專(zhuān)利名稱(chēng)：二乙酰基二苯庚烷防治慢性髓源性白血病的藥物用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及天然藥物化學(xué)和藥理學(xué)領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明涉及3，5-二乙 ?；?l-(3-甲氧基-4,5-二羥基苯基)-7-(4-羥基-3-甲氧基苯基)庚烷及其可藥用 鹽在制備防治人慢性髓源性白血病藥物中的新醫(yī)藥用途，該化合物被發(fā)現(xiàn)對(duì) 人慢性髓源性白血病細(xì)胞株(K562)及其阿霉素耐藥株(K562/ADR)體外增 殖具有強(qiáng)效抑制作用，可以預(yù)期用于制備治療相關(guān)的人慢性髓源性白血病的 藥物用途。
背景技術(shù)：
腫瘤多藥耐藥(multidrug resistance, MDR)是指一種藥物作用于腫瘤使之 產(chǎn)生耐藥性后，對(duì)其未接觸過(guò)的、結(jié)構(gòu)無(wú)關(guān)、機(jī)制各異的多種抗腫瘤藥物也 具有交叉耐藥性；也即腫瘤細(xì)胞對(duì)結(jié)構(gòu)、細(xì)胞靶點(diǎn)和作用機(jī)理迥然不同的抗 癌藥物同時(shí)產(chǎn)生耐藥的現(xiàn)象，是腫瘤化療失敗的最主要原因之一。MDR的形 成機(jī)制非常復(fù)雜，目前研究報(bào)道顯示，MDR可能跟P-糖蛋白(PgP)、多藥耐 藥相關(guān)蛋白(MRP)、谷胱甘肽-s-轉(zhuǎn)移酶(GST)、拓?fù)洚悩?gòu)酶II (TopoII)、 蛋白激酶C (PKC)、 二氫葉酸還原酶(DHFR)和DNA損傷修復(fù)相關(guān)酶等的 表達(dá)及活性改變有關(guān)。MDR逆轉(zhuǎn)劑的使用是目前克服多藥耐藥性的一種重要 的解決途徑。故此，尋找MDR逆轉(zhuǎn)劑、探討先導(dǎo)化合物逆轉(zhuǎn)MDR和抗MDR 的機(jī)理有著重要的理論意義和實(shí)用價(jià)值。
近年來(lái)研究者發(fā)現(xiàn)了多種化學(xué)逆轉(zhuǎn)劑，如維拉帕米(VRP)、環(huán)孢菌素A
(CsA)、三苯氧胺等，但這些化學(xué)逆轉(zhuǎn)劑大都存在作用靶點(diǎn)單一，體內(nèi)應(yīng)用 可引起不同程度的不良反應(yīng)或逆轉(zhuǎn)效果不佳等問(wèn)題，從而限制了其臨床應(yīng)用。 于是國(guó)內(nèi)外有些學(xué)者轉(zhuǎn)向從中藥中尋找高效、低毒、多靶點(diǎn)的逆轉(zhuǎn)劑，并己 在白血病、肝癌、乳腺癌、口腔上皮樣癌等腫瘤對(duì)長(zhǎng)春新堿(VCR)、阿霉繁
(ADR)、柔紅霉素(DNR)、依托泊苷(VP-16)等多種化療藥物的MDR逆 轉(zhuǎn)方面取得一定的療效。因此，從中藥有效成分中發(fā)掘腫瘤MDR逆轉(zhuǎn)劑、并 對(duì)其作用機(jī)理進(jìn)行深入研究成為中藥MDR逆轉(zhuǎn)劑研究的熱點(diǎn)之一。綜上所述，從新的天然藥物來(lái)源中，利用對(duì)多藥耐藥性MDR細(xì)胞有效抑 制的藥效學(xué)模型，發(fā)現(xiàn)新的先導(dǎo)化合物，是本發(fā)明的思路。依此思路，本發(fā) 明人選擇了從姜科植物中尋找人慢性髓源性白血病MDR細(xì)胞逆轉(zhuǎn)性先導(dǎo)化 合物為新藥研發(fā)和本發(fā)明的主線(xiàn)。
人慢性髓源性白血病是中國(guó)多發(fā)和常見(jiàn)重型傳染性疾病，白血病細(xì)胞耐 藥是臨床白血病化療的難點(diǎn)之一，而白血病細(xì)胞一旦發(fā)生耐藥，細(xì)胞的許多 生物學(xué)特性發(fā)生改變，且對(duì)多種藥物交叉耐藥。人類(lèi)紅成髓細(xì)胞白血病細(xì)胞 系K562是由Lozzio等于1975年從1例處于母原細(xì)胞危象中的慢性髓系白血 病患者的胸膜滲出液中建立的，具有費(fèi)城染色體(Ph)。因其在受到多種因素 的誘導(dǎo)時(shí)，具有向紅系，單核系或巨核細(xì)胞系分化的能力，還可以借其觀察 對(duì)血紅蛋白合成量的影響，故多作為細(xì)胞分化研究的細(xì)胞模型；人K562細(xì)胞 常作為篩選人慢性髓源性白血病的重要體外培養(yǎng)細(xì)胞模型。
本發(fā)明采用國(guó)際通用準(zhǔn)則，將K562細(xì)胞與臨床治療人慢性髓源性白血病 的一線(xiàn)用藥阿霉素(ADR)共同培養(yǎng)，逐漸增加藥物濃度,最后建立耐阿霉素 的細(xì)胞K562/ADR株。以此為體外篩選模型，本發(fā)明人繼而從姜科植物等天 然藥物中尋找對(duì)人慢性髓源性白血病細(xì)胞株(K562)及其阿霉素耐藥株 (K562/ADR)體外增殖均具有抑制活性的MDR逆轉(zhuǎn)活性先導(dǎo)化合物。
姜科植物廣布于中國(guó)各地，較為著名和常用的包括生姜(Z/ g/6w o^ c/"a/e)、姜黃(Cwrcww"L.)、蓬莪術(shù)(Cwrcw附a p/zaeocaw/Zs valeton)、 溫有[5金(Cwrcw附a we"yw力'"Y.H. Chen et C. Ling)、高良姜(^// z."/a o^ c/"anwi Hance)等，主要有溫胃散寒，消食止痛，行氣破血，清心解郁，消積化瘀， 利膽退黃等功效。中藥材郁金包括溫郁金、廣西莪術(shù)、姜黃、蓬莪術(shù)等的干 燥根莖或塊根，主要用于經(jīng)閉痛經(jīng)、胸腹?jié)q痛、刺痛、熱病神昏、癲癇發(fā)狂、 黃疸尿赤等。商品有黃郁金、黑郁金、白郁金、綠郁金， 一般以黃郁金為佳。 對(duì)中毒性肝炎有保護(hù)作用，具抗真菌作用，姜黃醇和姜黃素還有顯著降血脂 作用。莪術(shù)歸肝脾經(jīng)，用于徵叚痞塊，瘀血經(jīng)閉，食積漲痛，早期宮頸癌等。 藥用抗腫瘤、抗菌、升白、抗血栓等作用。高良姜主要分布于我國(guó)南部，按 照產(chǎn)地不同分為廣東、廣西、臺(tái)灣、海南四種，歸脾、胃經(jīng)，用于脘痛冷痛、 胃寒嘔吐、噯氣吞酸等，用于治療潰瘍、心絞痛等。
生姜(Z/"g^woi ">w/e)乃未本科根莖類(lèi)植物，有辛辣味，自古以來(lái)就 被用作調(diào)味和保健用途，有養(yǎng)顏、抗衰老、活血及幫助消化作用。朱熹《論 語(yǔ)集注》中有記載姜能通神明、去欏惡。惟其生物活性的作用機(jī)理大多不詳，而生姜內(nèi)各種不同的化合物種類(lèi)繁多，各有不同作用，故分離及鑒定其
有效成份尤其是對(duì)K562及K562/ADR細(xì)胞株生長(zhǎng)具有抑制活性的MDR逆轉(zhuǎn) 活性先導(dǎo)化合物對(duì)于發(fā)展生姜等姜科植物的藥用價(jià)值實(shí)屬必要。
我們采用了MTT[3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽]法，對(duì)姜 科植物中分到的一個(gè)二苯庚垸類(lèi)化合物，即3,5-二乙?；?1-(3-甲氧基-4，5-二 羥基苯基)-7-(4-羥基-3-甲氧基苯基)庚烷針對(duì)人慢性髓源性白血病細(xì)胞株 (K562)及其阿霉素耐藥株(K562/ADR)體外增殖進(jìn)行了生長(zhǎng)抑制活性測(cè)試， 發(fā)現(xiàn)了其對(duì)K562和K562/ADR細(xì)胞體外增殖均具有抑制活性，說(shuō)明其具有 MDR逆轉(zhuǎn)活性，屬于防治阿霉素耐藥性的人慢性髓源性白血病之先導(dǎo)化合物， 從而完成本發(fā)明。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供化合物3,5-二乙?；?1-(3-甲氧基-4，5-二羥基苯 基)-7-(4-羥基-3-甲氧基苯基)庚烷及其可藥用鹽在制備防治人慢性髓源性白血 病藥物中的用途。
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本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供了一種用于防治人慢性髓源性白血病的藥物 和藥物組合物，其含有治療有效量的作為活性成分的3,5-二乙?；?1-(3-甲氧 基-4,5-二羥基苯基)-7-(4-羥基-3-甲氧基苯基)庚烷及其可藥用鹽和可藥用輔 料；根據(jù)本發(fā)明，該藥物組合物中可加入各種藥用賦形劑，添加劑及載體。
本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供了一種通過(guò)從姜科植物如生姜、郁金、莪術(shù) 中提取純化3，5-二乙?；?1-(3-甲氧基-4,5-二羥基苯基)-7-(4-羥基-3-甲氧基苯 基)庚烷的制備方法。
本發(fā)明中制備得到的酚類(lèi)二苯庚烷類(lèi)化合物3,5-二乙?；?1-(3-甲氧基 -4，5-二羥基苯基)-7-(4-羥基-3-甲氧基苯基)庚垸用制藥領(lǐng)域中的常規(guī)方法，結(jié) 合中、西藥制藥中常規(guī)的可藥用輔料，可以制成各種藥物組合物，如注射劑、 片劑、膠囊劑、氣霧劑、栓劑、膜劑、滴丸劑、外用搽劑，或控釋或緩釋劑型或納米制劑。這些藥物組合物可以用于預(yù)防或/和治療人慢性髓原細(xì)胞白血 病尤其是阿霉素耐藥性人慢性髓原細(xì)胞白血病。
本發(fā)明的3,5-二乙?；?1 -(3-甲氧基-4,5-二羥基苯基)-7-(4-羥基-3-甲氧基 苯基)庚烷或其可藥用鹽，還可以與現(xiàn)已上市或正在臨床試驗(yàn)的維拉帕朱 (VRP)、環(huán)孢菌素A(CsA)、三苯氧胺、漢防己甲素(TrD)、川芎嗪(TMP)、 苦參堿(MAT)、蝙蝠葛堿(DRC)、蝙蝠葛蘇林堿(DRS)、槲皮素(quercetin， QT)、冬凌草甲素、板藍(lán)根組酸活性單體5b、布拉他辛(bullatacin)、大黃素、 小檗胺和砒霜的有效成分As203聯(lián)合使用，制備得到具有抑制K562/ADR細(xì) 胞生長(zhǎng)活性的細(xì)胞毒類(lèi)藥物組合物，可預(yù)期用于制備治療多藥耐藥性人慢性 髓原細(xì)胞白血病的藥物。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明所涉及的酚類(lèi)二苯庚烷類(lèi)化合物3,5-二乙酰基-1-(3-甲氧基-4，5-二羥基苯基)-7-(4-羥基-3-甲氧基苯基)庚烷的提取制備方法包括由姜科植 物根莖、塊根、葉、花部位經(jīng)醇水或酮水超聲提取、大孔樹(shù)脂富集、正相和 反相硅膠柱層析精制而成。本發(fā)明的提取方法包括以下步驟
(a) 由醇水或酮水經(jīng)冷浸或超聲提取干燥并磨粉的姜科植物根莖、塊根、葉、 花部位，減壓揮干溶劑后得浸膏；
(b) 用乙醇或甲醇進(jìn)行溶解，后經(jīng)大孔樹(shù)脂柱層析，先用水洗去雜質(zhì)，然后 用醇水系統(tǒng)梯度洗脫得不同流份；根據(jù)薄層層析檢測(cè)結(jié)果，合并相同組分流 份，將含有酚類(lèi)二苯庚烷類(lèi)化合物3,5-二乙?；?1-(3-甲氧基-4，5-二羥基苯 基)_7-(4_羥基-3-甲氧基苯基)庚垸的組分再分別用硅膠柱層析，以有機(jī)混合 溶劑系統(tǒng)梯度洗脫，經(jīng)過(guò)薄層層析檢測(cè)，合并含有相同成分的流份，再用反 相硅膠RP-ds柱層析精制，以甲醇-水溶劑系統(tǒng)洗脫，經(jīng)丙酮重結(jié)晶得到酚類(lèi) 二苯庚垸類(lèi)化合物3,5-二乙?；?l-(3-甲氧基-4,5-二羥基苯基)-7-(4-羥基 _3-甲氧基苯基)庚烷。
本發(fā)明中的制備方法中，步驟(a)中的醇可以是甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、 乙二醇、碳鏈小于32烷醇、碳鏈小于32烯醇及苯酚等或它們的混合物，優(yōu) 選乙醇。醇水混合溶劑可以是醇和水不同比例混合的溶劑，優(yōu)選乙醇和水的 混合溶劑。步驟(a)中的酮可以是丙酮、丁酮或其它小于6個(gè)碳的酮、優(yōu)選丙 酮。酮水混合溶劑可以是酮和水不同比例混合的溶劑，優(yōu)選丙酮和水的混合 溶劑。酚類(lèi)二苯庚烷類(lèi)化合物3，5-二乙?；?1-(3-甲氧基-4，5-二羥基苯 基)-7- (4-羥基-3-甲氧基苯基)庚烷主要來(lái)源于姜科植物的各個(gè)部位，優(yōu)選從 生姜、郁金、莪術(shù)的根莖、塊根、葉、花，包括其干品和鮮品中制備而得。
本發(fā)明的特點(diǎn)是，從生姜、郁金、莪術(shù)中分離純化得到的酚類(lèi)二苯庚烷 類(lèi)化合物3，5-二乙?；?1-(3-甲氧基-4,5-二羥基苯基)-7-(4-羥基-3-甲氧基 苯基)庚垸不僅對(duì)K562細(xì)胞的生長(zhǎng)具有較為明確的抑制作用，而且對(duì)阿霉素 耐藥株K562/ADR細(xì)胞的生長(zhǎng)也具有較為明確的抑制作用，說(shuō)明該化合物有 望發(fā)展為細(xì)胞毒類(lèi)治療人慢性髓原細(xì)胞白血病尤其是阿霉素耐藥性人慢性髓 原細(xì)胞白血病的藥物。
下面通過(guò)實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明。實(shí)施例給出了 3,5-二乙?；?1-(3-甲 氧基-4，5-二羥基苯基)-7-(4-羥基-3-甲氧基苯基)庚垸的分離制備和純化方法及 其相關(guān)結(jié)構(gòu)鑒定的數(shù)據(jù)。必須說(shuō)明，實(shí)施例中所述的分離純化方法以及化合 物來(lái)源是用于對(duì)本發(fā)明的說(shuō)明而不是對(duì)本發(fā)明的限制。
實(shí)施例還給出了化合物3，5-二乙?；?1-(3-甲氧基-4,5-二羥基苯萄-7-(4-羥基-3-甲氧基苯基)庚烷對(duì)人慢性髓源性白血病細(xì)胞株(K562)體外增殖的邦 制作用實(shí)驗(yàn)和對(duì)人慢性髓源性白血病細(xì)胞株阿霉素耐藥株(K562/ADR)體外 增殖的抑制作用實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以說(shuō)明其在防治人慢性髓源性白血病藥物開(kāi)發(fā)領(lǐng) 域中的用途。實(shí)施例給出了化合物的部分活性數(shù)據(jù)。同樣必須說(shuō)明，本發(fā)明 的這些藥理相關(guān)實(shí)施例仍是用于說(shuō)明本發(fā)明而不是對(duì)本發(fā)明的限制。根據(jù)本 發(fā)明的實(shí)質(zhì)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行的簡(jiǎn)單改進(jìn)都屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
實(shí)施例1:生姜中3，5-二乙酰基-1-(3-甲氧基-4,5-二羥基苯基)-7-(4-羥基-3-甲氧 基苯基)庚烷的分離制備和純化方法
生姜原生藥采自云南省羅平縣，生藥標(biāo)本由昆明醫(yī)學(xué)院張榮平教授鑒定。 干燥的生姜根莖(5.5公斤)磨粉后用10倍量95%乙醇浸泡，用超聲提取， 每次3小時(shí)。減壓揮干溶劑后用大孔樹(shù)脂柱層析，用乙醇一水(0:100—100:0) 梯度洗脫，根據(jù)薄層層析檢測(cè)結(jié)果，合并相同組分流份。收集乙醇-水(65:35) 洗脫流份，減壓蒸除溶劑，得褐色固體物3.3克。再分別用硅膠(200-300目， 200克)柱層析，以石油醚-乙酸乙酯(5:1-1:2)溶劑系統(tǒng)梯度洗脫。經(jīng)過(guò)薄 層層析檢測(cè)，合并含有相同成分的流份。再用反相硅膠RP-Ci8 (100克)柱層 析精制，以甲醇-水溶劑系統(tǒng)(0:100-100:0)洗脫，收取60:40洗脫流份，減壓蒸除溶劑，丙酮重結(jié)晶得黃色固體物23毫克。
3,5-二乙?；?1-(3-甲氧基-4,5-二羥基苯基)-7-(4-羥基-3-甲氧基苯基)庚 烷黃色固體物；質(zhì)譜EIMS (%): 476 (M", 38), 432 (2), 356 (5)， 219 (8)， 203 (9), 179 (8), 163 (17), 153 (65), 137 (100);核磁共振氫譜'HNMR(400MHz，気代氯 仿):<5 6.80 (1H, (!， /= 8.0 Hz， H-5")， 6.66 (1H， d， /= 1.6 Hz， H-2"), 6.62 (1H, dd /= 1.6， 8.0 Hz， H-6")， 6.36 (1H, br s, H曙2')， 6.26 (1H， br s， H-6')， 4.97 (2H， m， H-_ and 5)， 3.84 (s, OMe)， 3.82 (s， OMe), 2.47—2.52 (4H， m, H-l and 7)， 2.00 (6H, s， OAc)， 1.75—1.90 (6H， m， H-2,4 and 6)。 核磁共振碳譜13C NMR (lOOMHz，氖 代氯仿)(5 170.8 (3， 5-OAc)， 146.8 (C-3')， 146,3 (C匿3")， 143.8 (C畫(huà)5')， 143.7 (C-4")， 133.2 (C-l〃 )， 133.1 (C-l')， 130.5 (C-4')， 120.7 (C-6")， 114.2 (C國(guó)5"), 110,9 (C醒2"), 108.4 (C-2'), 103.2 (C國(guó)6'), 69.8 (C國(guó)3， 5)， 56.1 (3'誦OMe ), 55.9 (3"畫(huà)OMe)， 38.51 (C隱4), 36.62 (C-2)， 36.48 (C-6)， 31.20 (C-7), 31.43 (C隱l)。與文獻(xiàn)報(bào)道數(shù)據(jù) (Jianping Ma， Xiaoling Jin, Li Yang， Zhong-Li Liu,尸一oc/ em/s^7, 2004年，65 巻，1137-1143頁(yè))基本相符。
實(shí)施例2:溫郁金中3,5-二乙?；?1-(3-甲氧基-4，5-二羥基苯基)-7-(4-羥基-3-
甲氧基苯基)庚垸的分離制備和純化方法
溫郁金根莖采自浙江省瑞安南部，生藥由溫州醫(yī)學(xué)院黃可新教授鑒定。 干燥的溫郁金根莖(6.0公斤)磨粉后用10倍量95%乙醇浸泡，用超聲 提取，每次3小時(shí)。減壓揮干溶劑后用大孔樹(shù)脂柱層析，用乙醇-水(0:100-100:0)梯度洗脫，根據(jù)薄層層析檢測(cè)結(jié)果，合并相同組分流份。收集乙醇-水(65:35)洗脫流份，減壓蒸除溶劑，得褐色固體物5.1克。再分別用硅膠 (200-300目，200克)柱層析，以石油醚-乙酸乙酯(5:1-1:2)溶劑系統(tǒng)梯 度洗脫。經(jīng)過(guò)薄層層析檢測(cè)，合并含有相同成分的流份。再用反相硅膠RP-ds (100克)柱層析精制，以甲醇-水溶劑系統(tǒng)(0:100-100:0)洗脫，留取60:40 洗脫流份，減壓蒸除溶劑，丙酮重結(jié)晶得黃色固體物ll毫克。
3,5-二乙酰基-1-(3-甲氧基-4，5-二羥基苯基)-7-(4-羥基-3-甲氧基苯基)庚 垸黃色固體物；質(zhì)譜以及核磁共振波譜同實(shí)施例l。
實(shí)施例3:溫莪術(shù)全草中3，5-二乙?；?1-(3-甲氧基-4，5-二羥基苯基)-7-(4-羥基 -3-甲氧基苯基)庚垸的分離制備和純化方法
溫莪術(shù)全草采自浙江省瑞安南部，生藥由溫州醫(yī)學(xué)院黃可新教授鑒定。干燥的莪術(shù)全草(5.0公斤)磨粉后用10倍量95%乙醇浸泡，用超聲提 取，每次3小時(shí)。減壓揮干溶劑后用大孔樹(shù)脂柱層析，用乙醇-水(0:100-100:0) 梯度洗脫，根據(jù)薄層層析檢測(cè)結(jié)果，合并相同組分流份。收集乙醇-水(65:35) 洗脫流份，減壓蒸除溶劑，得褐色固體物4.5克。再分別用硅膠(200-300目， 200克)柱層析，以石油醚-乙酸乙酯(5:1-1:2)溶劑系統(tǒng)梯度洗脫。經(jīng)過(guò)薄 層層析檢測(cè)，合并含有相同成分的流份。再用反相硅膠RP-ds (100克)柱層 析精制，以甲醇-水溶劑系統(tǒng)(0:100-100:0)洗脫，收取60:40洗脫流份，減 壓蒸除溶劑，丙酮重結(jié)晶得黃色固體物12毫克。
3，5-二乙?；?1-(3-甲氧基-4,5-二羥基苯基)-7-(4-羥基-3-甲氧基苯基)庚 垸黃色固體物；質(zhì)譜以及核磁共振波譜同實(shí)施例1。
^Mli:3，5-二乙酰基-l-(3-甲氧基-4，5-二羥基苯基)-7-(4-羥基-3-甲氧基苯基) 庚烷對(duì)人慢性髓源性白血病細(xì)胞株(K562)體外增殖的抑制作用實(shí)驗(yàn) 4.1細(xì)胞培養(yǎng)
人慢性髓源性白血病(K562)細(xì)胞購(gòu)自中科院上海細(xì)胞所，用RPMI 1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)基中含10%小牛血清，100U/毫升青霉素和100U/毫升鏈 霉素。細(xì)胞以每孔5乂104個(gè)密度接種到96孔板中，在37匸，5%002潮濕空 氣的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)。
4.2細(xì)胞存活率的測(cè)定方法用改良MTT法
細(xì)胞經(jīng)24小時(shí)的孵育后，分別將新配的化合物3，5-二乙?；?1-(3-甲氧基 -4，5-二羥基苯基)-7-(4-羥基-3-甲氧基苯基)庚垸的二甲亞砜溶液以濃度梯度加 入到各孔中，使孔中該化合物的最終濃度分別為100微克/毫升、50微克/毫升、 25微克/毫升、5微克/毫升。72小時(shí)后，加入10微升MTT (5毫克/毫升)的 生理鹽水溶液，再繼續(xù)在37r, 5%<:02潮濕空氣的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3小時(shí)，每 孔中加入150微升二甲亞砜，振蕩溶解生成的MTT晶體甲臜(formazan),并 用酶標(biāo)儀在570nm波長(zhǎng)下比色，細(xì)胞存活率由樣品光密度(OD)值對(duì)于對(duì)照 OD值的比值計(jì)算。其中該化合物對(duì)K562細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC5Q)由劑 量效應(yīng)曲線(xiàn)得到。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示化合物3，5-二乙酰基-1-(3-甲氧基-4，5-二羥基苯萄-7-(4-羥 基-3-甲氧基苯基)庚烷對(duì)K562細(xì)胞生長(zhǎng)抑制的的ICso值為34.9 ± 0.6 mM。本 試驗(yàn)以抗腫瘤一線(xiàn)用藥順鉑(DDP)作為陽(yáng)性對(duì)照，陽(yáng)性對(duì)照藥物順鉬對(duì)K562細(xì)胞的ICso為12.9 ± 0.8 ^M;本試驗(yàn)又以抗白血病腫瘤一線(xiàn)用藥阿霉素作為 陽(yáng)性對(duì)照，陽(yáng)性對(duì)照藥物阿霉素對(duì)K562細(xì)胞的IC5。為0.07 ± 0.05 ^M。
4.3結(jié)果說(shuō)明
化合物3，5-二乙?；?1-(3-甲氧基-4，5-二羥基苯基)-7-(4-羥基-3-甲氧基苯 基)庚垸對(duì)K562細(xì)胞的生長(zhǎng)具有較為明確的抑制作用，說(shuō)明該化合物有望發(fā) 展為細(xì)胞毒類(lèi)治療人慢性髓源性白血病的藥物。
實(shí)施例5: 3，5-二乙?；?1-(3-甲氧基-4，5-二羥基苯基)-7-(4-羥基-3-甲氧基苯基) 庚垸對(duì)人慢性髓源性白血病細(xì)胞阿霉素耐藥株(K562/ADR)體外增殖的抑制 作用實(shí)驗(yàn)
5.1人慢性髓源性白血病阿霉素耐藥株(K562/ADR)細(xì)胞株的建立
人慢性髓源性白血病(K562)細(xì)胞用RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)基中
含5%小牛血清，加入0.1毫克/升阿霉素，然后每?jī)芍芤淮沃饾u增加阿霉素
的濃度，直至阿霉素終濃度為1.0毫克/升。觀察細(xì)胞穩(wěn)定后開(kāi)始試驗(yàn)。
將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞以每孔5乂104個(gè)密度接種到96孔板中，在37'C， 5%
C02潮濕空氣的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)。
5.2用改良MTT法測(cè)定陽(yáng)性藥物順鉑以及阿霉素對(duì)K562/ADR細(xì)胞生長(zhǎng)抑制 作用
細(xì)胞經(jīng)24小時(shí)的孵育后，分別將新配的陽(yáng)性對(duì)照藥物順鉑和陽(yáng)性對(duì)照藥 物阿霉素溶液以濃度梯度加入到各孔中，使孔中該化合物的最終濃度分別為 60微克/毫升、20微克/毫升、6.66微克/毫升、2.22微克/毫升。72小時(shí)后， 加入10微升MTT (5毫克/毫升)的生理鹽水溶液，再繼續(xù)在37。C， 5%C02 潮濕空氣的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3小時(shí)，每孔中加入150微升二甲亞砜，振蕩溶解 甲臜(formazan),用酶標(biāo)儀在570nm波長(zhǎng)下比色，細(xì)胞存活率由樣品OD值 對(duì)于對(duì)照OD值的比值計(jì)算。試驗(yàn)平行進(jìn)行三次，細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC50) 值由劑量效應(yīng)曲線(xiàn)得到。
試驗(yàn)結(jié)果如下陽(yáng)性對(duì)照藥物順鉑對(duì)K562/ADR細(xì)胞的IC5Q為14.6 ± 0.9 |iM，陽(yáng)性對(duì)照藥物阿霉素對(duì)K562/ADR細(xì)胞的IC5()為36.6 ± 5.2 pM。
5.3用改良MTT法測(cè)定化合物3，5-二乙?；?1-(3-甲氧基-4，5-二羥基苯基)-7-(4-羥基-3-甲氧基苯基)庚垸對(duì)K562/ADR細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用
本改良MTT試驗(yàn)具體步驟同5.2?；衔?,5-二乙酰基-1-(3-甲氧基-4，5-二羥基苯基)-7-(4-羥基-3-甲氧基苯基)庚垸的二甲亞砜溶液以濃度梯度加入到 各孔中，使孔中該化合物的最終濃度分別為20微克/毫升、10微克/毫升、5 微克/毫升、l微克/毫升。72小時(shí)后，加入10微升MTT (5毫克/毫升)的生 理鹽水溶液，再繼續(xù)在37匸，5XCCV潮濕空氣的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3小時(shí)，每孔 中加入150微升二甲亞砜，振蕩溶解生成的MTT晶體甲臜(foraiazan),所形 成的甲臜用酶標(biāo)儀在570nm波長(zhǎng)下比色，細(xì)胞存活率由樣品OD值對(duì)于對(duì)照 OD值的比值計(jì)算。試驗(yàn)平行進(jìn)行三次，其中該化合物對(duì)K562/ADR細(xì)胞的半 數(shù)抑制濃度(IC5())值由劑量效應(yīng)曲線(xiàn)得到。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示化合物3，5-二乙?；?l-(3-甲氧基-4，5-二羥基苯基)-7-(4-羥 基-3-甲氧基苯基)庚烷對(duì)K562/ADR細(xì)胞的IC5o為50.6 ± 23.5 pM。
5.4結(jié)果說(shuō)明-
根據(jù)以上試驗(yàn)結(jié)果，陽(yáng)性藥物阿霉素和順鉬對(duì)K562和K562/ADR細(xì)胞生 長(zhǎng)抑制強(qiáng)度的不同表現(xiàn)說(shuō)明了細(xì)胞對(duì)不同藥物敏感性不同。阿霉素對(duì)K562和 K562/ADR的K^值相差甚大(其ICso分別為0.07 ± 0.05 pM和36.6 ± 5.2 ^M) ， K562/ADR對(duì)ADR的耐受大約為其對(duì)K562細(xì)胞敏感株的520倍，說(shuō) 明人慢性髓源性白血病阿霉素耐藥株(K562/ADR)細(xì)胞株的建立是成功的。
化合物3,5-二乙?；?1 -(3-甲氧基-4，5-二羥基苯基)-7-(4-羥基-3-甲氧基苯 基)庚垸不僅對(duì)K562細(xì)胞的生長(zhǎng)具有較為明確的抑制作用(IC5o為34.9 ± 0.6 pM)，而且對(duì)阿霉素耐藥株K562/ADR細(xì)胞的生長(zhǎng)也具有較為明確的抑制作 用(IC5。為50.6 ± 23.5 pM)，說(shuō)明阿霉素耐藥株K562/ADR細(xì)胞對(duì)此化合物 也十分敏感，該化合物有望發(fā)展為細(xì)胞毒類(lèi)治療人慢性髓源性白血病尤其是 阿霉素耐藥性人慢性髓源性白血病的藥物。
在上述說(shuō)明書(shū)闡述本發(fā)明時(shí)，同時(shí)提供了實(shí)施例的目的是舉例說(shuō)明本發(fā) 明的實(shí)際操作過(guò)程和本發(fā)明的意義。在進(jìn)入本發(fā)明權(quán)利要求和其等同物范圍 內(nèi)時(shí)，本發(fā)明的實(shí)際應(yīng)用包括所有一般變化、配合，或改進(jìn)。
權(quán)利要求
1.3，5-二乙酰基-1-(3-甲氧基-4，5-二羥基苯基)-7-(4-羥基-3-甲氧基苯基)庚烷及其可藥用鹽在制備防治人慢性髓源性白血病藥物中的用途。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述之用途，其中人慢性髓源性白血病是指非腫瘤多藥耐 藥型人慢性髓源性白血病和腫----------瘤多藥耐藥型人慢性髓源性白血病。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1和2所述之用途，其特征在于3,5-二乙?；?1-(3-甲氧基-4,5-二羥基苯基)-7-(4-羥基-3-甲氧基苯基)庚烷及其可藥用鹽對(duì)于非腫瘤多藥耐藥 型人慢性髓源性白血病的防治功能是通過(guò)對(duì)非腫瘤多藥耐藥型人慢性髓源性 白血病細(xì)胞K562的生長(zhǎng)抑制作用得以實(shí)現(xiàn)。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1和2所述之用途，其特征在于3,5-二乙?；?1-(3-甲氧基-4，5-二羥基苯基)-7-(4-羥基-3-甲氧基苯基)庚垸及其可藥用鹽對(duì)于腫瘤多藥耐藥型 人慢性髓源性白血病的防治功能是通過(guò)對(duì)以K562/ADR細(xì)胞株為例的腫瘤多 藥耐藥型人慢性髓源性白血病細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用得以實(shí)現(xiàn)。
5. —種用于防治人慢性髓源性白血病的藥物組合物，其含有治療有效量的仆 為活性成分的3,5-二乙?；?1-(3-甲氧基-4,5-二羥基苯基)-7-(4-羥基-3-甲氧基 苯基)庚烷及其可藥用鹽和可藥用輔料；此處人慢性髓源性白血病是指非腫瘤 多藥耐藥型人慢性髓源性白血病和腫瘤多藥耐藥型人慢性髓源性白血病。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1、 5所述的藥物或藥物組合物，其劑型是注射劑、片劑、 膠囊劑、氣霧劑、栓劑、膜劑、滴丸劑、外用搽劑，或控釋或緩釋劑型或納 米制劑。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的3，5-二乙?；?1-(3-甲氧基-4,5-二羥基苯基)-7-(4-羥 基-3-甲氧基苯基)庚烷，其特征為該化合物由姜科植物的各個(gè)部位提取分離純 化得到。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述之3，5-二乙?；?1-(3-甲氧基-4,5-二羥基苯基)-7-(4-羥基-3-甲氧基苯基)庚烷的制備，其特征為姜科植物選自生姜、高良姜、溫郁金、 蓬莪術(shù)、廣西莪術(shù)、姜黃中的一種或多種，提取部位是植物的根莖、塊根、 葉、花中的一種或多種。
全文摘要
本發(fā)明涉及二乙酰基二苯庚烷防治慢性髓源性白血病的藥物用途，具體而言，本發(fā)明涉及3，5-二乙?；?1-(3-甲氧基-4，5-二羥基苯基)-7-(4-羥基-3-甲氧基苯基)庚烷及其可藥用鹽在制備防治慢性髓源性白血病的醫(yī)藥用途，該化合物主要從生姜、溫郁金、莪術(shù)等姜科植物中提取而得。經(jīng)藥理實(shí)驗(yàn)證明，該化合物對(duì)人慢性髓源性白血病細(xì)胞株(K562)及其阿霉素耐藥株(K562/ADR)體外增殖均有強(qiáng)效抑制作用，其IC₅₀值分別為34.9±0.6和50.6±23.5μM。
文檔編號(hào)C07C67/00GK101292974SQ200810062550
公開(kāi)日2008年10月29日 申請(qǐng)日期2008年6月24日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月24日
發(fā)明者于榮敏, 宋麗艷, 巫秀美, 李校堃, 楊雷香, 佳 瞿, 昱 趙, 黃可新 申請(qǐng)人:溫州醫(yī)學(xué)院