白質(zhì)A純化技術(shù)，然后將分離的IgG應(yīng)用于不變性的PAGE,隨后用考馬斯亮藍(lán)染色。結(jié)果與通過(guò)Westernblot觀察的結(jié)果一致，顯示了在huC242泳道中部分地裝配的抗體的顯著性水平、和在huC242變體泳道中完全裝配的抗體(H2L2)的比例的提高。在huC242變體中的殘基取代不會(huì)影響抗原結(jié)合活性[205]通過(guò)FACS，在抗原陽(yáng)性的Colo205細(xì)胞上評(píng)估了huC242和變體構(gòu)建體的相對(duì)結(jié)合活性。能夠增強(qiáng)抗體產(chǎn)率的huC242變體在抗原結(jié)合性活性方面未顯示出顯著的變化(圖ll(a))。為進(jìn)一步確認(rèn)這些結(jié)果，通過(guò)用逐次稀釋的、未標(biāo)記的huC242變體挑戰(zhàn)(challenge)結(jié)合于Colo205細(xì)胞上的生物素化huC242(圖ll(b))，進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合測(cè)試。該實(shí)驗(yàn)顯示，對(duì)于以依賴(lài)濃度的方式結(jié)合抗原陽(yáng)性的Colo205細(xì)胞，huC242變體能夠與huC242競(jìng)爭(zhēng)。定向的和競(jìng)爭(zhēng)性的結(jié)合測(cè)試的綜合結(jié)果表明，huC242和變體構(gòu)建體具有類(lèi)似的結(jié)合活性。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將會(huì)理解，無(wú)需借助于過(guò)多的實(shí)驗(yàn)，包括除在此具體闡明的工藝以外的工藝的基因工程再造條件和技術(shù)可以用于實(shí)施要求保護(hù)的本發(fā)明。本領(lǐng)域的普通技49術(shù)人員將認(rèn)識(shí)并理解在此闡明的步驟、工藝條件、以及技術(shù)的功能等同物存在于現(xiàn)有
技術(shù)領(lǐng)域：
中。所有這些已知的等價(jià)物都應(yīng)包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。權(quán)利要求1.一種用于通過(guò)序列基因工程再造來(lái)提高寄主細(xì)胞中人源化鼠抗體或其片段的產(chǎn)量的方法，其包含a)比對(duì)鼠抗體可變區(qū)構(gòu)架序列的集合，其中，這種比對(duì)可以識(shí)別在所述構(gòu)架中各個(gè)位置處出現(xiàn)最頻繁的氨基酸殘基(共有序列殘基)；b)將所述共有序列殘基與人源化抗體可變區(qū)構(gòu)架序列中的相應(yīng)殘基相比較；c)在所述人源化抗體中識(shí)別可變區(qū)構(gòu)架序列中一個(gè)以上非共有序列氨基酸殘基；以及d)在所述人源化抗體或其片段中用等效位置處的共有序列殘基取代一個(gè)以上非共有序列氨基酸殘基，以產(chǎn)生變異的抗體，其中在所述寄主細(xì)胞中以與所述人源化抗體相比更高的產(chǎn)率來(lái)生產(chǎn)所述變異的抗體；以及e)任選地，出于生物物理學(xué)考慮，用非共有序列殘基取代一個(gè)以上氨基酸。2.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述更高的產(chǎn)率是至少2倍或更大。3.如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，所述取代發(fā)生在所述重鏈中。4.如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，所述取代發(fā)生在所述輕鏈中。5.如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，所述取代同時(shí)發(fā)生在重鏈和輕鏈中。6.如權(quán)利要求3、4和5中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述取代發(fā)生在所述可變區(qū)構(gòu)架序列的核心。7.如權(quán)利要求3、4和5中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述非共有序列氨基酸是稀有氨基酸。8.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述人源化抗體是huC242，所述取代發(fā)生在下述位置處選自SEQIDNO:1中第16、26、46、或89位的一個(gè)以上重鏈可變區(qū)位置；或者SEQIDNO:2中第45或70位的輕鏈可變區(qū)位置；或者同時(shí)上述兩處位置，所述位置由Kabat編號(hào)方案確定，其中所述輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列由SEQIDNO:2表示，所述重鏈可變區(qū)的氨基酸序列由SEQIDNO:1表示。9.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述人源化抗體是huC242，所述取代是所述輕鏈中選自Q45K/R和A70D的一個(gè)以上、所述重鏈中選自氨基酸殘基E1A、D26G、K46E和T89V中的一個(gè)以上，所述氨基酸殘基由Kabat抗體殘基編號(hào)方案確定，其中所述輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列由SEQIDNO:2表示，所述重鏈可變區(qū)的氨基酸序列由SEQIDNO:1表示。10.如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，所述人源化抗體是huC242，所述取代是所述輕鏈中選自Q45K/R和A70D中的一個(gè)以上，所述氨基酸殘基由Kabat抗體殘基編號(hào)方案確定，其中所述輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列由SEQIDNO:2表示。11.如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，所述人源化抗體是huC242，所述取代是所述重鏈中選自氨基酸殘基ElA、D26G、K46E和T89V中的一個(gè)，所述氨基酸殘基由Kabat抗體殘基編號(hào)方案確定，其中所述重鏈可變區(qū)的氨基酸序列由SEQIDNO:1表示。12.如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，所述人源化抗體是huC242，并且所述取代是所述重鏈中選自氨基酸殘基E1A、D26G、K46E、T89V、K46E/D26G、K46E/K82S、K46E/T89V、K46E/E16A/D26G、K46E/K82S/D26G和K46E/T89V/D26G中的一個(gè)，所述氨基酸殘基由Kabat抗體殘基編號(hào)方案確定，其中所述重鏈可變區(qū)的氨基酸序列由SEQIDNO:1表示。13.如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，所述人源化抗體是huC242,所述取代是所述輕鏈中Q45K/R或A70D之一以及重鏈中氨基酸殘基K46E、D26G、K46E/D26G或K46E/T89V之一，所述氨基酸殘基由Kabat抗體殘基編號(hào)方案確定，其中所述輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列由SEQIDNO:2表示，所述重鏈可變區(qū)的氨基酸序列由SEQIDNO:1表示。14.如權(quán)利要求8至13中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述更高的產(chǎn)率是至少2倍或更大。15.—種通過(guò)如權(quán)利要求1和8-13中任一項(xiàng)所述的方法所生產(chǎn)的抗體。16.—種分離的核酸，其包含全長(zhǎng)的人C242編碼序列，該編碼序列在編碼重鏈可變區(qū)或輕鏈可變區(qū)的序列區(qū)域中具有至少一種變化，其中所述至少一種變化提高了被所述C242基因編碼的蛋白質(zhì)的產(chǎn)率，并且其中所述蛋白質(zhì)包含所述至少一種變化。17.如權(quán)利要求16所述的核酸，其特征在于，所述至少一種變化包括在所述編碼重鏈可變區(qū)(圖12)氨基酸基序、或輕鏈可變區(qū)(圖12)、或者同時(shí)兩者的序列的區(qū)域中的變化。18.如權(quán)利要求17所述的核酸，其特征在于，在所述基序中的所述至少一種變化選自下述氨基酸的編碼密碼子的取代Gln(CAG)對(duì)于Lys(AAA)或Arg(CGG);Ala(GCT)對(duì)于Asp(GAT);Glu(GAG)對(duì)于Ala(GCC);Asp(GAC)對(duì)于Gly(GGC);Lys(AAA)對(duì)于Glu(GAA);或者Thr(ACC)對(duì)于Val(GTC)。19.如權(quán)利要求16所述的核酸，其特征在于，所述密碼子的取代發(fā)生在輕鏈或重鏈。20.如權(quán)利要求16所述的核酸，其特征在于，所述輕鏈取代選自下述Q45K/RGin(CAG)對(duì)于Lys(AAA)或Arg(CGG);或者A70DAla(GCT)對(duì)于Asp(GAT)。21.如權(quán)利要求16所述的核酸，其特征在于，所述重鏈取代選自下述E16AGlu(GAG)對(duì)于Ala(GCC);D26GAsp(GAC)對(duì)于Gly(GGC);K46ELys(AAA)對(duì)于Glu(GAA);或者T89VThr(ACC)對(duì)于Val(GTC)。22.如權(quán)利要求16所述的核酸，其特征在于，所述序列編碼變異的C242的基因產(chǎn)物。23.如權(quán)利要求22所述的核酸，其特征在于，所述基因產(chǎn)物是抗體。24.—種變異抗體或其表位結(jié)合片段，其中所述變體具有一個(gè)以上在具有可變區(qū)的親代抗體中的氨基酸取代，所述可變區(qū)包含SEQIDNO:1[huC242]所示的重鏈和SEQIDNO:2[huC242]所示的輕鏈，當(dāng)被導(dǎo)入單一寄主細(xì)胞中時(shí)，所述變體顯示出與所述親代抗體相比提高的合成性。25.如權(quán)利要求24所述的抗體，其特征在于，所述取代發(fā)生在一個(gè)以上選自下述的位置所述SEQIDNO:2中第45和70位；或者所述SEQIDNO:1中第16、26、46、或89位，所述位置由Kabat編號(hào)方案確定。26.如權(quán)利要求24所述的抗體，其特征在于，所述取代選自下組重鏈中的Q45K/R、A70D、E16A、D26G、K46E、或T89V，所述位置由Kabat編號(hào)方案確定。27.—種用于通過(guò)序列基因工程再造來(lái)提高寄主細(xì)胞中人源化抗體或其表位結(jié)合片段的產(chǎn)量的方法，其包含-a)比對(duì)來(lái)自與人源化抗體來(lái)源所屬相同的屬或其他接近的系統(tǒng)分類(lèi)的抗體的抗體可變區(qū)構(gòu)架序列的集合，其中，這種比對(duì)可以識(shí)別出在構(gòu)架中各個(gè)位置出現(xiàn)最頻繁的氨基酸殘基(共有序列殘基)；b)將共有序列殘基與人源化抗體可變區(qū)構(gòu)架序列中相應(yīng)殘基相比較；C)在人源化抗體中識(shí)別可變區(qū)構(gòu)架序列中一個(gè)以上非共有序列殘基；以及d)在人源化抗體或其片段中用等效位置處的共有序列殘基取代所述一個(gè)以上非共有序列氨基酸殘基，從而產(chǎn)生變異抗體，其中，在細(xì)胞中以相比人源化抗體更高的產(chǎn)率來(lái)生產(chǎn)變異抗體；e)任選地，出于生物物理學(xué)考慮，一個(gè)以上氨基酸可以用非共有序列殘基取代。28.—種用于通過(guò)序列基因工程再造來(lái)提高寄主細(xì)胞中親代抗體或其抗原結(jié)合片段的產(chǎn)量的方法，其包含a)比對(duì)來(lái)自與親代起源抗體所屬相同的屬或接近的系統(tǒng)分類(lèi)的抗體的抗體可變區(qū)構(gòu)架序列的集合，其中，這種比對(duì)可以識(shí)別出在構(gòu)架中各個(gè)位置最頻繁地出現(xiàn)的氨基酸殘基(共有序列殘基)；b)將共有序列殘基與親代抗體可變區(qū)構(gòu)架序列中相應(yīng)殘基相比較；C)在親代抗體中識(shí)別可變區(qū)構(gòu)架序列中一個(gè)以上非共有序列氨基酸殘基；以及d)在親代抗體或其片段中用等效位置處的共有序列殘基取代一個(gè)以上非共有序列氨基酸殘基，從而產(chǎn)生變異抗體，其中，在寄主細(xì)胞中以相比親代抗體更高的產(chǎn)率來(lái)生產(chǎn)變異抗體；e)任選地，出于生物物理學(xué)考慮，一個(gè)以上氨基酸可以用非共有序列殘基取代。全文摘要本發(fā)明包括抗體變體比如huC242的變體、或其片段的制造，其中，通過(guò)取代一個(gè)以上親代抗體中的氨基酸殘基來(lái)制造變體。這種取代優(yōu)選在包含重鏈和輕鏈的親代抗體的可變區(qū)構(gòu)架序列中進(jìn)行。這種取代的結(jié)果是，當(dāng)被導(dǎo)入寄主細(xì)胞中時(shí)，與親代抗體相比，變異的抗體或其片段顯示出增強(qiáng)的抗體合成性。文檔編號(hào)C07H21/02GK101535332SQ200780039907公開(kāi)日2009年9月16日申請(qǐng)日期2007年10月30日優(yōu)先權(quán)日2006年10月31日發(fā)明者丹尼爾·塔瓦雷斯,周曉邁申請(qǐng)人:免疫基因公司