專利名稱：一種從動物肝臟中提取核糖核酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于動物生物制品領(lǐng)域，特別是涉及一種從畜類肝臟中提取核糖核酸的提
取方法。
背景技術(shù)：
核糖核酸(縮寫為RNA，即Ribo皿cleic Acid)，存在于生物細(xì)胞以及部分病毒、類 病毒中的遺傳信息載體。RNA由核糖核苷酸經(jīng)磷酯鍵縮合而成長鏈狀分子。 一個核糖核苷 酸分子由磷酸，核糖和堿基構(gòu)成。RNA的堿基主要有4種，即A腺嘌呤，G鳥嘌呤，C胞嘧啶， U尿嘧啶。其中，U(尿嘧啶)取代了 DNA中的T胸腺嘧啶而成為RNA的特征堿基。與DNA 不同，RNA —般為單鏈長分子，不形成雙螺旋結(jié)構(gòu)，但是很多RNA也需要通過堿基配對原則 形成一定的二級結(jié)構(gòu)乃至三級結(jié)構(gòu)來行使生物學(xué)功能。RNA的堿基配對規(guī)則基本和DNA相 同，不過除了 A-U、G-C配對外，G-U也可以配對。在細(xì)胞中，根據(jù)結(jié)構(gòu)功能的不同，RNA主要 分三類，即tRNA (轉(zhuǎn)運RNA) ， rRNA (核糖體RNA) ， mRNA (信使RNA) 。 mRNA是合成蛋白質(zhì)的模 板，內(nèi)容按照細(xì)胞核中的DNA所轉(zhuǎn)錄；tRNA是mRNA上堿基序列(即遺傳密碼子)的識別者 和氨基酸的轉(zhuǎn)運者；rRNA是組成核糖體的組分，是蛋白質(zhì)合成的工作場所。在病毒方面，很 多病毒只以RNA作為其唯一的遺傳信息載體(有別于細(xì)胞生物普遍用雙鏈DNA作載體)。
1982年以來，研究表明，不少RNA，如I、II型內(nèi)含子，RNase P，HDV，核糖體大亞基 RNA等等有催化生化反應(yīng)過程的活性，即具有酶的活性，這類RNA被稱為核酶(ribozyme)。 20世紀(jì)90年代以來，又發(fā)現(xiàn)了 RNAi (RNA interference, RNA干擾)等等現(xiàn)象，證明RNA在 基因表達(dá)調(diào)控中起到重要作用。在RNA病毒中，RNA是遺傳物質(zhì)，植物病毒總是含RNA。近 些年在植物中陸續(xù)發(fā)現(xiàn)一些比病毒還小得多的浸染性致病因子，叫做類病毒。類病毒是不 含蛋白質(zhì)的閉環(huán)單鏈RNA分子，此外，真核細(xì)胞中還有兩類RNA，即不均一核RNA(hnRNA)和 小核RNA (snRNA) 。 hnRNA是mRNA的前體；snRNA參與hnRNA的剪接( 一種加工過程)。自 1965年酵母丙氨酸t(yī)RNA的堿基序列確定以后，RNA序列測定方法不斷得到改進(jìn)。目前除多 種tRNA、5SrRNA、5. 8SrRNA等較小的RNA夕卜，尚有一些病毒RNA、 mRNA及較大RNA的一級結(jié) 構(gòu)測定已完成，如噬菌體MS2RNA含3569個核苷酸。 核糖核酸是動物體內(nèi)一種生物大分子，可作為免疫觸發(fā)劑或免疫調(diào)節(jié)劑。從動物 內(nèi)臟中提取的核糖核酸制成針劑注入體內(nèi)，可激活機(jī)體的T細(xì)胞及B細(xì)胞的活性，同時可提 高人體免疫功能。目前，實驗室規(guī)模制備高純度RNA方法已非常成熟，但工業(yè)規(guī)模制備注射 用RNA方法仍有許多有待改進(jìn)之處。傳統(tǒng)RNA制備方法多采用3體積量熱酚3次萃取法或 氯化鈉_檸檬酸鈉法制備動物臟器RNA，工藝繁雜，不僅成本高，收率低，而且操作條件極不 溫和，所用試劑不易回收，易造成環(huán)境污染，產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定，熱原難控制，甚至傷害工作人 員。目前從牛脾臟中制備RNA的傳統(tǒng)方法往往由于工藝中使用熱酚，可能使DNA從組蛋白 上解離下來，造成DNA含量超標(biāo)，同時生產(chǎn)周期過長，生產(chǎn)效率低；收率低。
目前大生產(chǎn)中提取RNA，主要原料是動物胰臟，采用的方法往往較為復(fù)雜繁瑣，生 產(chǎn)周期長，耗費大量人力物力，提取率較低。動物(畜類)肝臟中含有較少的脂肪，同時還含有蛋白、多糖等物質(zhì)，采用動物肝臟作為提取RNA的原料，來源廣泛、前期處理簡單易行。 從中提取RNA，操作中既要有效破碎完全，又要防止RNA酶對RNA的裂解作用；既要考慮充 分去除脂肪、蛋白、糖元等雜質(zhì)，又要盡量減少有機(jī)試劑的用量，盡可能回收化學(xué)藥品減小 污染排放、降低生產(chǎn)成本。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的旨在提供一種從動物肝臟中提取核糖核酸的方法，其特征在于對于 肝臟采用破碎、膠體磨研磨、高壓均質(zhì)機(jī)破壁、超濾、純化的提取過程，步驟包括
1)組織破碎:; 2)膠體磨研磨將搗碎的豬肝臟漿通過膠體磨制成勻漿，于2-『C冷藏過夜；
3)高壓均質(zhì)機(jī)破壁棄去冷藏過夜的勻漿的上層泡沫，并用高壓均質(zhì)機(jī)以60MPa 兩次破壁，收集高壓均質(zhì)好的勻漿，然后離心并收集上清液；
4)將上清液進(jìn)行超濾； 5)純化收集超濾后的液體采用酚氯仿抽提法進(jìn)行純化，即得提取出的核糖核 酸。 在一個具體實施方案中，在實施步驟1之前先清除肝臟的脂肪和血管。 在另一個具體實施方案中，在步驟1中，將肝臟在絞肉機(jī)內(nèi)初絞3遍，然后進(jìn)行精
絞，并將絞碎的豬肝臟與純化水按l : 0.5的比例放入搗碎缸，按每公斤肝臟加入8克苯甲
酸鈉，搗碎3分鐘，然后按肝臟/蒸餾水(1 : 1)再次搗碎2次，每次10秒，以達(dá)到混勻狀態(tài)。 在另一個具體實施方案中，所述的超濾使用截留分子量10000道爾頓以下的中空 纖維柱。 還在另一個具體實施方案中，所述的動物是畜類，優(yōu)選豬、牛。
有益效果 1.通過本發(fā)明方法所提取的RNA，產(chǎn)量有顯著提高，10kg肝臟可提出約8gRNA，質(zhì) 量濃度達(dá)到100ug ; 2.所用原料來源廣泛，簡單易得，前期處理簡單易行；
3.本方法所使用的有機(jī)試劑量少，并可回收化學(xué)藥品；
4.本方法可減小污染排放、降低生產(chǎn)成本； 5.本方法克服了實驗室復(fù)雜繁瑣的提取方法，方法簡單易行； 6.本方法克服了傳統(tǒng)方法所需要的過多人力物力，適于在畜牧業(yè)中推廣應(yīng)用
具體實施例方式
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的描述。
實施例1 :豬肝臟的RNA的提取 將融化為半凍態(tài)的豬肝臟用經(jīng)消毒的剪刀去除脂肪和血管。精確稱量出原料的投 料量，將剪摘后的原料，用自來水清洗3遍，用蒸餾水洗1遍，備用。首先進(jìn)行初絞，稱取除脂 后的肝臟在絞肉機(jī)內(nèi)初絞3遍，裝入潔凈物料桶。然后進(jìn)行精絞，將絞碎的豬肝臟與純化水 按l : 0.5的比例放入搗碎缸，按每公斤肝臟加入8克苯甲酸鈉，固定好搗碎缸點動電機(jī)，啟動電機(jī)，搗碎3分鐘，再按i : i(肝臟蒸餾水)，點動2次，每次io秒，以達(dá)到混勻狀態(tài)。 將搗碎的豬肝臟漿置于裝料斗內(nèi)，按膠體磨操作規(guī)程將其研磨，制成勻漿，并用潔凈物料桶 盛接。將研磨后的勻漿，于2-8t:冷藏過夜。將冷藏過夜的勻漿，棄去上層泡沫，用高壓均質(zhì)
機(jī)在壓力60MPa條件下壓二遍，收集高壓均質(zhì)好的勻槳。將得到的勻槳用5000-12000轉(zhuǎn)冷 凍離心機(jī)離心5-30分鐘，收集離心后的上清液。將收集到的上清液采用截留分子量10000 道爾頓以下的中空纖維柱，進(jìn)行超濾。收集超濾后的液體采用酚氯仿抽提法進(jìn)行純化，即得 提取出的核糖核酸。 實施例2 :提取的RNA產(chǎn)量和純度的鑒定 將融化為半凍態(tài)的10kg豬肝臟用經(jīng)消毒的剪刀去除脂肪和血管。精確稱量出原 料的投料量，將剪摘后的原料，用自來水清洗3遍，用蒸餾水洗1遍，備用。首先進(jìn)行初絞， 稱取除脂后的肝臟在絞肉機(jī)內(nèi)初絞3遍，裝入潔凈物料桶。然后進(jìn)行精絞，將絞碎的豬肝臟 與純化水按1 : 0. 5的比例放入搗碎缸，加入80克苯甲酸鈉，固定好搗碎缸點動電機(jī)，啟動
電機(jī)，搗碎3分鐘，再按i : i(肝臟蒸餾水)，點動2次，每次io秒，以達(dá)到混勻狀態(tài)。將
搗碎的豬肝臟漿置于裝料斗內(nèi)，按膠體磨操作規(guī)程將其研磨，制成勻漿，并用潔凈物料桶盛
接。將研磨后的勻漿，于2-8t:冷藏過夜。將冷藏過夜的勻漿，棄去上層泡沫，用高壓均質(zhì)機(jī)
在壓力60MPa條件下壓二遍，收集高壓均質(zhì)好的勻槳。將得到的勻槳用5000-12000轉(zhuǎn)冷凍 離心機(jī)離心5-30分鐘，收集離心后的上清液。將收集到的上清液采用截留分子量10000道 爾頓以下的中空纖維柱，進(jìn)行超濾。收集超濾后的液體采用酚氯仿抽提法進(jìn)行純化，即得提 取出的核糖核酸，約為8g。
樣品檢測 1)紫外分光光度儀分別測定樣品，在260/280的光密度及估算RNA的純度和濃度。
2)電泳檢測 a)加樣取DEPC水處理過的PCR管，加入RNA為5. 5 y L， 37 %甲醛3. 5 y L，甲酰 胺10ii L， 10X甲醛電泳緩沖液1 y L，放入PCR儀中進(jìn)行變性處理，條件是65°C 15min.迅 速冰浴冷卻，離心后，再加入2ii LRNA Loading Buffer。 b)電泳電泳液為IX甲醛電泳緩沖液；瓊脂糖甲醛凝膠為1% ;70 80V， 5min 預(yù)電泳；50 60V， 2 2. 5h電泳(達(dá)到溴酚蘭約8cm電泳結(jié)束)。
c)紫外光下觀察電泳結(jié)果并拍照. 檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用紫外分光光度法進(jìn)行檢領(lǐng)"其所測得的0D(260nm)/ 0D(280nm)的比值在1. 85 2. O，RNA的濃度=0D(260nm) X40mgPLX稀釋倍數(shù)，計算得出 的RNA的質(zhì)量濃度達(dá)到了 100ii g.所獲得的RNA的純度、濃度完全滿足大生產(chǎn)的需要。
通過電泳檢測發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)總RNA沒有降解，且純度較高、完整性較好，產(chǎn)量高。
權(quán)利要求
一種從動物肝臟中提取核糖核酸的方法，其特征在于對于肝臟采用破碎、膠體磨研磨、高壓均質(zhì)機(jī)破壁、超濾、純化的提取過程，具體步驟包括①.組織破碎；②.膠體磨研磨將搗碎的豬肝臟漿通過膠體磨制成勻漿，于2-8℃冷藏過夜；③.高壓均質(zhì)機(jī)破壁棄去冷藏過夜的勻漿的上層泡沫，并用高壓均質(zhì)機(jī)以60MPa兩次破壁，收集高壓均質(zhì)好的勻漿，然后離心并收集上清液；④.將上清液進(jìn)行超濾；⑤.純化收集超濾后的液體采用酚氯仿抽提法進(jìn)行純化，即得提取出的核糖核酸。
2. 權(quán)利要求1的方法，其中在實施步驟1之前先清除肝臟的脂肪和血管。
3. 權(quán)利要求1或2的方法，在步驟1中，將肝臟在絞肉機(jī)內(nèi)初絞3遍，然后進(jìn)行精絞，并將絞碎的豬肝臟與純化水按1 : 0.5的比例放入搗碎缸，按每公斤肝臟加入8克苯甲酸鈉，搗碎3分鐘，然后按肝臟/蒸餾水(1 : 1)再次搗碎2次，每次10秒，以達(dá)到混勻狀態(tài)。
4. 權(quán)利要求1至3的方法，所述的超濾使用截留分子量10000道爾頓以下的中空纖維柱。
5. 權(quán)利要求1至4的方法，所述的動物是畜類，優(yōu)選豬、牛。
全文摘要
本發(fā)明提供一種從動物肝臟中提取核糖核酸的方法，包括破碎、膠體磨研磨、高壓均質(zhì)機(jī)破壁、超濾、純化等步驟。其中，通過使用截留分子量10000道爾頓以下的中空纖維柱進(jìn)行超濾，可獲得高純度、高產(chǎn)量的RNA。該方法能充分破碎，防止RNA酶對RNA的裂解作用。同時可充分去除脂肪、蛋白、糖元等雜質(zhì)，減少有機(jī)試劑用量，從而降低生產(chǎn)成本、節(jié)省了時間，具有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號C07H21/02GK101759739SQ20081015434
公開日2010年6月30日 申請日期2008年12月23日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月23日
發(fā)明者劉菁, 李旭東, 蘇建東 申請人:天津瑞普生物技術(shù)股份有限公司