專利名稱：家蠶生產(chǎn)重組犬α干擾素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及DNA重組技術(shù)、蛋白質(zhì)的純化與活性分析，尤其涉及一種家蠶 生產(chǎn)重組犬a(chǎn)干擾素的方法。
背景技術(shù)：
干擾素(Interferon， IFN)是由脊椎動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)生的一類分泌型糖蛋白，它具 有廣譜抗病毒和增強(qiáng)免疫應(yīng)答的作用，其主要活性是抗病毒。犬的a干擾素全基 因?yàn)?61個(gè)堿基，編碼187個(gè)氨基酸，其中前23個(gè)氨基酸為信號(hào)肽，后164個(gè)氨基 酸為成熟蛋白，蛋白分子量約為19kDa。 Hiummler等于1987年首先開始了犬a(chǎn)干 擾素基因的研究。報(bào)道了犬a(chǎn)干擾素基因序列并專利控制了該基因的使用，而國(guó) 內(nèi)這方面研究較少。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種家蠶生產(chǎn)重組犬a(chǎn)干擾素的方法。利用基因工程 表達(dá)技術(shù)，構(gòu)建含有犬a(chǎn)干擾素基因的重組病毒，并利用家蠶作為宿主，表達(dá)生 產(chǎn)具有生物活性的重組犬a(chǎn)干擾素。
為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案其步驟如下
1、 一種家蠶生產(chǎn)重組犬a(chǎn)干擾素的方法
(1) a干擾素基因的克隆以浙江省當(dāng)?shù)丶胰难?xì)胞抽提的基因組DNA為 模板，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增得到犬a(chǎn)干擾素基因；引物設(shè)計(jì)如下正向引物
5 ，ggatcctgccacctgcccgac3 ，，含有5amHI酶切位點(diǎn)，反向引物5 ，aagctttcatttcctcctcct g3，,含有/^mini酶切位點(diǎn)；PCR反應(yīng)的循環(huán)數(shù)、溫度和時(shí)間的設(shè)計(jì)如下 一個(gè) 循環(huán)，94。C模板變性3分鐘；以下30個(gè)循環(huán)，94°C變性50秒，55°C退火30 秒，72。C延伸2分鐘；最后1個(gè)循環(huán)，72。C延伸10分鐘；利用1%瓊脂糖凝 膠電泳進(jìn)行PCR產(chǎn)物分析，并用0/agwe的PCR純化試劑盒純化，隨后將目的 PCR產(chǎn)物克隆進(jìn)/"vz7wge"公司的TA克隆3.9kb的載體pCR2.1 ，利用雙脫氧鏈 終止法在核苷酸測(cè)序儀上測(cè)序確認(rèn)克隆a干擾素基因順序正確性，并已登錄國(guó) 際基因數(shù)據(jù)庫GenBank,登錄號(hào)DQ520882;
(2) 含有犬a(chǎn)干擾素基因的重組桿狀病毒的構(gòu)建用限制性內(nèi)切酶B"mffl 和/^2din消化pCR2.1-a干擾素得到a干擾素基因片段，然后克隆入然后克隆 入美國(guó)Invitrogene公司的桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pBlueBacHisA;將此重組的轉(zhuǎn)移載
體與家蠶野生型核型多角體病毒BmNPV DNA共轉(zhuǎn)染入家蠶培養(yǎng)細(xì)胞，通過同 源重組產(chǎn)生重組病毒，具體的方法為在聚苯乙烯錐形管中加入1昭轉(zhuǎn)移載體 DNA和15嗎家蠶BmNPV DNA，混勻，并加入14 pl脂質(zhì)體lipofectin，最后 加入滅菌蒸餾水至終體積40 將該混合物在室溫培育15分鐘后共轉(zhuǎn)染對(duì)數(shù) 生長(zhǎng)期的Sf 21培養(yǎng)細(xì)胞；用無血清的TC-100培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時(shí)后，換成含有 10%胎牛血清的新鮮培養(yǎng)基，27'C培養(yǎng)5天，收集培養(yǎng)基上清作為病毒儲(chǔ)存原 液，用來篩選重組病毒。重組病毒通過幾輪空斑篩選，最終獲得高濃度純化的 病毒溶液，濃度為108pfb/ml。申請(qǐng)人將此重組病毒命名為含有犬a(chǎn)干擾素基因 的家蠶重組病毒；
(3)家蠶體內(nèi)表達(dá)和重組a干擾素純化使用家蠶幼蟲5齡起蠶，接種上述 重組病毒進(jìn)行感染表達(dá)；接種前，將幼蟲浸在冰水浴中麻醉10分鐘,注射用病毒 懸浮液濃度為106 pfU/ml，采用皮下注射的方法，每條家蠶注射20 pl，注射1小 時(shí)后給桑，在23-25。C下飼養(yǎng)；感染后的三天內(nèi)，看不到明顯的癥狀，到第四天， 幼蟲開始食欲減弱，漸漸地呈現(xiàn)出感染癥狀;感染后地五天或第六天，感染的幼 蟲大部分死亡，在此之前收集家蠶幼蟲；
將幼蟲的血淋巴作為重組犬a(chǎn)干擾素純化的起始材料，使用以下方法收集血 淋巴在15ml收集管的上方，將幼蟲向背面彎曲，用一只手固定幼蟲的頭部 和尾部，讓腹部和腹足伸向外邊并用25號(hào)針頭刺破腹足收集血液，讓血液直接 滴進(jìn)收集管中，為了防止血液氧化變黑，預(yù)先加入1/10體積的10mmol/L 二硫蘇 糖醇DTT，使其終濃度為1 mmol/L;
由于重組蛋白N-末端帶有6XHis尾巴，可以用Ni-NTA親和柱在非變性條 件下進(jìn)行蛋白純化；從感染的幼蟲收集的血淋巴用非變性結(jié)合緩沖液，Na3P04 50mmol/L， NaCl 0.5mol/L， pH8.0，進(jìn)行稀釋;樣品隨后結(jié)合于Ni-NTA柱,最后， 重組蛋白用含有250mmol/L咪唑的非變性洗脫緩沖液洗脫,通過SDS-PAGE考馬 斯亮藍(lán)染色后鑒定重組蛋白；
(4虔組a干擾素活性分析鑒定將純化的、倍比稀釋的重組a干擾素添加到 犬腎細(xì)胞(MDCK)單層培養(yǎng)細(xì)胞，作用18h，然后加入VSV病毒，同時(shí)設(shè)置陰性 對(duì)照組,24h后觀察細(xì)胞病變結(jié)果。根據(jù)結(jié)果分析判斷重組犬a(chǎn)干擾素的抗病毒活 性。
本發(fā)明與背景技術(shù)相比，具有的有益效果是
本發(fā)明較好地解決了 (x干擾素在大腸桿菌中表達(dá)需要復(fù)雜的復(fù)性操作、酵 母表達(dá)中質(zhì)粒轉(zhuǎn)化體不穩(wěn)定和在哺乳動(dòng)物培養(yǎng)細(xì)胞生產(chǎn)的成本太高的缺點(diǎn)，家 蠶幼蟲表達(dá)重組犬a(chǎn)干擾素具有較高的生物活性，且大部分被分泌進(jìn)血淋巴中， 非常有利于蛋白質(zhì)的快速提取。重組a干擾素可以大量生產(chǎn)為犬a(chǎn)干擾素在醫(yī) 學(xué)上的應(yīng)用開辟前景。
具體實(shí)施例方式
近年來，養(yǎng)犬業(yè)在我國(guó)發(fā)展迅速，犬作為寵物飼養(yǎng)已成為人們生活的一部 分，而病毒病卻嚴(yán)重危害著犬的健康和生存。為了研制和開發(fā)犬重組干擾素生 物制劑，本申請(qǐng)對(duì)a干擾素基因進(jìn)行了克隆.測(cè)序，并建立了利用我國(guó)的特色資 源昆蟲家蠶表達(dá)重組犬a(chǎn)干擾素的技術(shù)，為重組犬a(chǎn)干擾素的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
1、 材料DNA抽提試劑盒購(gòu)于^'agewe。 DNA處理和PCR擴(kuò)增試劑盒購(gòu) 于ra^ra (Kyoto, Japan)。 TA克隆試齊!j盒、桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體 pBlueBacHisA、 lipofectin和Ni-NTA樹脂均為美國(guó)/"v/Zroge"公司產(chǎn)品。DNA 測(cè)序試劑盒購(gòu)于尸五v4/^/!'^/歷o矽他ww 。胎牛血清FCS、家蠶BmN細(xì)胞培養(yǎng)基 TC-100均為的產(chǎn)品。本試驗(yàn)使用家蠶雜交種，品種名稱為秋豐x白玉， 家蠶幼蟲桑葉飼養(yǎng)，溫度為23 25t:。
2、 工作流程
一種家蠶生產(chǎn)重組犬a(chǎn)干擾素的方法
(1) a干擾素基因的克隆以浙江省當(dāng)?shù)丶胰难?xì)胞抽提的基因組DNA為
模板，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增得到犬(X干擾素基因；引物設(shè)計(jì)如下正向引物
5 ，ggatcctgccacctgcccgac3 ，，含有5a附HI酶切位點(diǎn)，反向引物5 ，aagctttcatttcctcctcct §3',含有///"(1111酶切位點(diǎn)；PCR反應(yīng)的循環(huán)數(shù)、溫度和時(shí)間的設(shè)計(jì)如下 一個(gè) 循環(huán)，94。C模板變性3分鐘；以下30個(gè)循環(huán)，94°C變性50秒，55。C退火30 秒，72。C延伸2分鐘；最后1個(gè)循環(huán)，72。C延伸10分鐘；利用1%瓊脂糖凝 膠電泳進(jìn)行PCR產(chǎn)物分析，并用0'agewe的PCR純化試劑盒純化，隨后將目的 PCR產(chǎn)物克隆進(jìn)/"v!>0gew公司的TA克隆3.9kb的載體pCR2.1 ，利用雙脫氧鏈 終止法在核苷酸測(cè)序儀上測(cè)序確認(rèn)克隆a干擾素基因順序正確性，并已登錄國(guó) 際基因數(shù)據(jù)庫GenBank，登錄號(hào)DQ520882;
(2) 含有犬(X干擾素基因的重組桿狀病毒的構(gòu)建用限制性內(nèi)切酶^W2HI 和///"dill消化pCR2.1-a干擾素得到a干擾素基因片段，然后克隆入然后克隆 入美國(guó)Invitrogene公司的桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pBlueBacHisA;將此重組的轉(zhuǎn)移載 體與家蠶野生型核型多角體病毒BmNPV DNA共轉(zhuǎn)染入家蠶培養(yǎng)細(xì)胞，通過同 源重組產(chǎn)生重組病毒，具體的方法為在聚苯乙烯錐形管中加入1嗎轉(zhuǎn)移載體 DNA和15jxg家蠶BmNPV DNA，混勻，并加入14 脂質(zhì)體lipofectin，最后
加入滅菌蒸餾水至終體積40 將該混合物在室溫培育15分鐘后共轉(zhuǎn)染對(duì)數(shù) 生長(zhǎng)期的Sf 21培養(yǎng)細(xì)胞；用無血清的TC-100培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時(shí)后，換成含有 10%胎牛血清的新鮮培養(yǎng)基，27。C培養(yǎng)5天，收集培養(yǎng)基上清作為病毒儲(chǔ)存原 液，用來篩選重組病毒。重組病毒通過幾輪空斑篩選，最終獲得高濃度純化的 病毒溶液，濃度為108pfii/ml。申請(qǐng)人將此重組病毒命名為含有犬ct干擾素基因 的家蠶重組病毒；
(3) 家蠶體內(nèi)表達(dá)和重組a干擾素純化使用家蠶幼蟲5齡起蠶，接種上述 重組病毒進(jìn)行感染表達(dá)；接種前，將幼蟲浸在冰水浴中麻醉10分鐘，注射用病毒 懸浮液濃度為106 pfli/ml，采用皮下注射的方法，每條家蠶注射20 pl,注射1小 時(shí)后給桑，在23-25。C下飼養(yǎng)；感染后的三天內(nèi)，看不到明顯的癥狀,到第四天， 幼蟲開始食欲減弱，漸漸地呈現(xiàn)出感染癥狀；感染后地五天或第六天，感染的幼 蟲大部分死亡，在此之前收集家蠶幼蟲；
將幼蟲的血淋巴作為重組犬a(chǎn)干擾素純化的起始材料,使用以下方法收集血 淋巴在15ml收集管的上方，將幼蟲向背面彎曲，用一只手固定幼蟲的頭部 和尾部，讓腹部和腹足伸向外邊并用25號(hào)針頭刺破腹足收集血液，讓血液直接 滴進(jìn)收集管中,為了防止血液氧化變黑，預(yù)先加入1/10體積的10mmol/L 二硫蘇 糖醇DTT，使其終濃度為1 mmol/L;
由于重組蛋白N-末端帶有6XHis尾巴，可以用Ni-NTA親和柱在非變性條 件下進(jìn)行蛋白純化；從感染的幼蟲收集的血淋巴用非變性結(jié)合緩沖液，Na3P04 50mmol/L， NaCl 0.5mol/L， pH8.0，進(jìn)行稀釋;樣品隨后結(jié)合于Ni-NTA柱,最后， 重組蛋白用含有250mmol/L咪唑的非變性洗脫緩沖液洗脫,通過SDS-PAGE考馬 斯亮藍(lán)染色后鑒定重組蛋白；
(4) 重組a干擾素活性分析鑒定將純化的、倍比稀釋的重組oi干擾素添加到 犬腎細(xì)胞(MDCK)單層培養(yǎng)細(xì)胞，作用18h，然后加入VSV病毒，同時(shí)設(shè)置陰性 對(duì)照組,24h后觀察細(xì)胞病變結(jié)果。根據(jù)結(jié)果分析判斷重組犬a(chǎn)干擾素的抗病毒活 性。
權(quán)利要求
1、一種家蠶生產(chǎn)重組犬α干擾素的方法，其特征在于(1)α干擾素基因的克隆以浙江省當(dāng)?shù)丶胰难?xì)胞抽提的基因組DNA為模板，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增得到犬α干擾素基因；引物設(shè)計(jì)如下正向引物5’ggatcctgccacctgcccgac3’，含有BamHI酶切位點(diǎn)，反向引物5’aagctttcatttcctcctcctg3’，含有HindIII酶切位點(diǎn)；PCR反應(yīng)的循環(huán)數(shù)、溫度和時(shí)間的設(shè)計(jì)如下一個(gè)循環(huán)，94℃模板變性3分鐘；以下30個(gè)循環(huán)，94℃變性50秒，55℃退火30秒，72℃延伸2分鐘；最后1個(gè)循環(huán)，72℃延伸10分鐘；利用1％瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行PCR產(chǎn)物分析，并用Qiagene的PCR純化試劑盒純化，隨后將目的PCR產(chǎn)物克隆進(jìn)Invitrogen公司的TA克隆3.9kb的載體pCR2.1，利用雙脫氧鏈終止法在核苷酸測(cè)序儀上測(cè)序確認(rèn)克隆α干擾素基因順序正確性，并已登錄國(guó)際基因數(shù)據(jù)庫GenBank，登錄號(hào)DQ520882；(2)含有犬α干擾素基因的重組桿狀病毒的構(gòu)建用限制性內(nèi)切酶BamHI和HindIII消化pCR2.1-α干擾素得到α干擾素基因片段，然后克隆入然后克隆入美國(guó)Invitrogene公司的桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pBlueBacHisA；將此重組的轉(zhuǎn)移載體與家蠶野生型核型多角體病毒BmNPV DNA共轉(zhuǎn)染入家蠶培養(yǎng)細(xì)胞，通過同源重組產(chǎn)生重組病毒，具體的方法為在聚苯乙烯錐形管中加入1μg轉(zhuǎn)移載體DNA和15μg家蠶BmNPV DNA，混勻，并加入14μl脂質(zhì)體lipofectin，最后加入滅菌蒸餾水至終體積40μl；將該混合物在室溫培育15分鐘后共轉(zhuǎn)染對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Sf21培養(yǎng)細(xì)胞；用無血清的TC-100培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時(shí)后，換成含有10％胎牛血清的新鮮培養(yǎng)基，27℃培養(yǎng)5天，收集培養(yǎng)基上清作為病毒儲(chǔ)存原液，用來篩選重組病毒。重組病毒通過幾輪空斑篩選，最終獲得高濃度純化的病毒溶液，濃度為108pfu/ml。申請(qǐng)人將此重組病毒命名為含有犬α干擾素基因的家蠶重組病毒；(3)家蠶體內(nèi)表達(dá)和重組α干擾素純化使用家蠶幼蟲5齡起蠶，接種上述重組病毒進(jìn)行感染表達(dá)；接種前，將幼蟲浸在冰水浴中麻醉10分鐘，注射用病毒懸浮液濃度為106pfu/ml，采用皮下注射的方法，每條家蠶注射20μl，注射1小時(shí)后給桑，在23-25℃下飼養(yǎng)；感染后的三天內(nèi)，看不到明顯的癥狀，到第四天，幼蟲開始食欲減弱，漸漸地呈現(xiàn)出感染癥狀；感染后地五天或第六天，感染的幼蟲大部分死亡，在此之前收集家蠶幼蟲；將幼蟲的血淋巴作為重組犬α干擾素純化的起始材料，使用以下方法收集血淋巴在15ml收集管的上方，將幼蟲向背面彎曲，用一只手固定幼蟲的頭部和尾部，讓腹部和腹足伸向外邊并用25號(hào)針頭刺破腹足收集血液，讓血液直接滴進(jìn)收集管中，為了防止血液氧化變黑，預(yù)先加入1/10體積的10mmol/L二硫蘇糖醇DTT，使其終濃度為1mmol/L；由于重組蛋白N-末端帶有6×His尾巴，可以用Ni-NTA親和柱在非變性條件下進(jìn)行蛋白純化；從感染的幼蟲收集的血淋巴用非變性結(jié)合緩沖液，Na3PO450mmol/L，NaCl 0.5mol/L，pH8.0，進(jìn)行稀釋；樣品隨后結(jié)合于Ni-NTA柱，最后，重組蛋白用含有250mmol/L咪唑的非變性洗脫緩沖液洗脫，通過SDS-PAGE考馬斯亮藍(lán)染色后鑒定重組蛋白；(4)重組α干擾素活性分析鑒定將純化的、倍比稀釋的重組α干擾素添加到犬腎細(xì)胞(MDCK)單層培養(yǎng)細(xì)胞，作用18h，然后加入VSV病毒，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照組，24h后觀察細(xì)胞病變結(jié)果。根據(jù)結(jié)果分析判斷重組α干擾素的抗病毒活性。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種家蠶表達(dá)重組犬α干擾素的方法。利用家蠶桿狀病毒作為載體，構(gòu)建了重組含有犬α干擾素基因的重組病毒。利用家蠶作為重組桿狀病毒的宿主，表達(dá)了具有生物活性的重組犬α干擾素。解決了犬α干擾素在大腸桿菌中表達(dá)需要復(fù)雜的復(fù)性操作、酵母表達(dá)中質(zhì)粒轉(zhuǎn)化體不穩(wěn)定和在哺乳動(dòng)物培養(yǎng)細(xì)胞生產(chǎn)的成本太高的缺點(diǎn)，家蠶幼蟲表達(dá)的重組犬α干擾素大部分被分泌進(jìn)血淋巴中，非常有利于蛋白質(zhì)的快速提取。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明利用重組桿狀病毒以家蠶生產(chǎn)重組犬α干擾素方法可行。重組犬α干擾素的大量表達(dá)為α干擾素在醫(yī)學(xué)和治療領(lǐng)域上的應(yīng)用開辟前景。
文檔編號(hào)C07K14/56GK101376885SQ20081012148
公開日2009年3月4日 申請(qǐng)日期2008年10月7日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月7日
發(fā)明者吳小鋒, 相興偉, 琳 陳 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)