專(zhuān)利名稱(chēng)：：使用高產(chǎn)率的半乳糖異構(gòu)化來(lái)制造塔格糖的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種使用高產(chǎn)率的半乳糖異構(gòu)化來(lái)制造塔格糖的方法,更特別涉及一種通過(guò)在最佳條件下向反應(yīng)溶液中加入特定結(jié)合到塔格糖，即酮式糖，上的硼酸鹽來(lái)顯著提高異構(gòu)化轉(zhuǎn)換率的方法以及使用該方法來(lái)制造塔格糖的方法。
背景技術(shù)：
：最近，已經(jīng)通過(guò)化學(xué)合成由半乳糖來(lái)制造塔格糖。根據(jù)化學(xué)合成的常規(guī)方法，半乳糖在無(wú)機(jī)鹽存在下異構(gòu)化，經(jīng)金屬氫氧化物作為催化劑進(jìn)行媒接，從而形成金屬氫氧化物-塔格糖復(fù)合物的中間體。該中間體經(jīng)酸中和來(lái)制造塔格糖。然而，該化學(xué)合成的常規(guī)方法，即使它是成本低且能高產(chǎn)率的制造該產(chǎn)品，但是其工藝非常復(fù)雜且效率低下，并產(chǎn)生工藝廢料。制造塔格糖的另一方法是酶媒接轉(zhuǎn)化法，其中醛糖或醛糖衍生物轉(zhuǎn)化為酮糖或酮糖衍生物，接著使用酶將半乳糖轉(zhuǎn)化為塔格糖。已知的是，已用于L-阿拉伯糖轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-核酮糖的阿拉伯糖異構(gòu)酶通過(guò)使用半乳糖作為活體外酶底物能夠產(chǎn)生塔格糖。因此，已經(jīng)報(bào)道了許多具有不同來(lái)源的阿拉伯糖異構(gòu)酶以及使用半乳糖來(lái)制造塔格糖的方法。半乳糖向塔格糖的異構(gòu)化是一種可逆反應(yīng)，表明反應(yīng)物的濃度與產(chǎn)物的濃度達(dá)到平衡。該酶反應(yīng)的特征在于熱力學(xué)上隨著反應(yīng)溫度的增加轉(zhuǎn)化率成正比增加。因此，研制在高溫穩(wěn)定的新型酶以及使用它異構(gòu)化的方法是使用異構(gòu)酶來(lái)制造塔格糖的酶媒接轉(zhuǎn)化的主要因素。當(dāng)在30°C進(jìn)行異構(gòu)化24小時(shí)時(shí)，源自大腸桿菌的常規(guī)阿拉伯糖異構(gòu)酶具有較低的從半乳糖向塔格糖的為25%的轉(zhuǎn)化率。經(jīng)報(bào)道，源自嗜3熱微生物嗜熱脂肪土芽孢桿菌(Geobacillusstearothermophilus)的阿拉伯糖異構(gòu)酶在穩(wěn)定反應(yīng)條件60°C下具有46%的轉(zhuǎn)化率。當(dāng)源自海棲熱袍菌(thermotogamaritime)的超嗜熱的阿拉伯糖異構(gòu)酶在70QC和80GC下的異構(gòu)化反應(yīng)時(shí)，半乳糖向塔格糖的轉(zhuǎn)化率分別為50%和56%(Oh，D.K.，Kim,H丄，Ryu，SA,Kim,P.,2001."用于生產(chǎn)工業(yè)用塔格糖的l-阿拉伯糖異構(gòu)酶的固定化方法"(Developmentofanimmobilizationmethodof1-arabinoseisomeraseforindustrialproductionoftagatose.)Biotechnol.Lett.23，1859-1862.;Kim，H丄，Oh,D.K.，2005."用于生產(chǎn)d-塔格糖，來(lái)自于嗜熱脫氮土壤芽孢桿菌L-阿拉伯糖異構(gòu)酶的純化及特征"(PurificationandcharacterizationofanL-arabinoseisomerasefromanisolatedstrainofGeobacillusthermodenitrificansproducingd誦tagatose.),J.Biotech.Nov4;120(2):162-73.Epub2005Aug9.;Lee,D.W.,Jang，H丄，Choe，EA,Kim，B.C.，Lee,S丄，Kim,S.B.,Hong.Y.H.,Pyun.Y.R.，2004."一種熱穩(wěn)定，來(lái)自于超嗜熱海棲熱胞菌的1-阿拉伯糖(d-半乳糖)異構(gòu)酶的特征"(Characterizationofathermostable1-arabinose(d-galactose)isomerasefromthehyperthermophiliceubacteriumThermotogamaritima.)Appl.Environ.Microbiol.70，1397-1404.)。嗜熱酶的應(yīng)用和高溫下的反應(yīng)能夠逐漸增加半乳糖向塔格糖的轉(zhuǎn)化率。然而，通常，在70^或以上的反應(yīng)溫度，糖溶液的褐色程度成正比地隨著溫度的上升顯著增加。此外，這種高溫反應(yīng)產(chǎn)生的副產(chǎn)物對(duì)最終產(chǎn)物的純度和提純成本有不利影響。因此，反應(yīng)溫度的上升是有限的。所以，最適用的反應(yīng)溫度似乎是7()GC，且在此溫度下異構(gòu)化的最大轉(zhuǎn)化率為56%。到現(xiàn)在為止，還沒(méi)有獲得更高的轉(zhuǎn)化率。
發(fā)明內(nèi)容因此，本發(fā)明人通過(guò)證實(shí)使用半乳糖的異構(gòu)化制造塔格糖的方法比常規(guī)方法產(chǎn)生了更高的產(chǎn)率而實(shí)現(xiàn)了本發(fā)明，該方法包括添加特定結(jié)合到塔格糖上的硼酸鹽的步驟。本發(fā)明的目的之一是提供一種使用嗜熱異構(gòu)酶和包含其的宿主細(xì)胞來(lái)通過(guò)半乳糖異構(gòu)化制造塔格糖的方法，更特別是提供一種通過(guò)添加特定結(jié)合到塔格糖上的硼酸鹽來(lái)提高異構(gòu)化轉(zhuǎn)化率的方法以及提供一種使用該方法高產(chǎn)率地制造塔格糖的方法。本發(fā)明的另一目的是提供一種通過(guò)添加適當(dāng)量的硼酸鹽并在誘導(dǎo)硼酸鹽選擇性結(jié)合到塔格糖的條件下進(jìn)行高溫異構(gòu)化來(lái)人工提高異構(gòu)化轉(zhuǎn)化率的方法。為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明人通過(guò)添加特定結(jié)合到塔格糖上的硼酸鹽顯著增加了轉(zhuǎn)化率以便通過(guò)使用源自嗜熱的或超嗜熱的微生物由阿拉伯糖異構(gòu)酶來(lái)制造塔格糖，并進(jìn)一步證實(shí)了通過(guò)使用該方法能夠高產(chǎn)率地由半乳糖制造塔格糖。下文對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。本文中的阿拉伯糖異構(gòu)酶可源自多種嗜熱微生物，該嗜熱微生物包括土芽孢桿菌屬、極端嗜熱菌、棲熱菌屬(Thermussp.)微生物等，但不總是限制于此。源自不同菌種的阿拉伯糖異構(gòu)酶能夠在不同反應(yīng)條件下使用，只要該條件在它們自己的最佳反應(yīng)條件(溫度，pH)范圍內(nèi)即可。因此，在這些條件下進(jìn)行每種異構(gòu)化都包括在本發(fā)明的規(guī)范內(nèi)。本發(fā)明中能夠特定結(jié)合到塔格糖上的鹽為硼酸鹽。本發(fā)明中使用的硼酸鹽特定結(jié)合到塔格糖上而非半乳糖上(圖1)。硼酸鹽的加入導(dǎo)致比不使用硼酸鹽的常規(guī)方法更加有效的使半乳糖異構(gòu)化，從而改變了酶底物和反應(yīng)物之間的相平衡。本發(fā)明的鹽的效果并不局限于硼酸鹽，能夠使用任何特定結(jié)合到塔格糖上的其他鹽，也就是說(shuō)，本發(fā)明的效果能夠由不同條件下的不同鹽實(shí)現(xiàn)。因此，添加塔格糖的特定鹽來(lái)提高轉(zhuǎn)化率的所有機(jī)理都包括在本發(fā)明的規(guī)范中。參照附圖對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式的實(shí)施可以達(dá)到最好地理解，其中圖1圖示了在不同條件下半乳糖和塔格糖與硼酸鹽反應(yīng)后進(jìn)行的TLC(薄層色譜法)結(jié)果。通道l、塔格糖通道2、半乳糖通道3、半乳糖+硼酸鹽通道4、塔格糖+半乳糖+硼酸鹽通道5、塔格糖+半乳糖圖2是添加或不添加硼酸鹽時(shí)以pH為參數(shù)的半乳糖向塔格糖的轉(zhuǎn)化率圖示，其中最高轉(zhuǎn)化率被認(rèn)為是100，并計(jì)算相對(duì)值。參表示在20mM硼酸鹽存在下的反應(yīng)結(jié)果，O表示硼酸鹽不存在下的的反應(yīng)結(jié)果。圖3是是添加或不添加硼酸鹽時(shí)以溫度為參數(shù)的半乳糖向塔格糖的轉(zhuǎn)化率圖示，其中最高轉(zhuǎn)化率被認(rèn)為是100，并計(jì)算相對(duì)值?！侗硎驹?0mM硼酸鹽存在下的反應(yīng)結(jié)果，O表示硼酸鹽不存在下的反應(yīng)結(jié)果。圖4是根據(jù)不同條件的轉(zhuǎn)化率圖示，其中以不同的摩爾比向高濃度酶底物中加入硼酸鹽(100g/L、200g/L和300g/L)圖5是硼酸鹽存在和不存在時(shí)于含300g/L半乳糖的酶底物溶液(酶底物硼酸鹽=100:40，摩爾比)中生成的塔格糖的異構(gòu)化反應(yīng)的結(jié)果圖示。參表示在640mM硼酸鹽存在下的反應(yīng)結(jié)果，O表示不存在硼酸鹽時(shí)的反應(yīng)結(jié)果。國(guó)和口分別表示消耗的半乳糖和產(chǎn)生的塔格糖。實(shí)施本發(fā)明的最佳實(shí)施方式本發(fā)明的實(shí)際實(shí)施方式和目前優(yōu)選的實(shí)施方式是示例性，如以下實(shí)施例中所示。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員將會(huì)明白，在考慮本
發(fā)明內(nèi)容時(shí)，能夠在本發(fā)明的實(shí)質(zhì)和保護(hù)范圍內(nèi)進(jìn)行修改和改進(jìn)。實(shí)施例1:硼酸鹽與酶底物和產(chǎn)物的結(jié)合能力6為了研究在與硼酸鹽異構(gòu)化的產(chǎn)物中存在的兩種糖源，半乳糖和塔格糖的相互作用，將每種糖源加入到硼酸鹽緩沖液中，然后對(duì)比。半乳糖、塔格糖和它們的混合物(1:1)，每個(gè)都制成100mM。lml的糖源與lml的100mM的硼酸鹽緩沖液(pH9.5)混合，混合物在室溫下保持30分鐘，然后進(jìn)行TLC(薄層色譜法)。50^1的每種反應(yīng)產(chǎn)物裝在TLC片上，干燥然后在85%的乙腈溶液中顯影。進(jìn)行顯色以分析結(jié)果，此時(shí)，著色劑用95%甲烷、5%硫酸和0.3%的N-l-萘基乙二胺制成。結(jié)果，硼酸鹽特定結(jié)合到塔格糖上，該結(jié)果顯示在圖l中。實(shí)施例2:嗜熱的阿拉伯糖異構(gòu)酶的表達(dá)為了進(jìn)行半乳糖異構(gòu)化以在高溫下由半乳糖制造塔格糖，使用了源自嗜熱微生物嗜熱脫氮土壤芽孢桿菌(geobacillustheimodenitrificans)的阿拉伯糖異構(gòu)酶基因。根據(jù)以前的數(shù)據(jù)，將其中450th(半胱氨酸)和475th(天冬酰胺酸)氨基酸用絲氨酸和賴(lài)氨酸替換的突變基因插入載體pTrc99A中，為了轉(zhuǎn)染將其引入大腸桿菌屬BL21(DE3invitrogen,美國(guó))。轉(zhuǎn)化細(xì)胞用作制造菌株。重組細(xì)胞菌株以006。。=0.1的起始濃度接種在含有5(Hig/ml的氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基(細(xì)菌用胰化胨10g/L，酵母提取物5g/L,NaCl10g/L)中，隨后在37。C培育2小時(shí)。然后，通過(guò)加入IPTG(異丙基-(3-D-硫代半乳糖苷)誘導(dǎo)酶表達(dá)，最終濃度為lmM。為了測(cè)量表達(dá)的阿拉伯糖異構(gòu)酶的酶活性，通過(guò)用培養(yǎng)液在8000xg下離心10分鐘恢復(fù)細(xì)胞。將細(xì)胞再懸浮在50mM的三-HCl緩沖液(pH7.0)中，通過(guò)超聲處理細(xì)胞溶解。溶胞產(chǎn)物用作未加工的酶溶液來(lái)催化半乳糖異構(gòu)化。半乳糖異構(gòu)化的活性用含有40mM的半乳糖酶底物和lml的反應(yīng)緩沖液(50mM的三-HCl，pH7.0)的100^1酶溶液混合物進(jìn)行測(cè)量。同時(shí)，在反應(yīng)溶液中也加入MnCl2(最終濃度為5mM)andMgCl2(最終濃度為1mM)實(shí)施例3:酶反應(yīng)條件的最優(yōu)化為了確定在硼酸鹽存在下酶反應(yīng)的最佳pH，通過(guò)混合半乳糖和具有不同pH值的硼酸鹽緩沖液(pH7.0、7.5、8.0、8.5、9.0)來(lái)制備反應(yīng)酶底物溶液。反應(yīng)酶底物原液的最終成分平衡為100mM的半乳糖和20mM的硼酸鹽。純化的酶加入到反應(yīng)底物溶液(4mg/ml)中，隨后在60'C下反應(yīng)，直到它達(dá)到平衡。分析到達(dá)平衡的底物的轉(zhuǎn)化率并與相對(duì)值比較(圖2)。結(jié)果，通過(guò)加入硼酸鹽使半乳糖向塔格糖的轉(zhuǎn)化率增加。在中性pH到pH8.0的堿性條件下，轉(zhuǎn)化率逐漸增加，然后在pH8.5或以上趨于固定?？偟膩?lái)說(shuō)，在pH9.0或以上的條件下，化學(xué)合成相比酶反應(yīng)要占主導(dǎo)地位。因此，酶活性最高并轉(zhuǎn)化率最大程度增加的pH8.5被確定為反應(yīng)的最佳pH值。4mg/ml的粗酶溶液加入到最佳的反應(yīng)條件下的酶底物(100mM半乳糖，20mM硼酸鹽，pH8.5)中。以反應(yīng)溫度為變化參數(shù)測(cè)量了轉(zhuǎn)化率。通過(guò)將最大產(chǎn)量生成塔格糖處的點(diǎn)作為100來(lái)獲得相對(duì)值(圖3)。結(jié)果，當(dāng)在6(TC加入硼酸鹽時(shí)，獲得了最高的轉(zhuǎn)化率。實(shí)施例4:根據(jù)硼酸鹽的摩爾比，最優(yōu)化來(lái)自高濃度酶底物的轉(zhuǎn)化至為了研究是否通過(guò)向高濃度的酶底物中加入硼酸鹽能增加半乳糖向塔格糖的轉(zhuǎn)化率并且為了最優(yōu)化反應(yīng)條件，在不同濃度下(100g/L、200g/L和300g/L)制備了半乳糖酶底物溶液。每個(gè)酶底物溶液中半乳糖與硼酸鹽的摩爾比分別為100:20、100:40、100:60和100:80，且反應(yīng)同樣在pH為8.5、在60'C下進(jìn)行(圖4)。結(jié)果證實(shí)，半乳糖異構(gòu)化中硼酸鹽對(duì)塔格糖的作用與酶底物的濃度、半乳糖無(wú)關(guān)，該轉(zhuǎn)化率隨著硼酸鹽摩爾比的增加成比例地增加。半乳糖與硼酸鹽的最佳摩爾比證實(shí)為100:40。實(shí)施例5:在最佳反應(yīng)條件下生成塔格糖對(duì)以實(shí)施例1-4中最優(yōu)化的摩爾比添加硼酸鹽所進(jìn)行的試驗(yàn)結(jié)果與不添加硼酸鹽所進(jìn)行的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行比較。更特別地，制備了包含300g/L的半乳糖和640mM的硼酸鹽(pH8.5)的酶底物溶液。其中加入30mg/L的粗酶溶液，接著在6(TC下進(jìn)行異構(gòu)化反應(yīng)(圖5)。8添加硼酸鹽時(shí)，轉(zhuǎn)化率顯著增加。經(jīng)證實(shí)，當(dāng)不添加硼酸鹽時(shí)，反應(yīng)20小時(shí)后在300g/L的半乳糖底物中塔格糖產(chǎn)量為158g/L，當(dāng)加入硼酸鹽時(shí)塔格糖產(chǎn)量為232g/L，表明每組的轉(zhuǎn)化率分別是52.7%和77.3%。工業(yè)實(shí)用性如上所述，當(dāng)向半乳糖異構(gòu)化反應(yīng)中選擇性地加入不影響最佳酶反應(yīng)條件的硼酸鹽以制造通過(guò)阿拉伯糖異構(gòu)酶媒接的塔格糖時(shí)，轉(zhuǎn)化率顯著增加。熱動(dòng)力學(xué)上，隨著溫度的增加異構(gòu)化的轉(zhuǎn)化率增加。因此，在高溫反應(yīng)下能夠增加半乳糖向塔格糖的轉(zhuǎn)化率。然而，通常，糖的處理過(guò)程在60-7(TC或以上的反應(yīng)中有困難，因?yàn)樘窃诟邷厥呛苋菀邹D(zhuǎn)變成褐色的特性。因此，在本發(fā)明中使用阿拉伯糖異構(gòu)酶的半乳糖向塔格糖的最大可能轉(zhuǎn)化率在70。C下為55%。然而，根據(jù)本發(fā)明的特征在于添加硼酸鹽的方法，相同條件下能夠顯著地增加轉(zhuǎn)化率，并降低了生產(chǎn)成本。權(quán)利要求1、一種通過(guò)半乳糖異構(gòu)化生產(chǎn)塔格糖的方法，其特征在于，包括添加硼酸鹽的步驟。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的制造塔格糖的方法，其特征在于，向每lOOmol的半乳糖中加入l-80mo1的硼酸鹽。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)塔格糖的方法，其特征在于，異構(gòu)化在8.5-9的pH范圍內(nèi)進(jìn)行。4、根據(jù)權(quán)利要求l所述的制造塔格糖的方法，其特征在于，異構(gòu)化在60'C-7(TC的溫度范圍內(nèi)進(jìn)行。全文摘要本發(fā)明涉及一種使用高產(chǎn)率的半乳糖異構(gòu)化來(lái)制造塔格糖的方法，更特別涉及一種通過(guò)加入可特定結(jié)合到塔格糖上的硼酸鹽來(lái)提高異構(gòu)化轉(zhuǎn)換率的方法以及使用該方法制造塔格糖的方法。文檔編號(hào)C07H7/06GK101558077SQ200780045683公開(kāi)日2009年10月14日申請(qǐng)日期2007年12月10日優(yōu)先權(quán)日2006年12月11日發(fā)明者吳德根,宋相勛,樸承源,李康杓,林昞哲,金慧貞,金成俌申請(qǐng)人:Cj第一制糖株式會(huì)社