背景分離的核酸，特別是編碼蛋白質(zhì)的那些，是各種臨床應(yīng)用的有吸引力的候選者。特別是編碼蛋白質(zhì)的rna(例如mrna)為臨床應(yīng)用提供了許多潛在的優(yōu)點(diǎn)。例如，rna可以體內(nèi)、體外或離體轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中以誘導(dǎo)用于治療或診斷疾病的期望的治療或診斷蛋白質(zhì)的表達(dá)。然而，rna治療的潛力受rna的穩(wěn)定性和半衰期以及編碼的蛋白質(zhì)的表達(dá)水平的限制。天然存在的mrna含有5’帽結(jié)構(gòu)，其有助于穩(wěn)定rna并且是真核基因表達(dá)的基礎(chǔ)(shuman,s.等人mol.microbiol.1995,17,405-410)。這些mrna還含有3’polya尾。兩種修飾都能穩(wěn)定和改善編碼的蛋白質(zhì)的翻譯。在真核信使rna(mrna)和許多病毒rna的5’末端發(fā)現(xiàn)的5’-帽結(jié)構(gòu)由通過5’-5’三磷酸連接與前mrna的5’-末端核苷連接的n7-甲基鳥苷核苷組成(shatkin,a.j.cell1976,2,645-53；shuman,s.prog.nucleicacidres.mol.biol.2001,66,1-40；decroly,e.等人plospathog.2011,7,e1002059)。這種帽結(jié)構(gòu)實(shí)現(xiàn)最終導(dǎo)致mrna翻譯的許多作用。rna加帽對(duì)于其他過程也是重要的，例如rna剪接和從細(xì)胞核導(dǎo)出和避免通過細(xì)胞先天免疫機(jī)制的mrna識(shí)別(daffis,s.等人nature2010,468,452-6；züst,r.等人nat.immunol.2011,12,137-43)。已經(jīng)描述了許多合成的帽類似物。參見例如wo2009/149253、wo2011/015347。合成的mrna通常通過使用rna聚合酶和dna模板，然后通過酶促加入5’-帽和3’-末端的酶促合成進(jìn)行制備(peyrane,f.等人nucleicacidsres.2007,35,e26)。然而，該方法昂貴且難以控制，因此對(duì)于商業(yè)規(guī)模生產(chǎn)是不合需要的。因此，需要在5’-末端、3’-末端或者5’-末端和3’-末端被修飾的rna，其在可以被有效產(chǎn)生，并且具有改善的由rna編碼的產(chǎn)物(例如蛋白質(zhì))的表達(dá)、降低免疫原性和/或提高穩(wěn)定性。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本公開內(nèi)容涉及在5’-末端、3’-末端或5’-末端和3-末端兩者都含有修飾的核酸分子(例如rna和dna分子)。核酸分子優(yōu)選為編碼產(chǎn)物如多肽或核酸的rna分子，更優(yōu)選為mrna，包括用于crispr基因組編輯技術(shù)的編碼cas9蛋白的mrna和/或用于crispr基因組編輯技術(shù)的sgrna(或crrna和tracrrna)的3’-末端。一方面，本公開涉及式i化合物及其鹽(優(yōu)選藥學(xué)上可接受的鹽)：其中z1是帽0、帽1、前提是當(dāng)z1是帽0或帽1時(shí)，-a1–r5和-a3–r8不都是–oh或a2不是不存在(null)；z2是不存在或是連接部分(linkingmoiety)，所述連接部分選自–o–、–s–、任選取代的低級(jí)烷基、任選取代的氨基烷基、任選取代的芳基、任選取代的雜芳基、任選取代的環(huán)烷基、任選取代的環(huán)烯基、任選取代的雜環(huán)基、a1和a3獨(dú)立地選自不存在、nh、s和o；a2是不存在或選自>cr6r7、>nr6、>nnr6r7、>nor6、>s和>o；y是不存在或是連接部分，所述連接部分選自任選取代的低級(jí)烷基、任選取代的烯基、任選取代的炔基、–(ch2)nor15、–(ch2)ncoor15和–(ch2)nc(o)nr12；r1選自h、任選取代的環(huán)烷基、任選取代的環(huán)烯基、任選取代的芳基、任選取代的雜芳基和任選取代的雜環(huán)基；r2選自h、–oh、任選取代的烷基、–c(o)nr12r13和–nr12r13；r5、r6和r8獨(dú)立地選自h、任選取代的烷基、聚胺、pegs、–(ch2)n1nr12r13、–(ch2)n1nr14c(o)r15、–(ch2)n1or15、–(ch2)n1c(o)or15、–(ch2)n1c(o)r15、–(ch2)n1c(o)nr12r13、–o–(ch2)n3–c(o)–(nr12)2–c(o)–x2、–o–(ch2)n3–c(o)–[nr12–c(o)–(ch2)n3]1-3–x2，或r6和r8一起形成環(huán)，該環(huán)任選被取代且含有10-80個(gè)環(huán)原子，其中10-40個(gè)環(huán)原子可以是雜原子，或者r6和r7一起形成3-8元環(huán)，其任選被取代且其中1-6個(gè)環(huán)原子可以是雜原子；r7、r11、r12、r13、r14、r15和r16獨(dú)立地選自h、任選取代的低級(jí)烷基和任選取代的?；籸9選自h和任選取代的低級(jí)烷基；r10選自h、–nr12r13和–or16；n是1-4；n1是0-10；n2是1-12；n3是1-8；x選自o、s、nh和任選取代的烷二基；x1選自r3和r4獨(dú)立地選自h和–or16，或r3和r4一起形成o-q-o；q選自–ch2–和–c(me)2–；x2選自親和部分和檢測(cè)部分，且xn是核堿基。在一些方面，式i化合物在5’-末端和3’-末端被修飾并且是式ii、iii、iv化合物或其鹽(優(yōu)選藥學(xué)上可接受的鹽)，式ii、iii和iv中的變量如式i中所定義，前提是-a1–r5和-a3–r8不都是–oh，或a2不是不存在。在一些實(shí)施方案中，所述化合物是式ii、iii或iv化合物，前提是-a1–r5和-a3–r8不都是–oh，或a2不是不存在。在其它方面中，式i化合物在5’-末端被修飾并且在3’-末端未被修飾，且是式vi、式vii、式viii化合物或其鹽(優(yōu)選藥學(xué)上可接受的鹽)，式vi、vii和viii中的變量如式i中所定義，前提是-a1–r5和-a3–r8都是–oh且a2是不存在。在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述化合物是式i–iv和vi–viii中任何一式的化合物，其中y是烷基連接部分，優(yōu)選低級(jí)烷基連接部分例如(-ch2-)；且r1是取代的芳基或取代的雜芳基，例如苯基取代的芳基或苯基取代的雜芳基。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，-y-r1可以是在其它方面中，式i化合物在3’-末端被修飾且在5’-末端未被修飾，且是式v化合物或其鹽(優(yōu)選藥學(xué)上可接受的鹽)在式v中，*z1選自帽0和帽1，且其它變量如式i中所述，前提是a2不是不存在，或-a1–r5和-a3–r8不都是–oh。式i–viii化合物含有核堿基xn，其可以是任何期望的核堿基例如腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶，或修飾的核堿基例如假尿嘧啶。優(yōu)選的核堿基是腺嘌呤。式i–viii化合物中的rna可以是任何期望的rna分子，但其優(yōu)選編碼產(chǎn)物例如蛋白質(zhì)。在其它方面中，本公開涉及鳥苷或嘌呤衍生物，其可以用于制備本文所公開的5’-末端修飾的核酸(例如rna)。在特別方面，本公開涉及式ix、x、xi化合物或其鹽(藥學(xué)上可接受的鹽):在式ix、x和xi的每一式中，z選自–oh、n4是0-2；并且其它變量如式i中所定義。在該方面的某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，y是烷基連接部分，優(yōu)選低級(jí)烷基連接部分例如(-ch2-)；且r1是取代的芳基或取代的雜芳基，例如苯基取代的芳基或苯基取代的雜芳基。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，-y-r1可以是本發(fā)明還涉及使用和制備本文公開的化合物的方法。發(fā)明詳述盡管下面詳細(xì)描述了本發(fā)明，但是應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明不限于本文所述的特定方法、方案和試劑，因?yàn)樗鼈兛梢宰兓?。還應(yīng)當(dāng)理解，本文使用的術(shù)語僅用于描述特定實(shí)施方案的目的，并不意圖限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的范圍將僅由所附權(quán)利要求限制。除非另有定義，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的相同的含義。本公開內(nèi)容涉及在5’-末端、3’-末端或者5’-末端和3-末端含有修飾的核酸分子(例如rna和dna分子)。核酸分子優(yōu)選是編碼產(chǎn)物如多肽或核酸的rna分子，更優(yōu)選是mrna。如本文公開的修飾的rna或mrna可以使用任何期望的方法如酶促合成或化學(xué)合成來制備。5’-末端修飾包括基于鳥苷或嘌呤的帽結(jié)構(gòu)，其增加由rna編碼的產(chǎn)物(例如蛋白質(zhì))的表達(dá)，降低免疫原性和/或提高rna的穩(wěn)定性。3’-末端修飾包括在rna的末端核糖的3’和2'位上的順式二醇的修飾，例如通過在這些位置之間插入環(huán)原子或用其它取代基替換一個(gè)或兩個(gè)羥基，以增加由rna編碼的產(chǎn)物(例如蛋白質(zhì))的表達(dá)和/或提高rna的穩(wěn)定性(例如，通過降低降解速率)。如果需要，3’-末端修飾可以包括多個(gè)功能部分，例如親和部分或檢測(cè)部分。含有這些部分的化合物特別可用于例如成像、生物化學(xué)分析和生物綴合。如本文所述和所示例，已經(jīng)制備了含有本文公開的基于鳥苷或嘌呤的5’-末端帽結(jié)構(gòu)的rna。這些修飾的rna顯示結(jié)合eif4e并在細(xì)胞中翻譯。還制備了3’-末端rna，與未修飾的rna相比，其半衰期和表達(dá)增加。一方面，本公開涉及含有5’-末端帽結(jié)構(gòu)、3’-末端修飾或者5’-末端帽結(jié)構(gòu)和3’-末端修飾的rna分子。這樣的rna分子是式i化合物和其鹽(優(yōu)選藥學(xué)上可接受的鹽)：其中z1是帽0、帽1、前提是當(dāng)z1是帽0或帽1時(shí)，-a1–r5和-a3–r8不都是–oh，或a2不是不存在；z2是不存在或是連接部分，所述連接部分選自–o–、–s–、任選取代的低級(jí)烷基、任選取代的氨基烷基、任選取代的芳基、任選取代的雜芳基、任選取代的環(huán)烷基、任選取代的環(huán)烯基、任選取代的雜環(huán)基、a1和a3獨(dú)立地選自不存在、nh、s和o；a2是不存在或選自>cr6r7、>nr6、>nnr6r7、>nor6、>s和>o；y是不存在或是連接部分，所述連接部分選自任選取代的低級(jí)烷基、任選取代的烯基、任選取代的炔基、–(ch2)nor15、–(ch2)ncoor15和–(ch2)nc(o)nr12；r1選自h、任選取代的環(huán)烷基、任選取代的環(huán)烯基、任選取代的芳基、任選取代的雜芳基和任選取代的雜環(huán)基；r2選自h、–oh、任選取代的烷基、–c(o)nr12r13和–nr12r13；r5、r6和r8獨(dú)立地選自h、任選取代的烷基、聚胺、pegs、–(ch2)n1nr12r13、–(ch2)n1nr14c(o)r15、–(ch2)n1or15、–(ch2)n1c(o)or15、–(ch2)n1c(o)r15、–(ch2)n1c(o)nr12r13、–o–(ch2)n3–c(o)–(nr12)2–c(o)–x2、–o–(ch2)n3–c(o)–[nr12–c(o)–(ch2)n3]1-3–x2，或r6和r8一起形成環(huán)，該環(huán)任選被取代且含有10-80個(gè)環(huán)原子，其中10-40個(gè)環(huán)原子可以是雜原子，或者r6和r7一起形成3-8元環(huán)，其任選被取代且其中1-6個(gè)環(huán)原子可以是雜原子；r7、r11、r12、r13、r14、r15和r16獨(dú)立地選自h、任選取代的低級(jí)烷基和任選取代的?；?；r9選自h和任選取代的低級(jí)烷基；r10選自h、–nr12r13和–or16；n是1-4；n1是0-10；n2是1-12；n3是1-8；x選自o、s、nh和任選取代的烷二基；x1選自和r3和r4獨(dú)立地選自h和–or16，或r3和r4一起形成o-q-o；q選自–ch2–和–c(me)2–；x2選自親和部分和檢測(cè)部分，且xn是核堿基。在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述化合物是式i化合物，其中z1是y是烷基連接部分，優(yōu)選低級(jí)烷基連接部分例如(-ch2-)；且r1是取代的芳基或取代的雜芳基，例如苯基取代的芳基或苯基取代的雜芳基。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，-y-r1可以是在其它優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述化合物是式i化合物，其中-a1–r5和-a3–r8不都是–oh，或a2不是不存在。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，-a1–r5和-a3–r8不都是–oh，且a2不是不存在。在一些方面，式i化合物在5’-末端和3’-末端都被修飾且是式ii、iii或iv化合物或其鹽，式ii、iii和iv中的變量如式i中所定義，前提是-a1–r5和-a3–r8不都是–oh，或a2不是不存在。在一些實(shí)施方案中，所述化合物是式ii、iii或iv化合物，前提是-a1–r5和-a3–r8不都是–oh，或a2不是不存在。在該方面的某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，y是烷基連接部分，優(yōu)選低級(jí)烷基連接部分例如(-ch2-)；且r1是取代的芳基或取代的雜芳基，例如苯基取代的芳基或苯基取代的雜芳基。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，-y-r1可以是在其它方面中，式i化合物在5’-末端被修飾且在3’-末端未被修飾，且是式vi、式vii、式viii化合物或其鹽,式vi、vii和viii中的變量如式i中所定義，前提是-a1–r5和-a3–r8都是–oh且a2是不存在。在該方面的某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，y是烷基連接部分，優(yōu)選低級(jí)烷基連接部分例如(-ch2-)；且r1是取代的芳基或取代的雜芳基，例如苯基取代的芳基或苯基取代的雜芳基。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，-y-r1可以是在其它方面中，式i化合物在3’-末端被修飾且在5’-末端未被修飾，且是式v化合物或其鹽在式v中，*z1選自帽0和帽1，且其它變量如式i中所述，前提是a2不是不存在，或-a1–r5和-a3–r8不都是–oh。式i–viii化合物包含核堿基xn，其可以是任何期望的核堿基，例如腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶，或修飾的核堿基例如假尿嘧啶。優(yōu)選的核堿基是腺嘌呤。式i-viii化合物中的rna可以是任何期望的rna分子，但其優(yōu)選編碼產(chǎn)物例如蛋白質(zhì)。合適的蛋白質(zhì)包括治療性蛋白質(zhì)，例如抗體或其抗原結(jié)合片段、受體、細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子；抗原，例如來自病原體或腫瘤細(xì)胞的抗原。rna例如mrna可以含有核糖-磷酸骨架，其具有與核糖環(huán)的1”位結(jié)合的常見核堿基腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤和尿嘧啶。如果需要，rna中可以以需要的程度包含一個(gè)或多個(gè)修飾的堿基。例如，0.1％至100％的核堿基可以是修飾的堿基，例如假尿嘧啶。如果需要，rna分子可以含有一個(gè)或多個(gè)氨基磷酸酯、硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、硒代磷酸酯(phosphoroselenoate)或其它合適的連接(linkages)。在其它方面，本公開涉及可用于制備本文公開的5’-末端修飾的核酸(例如rna)的鳥苷或嘌呤衍生物。在具體方面，本公開涉及式ix、x、xi的化合物或其鹽(藥學(xué)上可接受的鹽)：在各式ix、x和xi中，z選自–oh、n4是0-2；且其它變量如式i中所定義。在該方面的某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，y是烷基連接部分，優(yōu)選低級(jí)烷基連接部分例如(-ch2-)；且r1是取代的芳基或取代的雜芳基，例如苯基取代的芳基或苯基取代的雜芳基。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，-y-r1可以是在優(yōu)選的式ix化合物中，r2優(yōu)選是任選取代的氨基；x優(yōu)選是o；和/或x1優(yōu)選是其中r3和r4如式i中所定義。應(yīng)用末端加帽的核酸的方法本文公開的末端加帽的核酸可用于多種目的，包括誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生所需蛋白質(zhì)，用于診斷或治療目的。例如，編碼蛋白質(zhì)的末端加帽的mrna可以在體內(nèi)或體外轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中。用于轉(zhuǎn)染mrna的合適方法是本領(lǐng)域公知的，并且包括例如使用陽離子聚合物、磷酸鈣或陽離子脂質(zhì)以促進(jìn)轉(zhuǎn)染的方法以及直接注射、生物射彈(biolistic)粒子遞送、電穿孔、激光照射、超聲和磁性納米顆粒法。參見例如kim等人,analbioanalchem.397:3173-3178(2010)。待轉(zhuǎn)染的細(xì)胞優(yōu)選是動(dòng)物細(xì)胞，例如來自哺乳動(dòng)物、魚、鳥，更優(yōu)選人。合適的動(dòng)物受試者包括例如牛、豬、馬、鹿、綿羊、山羊、野牛(bison)、兔、貓、狗、雞、鴨、火雞等。本發(fā)明的末端加帽的rna分子也可以遞送到離體細(xì)胞，例如從個(gè)體患者外植的細(xì)胞(例如，淋巴細(xì)胞、骨髓抽吸物、組織活檢)，隨后通常在對(duì)已經(jīng)用末端加帽的rna分子轉(zhuǎn)染的細(xì)胞進(jìn)行選擇后將細(xì)胞重新植入到患者中。遞送給患者的適當(dāng)量的細(xì)胞將隨著患者狀況和期望的效果而變化，這可由本領(lǐng)域技術(shù)人員來確定。優(yōu)選地，使用的細(xì)胞是自體的，即從被治療的患者獲得的細(xì)胞。末端加帽的核酸(例如，mrna)可用于被稱為crispr(規(guī)律成簇間隔短回文重復(fù)序列)的基因組編輯技術(shù)，其是細(xì)菌抗病毒防御系統(tǒng)的一部分，并且可用于誘導(dǎo)真核細(xì)胞中的靶向基因組編輯。當(dāng)用作基因組編輯工具時(shí)，ii型crispr系統(tǒng)通常由2或3種組分組成：是rna依賴性dna核酸內(nèi)切酶的cas9蛋白，每個(gè)dna鏈切割位點(diǎn)有一個(gè)或兩個(gè)rna(天然2rna系統(tǒng)包括crispr-rna(crrna)和反式激活(tracrrna)，而在單rna系統(tǒng)中，2個(gè)crrna和tracrrna被重新設(shè)計(jì)成單功能轉(zhuǎn)錄物，稱為單向?qū)na(sgrna))。crispr編輯的標(biāo)準(zhǔn)系統(tǒng)可以在慢病毒載體中編碼sgrna或多個(gè)rna和cas9蛋白。然而，病毒載體的挑戰(zhàn)在于對(duì)其可以編碼的另外的基因的大小是有限制的，并且長(zhǎng)度為～1000-2000個(gè)氨基酸的大小的cas9蛋白質(zhì)可能難以在病毒載體中編碼。使用與體外轉(zhuǎn)錄的sgrna(或crrna+tracrrna)共同配制的體外轉(zhuǎn)錄的cas9mrna的所有rnacrispr系統(tǒng)可共同配制用于在體內(nèi)、體外或離體轉(zhuǎn)染至細(xì)胞以特異性編輯轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的基因組。本文公開的末端加帽的mrna非常適合于該應(yīng)用。末端加帽的核酸也可以用于各種生化和分析目的。例如，末端加帽的核酸可用于成像研究，研究rna的代謝和研究rna與其他生物分子的相互作用。合成流程本發(fā)明的化合物可以通過以下流程或?qū)嵤├忻枋龅耐緩街苽洹Ａ鞒?：式vi所定義的通式結(jié)構(gòu)i的化學(xué)加帽的mrna可以如下獲得：使mrna-5’-單磷酸與通式結(jié)構(gòu)ii的咪唑活化的帽結(jié)構(gòu)在適當(dāng)緩沖的鹽水溶液(緩沖液：hepes、tris、mes、pbs)在范圍為5.5-7.5的合適的ph的條件下、在存在或不存在有機(jī)溶劑如dmf和dmso的情況下、在合適的路易斯酸性活化劑如mncl2、nicl2、zncl2存在下反應(yīng)。流程2：其中y和r1如式i中定義的通式結(jié)構(gòu)ii的化合物可以如下制備：用咪唑或n-甲基-咪唑、合適的叔膦例如三苯基膦、合適的氧化劑如2,2'-二吡啶基二硫化物以及合適的堿(例如三乙胺)在合適的溶劑如dmf、dmso、nmp、磷酸三甲酯中，在合適的溫度例如室溫下處理磷酸酯iii(三丁基銨鹽)，(a)m.lewdorowicz,y.yoffe,j.zuberek,j.jemielity,j.stepinski,r.kierzek,r.stolarski,m.shapira,e.darzynkiewicz,rna2004,10,1469；b)r.worch,j.stepinski,a.niedzwiecka,m.jankowska-anyszka,c.mazza,s.cusack,r.stolarski,e.darzynkiewicz,nucleosidesnucleotidesandnucleicacids2005,24,1131；c)m.warminski,j.kowalska,j.buck,j.zuberek,m.lukaszewicz,c.nicola,a.n.kuhn,u.sahin,e.darzynkiewicz,j.jemielity,bioorg.med.chem.,2013,23,3753)。流程3：其中y和r1如式i中定義的通式結(jié)構(gòu)iii的化合物可以如下制備：使活化的磷酸酯iv與磷酸三乙銨或類似的磷酸鹽在合適的溶劑如dmf、dmso或水中，在諸如氯化鋅、氯化鎂或氯化錳的路易斯酸存在下，在合適的溫度如室溫下反應(yīng)，(a)m.lewdorowicz,y.yoffe,j.zuberek,j.jemielity,j.stepinski,r.kierzek,r.stolarski,m.shapira,e.darzynkiewicz,rna2004,10,1469；b)r.worch,j.stepinski,a.niedzwiecka,m.jankowska-anyszka,c.mazza,s.cusack,r.stolarski,e.darzynkiewicz,nucleosidesnucleotidesandnucleicacids2005,24,1131；c)m.warminski,j.kowalska,j.buck,j.zuberek,m.lukaszewicz,c.nicola,a.n.kuhn,u.sahin,e.darzynkiewicz,j.jemielity,bioorg.med.chem.,2013,23,3753)。其中y和r1如式i中定義的通式結(jié)構(gòu)iii的化合物可以通過使用合適的烷基化試劑如烷基鹵化物、三氟甲磺酸酯或甲磺酸酯在合適的溶劑如dmf、dmso或nmp中，在范圍為室溫至60℃的適宜反應(yīng)溫度下烷基化v來制備。當(dāng)x＝o時(shí)，其中y和r1如式i中定義的通式結(jié)構(gòu)iii的化合物也可以通過使vi與二磷酸四氯化物(diphosphoricacidtetrachloride)在合適的溶劑如磷酸三甲酯中、在0℃至室溫的適當(dāng)?shù)臏囟认路磻?yīng)來制備(j.emsley,j.moore,p.b.udy,j.chem.soc.(a)inorg.phys.theor.1971,2863)。當(dāng)x＝nh時(shí)，其中y和r1如式i中定義的通式結(jié)構(gòu)iii的化合物也可以如下制備：使iv與亞氨基-雙(磷酰二氯)在合適的溶劑如磷酸三甲酯中在0℃至室溫的適當(dāng)?shù)臏囟确磻?yīng)(a.m.rydzik,m.kulis,m.lukaszewicz,j.kowalska,j.zuberek,z.m.darzynkiewicz,e.darzynkiewicz,j.jemielity,bioorganic&med.chem.2012,20,1699)。當(dāng)x＝ch2時(shí)，其中y和r1如式i中定義的通式結(jié)構(gòu)iii的化合物也可以如下制備：使iv與亞甲基雙(膦酰二氯)在合適的溶劑如磷酸三甲酯中在適當(dāng)?shù)臏囟壤?℃或室溫下反應(yīng)(a)m.honcharenko,m.zytek,b.bestas,p.moreno,j.jemielity,e.darzynkiewicz,c.i.e.smith,r.stroemberg,bioorg.med.chem.,2013,21,7921；b)m.kalek,j.jemielity,z.m.darzynkiewicz,e.bojarska,j.stepinski,r.stolarski,r.e.davis,e.darzynkiewic,bioorg.med.chem.2006,14,3223；c)m.kalek,j.jemielity,j.stepinski,r.stolarski,e.darzynkiewics,tetrahedronlett.2005,46,2417)。流程4：其中y和r1如式i中定義的通式結(jié)構(gòu)iv的化合物可以如下制備：用咪唑、合適的叔膦如三苯基膦、合適的氧化劑例如2,2'-二吡啶基二硫化物和合適的堿如三乙胺在合適的溶劑如dmf或dmso中，在合適的溫度例如室溫下處理磷酸酯vii(三丁基銨鹽)(p.c.joshi,m.f.aldersley,d.v.zagorevskii,j.p.ferris,nucleosides,nucleotidesandnucleicacids2012,31,7,536)。流程5：其中y和r1如式i中定義的通式結(jié)構(gòu)vii的化合物可以如下制備：使用合適的烷基化試劑如烷基鹵化物、三氟甲磺酸酯或甲磺酸酯在合適的溶劑如dmf或dmso中，在范圍為室溫至50℃的適宜的反應(yīng)溫度下烷基化viii。其中y和r1如式i所定義的通式結(jié)構(gòu)viii的化合物可以如下獲得：在合適的溶劑如磷酸三甲酯中，在范圍為0℃或室溫的合適的溫度，使x與合適的磷?；噭├缌柞Ｂ确磻?yīng)。其中y和r1如式i中定義的通式結(jié)構(gòu)vii的化合物也可以如下制備：在合適的溶劑如磷酸三甲酯中，在范圍為0℃至室溫的合適的溫度，使ix與合適的磷?；噭├缌柞Ｂ确磻?yīng)。其中y和r1如式i中定義的通式結(jié)構(gòu)ix的化合物可以如下制備：使用合適的烷基化試劑如烷基鹵化物、三氟甲磺酸酯或甲磺酸酯在合適的溶劑如dmf或dmso中在范圍為室溫至50℃的適宜的反應(yīng)溫度烷基化x。流程6：其中y和r1如式i中定義的通式結(jié)構(gòu)vi的化合物可以如下制備：使用合適的烷基化試劑如烷基鹵化物、三氟甲磺酸酯或甲磺酸酯在合適的溶劑如dmf或dmso中，在范圍為室溫至50℃的適宜的反應(yīng)溫度烷基化x。流程7：當(dāng)x＝br、cl、i且a＝ch3時(shí)，通式結(jié)構(gòu)xi和xii的化合物可以使用合適的自由基引發(fā)劑如偶氮二異丁腈和鹵化物供體如n-溴代琥珀酰亞胺、n-溴代乙酰胺、n-氯代琥珀酰亞胺、n-碘代琥珀酰亞胺、溴化物、氯化物或碘化物，在合適的溶劑如四氯化碳中，在合適的反應(yīng)溫度如85℃分別由xiii和xiv通過自由基鹵化來制備(a)k.ziegler,a.spath,e.schaaf,w.schumann,e.winkelmann,ann.1942,551,80；b)a.nechvatal,advancesinfree-radicalchemistry(london)1972,4,175)。當(dāng)x＝br、cl、i且a＝ch2oh時(shí)，通式結(jié)構(gòu)xi和xii的化合物可以分別由xiii和xiv通過與合適的膦如三苯基膦和合適的氧化劑如四溴化碳、四氯化碳、n-碘代琥珀酰亞胺在合適的溶劑如二氯甲烷中，在合適的反應(yīng)溫度如室溫反應(yīng)來制備(a)r.appel,angew.chem.int.ed.1979,14,801；b)cadogan,j,ed.(1979).organophosphorusreagentsinorganicsynthesis.london:academicpress)。當(dāng)x＝br、cl、i且a＝ch2oh時(shí)，通式結(jié)構(gòu)xi和xii的化合物可以分別由xiii和xiv通過用合適的酸如hbr(48％水溶液)、hcl(12maq.)或hi(aq.)處理來制備(a)m.uchida,f.tabusa,m.komatsu,s.morita,t.kanbe,k.nakagawa,chem.pharm.bull.1985,33,3775；b)v.boekelheide,g.k.vick,j.am.chem.soc.1956,78,653；c)k.m.doxsee,m.feigel,k.d.stewart,j.w.canary,c.b.knobler,d.j.cram,j.am.chem.soc.1987,109,3098.)。當(dāng)x＝oms、otf且a＝ch2oh時(shí)，通式結(jié)構(gòu)xi和xii的化合物可以分別由xiii和xiv通過與合適的試劑如mscl、(ms)2o、(tf)2o在合適的堿例如叔胺例如三乙胺存在下，在合適的溶劑如二氯甲烷中反應(yīng)來制備。當(dāng)a＝ch2oh時(shí)，通式結(jié)構(gòu)xiii的化合物可以如下制備：由相應(yīng)的酸(a＝cooh)與合適的還原劑如硼烷二甲硫醚加合物或氫化鋁鋰在合適的溶劑如四氫呋喃中在合適的反應(yīng)溫度例如室溫下反應(yīng)來制備(a)n.g.gaylord,reductionwithcomplexmetalhydrides,wiley,ny,.1956,322；b)h.c.brown,w.korytnyk,j.am.chem.soc.1960,82,3866)。當(dāng)a＝ch3、ch2oh時(shí)，通式結(jié)構(gòu)xiii和xiv的化合物可以使用合適的芳基底物xv-xvii作為起始原料，通過suzuki交聯(lián)反應(yīng)來制備(n.miyaura,a.suzuki,chem.rev.1995,95,2457)。如果b＝br、i、otf，則交聯(lián)反應(yīng)包括使用合適的催化劑如sphospalladacycleg2(氯(2-二環(huán)己基膦基-2′,6′-二甲氧基-1,1′-聯(lián)苯基)[2-(2′-氨基-1,1′-聯(lián)苯基)]鈀(ii))和合適的堿例如k2co3在合適的溶劑混合物例如dmf/h2o中，在合適的溫度例如室溫、50℃或80℃使xv或xvi與硼試劑xvii(c＝b(oh)2,bpin)反應(yīng)(t.e.barder,s.d.walker,j.r.martinelli,s.l.buchwald,s.l.j.am.chem.soc.2005,1274685；b)r.a.altman,s.l.buchwald,natureprotocols2007,2,3115–3121)。如果b＝b(oh)2、bpin，交叉偶聯(lián)反應(yīng)包括使用合適的催化劑如sphospalladacycleg2(氯(2-二環(huán)己基膦基-2′,6′-二甲氧基-1,1′-聯(lián)苯基)[2-(2′-氨基-1,1′-聯(lián)苯基)]鈀(ii))和合適的堿例如k2co3在合適的溶劑混合物如dmf/h2o在合適的溫度如室溫、50℃或80℃使xv或xvi與試劑xvii(c＝br、i、otf)反應(yīng)。化合物xvi-xvii是市售的。流程8：如式v所定義的通式結(jié)構(gòu)xviii的化學(xué)3’-修飾的mrna可以如下獲得：使rna與通式結(jié)構(gòu)xx和naio4在適當(dāng)?shù)木彌_水溶液(緩沖劑：naoac、tris、pbs、mes、hepes)，在范圍為5.0-7.5的適宜的ph，范圍為0℃至室溫的溫度反應(yīng)，然后用合適的親核試劑例如肼、酰腙、羥胺、1,2-氨基硫醇、胺處理。如式v中定義的通式結(jié)構(gòu)xviii的化學(xué)3’-修飾的mrna可以如下獲得：使rna與通式結(jié)構(gòu)xx和naio4在適當(dāng)?shù)木彌_水溶液(緩沖劑：naoac、tris、pbs、mes、hepes)，在范圍為5.0-7.5的適宜的ph值，在范圍為0℃至室溫的溫度反應(yīng)，然后用合適的胺親核試劑例如肼、酰腙、羥胺、胺處理，隨后用合適的還原劑例如nacnbh3在范圍為室溫至37℃的溫度處理。如式i中定義的通式結(jié)構(gòu)xix的rna可以如下獲得：使rna與通式結(jié)構(gòu)xx和naio4在適當(dāng)?shù)木彌_水溶液(緩沖劑：naoac、tris、pbs、mes、hepes)中在范圍為5.0-7.5的合適的ph下，范圍為0℃至室溫的溫度反應(yīng)，隨后用合適的親核試劑如meldrum酸處理。流程9：如下定義的通式結(jié)構(gòu)xxi和xxii的5’3’-雙修飾的rna可通過在流程1中描述的條件下與鳥苷衍生物ii反應(yīng)分別由結(jié)構(gòu)xxiii和xxiv的3’-修飾的rna獲得。流程10：通式結(jié)構(gòu)xxv的化學(xué)加帽的mrna可以如下獲得：使mrna-5’-單磷酸與通式結(jié)構(gòu)xxvi的咪唑活化的帽結(jié)構(gòu)在合適的緩沖鹽水溶液(緩沖液：hepes、tris、mes、pbs)在范圍為5.5-7.5的合適的ph，在存在或不存在有機(jī)溶劑如dmf和dmso的情況下，在合適的路易斯酸性活化劑如例如mncl2、nicl2、zncl2存在下反應(yīng)。可以制備的示例性5’帽結(jié)構(gòu)包括流程11：其中y和r1如式i所定義的通式結(jié)構(gòu)xxvi的化合物可以如下制備：用咪唑或n-甲基-咪唑、合適的叔膦例如三苯基膦、合適的氧化劑如2,2'-二吡啶基二硫化物以及合適的堿(例如三乙胺)在合適的溶劑如dmf、dmso、nmp、磷酸三甲酯中，在合適的溫度例如室溫下處理磷酸酯xxvii(三丁基銨鹽)(a)m.lewdorowicz,y.yoffe,j.zuberek,j.jemielity,j.stepinski,r.kierzek,r.stolarski,m.shapira,e.darzynkiewicz,rna2004,10,1469；b)r.worch,j.stepinski,a.niedzwiecka,m.jankowska-anyszka,c.mazza,s.cusack,r.stolarski,e.darzynkiewicz,nucleosidesnucleotidesandnucleicacids2005,24,1131；c)m.warminski,j.kowalska,j.buck,j.zuberek,m.lukaszewicz,c.nicola,a.n.kuhn,u.sahin,e.darzynkiewicz,j.jemielity,bioorg.med.chem.,2013,23,3753)。流程12：其中y、r1和z2如式i中所定義的通式結(jié)構(gòu)xxvii的化合物可以如下制備：在合適的溶劑例如dmf、dmso或水中，在諸如氯化鋅、氯化鎂或氯化錳的路易斯酸存在下，在合適的溫度例如室溫下，使活化的磷酸酯xxix與磷酸三乙銨或類似的磷酸鹽反應(yīng)(a)m.lewdorowicz,y.yoffe,j.zuberek,j.jemielity,j.stepinski,r.kierzek,r.stolarski,m.shapira,e.darzynkiewicz,rna2004,10,1469；b)r.worch,j.stepinski,a.niedzwiecka,m.jankowska-anyszka,c.mazza,s.cusack,r.stolarski,e.darzynkiewicz,nucleosidesnucleotidesandnucleicacids2005,24,1131；c)m.warminski,j.kowalska,j.buck,j.zuberek,m.lukaszewicz,c.nicola,a.n.kuhn,u.sahin,e.darzynkiewicz,j.jemielity,bioorg.med.chem.,2013,23,3753)。當(dāng)x＝o時(shí)，其中y、r1和z2如式i中定義的通式結(jié)構(gòu)xxvii化合物也可以通過在合適的溶劑如磷酸三甲酯中，在0℃至室溫的適當(dāng)?shù)臏囟龋箈xviii與二磷酸四氯化物反應(yīng)來制備(j.emsley,j.moore,p.b.udy,j.chem.soc.(a)inorg.phys.theor.1971,2863)。當(dāng)x＝nh時(shí)，其中y、r1和z2如式i中定義的通式結(jié)構(gòu)xxvii的化合物也可以通過使xxviii與亞氨基-雙(磷酰二氯)在合適的溶劑如磷酸三甲酯中以范圍為0℃至室溫的合適的溫度反應(yīng)來制備(a.m.rydzik,m.kulis,m.lukaszewicz,j.kowalska,j.zuberek,z.m.darzynkiewicz,e.darzynkiewicz,j.jemielity,bioorganic&med.chem.2012,20,1699)。當(dāng)x＝ch2時(shí)，其中y、r1和z2如式i中定義的通式結(jié)構(gòu)xxvii的化合物也可以通過在合適的溶劑如磷酸三甲酯中在合適的溫度例如0℃或室溫下使xxviii與亞甲基雙(膦酰二氯)反應(yīng)來制備(a)m.honcharenko,m.zytek,b.bestas,p.moreno,j.jemielity,e.darzynkiewicz,c.i.e.smith,r.stroemberg,bioorg.med.chem.,2013,21,7921；b)m.kalek,j.jemielity,z.m.darzynkiewicz,e.bojarska,j.stepinski,r.stolarski,r.e.davis,e.darzynkiewic,bioorg.med.chem.2006,14,3223；c)m.kalek,j.jemielity,j.stepinski,r.stolarski,e.darzynkiewics,tetrahedronlett.2005,46,2417)。其中y、r1和z2如式i中所定義的通式結(jié)構(gòu)xxix(z＝咪唑、n-甲基咪唑)的化合物可以通過用咪唑或n-甲基-咪唑、合適的叔膦如三苯基膦、合適的氧化劑如2,2'-聯(lián)吡啶二硫化物以及合適的堿如三乙胺，在合適的溶劑如dmf、dmso、nmp、磷酸三甲酯中的適宜的溫度例如室溫處理磷酸酯xxix(z＝oh，三丁基銨鹽)來制備(a)m.lewdorowicz,y.yoffe,j.zuberek,j.jemielity,j.stepinski,r.kierzek,r.stolarski,m.shapira,e.darzynkiewicz,rna2004,10,1469；b)r.worch,j.stepinski,a.niedzwiecka,m.jankowska-anyszka,c.mazza,s.cusack,r.stolarski,e.darzynkiewicz,nucleosidesnucleotidesandnucleicacids2005,24,1131；c)m.warminski,j.kowalska,j.buck,j.zuberek,m.lukaszewicz,c.nicola,a.n.kuhn,u.sahin,e.darzynkiewicz,j.jemielity,bioorg.med.chem.,2013,23,3753)。其中y、r1和z2如式i所定義的通式結(jié)構(gòu)xxix(z＝oh)的化合物也可以通過在合適的溶劑如磷酸三甲酯中在范圍為0℃至室溫的合適的溫度使xxviii與合適的磷酰化試劑例如磷酰氯反應(yīng)來制備。其中y、r1和z2如實(shí)施方案式i所定義的通式結(jié)構(gòu)xxvii的化合物也可以通過使用合適的芳基底物和化合物xxx作為起始原料的交聯(lián)反應(yīng)來制備(n.miyaura,a.suzuki,chem.rev.1995,95,2457)?；衔飜xx可以通過使用合適的烷基化試劑如烷基鹵化物、三氟甲磺酸酯或甲磺酸酯，在合適的溶劑如dmf、dmso或nmp中，在范圍為室溫至60℃的溫度下烷基化市售的8-溴-3-甲基-1h-嘌呤-2,6(3h,7h)-二酮(a＝h)或8-溴-1,3-二甲基-1h-嘌呤-2,6(3h,7h)-二酮(a＝me)來制備。流程13：其中y、r1和z2如式i所定義的通式結(jié)構(gòu)xxviii的化合物可以使用適當(dāng)?shù)膲A例如叔丁醇鈉、叔丁醇鉀或異丙醇鈉，在合適的溶劑如乙醇、異丙醇或thf中，在范圍為50-100℃的溫度下通過環(huán)化由通式結(jié)構(gòu)xxxii的酰胺得到。其中y、r1和z2如式i所定義的通式結(jié)構(gòu)xxix的化合物可以通過使用合適的路易斯酸例如三甲基甲硅烷基溴、三溴化硼或三氯化鋁在溶劑如dmf、dmso、nmp或thf中，在范圍為0℃至30℃的溫度下通過水解通式結(jié)構(gòu)xxxi的單-或二烷基膦和磷酸酯獲得。其中y、r1和z2如實(shí)施方案式i中所定義的通式結(jié)構(gòu)xxxi的化合物可以由通式結(jié)構(gòu)xxxii的酰胺通過使用適當(dāng)?shù)膲A例如叔丁醇鈉、叔丁醇鉀或異丙醇鈉在合適的溶劑如乙醇、異丙醇或thf中，在50-100℃的溫度下進(jìn)行環(huán)化而獲得。流程14：其中y、r1和z2如實(shí)施方案xxx中所定義的通式結(jié)構(gòu)xxxii的化合物可以通過使用合適的活化劑例如hatu、hbtu、o-(苯并三唑-1-基)-n,n,n′,n′-四甲基脲四氟硼酸鹽或(苯并三唑-1-基氧基)三吡咯烷子基六氟磷酸鹽和合適的堿例如三乙胺或hunig堿在合適溶劑例如dmf、dmso或nmp中，在范圍為室溫至50℃的溫度下酰化xxxiii來獲得。其中y、r1如實(shí)施方案式i中所定義的通式結(jié)構(gòu)xxxiii的化合物可以通過使用還原劑如氫化鋁鋰或red-al在合適的溶劑如thf、乙醚或二烷中，范圍為室溫至120℃的溫度下來還原xxxiv(其中y是取代基r1的相應(yīng)羧酸)來獲得。通式結(jié)構(gòu)xxxiv的化合物可以如下獲得：使用合適的活化劑例如hatu、hbtu、o-(苯并三唑-1-基)-n,n,n′,n′-四甲基脲四氟硼酸鹽或(苯并三唑-1-基氧基)三吡咯烷子基六氟磷酸鹽和合適的堿例如三乙胺或hunig堿在合適溶劑例如dmf、dmso或nmp中、在范圍為室溫至50℃的溫度下用合適的羧酸?；惺鄣?,6-二氨基嘧啶-4(3h)-酮(xxxv)以引入取代基r1。流程15：如上所定義的通式結(jié)構(gòu)xxxvi和xxxvii的5’3’-雙修飾的rna可分別由結(jié)構(gòu)xl和xli的3’修飾的rna通過與鳥苷衍生物xxvi在流程1中描述的條件下反應(yīng)得到。流程10描述了xxvi的合成。定義術(shù)語“?；笔侵溉芜x取代的烷基羰基、任選取代的芳基羰基。這些?；膶?shí)例包括乙?；?、苯甲?；?。術(shù)語“親和部分”是指特異性結(jié)合目的分子例如蛋白質(zhì)或核酸或其他分子的分子。親和部分的實(shí)例包括但不限于生物素和地高辛(digoxigenin)。術(shù)語“烷二基”是指衍生自脂族烴的通式cnh2n的二價(jià)基團(tuán)。除非另有說明，此類烷二基包括取代的烷二基。合適的實(shí)例包括亞甲基(-ch2-)，乙二基(-ch2-ch2-)等。本文單獨(dú)或組合使用的術(shù)語“烯基”和“炔基”是指含有1至20個(gè)碳原子并包括一個(gè)或多個(gè)不飽和單元的脂族直鏈或支鏈烴鏈。烯基含有至少一個(gè)碳-碳雙鍵，但不含碳-碳叁鍵。炔基含有至少一個(gè)碳-碳叁鍵。優(yōu)選的烯基和炔基可以包含2至10個(gè)碳原子或2至6個(gè)碳原子。合適的烯基包括例如乙烯基、烯丙基、1-丙烯基、2-丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、3-丁烯基、1-戊烯基、2-戊烯基、3-戊烯基、4-戊烯基、1-己烯基、2-己烯基、3-己烯基、4-己烯基、5-己烯基、1-庚烯基、2-庚烯基、3-庚烯基、4-庚烯基、5-庚烯基、6-庚烯基、1-辛烯基、2-辛烯基、3-辛烯基、4-辛烯基、5-辛烯基、6-辛烯基、7-辛烯基、1-壬烯基、2-壬烯基、3-壬烯基、4-壬烯基、5-壬烯基、6-壬烯基、7-壬烯基、8-壬烯基、1-癸烯基、2-癸烯基、3-癸烯基、4-癸烯基、5-癸烯基、6-癸烯基、7-癸烯基、8-癸烯基或9-癸烯基。合適的炔基包括例如乙炔基、1-丙炔基、2-丙炔基、1-丁炔基、2-丁炔基、3-丁炔基、1-戊炔基、2-戊炔基、3-戊炔基、4-戊炔基、1-己炔基、2-己炔基、3-己炔基、4-己炔基、5-己炔基、1-庚炔基、2-庚炔基、3-庚炔基、4-庚炔基、5-庚炔基、6-庚炔基、1-辛炔基、2-辛炔基、3-辛炔基、4-辛炔基、5-辛炔基、6-辛炔基、7-辛炔基、1-壬炔基、2-壬炔基、3-壬炔基、4-壬炔基、5-壬炔基、6-壬炔基、7-壬炔基、8-壬炔基、1-癸炔基、2-癸炔基、3-癸炔基、4-癸炔基、5-癸炔基、6-癸炔基、7-癸炔基、8-癸炔基或9-癸炔基。烯基和炔基可以如本文所述任選地被取代。本文單獨(dú)使用或組合使用的術(shù)語“烷基”是指含有1至20個(gè)碳原子的脂肪族直鏈或支鏈飽和烴鏈。在某些實(shí)施方案中，烷基可以包含1至10個(gè)碳原子。在另外的實(shí)施方案中，烷基可以包含1至6個(gè)碳原子。烷基可以如本文所述任選地被取代。烷基的實(shí)例包括甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、異戊基、己基、辛基、壬基(noyl)等。術(shù)語“氨基”是指基團(tuán)–nh2。術(shù)語“氨基烷基”是指被伯、仲或叔氨基取代的烷基。優(yōu)選的氨基烷基包括具有一個(gè)或多個(gè)伯、仲和/或叔胺基團(tuán)以及1至約12個(gè)碳原子、更優(yōu)選1至約8個(gè)碳原子、還更優(yōu)選1、2、3、4、5或6個(gè)碳原子的那些氨基烷基。此類氨基烷基的實(shí)例包括氨基甲基、氨基乙基等。本文單獨(dú)或組合使用的術(shù)語“芳基”表示含有至少一個(gè)芳環(huán)的碳環(huán)芳烴環(huán)體系。芳環(huán)體系可以是包括芳族或非芳族烴環(huán)的稠環(huán)體系或包括非芳族烴環(huán)的芳環(huán)體系。術(shù)語“芳基”包括芳族基團(tuán)如苯基、萘基、蒽基和菲基。芳基可以如本文所述任選地被取代。術(shù)語“帽0”是指其中僅有的甲基化在m7g中的帽。術(shù)語“帽1”是指在n1中具有另外的甲基化的帽。概括的帽結(jié)構(gòu)表示為m7g(5’)ppp(5’)nlmpn2mpn3p....其中n是任何核苷酸，優(yōu)選嘌呤或嘧啶，p是磷酸酯基團(tuán)，且m是甲基。在鳥苷的n7位含有甲基的m7g位于mrna的最5’-末端。另一方面，在n1和n2位置的甲基化是核糖部分的2'-oh基團(tuán)處的取代。各種帽結(jié)構(gòu)根據(jù)其含有的甲基數(shù)量進(jìn)行分類(banerjee,a.k.microbiologicalrev.,1980,44,175)。除非另有說明，本文單獨(dú)或與其它術(shù)語組合使用的術(shù)語“環(huán)烯基”表示含有至少一個(gè)碳-碳雙鍵的環(huán)狀形式的“烯基”，具有優(yōu)選3至10個(gè)碳原子，即3、4、5、6、7、8、9或10個(gè)碳原子，優(yōu)選3至6個(gè)碳原子形成環(huán)。術(shù)語“環(huán)烯基”也意在包括其雙環(huán)形式。如果形成雙環(huán)，則優(yōu)選各個(gè)環(huán)在兩個(gè)相鄰的碳原子處彼此連接，然而，或者兩個(gè)環(huán)通過相同的碳原子連接，即它們形成螺環(huán)體系或它們形成橋環(huán)體系。環(huán)烯基的實(shí)例包括環(huán)丙烯基、環(huán)丁烯基、環(huán)戊烯基、環(huán)戊二烯基、環(huán)己烯基、1,3-環(huán)己烯基、環(huán)庚烯基、環(huán)庚三烯基、環(huán)辛烯基、環(huán)壬烯基、環(huán)癸烯基、二環(huán)[2.2.1]-2-庚烯基、二環(huán)[2.2.1]-2-辛烯基或二環(huán)[4.4.0]-2-癸烯基。環(huán)烯基可以如本文所述任選地被取代。除非另有說明，本文單獨(dú)或與其它術(shù)語組合使用的術(shù)語“環(huán)烷基”表示包括雙環(huán)和多環(huán)烷基的環(huán)狀形式的“烷基”。雙環(huán)或多環(huán)體系的環(huán)可以被稠合通過單個(gè)共享原子連接，即它們形成螺環(huán)體系或橋環(huán)體系。環(huán)烷基可優(yōu)選含有3至10個(gè)碳原子，即3、4、5、6、7、8、9或10個(gè)碳原子，優(yōu)選3至6個(gè)碳原子，形成環(huán)。合適的環(huán)烷基的實(shí)例包括環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基、環(huán)庚基、環(huán)辛基、環(huán)壬基或環(huán)癸基。合適的環(huán)烷基的實(shí)例包括環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基、環(huán)庚基、環(huán)辛基、螺[3,3]庚基、螺[3,4]辛基、螺[4,3]辛基、二環(huán)[4.1.0]庚基、二環(huán)[3.2.0]庚基、二環(huán)[2.2.1]庚基、二環(huán)[2.2.2]辛基、二環(huán)[5.1.0]辛基、二環(huán)[4.2.0]辛基等。環(huán)烷基可以如本文所述任選地被取代。術(shù)語“檢測(cè)部分”是指可以使用合適的方法容易地檢測(cè)的化學(xué)部分。檢測(cè)部分的實(shí)例包括但不限于熒光材料、發(fā)光材料、生物發(fā)光材料和放射性材料。術(shù)語“半衰期”(t1/2)涉及消除分子的活性、量或數(shù)量的一半所需要的時(shí)間。在本發(fā)明的上下文中，rna的半衰期表示所述rna的穩(wěn)定性。術(shù)語“雜原子”是指氮、氧和硫。本文所用的術(shù)語“雜芳基”是其中一個(gè)或多個(gè)碳環(huán)原子獨(dú)立地被o、s和n代替的芳基。在某些實(shí)施方案中，雜芳基可以包含5至7個(gè)碳原子。該術(shù)語還包括其中雜環(huán)與芳環(huán)稠合、其中雜芳基環(huán)與其它雜芳基環(huán)稠合、其中雜芳基環(huán)與雜環(huán)烷基環(huán)稠合或其中雜芳基環(huán)與環(huán)烷基環(huán)稠合的稠合多環(huán)基團(tuán)。雜芳基的實(shí)例包括吡咯基、吡咯啉基、咪唑基、吡唑基、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、噠嗪基、三唑基、吡喃基、呋喃基、噻吩基、唑基、異唑基、二唑基、噻唑基、噻二唑基、異噻唑基、吲哚基、異吲哚基、吲嗪基、苯并咪唑基、喹啉基、異喹啉基、喹喔啉基、喹唑啉基、吲唑基、苯并三唑基、苯并間二氧雜環(huán)戊烯基、苯并吡喃基、苯并唑基、苯并二唑基、苯并噻唑基、苯并噻二唑基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、色酮基(chromonyl)、香豆素基、苯并吡喃基、四氫喹啉基、四唑并噠嗪基、四氫異喹啉基、噻吩并吡啶基、呋喃并吡啶基、吡咯并吡啶基等。示例性的三環(huán)雜環(huán)基包括咔唑基、苯并吲哚基、菲咯啉基、二苯并呋喃基、吖啶基、菲啶基、呫噸基等。雜芳基可以如本文所述任選地被取代。術(shù)語“雜環(huán)基”是指如上定義的環(huán)烷基，其中環(huán)中的1至3個(gè)碳原子獨(dú)立地被o、s或n代替。這種雜環(huán)基的實(shí)例是吡咯烷基、咪唑烷基、唑烷基、噻唑烷基、四氫呋喃基、哌啶基、哌嗪基、嗎啉基、硫代嗎啉基、四氫吡喃基、二烷基、二氫吲哚基、異二氫吲哚基、二氫苯并呋喃基、二氫異苯并呋喃基、四氫喹啉基、四氫異喹啉基、四氫喹喔啉基、色滿基、異色滿基、二氫苯并嗪基、二氫苯并噻嗪基或二氫苯并二氧芑基。雜環(huán)基可以如本文所述任選地被取代。術(shù)語“免疫原性”是指誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的能力。術(shù)語“連接基團(tuán)”是指連接兩個(gè)其它部分的二價(jià)基團(tuán)。連接基團(tuán)通常將含有1至40個(gè)原子，并且可以是例如烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、環(huán)烯基、芳基、雜芳基或雜環(huán)連接基團(tuán)，其各自可以如本文所述任選地被取代。例如，合適的連接基團(tuán)包括亞甲基(-ch2-)、乙二基(-ch2-ch2-)、乙烯二基(-ch＝ch-)、乙炔二基(-c≡c-)、-ch2ch2ch2-、-ch2ch(ch3)-、-c(ch3)2-、-(c6h4)-、-(c6h10)-等。合適的連接基團(tuán)的另外的實(shí)例包括但不限于本文單獨(dú)或組合使用的術(shù)語“低級(jí)”，當(dāng)沒有另外具體定義時(shí)，意味著含有1至6(包括6)個(gè)碳原子。術(shù)語“核堿基”是指為核苷酸成分的含氮堿基。核堿基包括例如初級(jí)核堿基胞嘧啶、鳥嘌呤、腺嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶；假尿嘧啶；以及修飾的核堿基，例如m5c(5-甲基胞苷)、m5u(5-甲基尿苷)、m6a(n6-甲基腺苷)、s2u(2-硫尿苷)、um(2'-0-甲基尿苷)、m1a(l-甲基腺苷)；m2a(2-甲基腺苷)；am(2-1-o-甲基腺苷)；ms2m6a(2-甲硫基-n6-甲基腺苷)；i6a(n6-異戊烯基腺苷)；ms2i6a(2-甲硫基-n6異戊烯基腺苷)；io6a(n6-(順-羥基異戊烯基)腺苷)；ms2io6a(2-甲硫基-n6-(順-羥基異戊烯基)腺苷)；g6a(n6-甘氨酰氨基甲?；佘?；t6a(n6-蘇氨酰氨基甲?；佘?；ms2t6a(2-甲硫基-n6-蘇氨酰氨基甲?；佘?；m6t6a(n6-甲基-n6-蘇氨酰氨基甲?；佘?；hn6a(n6-羥基正纈氨酰氨基甲?；佘?；ms2hn6a(2-甲硫基-n6-羥基正纈氨酰氨基甲酰基腺苷)；ar(p)(2'-o-核糖基腺苷(磷酸酯(phosphate)))；i(肌苷)；m11(1-甲基肌苷)；m'im(1,2'-o-二甲基肌苷)；m3c(3-甲基胞苷)；cm(2t-o-甲基胞苷)；s2c(2-硫胞苷)；ac4c(n4-乙酰基胞苷)；f5c(5-fonnyl胞苷)；m5cm(5,2-o-二甲基胞苷)；ac4cm(n4乙酰基2to甲基胞苷)；k2c(賴胞苷)；m1g(1-甲基鳥苷)；m2g(n2-甲基鳥苷)；m7g(7-甲基鳥苷)；gm(2'-o-甲基鳥苷)；m22g(n2,n2-二甲基鳥苷)；m2gm(n2,2'-o-二甲基鳥苷)；m22gm(n2,n2,2'-o-三甲基鳥苷)；gr(p)(2'-o-核糖基鳥苷(磷酸酯(phosphate)))；yw(懷丁苷(wybutosine))；o2yw(過氧懷丁苷)；ohyw(羥基懷丁苷)；ohyw*(修飾下的羥基懷丁苷)；img(懷俄苷(wyosine))；mimg(甲基鳥苷)；q(辮苷(queuosine))；oq(環(huán)氧辮苷)；galq(半乳糖基-辮苷)；manq(甘露糖基-辮苷)；preqo(7-氰基-7-去氮雜鳥苷)；preqi(7-氨基甲基-7-去氮雜鳥苷)；g(古嘌苷)；d(二氫尿苷)；m5um(5,2'-o-二甲基尿苷)；s4u(4-硫尿苷)；m5s2u(5-甲基-2-硫尿苷)；s2um(2-硫-2'-o-甲基尿苷)；acp3u(3-(3-氨基-3-羧基丙基)尿苷)；ho5u(5-羥基尿苷)；mo5u(5-甲氧基尿苷)；cmo5u(尿苷5-氧基乙酸)；mcmo5u(尿苷5-氧基乙酸甲基酯)；chm5u(5-(羧基羥基甲基)尿苷))；mchm5u(5-(羧基羥基甲基)尿苷甲基酯)；mcm5u(5-甲氧基羰基甲基尿苷)；mcm5um(s-甲氧基羰基甲基-2-o-甲基uricjine)；mcm5s2u(5-甲氧基羰基甲基-2-硫尿苷)；nm5s2u(5-氨基甲基-2-硫尿苷)；mnm5u(5-甲基氨基甲基尿苷)；mnm5s2u(5-甲基氨基甲基-2-硫尿苷)；mnm5se2u(5-甲基氨基甲基-2-硒尿苷)；ncm5u(5-氨基甲?；谆蜍?；ncm5um(5-氨基甲酰基甲基-2'-o-甲基尿苷)；cmnm5u(5-羧基甲基氨基甲基尿苷)；cnmm5um(5-羧基甲基氨基甲基-2-l-o甲基尿苷)；cmnm5s2u(5-羧基甲基氨基甲基-2-硫尿苷)；m62a(n6,n6-二甲基腺苷)；tm(2'-o-甲基肌苷)；m4c(n4-甲基胞苷)；m4cm(n4,2-o-二甲基胞苷)；hm5c(5-羥基甲基胞苷)；m3u(3-甲基尿苷)；cm5u(5-羧基甲基尿苷)；m6am(n6,t-o-二甲基腺苷)；rn62am(n6,n6,o-2-三甲基腺苷)；m2'7g(n2,7-二甲基鳥苷)；m2'2'7g(n2,n2,7-三甲基鳥苷)；m3um(3,2t-o-二甲基尿苷)；m5d(5-甲基二氫尿苷)；f5cm(5-甲?；?2'-o-甲基胞苷)；m1gm(1,2'-o-二甲基鳥苷)；m'am(1,2-0-二甲基腺苷)irino甲基尿苷)；tm5s2u(s-taurino甲基-2-硫尿苷))；img-14(4-去甲基鳥苷)；img2(異鳥苷)；或ac6a(n6-乙?；佘?、次黃嘌呤、肌苷、8-氧代-腺嘌呤、其7-取代的衍生物、二氫尿嘧啶、假尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-氨基尿嘧啶、5-(c1-c6)-烷基尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、5-(c2-c6)-烯基尿嘧啶、5-(c2-c6)-炔基尿嘧啶、5-(羥基甲基)尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羥基胞嘧啶、5-(c1-c6)-烷基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-(c2-c6)-烯基胞嘧啶、5-(c2-c6)-炔基胞嘧啶、5-氯胞嘧啶、5-氟胞嘧啶、5-溴胞嘧啶、n2-二甲基鳥嘌呤、7-去氮雜鳥嘌呤、8-氮雜鳥嘌呤、7-去氮雜-7-(c2-c6)炔基鳥嘌呤、8-羥基鳥嘌呤、6-硫鳥嘌呤、8-氧代鳥嘌呤、2-氨基嘌呤、2-氨基-6-氯嘌呤、2,4-二氨基嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、8-氮雜嘌呤等。當(dāng)基團(tuán)被定義為“不存在(null)”時(shí)，意思是該基團(tuán)不存在。術(shù)語“任選取代的”表示所涉基團(tuán)可以是取代的或未被取代的。當(dāng)被取代時(shí)，“任選取代的”基團(tuán)的取代基可以包括但不限于一個(gè)或多個(gè)獨(dú)立地選自單獨(dú)或組合的以下基團(tuán)或特別指定的一組基團(tuán)的取代基：低級(jí)烷基、低級(jí)烯基、低級(jí)炔基、低級(jí)烷?；⒌图?jí)雜烷基、低級(jí)雜環(huán)烷基、低級(jí)鹵代烷基、低級(jí)鹵代烯基、低級(jí)鹵代炔基、低級(jí)全鹵代烷基、低級(jí)全鹵代烷氧基、低級(jí)環(huán)烷基、苯基、芳基、芳氧基、低級(jí)烷氧基、低級(jí)鹵代烷氧基、氧代、低級(jí)酰氧基、羰基、羧基、低級(jí)烷基羰基、低級(jí)羧基酯、低級(jí)甲酰氨基、氰基、鹵素、羥基、氨基、低級(jí)烷基氨基、芳基氨基、酰氨基、硝基、硫醇、低級(jí)烷硫基、低級(jí)鹵代烷硫基、低級(jí)全鹵代烷硫基、芳硫基、磺酸酯、磺酸、三取代甲硅烷基、n3、sh、sch3、c(o)ch3、co2ch3、co2h、腈、cf3、環(huán)烷基、吡啶基、噻吩、呋喃基、低級(jí)氨基甲酸酯、鹵代苯基、羥基苯基、鹵代烷基和羥烷基。兩個(gè)取代基可以連接在一起以形成含有一至三個(gè)雜原子的五、六或七元芳族或非芳族碳環(huán)或雜環(huán)，例如形成亞甲二氧基或亞乙二氧基。任選取代的基團(tuán)可以是未完全取代的(例如-ch2ch3)，完全取代的(例如-cf2cf3)，單取代的(-ch2ch2f)或在完全取代和單取代之間的任何水平取代(例如-ch2cf3)。當(dāng)取代基被列出而沒有關(guān)于取代的資格時(shí)，包括取代和未取代的形式。當(dāng)取代基被認(rèn)定為“取代的”時(shí)，取代的形式是特別意圖的。另外，可以根據(jù)需要限定特定部分的不同組的任選取代基；在這些情況下，任選的取代被定義，通常緊隨短語“任選被...取代”之后。根據(jù)本發(fā)明的化合物可以提供在“藥學(xué)上可接受的制劑”中。這樣的組合物可以含有鹽、緩沖劑、防腐劑、載體和任選的其它治療劑?！八帉W(xué)上可接受的鹽”包括生理上相容并優(yōu)選無毒的鹽。例如，可以例如通過將化合物溶液與藥學(xué)上可接受的酸如鹽酸、硫酸、富馬酸、馬來酸、琥珀酸、乙酸、苯甲酸、檸檬酸、酒石酸、碳酸或磷酸的溶液混合而形成酸加成鹽。此外，當(dāng)化合物攜帶酸性部分時(shí)，其合適的藥學(xué)上可接受的鹽可包括堿金屬鹽(例如鈉鹽或鉀鹽)；堿土金屬鹽(如鈣鹽或鎂鹽)；與合適的有機(jī)配體形成的鹽(例如，使用抗衡陰離子如鹵化物、氫氧化物、羧酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽、硝酸鹽、烷基磺酸鹽和芳基磺酸鹽形成的銨、季銨和胺陽離子)。藥學(xué)上可接受的鹽的說明性實(shí)例包括但不限于乙酸鹽、己二酸鹽、藻酸鹽、抗壞血酸鹽、天冬氨酸鹽、苯磺酸鹽、苯甲酸鹽、碳酸氫鹽、硫酸氫鹽、酒石酸氫鹽、硼酸鹽、溴化物、丁酸鹽、依地酸鈣、樟腦酸鹽(camphorate)、樟腦磺酸鹽、右旋樟腦磺酸鹽(camsylate)、碳酸鹽、氯化物、檸檬酸鹽、克拉維酸鹽、環(huán)戊烷丙酸鹽、二葡糖酸鹽、二鹽酸鹽、十二烷基硫酸鹽、依地酸鹽、乙二磺酸鹽、丙酸酯月桂硫酸鹽(estolate)、乙磺酸鹽(esylate)、乙烷磺酸鹽(ethanesulfonate)、甲酸鹽、富馬酸鹽、葡庚糖酸鹽(gluceptate)、葡庚糖酸鹽(glucoheptonate)、葡糖酸鹽、谷氨酸鹽、甘油磷酸鹽、glycolylarsanilate、半硫酸鹽、庚酸鹽、己酸鹽、己基resorcinate、海巴明(hydrabamine)、氫溴酸鹽、鹽酸鹽、氫碘酸鹽、2-羥基-乙磺酸鹽、羥基萘甲酸鹽、碘化物、異硫化羥酸鹽(isothionate)、乳酸鹽、乳糖酸鹽、月桂酸鹽、月桂基硫酸鹽、蘋果酸鹽、馬來酸鹽、丙二酸鹽、扁桃酸鹽、甲磺酸鹽、甲烷磺酸鹽、甲基硫酸鹽、粘酸鹽、2-萘磺酸鹽、萘磺酸鹽、煙酸鹽、硝酸鹽、n-甲基葡糖胺銨鹽、油酸鹽、草酸鹽、撲酸鹽(雙羥萘酸鹽)、棕櫚酸鹽、泛酸鹽、果膠酸鹽、過硫酸鹽、3-苯基丙酸鹽、磷酸鹽/二磷酸鹽(diphosphate)、苦味酸鹽、新戊酸鹽、聚半乳糖醛酸鹽、丙酸鹽、水楊酸鹽、硬脂酸鹽、硫酸鹽、次乙酸鹽、琥珀酸鹽、鞣酸鹽、酒石酸鹽、teoclate、甲苯磺酸鹽、三乙基碘(triethiodide)、十一酸鹽、戊酸鹽等(參見例如berge,s.m.等人j.pharm.sci.1977,66,1-19)。術(shù)語“peg”是指具有重復(fù)單元的聚合物，其中n2是2至12。直鏈或支鏈聚乙二醇聚合物包括在此術(shù)語中，并且包括聚乙二醇的單甲基醚(mpeg)。術(shù)語“peg”還包括newkome型樹突狀分子，例如peg以多種配方(例如carbowaxtm(dowchemical,midland,mi)、(archchemicals,norwalkct)和solbase)是商業(yè)可得的。術(shù)語“聚胺”是指含有具有至少一個(gè)氨基氫原子的至少兩個(gè)氨基的胺化合物。聚胺的實(shí)例包括但不限于聚乙烯亞胺、聚丙烯-亞胺、聚乙烯胺、聚烯丙胺、乙二胺、六亞甲基二胺、二亞乙基三胺、三亞乙基四胺、四亞乙基五胺和雙六亞甲基三胺。在本文公開的式中，表達(dá)式是指5’→3’取向的rna。實(shí)施例材料和方法：除非另有說明，所有試劑均購(gòu)自商業(yè)來源，不經(jīng)處理便使用。在topspin程序控制下，使用icon-nmr在brukeravance400mhz或500mhznmr波譜儀上進(jìn)行nmr波譜測(cè)定。記錄13cnmr和31pnmr波譜。在298k下測(cè)量波譜，除非另有說明，并且參考相對(duì)于溶劑共振?；瘜W(xué)位移(δ)以ppm表示，信號(hào)描述為s(單峰)、d(雙峰)、t(三重峰)、q(四重峰)和m(多重峰)。由以下配置的各種儀器使用電噴霧電離方法在lc-ms系統(tǒng)上獲得質(zhì)譜。[m+h+]+是指化學(xué)物質(zhì)的質(zhì)子化分子離子。[m-h+]-指化學(xué)物質(zhì)的去質(zhì)子化分子離子。lcms方法1rxnmon_acidclcms方法2rxnmonacidic_polar_＝rxnmonacidic_polar_posneglcms方法4rxnmon_basic_polarlcms方法5sq4mrnacap_fiaacidiclcms方法6acquitylctp2tof_產(chǎn)物分析酸性的lcms方法7sq4酸性極性的lcms方法8sq4酸性的lcms方法9ipclcms方法10監(jiān)控(scout)堿性肽縮寫:atp腺苷5’-三磷酸atm大氣acoh乙酸aq含水的ar芳基br寬的br.s.,bs寬單峰bsa牛血清白蛋白℃攝氏度cdcl3氘代氯仿ch2cl2,dcm二氯甲烷ch3cn,mecn乙腈d雙重峰dd雙二重峰ddd雙重峰的雙二重峰dipean-乙基二異丙基胺dmfn,n-二甲基甲酰胺dmap二甲基氨基吡啶dmso二甲基亞砜dt雙三重峰e(cuò)si電噴霧電離etoac乙酸乙酯etoh乙醇fcc快速柱色譜法g號(hào)(gauge)gmp鳥苷5’-單磷酸gdp鳥苷5’-二磷酸gtp鳥苷5’-三磷酸h小時(shí)hcl鹽酸hatu1-[雙(二甲基氨基)亞甲基]-1h-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶3-氧化物六氟磷酸鹽hbtuo-(苯并三唑-1-基)-n,n,n′,n′-四甲基脲六氟磷酸鹽hepes2-[4-(2-羥基乙基)哌嗪-1-基]乙烷磺酸hfip六氟異丙醇hobt羥基苯并三唑hplc高壓液相色譜法i-proh異丙醇h2o水k開爾文koh氫氧化鉀lc液相色譜法m摩爾的m多重峰,質(zhì)量meoh甲醇mes2-(n-嗎啉代)乙烷磺酸mgso4硫酸鎂mhz兆赫ml毫升mm毫米mmol毫摩爾min.分鐘mrna信使核糖核酸ms質(zhì)譜mw微波m/z質(zhì)荷比naoh氫氧化鈉na2so4硫酸鈉net3三乙胺nh3氨nmr核磁共振pbs磷酸鹽緩沖液ppt沉淀ppm百萬分之率rbf圓底燒瓶rf阻滯因子rp反相rt,rt室溫rt保留時(shí)間s單峰sat.飽和的sm原料t三重峰tba三丁胺tea三乙胺teab三乙基碳酸氫銨tfa三氟乙酸t(yī)hf四氫呋喃tlc薄層色譜法tris2-氨基-2-羥基甲基-丙烷-1,3-二醇uplc超高效液相色譜法tris·hcl氨基三(羥基甲基)甲烷鹽酸鹽wt重量xphospdg2第2代xphosprecatalyst,氯(2-二環(huán)己基膦基-2′,4′,6′-三異丙基-1,1′-聯(lián)苯基)[2-(2′-氨基-1,1′-聯(lián)苯基)]鈀(ii)μg微克μl微升核苷酸三烷基銨鹽根據(jù)文獻(xiàn)方法(y.thillier,e.decroly,f.morvan,b.canard,j.-j.vasseur,f.debartrna2012,18,856-868；gmpna-鹽:sigma-aldrichno.g8377；gdpna-鹽:sigma-aldrichno.g7127；2’-脫氧gmpna-鹽:sigma-aldrichno.d9500；肌苷5’-單磷酸na-鹽:sigma-aldrichno.i4625；肌苷5’-二磷酸na-鹽:sigma-aldrichno.i4375)或在類似于下述那些條件從相應(yīng)的市售鈉鹽獲得。gmp三乙基銨鹽:將gmp鈉鹽(2.0g,4.91mmol)溶解于無rnase水(40ml)中并通過dowex樹脂(50wx8,40g,用h2o徹底淋洗)進(jìn)入冰冷的三乙胺(10g,98mmol)的etoh(60ml)溶液中。洗脫，隨后測(cè)量洗脫液的uv吸收，并將樹脂用水淋洗，直到?jīng)]有進(jìn)一步的gmp洗脫出。將得到的溶液在真空中濃縮至約500ml，然后凍干，獲得標(biāo)題產(chǎn)物，為白色固體(2.2g,gmp/tea1/2，通過1h-nmr判斷).gdp三丁基銨鹽:將gdp-二鈉鹽(1.17g,2.40mmol)溶解于水(100ml)中并通過dowex樹脂(50wx8,10ml,>1.7meq/ml,用h2o徹底淋洗)進(jìn)入冰冷的三丁基胺(1.34g,7.20mmol)的etoh(20ml)溶液中。將樹脂用水(1000ml)淋洗，并將得到的溶液在真空中濃縮至約500ml)，然后凍干，獲得標(biāo)題產(chǎn)物，為無色固體(1.88g,gdp/tba1/2.5，通過1h-nmr判斷)。gmpn7烷基化的通用方法方法a:在2-打蘭(dram)小瓶中，將鳥苷單磷酸三丁基銨鹽(50mg,68umol)溶解于dmso(680ul)中，并用商業(yè)可獲得的烷基溴或烷基氯試劑(4equiv.)處理。當(dāng)使用氯化物烷基化試劑時(shí)并且在(2-溴乙氧基)-苯底物情況下，加入nai(5mg,0.5eq.)。將獲得的溶液在40℃振搖或攪拌18h。將獲得的溶液直接通過hplc(反相,h2o+0.1％tfa至mecn+0.1％tfa0-100％)純化。將含有需要的產(chǎn)物的級(jí)分合并，并通過凍干除去溶劑，獲得純產(chǎn)物，為無色固體或泡沫狀物。方法b:在2-打蘭小瓶中，將0.1mgmp或gdp三乙基-或三丁基銨鹽的dmso溶液用溴化物烷基化試劑(4equiv.)處理。將溶液在室溫或55℃攪拌18h，然后直接通過反相柱色譜法(iscoteledynec18aq.洗脫液:0.1m三乙基碳酸氫銨(ph＝8.0)至mecn0-100％)純化。將含有需要的產(chǎn)物的級(jí)分合并，并通過凍干除去溶劑，獲得為三丁基銨鹽的純產(chǎn)物，為無色固體或泡沫狀物。實(shí)施例1.n7-([1,1'-聯(lián)苯]-4-基甲基)-5’-gmptea鹽將鳥苷單磷酸三乙基銨鹽(100mg,0.177mmol)和4-聯(lián)苯基甲基溴(175mg,0.710mmol)的dmso(1ml)溶液在55℃攪拌過夜。將溶液直接通過反相柱色譜法(iscoteledynec1830ggold柱,洗脫液a:0.1mteab；b:20％mecn的0.1mteab溶液；梯度:0-100％b/a)純化。合并產(chǎn)物級(jí)分并凍干，得到為白色粉末的標(biāo)題化合物(38mg,28％).1hnmr(400mhz,d2o)δppm:7.58-7.67(4h,m),7.46-7.53(4h,m),7.38-7.46(1h,m),5.97-6.03(1h,m),5.63-5.76(2h,m),4.62-4.69(1h,m),4.46-4.52(1h,m),4.32-4.40(1h,m),3.97-4.18(2h,m),3.11-3.25(8.6h,q),1.20-1.34(13h,t).31pnmr(162mhz,d2o):δppm:3.73(1p).lcms方法2rt:1.39min,ms[m+h]+觀測(cè)值:529.8.計(jì)算值:530.1.實(shí)施例2.n7-([1,1'-聯(lián)苯]-4-基甲基)-5’-gdptea鹽將鳥苷二磷酸三乙基銨鹽(400mg,0.538mmol)和4-聯(lián)苯基甲基溴(400mg,1.619mmol)的dmso(2ml)溶液在室溫?cái)嚢柽^夜。加入1mnaclo4丙酮溶液(3.23ml)，然后用丙酮稀釋。通過離心分離沉淀，用丙酮洗滌并在真空下干燥。將如此獲得的固體溶解于0.1mteab(5ml)中。將得到的溶液通過反相柱色譜法純化(isco,teledynec18,30ggold柱,洗脫液a:0.1mteab；b:90％mecn的0.1mteab溶液；梯度:0-100％b/a)。合并產(chǎn)物級(jí)分并凍干，得到標(biāo)題化合物，為白色粉末(90mg,18％).1hnmr(400mhz,d2o)δppm:7.57-7.67(4h,m),7.39-7.53(5h,m),5.92-6.00(1h,d),5.64-5.75(2h,m),4.67-4.72(2h,m),4.56-4.64(1h,m),4.34-4.40(1h,m),4.26-4.34(2h,m),3.12-3.24(12h,q),1.27(18h,t).31pnmr(162mhz,d2o):δppm:7.16(1p),10.93(1p).lcms方法2rt:1.43min,ms[m-h]+觀測(cè)值:608.2,計(jì)算值:608.1.實(shí)施例3.n7-(4-氯苯氧基乙基)-5’-gdptea鹽將鳥苷二磷酸三乙基銨鹽(500mg,0.672mmol)和4-氯苯基2-溴乙基醚(633mg,2.69mmol)的dmso(4ml)溶液在55℃攪拌過夜。加入1mnaclo4丙酮溶液(4ml)，然后用丙酮稀釋。通過離心分離沉淀，用丙酮洗滌并在真空下干燥。將如此獲得的固體溶解于0.1mteab(5ml)中。將得到的溶液通過離子交換色譜法純化(tosoh,tskgeldeae-5pw,21.5mmx15cm,13μm,洗脫液a:h2o；b:1mteab的水溶液；梯度:0-100％b/a)。合并產(chǎn)物級(jí)分并凍干，得到標(biāo)題化合物，為白色粉末(25mg,4％).1hnmr(400mhz,d2o)δppm:7.22-7.31(2h,d),6.86-6.94(2h,d),5.96-6.03(1h,m),4.46-4.52(1h,m),4.37-4.44(1h,m),4.29-4.37(1h,m),4.19-4.29(2h,m),3.12-3.26(9h,q),1.20-1.34(16h,t).31pnmr(162mhz,d2o):δppm:9.91(1p),11.28(1p).lcms方法2rt:1.20min,ms[m-h]+觀測(cè)值:596.8,計(jì)算值:596.0.實(shí)施例4.n7-(4-氯苯氧基乙基)-5’-gmptea鹽如先前所述制備(a.r.kore等人bioorg.med.chem.2013,21,4570；chen等人j.med.chem.2012,55,3837)。獲得產(chǎn)物，為白色粉末(84mg,12％).1hnmr(400mhz,d2o)δppm:7.18-7.27(2h,d),6.83-6.93(2h,d),5.92-6.02(1h,m),4.41-4.48(1h,m),4.33-4.41(1h,m),4.11-4.20(1h,m),3.97-4.09(1h,m),3.13-3.26(10h,q),1.20-1.34(15h,t).31pnmr(162mhz,d2o):δppm:3.39(1p).lcms方法2rt:1.20min,ms[m+h]+觀測(cè)值:517.8,計(jì)算值:518.1.實(shí)施例5.n7-芐基-5’-gmptea鹽如先前所述制備(brown等人j.molbiol.2007,372,7-15).獲得產(chǎn)物，為白色粉末(55mg,38％).1hnmr(400mhz,d2o)δppm:7.33-7.45(5h,m),6.02-6.11(1h,m),5.64-5.73(2h,m),4.44-4.53(1h,m),4.33-4.42(1h,m),3.96-4.17(2h,m),3.19(10h,q),1.27(14h,t).31pnmr(162mhz,d2o):δppm:3.78(1p).lcms方法2rt:0.84min,ms[m+h]+觀測(cè)值:454.2,計(jì)算值:454.1.實(shí)施例6.n7-(6-苯基吡啶-3-基)甲基)-5’-gmptea鹽步驟1.5-(溴甲基)-2-苯基吡啶將(6-苯基吡啶-3-基)甲醇(300mg,1.620mmol)在33％hbr的乙酸溶液(2.93ml,16.20mmol)中的溶液在40℃攪拌過夜。蒸發(fā)揮發(fā)物。將殘留物在dcm間分配，用碳酸氫鈉溶液稀釋，并分離有機(jī)層。將有機(jī)層用水洗滌，干燥并在真空下濃縮，得到固體(277mg,69％).lcms方法3rt:1.36min,ms[m+h]+觀測(cè)值:249.9,計(jì)算值:250.0.步驟2.n7-(6-苯基吡啶-3-基)甲基)-5’-gmptea鹽通過實(shí)施例5中所述的方法由130mggmptea鹽制備標(biāo)題化合物(40mg,23％)。1hnmr(400mhz,d2o)δppm:8.57-8.66(1h,m),7.85-7.93(1h,m),7.66-7.82(3h,m),7.39-7.52(3h,m),5.91-6.02(1h,m),5.58-5.77(2h,m),4.42-4.50(1h,m),4.28-4.37(1h,m),4.06-4.17(1h,m),3.95-4.02(1h,m),3.06-3.23(10h,m),1.11-1.30(15h,m).31pnmr(162mhz,d2o):δppm:3.54(1p).lcms方法2rt:0.91min,ms[m+h]+觀測(cè)值:531.0,計(jì)算值:531.1.實(shí)施例7.n7-([1,1'-聯(lián)苯]-4-基甲基)-2’,3’-亞異丙基-5’-gmptea鹽步驟1:n7-([1,1'-聯(lián)苯]-4-基甲基)-2’,3’-亞異丙基鳥苷將2’,3’-亞異丙基鳥苷(500mg,1.547mmol)和4-聯(lián)苯基甲基溴(145mg,0.849mmol)的dmso(2ml)溶液在室溫?cái)嚢柽^夜。將溶液通過反相hplc直接純化(x-bridge50x50mmm,5μm柱,洗脫液a:含有5mmnh4oh的水；b含有5mmnh4oh的mecn；梯度:15-40％b/a)。合并產(chǎn)物級(jí)分并凍干，得到標(biāo)題化合物，為白色粉末(260mg,34％).lcms方法1rt:1.02min,ms[m+h]+觀測(cè)值:490.1,計(jì)算值:490.2.步驟2:n7-([1,1'-聯(lián)苯]-4-基甲基)-2’,3’-亞異丙基-5’-gmptea鹽在0℃和在n2攪拌下，將三氯氧磷(95μl,1.021mmol)緩慢加入n7-([1,1'-聯(lián)苯]-4-基甲基)-2’,3’-亞異丙基鳥苷(100mg,0.204mmol)的磷酸三甲酯(1ml)混合物中，持續(xù)3hrs。在0℃將反應(yīng)混合物滴加至1mteab溶液(3ml)中，將得到的混合物離心。將如此獲得的溶液通過反相柱色譜法純化(iscoteledynec1830ggold柱,洗脫液a:0.1mteab；b:30％mecn的0.1mteab溶液；梯度:0-100％b/a)。合并產(chǎn)物級(jí)分并凍干，得到標(biāo)題化合物，為白色粉末(38mg,24％).1hnmr(400mhz,d2o)δppm:9.70-9.90(1h,br),7.57-7.69(4h,m),7.29-7.57(5h,m),6.01-6.13(1h,m),5.61-5.78(2h,m),5.34-5.41(1h,m),5.09-5.15(1h,m),4.52-4.60(1h,m),3.98-4.09(1h,m),3.80-3.92(1h,m),2.60(8h,q),1.50(3h,s),1.34(4h,s),1.00(14h,t).31c(162mhz,d2o):δppm:0.224(1p).lcms方法4rt:0.94min,ms[m+h]+觀測(cè)值:570.1,計(jì)算值:570.2.實(shí)施例8.7-([1,1'-聯(lián)苯]-4-基甲基)-2-氨基-9-((2-(膦?；趸?乙氧基)甲基)-9h-嘌呤-7--6-醇鹽三乙基銨鹽步驟1:7-([1,1'-聯(lián)苯]-4-基甲基)-2-氨基-9-((2-羥基乙氧基)甲基)-9h-嘌呤-7--6-醇鹽無環(huán)鳥苷(sigma-aldrichno.a4669)的烷基化按照通用方法b進(jìn)行。lc-ms方法1rt＝0.95mins；msm/z[m+h]+392.2.步驟2:7-([1,1'-聯(lián)苯]-4-基甲基)-2-氨基-9-((2-(膦?；趸?乙氧基)甲基)-9h-嘌呤-7--6-醇鹽三乙基銨鹽將步驟1中獲得的醇(73mg,0.19mmol)混懸在po(ome)3(1.9ml)中，并加入pocl3(86mg,0.56mmol)。將溶液在rt攪拌3h，然后通過加入teab(0.1m,1ml)淬滅。將獲得的溶液直接通過柱色譜法純化(isocrpc18aq用teab0.1m和mecn洗脫；0-100％mecn)。將獲得的級(jí)分凍干后，獲得產(chǎn)物，為無色泡沫(84mg,0.14mmol,75％,磷酸酯與net3比例1/1.4，通過1h-nmr測(cè)定).lc-ms方法6rt＝1.79mins；msm/z[m+h]+472.1168；計(jì)算值:472.1145,1hnmr(400mhz,d2o)δ7.457.44(3h,m),7.54(2h,d,j＝8.14hz),7.50(2h,d,j＝7.80hz),5.53(2h,s),5.50(2h,s),3.78–3.74(2h,m),3.65–3.62(2h,m),3.05(8.4h,q,j＝7.34hz,net3),1.13(12.7h,t,j＝7.56hz,net3).實(shí)施例9.7-([1,1'-聯(lián)苯]-4-基甲基)-2-氨基-9-((2-((羥基(膦?；趸?磷?；?氧基)乙氧基)甲基)-9h-嘌呤-7--6-醇鹽三乙基銨鹽步驟1:將無環(huán)鳥苷磷酸酯三乙基銨鹽(如上所述獲得的,77mg,0.13mmol)混懸在dmf(無水的,6.7ml)和咪唑(101mg,1.48mmol)中，加入2,2’-二吡啶基二硫醚(151mg,0.685mmol)和net3(34mg,0.24mmol)。將混懸液在rt攪拌10min，然后加入三苯基膦(183mg,0.698mmol)。反應(yīng)混合物變?yōu)闇\黃色，并在rt攪拌5h。加入naclo4的丙酮溶液(1m,2.1ml)和丙酮(15ml)，并將混懸液在冰上保持10min。將得到的溶液離心(3min,2000xg)，并將沉淀物用10ml冰冷的丙酮洗滌兩次。將沉淀物在真空下干燥獲得咪唑活化的磷酸酯(50mg,0.096mmol,71％)，其沒有進(jìn)一步純化直接使用。步驟2:將步驟1中獲得的活化的磷酸酯混懸在dmf(0.5ml)中，并加入磷酸三丁基銨鹽(1.0m的dmf溶液,0.5ml,0.479mmol)和zncl2(13mg,0.096mmol)。將溶液在rt劇烈攪拌5h，然后直接通過柱色譜法在iscorpaq18上純化，用0.1mteab和mecn洗脫，0至100％mecn。凍干含有產(chǎn)物的級(jí)分，得到標(biāo)題產(chǎn)物，為無色固體(52mg,0.065mmol,68％,磷酸酯與net3的比例1/2.45，通過1hnmr測(cè)定).lc-ms:rt＝0.99mins；msm/z[m+h]+552.1lcms方法1；1hnmr(400mhz,d2o)δ7.59–7.54(4h,m),7.40–7.36(4h,m),7.32–7.28(1h,m),5.58(2h,s),5.55(2h,s),3.98–3.94(2h,m),3.73–3.71(2h,m),3.08(q,j＝7.22hz,net3),1.13(12.7h,t,j＝7.56hz,net3).實(shí)施例10.7-((2-氯-[1,1'-聯(lián)苯]-4-基)甲基)-5’-gdptea鹽步驟1:2-氯-4-甲基-1,1'-聯(lián)苯在2打蘭小瓶中，將苯基碘(200mg,0.98mmol)和(2-氯-4-甲基苯基)硼酸(167mg,0.98mmol)溶解在dmf(4.9ml)中。加入k2co3水溶液(542mg在400μlh2o中)和sphospalladacycleg2(7.1mg,9.8μmol)，并將得到的混懸液在80℃劇烈攪拌3h。冷卻至室溫后，加入dcm(5ml)，并將有機(jī)層用水(10ml)，10％licl(aq.,3x10ml)洗滌，并用na2so4干燥。將在真空中除去溶劑后獲得的殘留物通過快速色譜法純化(sio2,庚烷至20％etoac的庚烷溶液)。獲得2-氯-4-甲基-1,1'-聯(lián)苯，為無色油狀物(147mg,0.725mmol,74％).1hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.457.44(3h,m),7.41–7.36(1h,m),7.32(1h,brs),7.25(1h,d,j＝7.58hz),7.14(1h,d,j＝7.58hz),2.40(3h,s).步驟2:4-(溴甲基)-2-氯-1,1'-聯(lián)苯將2-氯-4-甲基-1,1'-聯(lián)苯(140mg,0.691mmol)、n-溴琥珀酰亞胺(135mg,0.760mmol)和偶氮二異丁腈(11mg,0.069mmol)溶解在ccl4(6.9ml)中，并將溶液在85℃攪拌1h。在真空下除去溶劑，并將殘留物通過快速色譜法純化(sio2,庚烷至20％etoac的庚烷溶液)，獲得標(biāo)題化合物，為含有原料的混合物(3:1,，通過1hnmr判斷)，為無色固體(173mg,0.406mmol,66％)。將如此的混合物用于隨后的烷基化反應(yīng)。步驟3:7-((2-氯-[1,1'-聯(lián)苯]-4-基)甲基)-5’-gdptea鹽按照通用方法b，將gdp三丁基銨鹽(70mg,0.086mmol)用步驟2的產(chǎn)物(73mg,0.26mmol)烷基化。獲得標(biāo)題產(chǎn)物，為無色固體(30mg,0.036mmol,42％).lcms方法1:rt＝1.01mins；msm/z[m+h]+644.0；1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ10.42(1h,s),7.93(1h,s),7.78(1h,d,j＝8.12hz),7.72-7.63(1h,m),7.47-7.35(9h,m),5.81(1h,s),5.72(1h,brs),4.48(1h,brs),4.40(1h,brs),4.14-4.04(3h,m),3.34(br,net3),1.03(12.7h,t,j＝7.56hz,net3).實(shí)施例11.7-((3-甲氧基-[1,1'-聯(lián)苯]-4-基)甲基)-5’-gdptea鹽步驟1:3-甲氧基-4-甲基-1,1'-聯(lián)苯在2打蘭小瓶中，將苯基碘(200mg,0.98mmol)和(3-甲氧基-4-甲基苯基)硼酸(163mg,0.98mmol)溶解在dmf(4.9ml)中。加入k2co3水溶液(542mg在400μlh2o中)，并加入sphospalladacycleg2(7.1mg,9.8μmol)，并將得到的混懸液在80℃劇烈攪拌12h。冷卻至室溫后，加入dcm(5ml)，并將有機(jī)層用水(10ml),10％licl(aq.,3x10ml)洗滌，并用na2so4干燥。將在真空中除去溶劑后獲得的殘留物通過快速色譜法純化(sio2,庚烷至20％etoac的庚烷溶液)。獲得3-甲氧基-4-甲基-1,1'-聯(lián)苯，為無色油狀物(149mg,0.752mmol,77％).1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ7.70-7.66(2h,m),7.53–7.49(2h,m),7.44–7.39(1h,m),7.28(1h,d,j＝7.04hz),7.19(1h,dd,j＝7.60,1.77hz),7.13(1h,d,j＝1.50hz),3.97(3h,s),2.37(3h,s).步驟2:4-(溴甲基)-3-甲氧基-1,1'-聯(lián)苯將3-甲氧基-4-甲基-1,1'-聯(lián)苯(147mg,0.741mmol)、n-溴琥珀酰亞胺(145mg,0.816mmol)和偶氮二異丁腈(12mg,0.074mmol)溶解在ccl4(7.4ml)中，并將溶液在85℃攪拌1h。在真空下除去溶劑，并將殘留物通過快速色譜法純化(sio2,庚烷至20％etoac的庚烷溶液)，獲得標(biāo)題化合物，為無色固體(163mg,0.588mmol,79％).1hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.62-7.59(2h,m),7.49–7.45(2h,m),7.43–7.39(2h,m),7.18(1h,dd,j＝7.75,1.66hz),7.11(1h,d,j＝1.59hz),4.65(2h,s),3.99(3h,s).步驟3:7-((3-甲氧基-[1,1'-聯(lián)苯]-4-基)甲基)-5’-gdptea鹽按照通用方法b，將gdp三丁基銨鹽(100mg,0.123mmol)用步驟2的產(chǎn)物(102mg,0.369mmol)烷基化。獲得標(biāo)題產(chǎn)物，為無色固體(46mg,0.056mmol,45％).lcms方法1rt＝0.99mins；msm/z[m+h]+640.0；1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ9.80(1h,s),7.66(2h,d,j＝7.49hz),7.47-7.43(3h,m),7.38–7.34(1h,m),7.21(1h,brs),7.15(1h,d,j＝7.59hz),5.83(1h,s),5.56(2h,s),4.48(2h,s),4.14(1h,brs),4.06(1h,brs),3.95(3h,s),2.68(br,net3),1.04(t,j＝6.81hz,net3).實(shí)施例12.7-(6-苯基吡啶-2(1h)-酮-3-基)-5’-gdptea鹽步驟1:3-(羥基甲基)-6-苯基吡啶-2(1h)-酮向2-氧代-6-苯基-1,2-二氫吡啶-3-甲酸(533mg,2.48mmol)的thf(24ml)溶液中，加入硼烷二甲基硫醚絡(luò)合物(1.0m的thf溶液,991μl,9.91mmol)，并將混懸液在室溫?cái)嚢?8h。緩慢加入meoh，直到氣體產(chǎn)生停止。將得到的溶液在etoac和鹽水間分配，并將有機(jī)層用naso4干燥。在真空下除去溶劑，并通過快速色譜法(sio2,dcm至5％meoh的dcm溶液)純化殘留物，得到標(biāo)題化合物，為淡黃色固體(331mg,1.65mmol,66％).lcms方法1rt＝0.89mins；msm/z[m-oh-]+183.6.步驟2:3-(溴甲基)-6-苯基吡啶-2(1h)-酮將3-(羥基甲基)-6-苯基吡啶-2(1h)-酮(331mg,1.65mmol)用hbr(aq.48％,16.5ml)處理，并將混懸液在室溫?cái)嚢?h，然后在60℃攪拌1h。在此期間，混懸液首先澄清，然后形成沉淀。過濾沉淀，用水充分洗滌，并在真空中干燥，得到3-(溴甲基)-6-苯基吡啶-2(1h)-酮，為無色粉末(388mg,1.469mmol,89％).1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ7.08-7.74(4h,m),7.55-7.51(3h,m),7.50-7.46(1h,m),5.28(2h,s).步驟3:7-(6-苯基吡啶-2(1h)-酮-3-基)-5’-gdptea鹽按照通用方法b將gdp三丁基銨鹽(100mg,0.123mmol)用步驟2的產(chǎn)物(102mg,0.369mmol)烷基化。獲得標(biāo)題產(chǎn)物，為無色固體(46mg,0.056mmol,45％).lcms方法1rt＝0.73mins；msm/z[m+h]+627.1；1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ9.7(1h,s),7.78–7.76(2h,m),7.63(1h,d,j＝7.33hz),7.47-7.55(5h,m),6.69(1h,d,j＝7.33hz),5.82(1h,d,j＝2.04hz),5.45(2h,s),4.47(1h,br),4.40(1h,dd,j＝5.48hz),4.13(1h,br),4.08(1h,br),4.03(1h,br),3.35(br,net3),1.05(t,j＝6.49hz,net3).實(shí)施例13.7-(3,5-二甲基芐基)-5’-gdptea鹽按照通用方法b將gdp三丁基銨鹽(150mg,0.184mmol)用3,5-二甲基芐基溴(110mg,0.553mmol)烷基化。獲得標(biāo)題產(chǎn)物，為無色固體(66mg,0.090mmol,49％).lcms方法1rt＝0.80mins；msm/z[m+h]+561.9；1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ10.38(1h,s),8.20(1h,d,j＝7.48hz),7.95(1h,d,j＝8.73hz),7.65–7.58(1h,m),5.81(2h,brs),4.44(1h,brs),4.38(1h,brs),4.13–4.04(2h,m),2.69(br,net3),1.05(t,j＝6.49hz,net3).實(shí)施例14.7-(3-氟芐基)-鳥苷-5’-gdptea鹽按照通用方法b將gdp三丁基銨鹽(150mg,0.184mmol)用3-氟芐基溴(105mg,0.553mmol)烷基化。獲得標(biāo)題產(chǎn)物，為無色固體(40mg,0.055mmol,30％).lcms方法1:rt＝0.59mins；msm/z[m+h]+551.9；1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ10.38(1h,s),7.61(1h,d,j＝9.96hz),7.54(1h,d,j＝7.87hz),7.38(1h,dd,j＝14.50,7.44hz),5.79(1h,d,j＝1.82hz),5.66(1h,brs),4.45(1h,brs),4.39(1h,brs),4.11–4.05(2h,m),2.73(br,net3),1.05(t,j＝6.49hz,net3).實(shí)施例15.7-((3-氟-[1,1'-聯(lián)苯]-4-基)甲基)-5’-gdptea鹽步驟1:3-氟-4-甲基-1,1'-聯(lián)苯在2打蘭小瓶中，將苯基碘(800mg,3.92mmol)和(3-氟-4-甲基苯基)硼酸(604mg,3.92mmol)溶解在dmf(19.6ml)中。加入k2co3水溶液(2.17g在1.9mlh2o中)和sphospalladacycleg2(28.3mg,39.0μmol)，并將得到的混懸液在80℃劇烈攪拌16h。冷卻至室溫后，加入dcm(15ml)，并將有機(jī)層用水(10ml)、10％licl(aq.,3x10ml)洗滌，并用na2so4干燥。將在真空中除去溶劑后獲得的殘留物通過快速色譜法純化(sio2,庚烷至20％etoac的庚烷溶液)。獲得3-氟-4-甲基-1,1'-聯(lián)苯，為無色油狀物(746mg,3.61mmol,91％,90％純度).1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ7.69–7.66(2h,m),7.48–7.36(6h,m),2.27(3h,d,j＝1.68hz).步驟2:4-(溴甲基)-3-氟-1,1'-聯(lián)苯將3-氟-4-甲基-1,1'-聯(lián)苯(300mg,1.611mmol)、n-溴琥珀酰亞胺(315mg,1.77mmol)和偶氮二異丁腈(26.5mg,0.161mmol)溶解在ccl4(16ml)中，并將溶液在85℃攪拌1h。在真空下除去溶劑，并將殘留物通過快速色譜法純化(sio2,庚烷至20％etoac的庚烷溶液)，獲得標(biāo)題化合物，為淡黃色固體(311mg,1.17mmol,72％).1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ7.74–7.71(2h,m),7.62(1h,d,j＝7.92hz),7.57(1h,dd,j＝11.47,1.70hz),7.53(1h,dd,j＝7.92,1.60hz),7.51–7.46(2h,m),7.43–7.38(1h,m).步驟3:7-((3-氟-[1,1'-聯(lián)苯]-4-基)甲基)-5’-gdptea鹽按照通用方法b將gdp三丁基銨鹽(150mg,0.184mmol)用步驟2中獲得的溴化物(147mg,0.553mmol)烷基化。獲得標(biāo)題產(chǎn)物，為無色固體(45mg,0.056mmol,30％).lcms方法1rt＝0.96mins；msm/z[m+h]+627.9；1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ10.13(1h,s),7.69–7.67(2h,m),7.55–7.50(2h,m),7.48–7.44(3h,m),7.41–7.38(1h,m),5.84–5.78(2h,m),4.46–4.43(2h,m),4.11–4.06(2h,m),2.75(br,net3),1.05(t,j＝6.49hz,net3).實(shí)施例16.7-(二苯甲基)-鳥苷-5’-gdptea鹽按照通用方法b將gdp三丁基銨鹽(150mg,0.184mmol)用二苯甲基溴(91mg,0.369mmol)烷基化。獲得標(biāo)題產(chǎn)物，為無色固體(20mg,0.021mmol,30％).lcms方法1rt＝0.90mins；msm/z[m+h]+610.1；1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ7.53–7.47(2h,m),7.44–7.29(8h,m),5.86(1h,d,j＝4.62hz),5.82(1h,d,j＝4.32),4.72(1h,brs),4.48–4.40(1h,brs),4.20–4.02(3h,m),3.98–3.92(2h,m),2.62(br,net3),1.00(t,j＝6.49hz,net3).實(shí)施例17.7-((1-(5-甲基-1,2,4-二唑-3-基)苯基4-基)甲基)-5’-gdptea鹽n7-烷基化gmp衍生物的分析數(shù)據(jù)提供在表1中。下面的類似物通過與通用方法a或b或?qū)嵤├?-17中所述的方法類似的方法制備。表1:n7-烷基化gmp衍生物的分析數(shù)據(jù).n7-烷基化gdp衍生物的分析數(shù)據(jù)提供在表2中。下面的類似物通過與通用方法a或b或?qū)嵤├?-17中所述的方法類似的方法制備。表2:n7-烷基化gdp衍生物的分析數(shù)據(jù)n7-烷基化肌苷衍生物的分析數(shù)據(jù)提供在3表中。下面的類似物通過與通用方法a或b或?qū)嵤├?-17中所述的方法類似的方法制備。表3:n7-烷基化肌苷衍生物的分析數(shù)據(jù).c8取代的黃嘌呤的合成方法實(shí)施例18.7-([1,1'-聯(lián)苯]-4-基甲基)-8-溴-3-甲基-1h-嘌呤-2,6(3h,7h)-二酮將8-溴-3-甲基-1h-嘌呤-2,6(3h,7h)-二酮(245mg,1.000mmol)、4-(溴甲基)-1,1'-聯(lián)苯(247mg,1.000mmol)和k2co3(38.5mg,1.000mmol)的dmf(5ml)混合物在rt攪拌過夜。將水加入反應(yīng)混合物。將得到的固體通過過濾收集，用水洗滌并干燥。isco純化(silica80g,0-5％meoh的dcm溶液)提供標(biāo)題產(chǎn)物。實(shí)施例19:(4-(7-([1,1'-聯(lián)苯]-4-基甲基)-3-甲基-2,6-二氧代-2,3,6,7-四氫-1h-嘌呤-8-基)苯基)膦酸將實(shí)施例18(60mg,0.146mmol)、(4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼雜環(huán)戊-2-基)苯基)膦酸二甲酯(45.5mg,0.146mmol)、na2co3(30.9mg,0.292mmol)、四(三苯基膦)鈀(16.9mg,0.015mmol)和水(0.2ml)在二氧六環(huán)(1ml)中的反應(yīng)混合物用n2沖洗2分鐘，然后在密封小瓶中在100℃攪拌過夜。prep-hplc純化(watersx-bridgec1830x50mm5um柱,acn/h2ow/5mmnh4oh@75ml/min,15-40％acn，歷經(jīng)3.5min梯度)分離單-甲基酯和二甲基酯。將含有這兩種產(chǎn)物的級(jí)分合并，并在真空下濃縮。將殘留物溶解于dmf(1ml)中，加入溴三甲基硅烷(112mg,0.729mmol)。將反應(yīng)混合物在rt攪拌過夜。加入水和meoh，淬滅反應(yīng)，并在真空下濃縮得到的溶液。prep-hplc純化(watersx-bridgec1830x50mm5um柱acn/h2ow/5mmnh4oh@75ml/min,5-20％acn，歷經(jīng)3.2min梯度)提供需要的產(chǎn)物。1hnmr(400mhz,dmso-d6):δppm7.64-7.77(2h,m),7.54-7.64(6h,m),7.27-7.46(3h,m),7.03-7.15(2h,m),5.56-5.71(2h,m),3.42(3h,s).lcms(xbridgec183.5μm3.0x30mmacn/h2ow/5mmnh4oh@75ml/min,5-95，歷經(jīng)2min梯度)rt＝0.51min,ms[m+h]+觀測(cè)值:489.3,計(jì)算值:489.4.實(shí)施例20:7-([1,1'-聯(lián)苯]-4-基甲基)-8-溴-1,3-二甲基-1h-嘌呤-2,6(3h,7h)-二酮根據(jù)上面所述的方法類似地制備標(biāo)題產(chǎn)物。1hnmr(400mhz,甲醇-d4):δppm7.88-8.00(2h,m),7.68-7.78(2h,m),7.49-7.59(4h,m),7.27-7.44(3h,m),7.03-7.15(2h,m),5.72-5.81(2h,m),3.63(3h,s),3.38(3h,s).lcms(xbridgec183.5μm3.0x30mmacn/h2ow/5mmnh4oh@75ml/min,5-95，歷經(jīng)2min梯度)rt:0.63min,ms[m+h]+觀測(cè)值:503.3,計(jì)算值:503.4.c8取代的嘌呤的通用合成:步驟1:6-氨基-5-((2-(4-氯苯氧基)乙基)氨基)嘧啶-4(3h)-酮將2-(4-氯苯氧基)乙酸(13.3g,71.4mmol)溶解于dmf(90ml,0.8m)中，并加入三乙胺(14.4g,143mmol,2equiv.)和hatu(27.1g,71.4mmol)。將反應(yīng)在室溫?cái)嚢?0min，然后加入吡啶酮(9.0g,71.4mmol)。將混合物在室溫?cái)嚢柽^夜后，將反應(yīng)用水淬滅，并通過加入5nhcl將ph調(diào)至1。收集白色沉淀，用1nhcl洗滌并在真空下干燥2天(12.7g,43.1mmol,60％)。將獲得的酰胺直接用于下一步驟。將上面獲得的酰胺(10g,33.9mmol)溶解于thf(250ml)中并冷卻至0℃。緩慢加入lialh4(7.73g,204mmol)，并將混合物在室溫?cái)嚢?0min，在50℃攪拌5小時(shí)。然后將混合物冷卻至0℃，并通過加入1nhcl淬滅。收集白色沉淀，用1nhcl洗滌并在真空下干燥2天。獲得產(chǎn)物，為白色固體，其沒有進(jìn)一步純化即使用(3.0g,10.7mmol,32％).步驟2:用于?；烷]環(huán)的通用方法:將羧酸溶取在dmf(0.1m)中，并用hatu(2equiv.)和三乙胺(4.5equiv.)處理。將溶液在室溫?cái)嚢?5min，然后加入步驟1中獲得的嘧啶。將得到的溶液在室溫?cái)嚢?6h，然后用etoac稀釋并用緩沖溶液(ph＝7.0)洗滌。將含水層用etoac萃取2x，并將合并的有機(jī)層用na2so4干燥。在真空下濃縮溶液，得到棕色油狀物，將其通過rp-hplc純化。對(duì)于r＝oh:將上面獲得的酰胺溶取在異丙醇(0.1m)中，加入叔丁醇鈉(5equiv.)，并將混合物在80℃攪拌4h。加入乙酸，直到溶液成酸性，并且形成沉淀。過濾沉淀，用水洗滌并在真空中干燥。將得到的醇通過用pocl3的磷酸三甲酯溶液在0℃處理2h磷酸化。將反應(yīng)用teab(1m)淬滅，并直接通過rp-hplc純化。對(duì)于r＝po(oet)2:將上面獲得的磷酸酯通過用tmsbr(5.5eq.)處理0.7m在dmf中的溶液來水解。在室溫?cái)嚢?6h后，通過加入meoh/h2o1/1和1mteab將反應(yīng)淬滅。過濾混懸液并直接通過rp-hplc純化。c8-取代的嘌呤的分析數(shù)據(jù)提供在表4中。通過上面所述方法制備下面的類似物。表4:c8取代的嘌呤的分析數(shù)據(jù)咪唑活化的mrna帽的制備用于gmp和gdp衍生物的咪唑活化的通用方法：向n7-烷基化的-gmp/gdp衍生物的三乙基銨鹽的dmf溶液中加入咪唑(10eq.)、2,2'-二吡啶基二硫醚(4eq.)和tea(2eq.)。將反應(yīng)在rt攪拌5min，然后加入三苯基膦(4eq.)，反應(yīng)變?yōu)辄S色。在rt攪拌16-18h后，將1mnaclo4的丙酮溶液(10eq.)加入反應(yīng)中，產(chǎn)生白色沉淀。將另外的丙酮加入反應(yīng)中，并將得到的混懸液在4℃冷卻20min并離心。將上清液傾出，并用丙酮洗滌沉淀，在4℃冷卻10min并離心。將該洗滌操作重復(fù)一次或兩次。將得到的沉淀在真空下干燥，得到咪唑活化的n7-烷基化gmp/gdp衍生物的鈉鹽。實(shí)施例21:p2-咪唑陰離子(imidazolide)n7-([1,1'-聯(lián)苯]-4-基甲基)-5’-gdpna鹽將n7-([1,1'-聯(lián)苯]-4-基甲基)-5’gdp的三乙基銨鹽(45mg,0.049mmol)、咪唑(50mg,0.742mmol)、2,2’-二硫二吡啶(65mg,0.297mmol),三乙胺(207μl,1.484mmol)和三苯基膦(78mg,0.297mmol)的二甲基甲酰胺(1.0ml)混合物在室溫?cái)嚢?h。加入高氯酸鈉的丙酮溶液(1m,1ml)，然后用丙酮(40ml)稀釋。通過離心分離沉淀，用丙酮洗滌三次，并在真空下干燥，得到為鈉鹽的標(biāo)題化合物(34mg,93％).1hnmr(400mhz,d2o)δppm:7.80-7.90(1h,s),7.63-7.72(4h,m),7.38-7.56(5h,m),7.18-7.27(1h,s),6.86-6.95(1h,s),5.97-6.07(1h,m),5.59-5.75(2h,m),4.58-4.64(2h,m),4.33-4.40(3h,m),4.16-4.29(1h,m),4.06-4.16(1h,m).13cnmr(162mhz,d2o):δppm:11.712(1p),19.863(1p).lcms方法2rt:1.35min,ms[m-h]+觀測(cè)值:659.1,計(jì)算值:659.1.實(shí)施例22:p2-咪唑陰離子n7-([1,1'-聯(lián)苯]-4-基甲基)-5’-gmpna鹽用與實(shí)施例21中所述的方法類似的方法合成標(biāo)題化合物。1hnmr(400mhz,d2o)δppm:7.78-7.83(1h,s),7.43-7.49(4h,m),7.16-7.40(5h,m),7.01-7.08(1h,s),6.83-6.90(1h,s),5.79-5.87(1h,m),5.51-5.76(2h,m),4.50-4.57(1h,m),4.20-4.35(2h,m),4.00-4.16(2h,m).31pnmr(162mhz,d2o):δppm:8.134(1p).lcms方法2rt:1.32min,ms[m-h]+觀測(cè)值:577.9,計(jì)算值:578.2.實(shí)施例23:7-([1,1'-聯(lián)苯]-4-基甲基)-2-氨基-9-((2-((羥基((羥基(1h-咪唑-1-基)磷?；?氧基)磷?；?氧基)乙氧基)甲基)-9h-嘌呤-7--6-醇鹽按照上面所述的二磷酸酯的咪唑活化的通用方法合成標(biāo)題化合物。lcms方法5ms[m-h]+觀測(cè)值:602.3,計(jì)算值:602.1.實(shí)施例24:p2-咪唑陰離子-n7-(2-(4-氯苯氧基)乙基)-2’-o-甲基-5’-gdpna鹽步驟1:n7-(2-(4-氯苯氧基)乙基)-2’-o-甲基-鳥苷將2'ome-鳥苷(0.673mmol)和1-(2-溴乙氧基)-4-氯苯(2.70mmol)溶取在4ml無水dmso中，并在50℃攪拌20h。將反應(yīng)冷卻至rt，用dmso稀釋，并在制備hplc上純化[shimadzuprephplc(sunfireprepc185μm,100mmx30mm柱；0-20min:5至30％0.1％tfa的acn溶液/0.1％tfa的h2o溶液；42ml/min)]。合并產(chǎn)物級(jí)分并濃縮，同時(shí)與甲苯共沸，得到標(biāo)題化合物的三氟乙酸鹽，為白色固體(99mg,0.17mmol,26％).lcms方法2rt＝1.38mins；msm/z[m+h]+452.2.步驟2:n7-(2-(4-氯苯氧基)乙基)-2’-o-甲基-5’-gmptea鹽向冷卻至0℃的n7-(2-(4-氯苯氧基)乙基)-2’-o-甲基-鳥苷(0.085mmol)的1.0ml磷酸三甲酯溶液中緩慢滴加加入pocl3(0.536mmol)。將反應(yīng)在0℃攪拌6.5h，然后冷卻至-20℃反應(yīng)16h。然后將反應(yīng)升溫至0℃，持續(xù)2h。將另外的pocl3(0.536mmol)加至反應(yīng)中，并將反應(yīng)在0℃攪拌3h。在0℃用1mteab(aq.)(3.5ml)將反應(yīng)緩慢淬滅。一旦teab加入完成，將反應(yīng)升溫至rt，以確保淬滅過量的pocl3。將淬滅的反應(yīng)物通過制備離子交換色譜法直接純化[(tosohtskgeldeae-5pw,13μm,21.5x150mm,0-30min:0-100％1mteab,5ml/min)]。凍干產(chǎn)物級(jí)分得到標(biāo)題化合物的三乙基銨鹽，為白色固體，將其直接用于下一步驟中。lcms方法2rt＝1.34mins；msm/z[m+h]+532.9；1hnmr(d2o)δ:7.16-7.22(m,2h),6.80-6.86(m,2h),6.03(d,j＝3.4hz,1h),4.78-4.84(m,2h),4.48-4.54(m,2h),4.46(t,j＝5.3hz,1h),4.25-4.30(m,1h),4.18-4.22(m,1h),4.09-4.17(m,1h),3.96-4.03(m,1h),3.51(s,3h),3.14(q,j＝7.4hz,net3),1.21(t,j＝7.3hz,net3).步驟3:p1-咪唑陰離子n7-(2-(4-氯苯氧基)乙基)-2’-o-甲基-5’-gmpna鹽向n7-(2-(4-氯苯氧基)乙基)-2’-o-甲基-5’-gmp(0.05mmol)的1.0ml無水的dmf混懸液中加入咪唑(0.514mmol)、2,2'-二吡啶基二硫醚(0.227mol)和tea(0.072mmol)。然后將pph3(0.229mmol)加至反應(yīng)物中，使其變?yōu)辄S色。在rt攪拌18h后，將1mnaclo4的丙酮溶液(0.250mmol)加入反應(yīng)物中，隨后加入4ml丙酮。將得到的混懸液在4℃冷卻20min并離心。傾出上清液并將得到的沉淀用5ml丙酮洗滌，在4℃冷卻20min并再離心。將該洗滌操作再重復(fù)兩次。將得到的灰白色固體在真空下干燥，得到標(biāo)題化合物的鈉鹽(30mg)。將該化合物直接用于步驟4中。lcms方法5ms(es-):m/z＝580.4(m-h+).步驟4:n7-(2-(4-氯苯氧基)乙基)-2’-o-甲基-5’-gdptea鹽向p1-咪唑陰離子n7-(2-(4-氯苯氧基)乙基)-2’-o-甲基-5’-gmpna鹽(0.05mmol)的1ml無水dmf溶液中滴加加入正磷酸三丁基銨鹽(如:a.r.kore,g.parmar,syn.comm.2006,36,3393-3399中所述制備；1m的dmf溶液,0.250mmol)中，隨后加入zncl2(0.051mmol)。將反應(yīng)在rt攪拌4.5h，然后用水(1ml)淬滅并濃縮至油性固體。將該固體溶取在dmf(1ml)中，并加入1mnaclo4的丙酮溶液(0.500mmol)，隨后加入7ml丙酮。將得到的混懸液冷卻至0℃，保持～10min，離心并傾倒上清液。將固體用丙酮洗滌一次，離心并傾倒上清液。然后將得到的固體在真空下干燥，以除去任何殘留物有機(jī)物并溶取在h2o中，采用制備離子交換色譜法純化[(tosohtskgeldead-5pw,13μm,21.5x150mm,0-100％1mteab,5ml/min)].合并產(chǎn)物級(jí)分，濃縮，并與乙醇共沸，得到標(biāo)題化合物的三乙基銨鹽，為白色固體(5.7mg,6.6μmol,13％).lcms方法5ms(es+):m/z＝612.0(m+h+)；1hnmr(d2o)δ:9.25(s,1h),7.13(d,j＝8.9hz,2h),6.79(d,j＝8.9hz,2h),5.99(d,j＝3.1hz,1h),4.76-4.87(m,2h),4.40-4.54(m,3h),4.24-4.35(m,2h),4.13-4.23(m,2h),3.50(s,3h),3.13(q,j＝7.3hz,net3),1.17-1.23(m,j＝7.3,7.3hz,net3).步驟5:p2-咪唑陰離子-n7-(2-(4-氯苯氧基)乙基)-2’-o-甲基-5’-gdpna鹽向n7(2-(4-氯苯氧基)乙基)-2’-o-甲基-5’-gdptea鹽(6.55μmol)的0.5ml無水dmf混懸液中加入咪唑(88μmol)、2,2'-二吡啶基二硫醚(27.2μmol)和tea(14.3μmol)。然后將pph3(26.7μmol)加至反應(yīng)物中，使其變?yōu)辄S色。在rt攪拌18h后，將1mnaclo4的丙酮(0.100mmol)加入反應(yīng)物中，隨后加入丙酮(2ml)，產(chǎn)生白色沉淀。將該混懸液在4℃冷卻20min并離心。傾出上清液并將得到的沉淀用丙酮(3ml)洗滌，在4℃冷卻10min并離心。將該丙酮洗滌操作再重復(fù)一次。將得到的白色固體在真空下干燥，得到標(biāo)題化合物的鈉鹽(4.6mg,6.4μmol,97％)。將該化合物直接用于mrna加帽反應(yīng)。lcms方法5ms(es-):m/z＝660.2(m-h+).實(shí)施例25:p2-咪唑陰離子-n7-(2-(4-氯苯氧基)乙基)-3’-o-甲基-5’-gdpna鹽步驟1:n7-(2-(4-氯苯氧基)乙基)-3’-o-甲基-5’-鳥苷將3’ome-鳥苷(0.673mmol)和1-(2-溴乙氧基)-4-氯苯(2.70mmol)溶取在4ml無水dmso中，并在50℃攪拌20h。將反應(yīng)冷卻至rt，用dmso稀釋并在制備hplc上純化[shimadzuprephplc(sunfireprepc185μm,100mmx30mm柱；0-20min:5至30％0.1％tfa的acn溶液/0.1％tfa的h2o溶液；42ml/min)]。合并產(chǎn)物級(jí)分并濃縮，同時(shí)與甲苯共沸，得到標(biāo)題化合物的三氟乙酸鹽，為白色固體(124mg,0.223mmol,33％).lcms方法2rt＝1.39mins；msm/z[m+h]+452.9.步驟2:n7-(2-(4-氯苯氧基)乙基)-3’-o-甲基-5’-gmptea鹽向冷卻至0℃的n7-(2-(4-氯苯氧基)乙基)-3’-o-甲基-5’-鳥苷(0.115mmol)的1.0ml磷酸三甲酯溶液緩慢滴加加入pocl3(0.536mmol)。將反應(yīng)在0℃攪拌6.5h，然后冷卻至-20℃，保持16h(置于冰箱中過夜)。然后將反應(yīng)升溫至0℃持續(xù)2h。將另外的pocl3(0.536mmol)加入反應(yīng)中，并將反應(yīng)在0℃攪拌3h。將反應(yīng)在0℃用1mteab(aq.)(3.5ml)緩慢淬滅。一旦teab加入完成，將反應(yīng)升溫至rt，以確保淬滅過量的pocl3。將淬滅的反應(yīng)物通過制備離子交換色譜法直接純化[(tosohtskgeldeae-5pw,13μm,21.5x150mm,0-30min:0-100％1mteab,5ml/min)]。凍干產(chǎn)物級(jí)分得到標(biāo)題化合物的三乙基銨鹽，為白色固體，將其如獲得那樣用于下一步驟。lcms方法2rt＝1.34mins；msm/z[m+h]+532.8；1hnmr(d2o)δ:7.16-7.23(m,2h),6.79-6.87(m,2h),5.94(d,j＝4.0hz,1h),4.78-4.86(m,2h),4.47-4.52(m,j＝5.0,5.0hz,2h),4.36-4.43(m,1h),4.09-4.17(m,1h),4.07(t,j＝5.0hz,1h),3.93-4.01(m,1h),3.43(s,3h),3.13(q,j＝7.4hz,net3),1.21(t,j＝7.3hz,net3).步驟3:p1-咪唑陰離子-n7-(2-(4-氯苯氧基)乙基)-3’-o-甲基-5’-gmpna鹽向n7-(2-(4-氯苯氧基)乙基)-3’-o-甲基-5’-gmptea鹽(0.075mmol)的1.0ml無水dmf混懸液中加入咪唑(0.734mol)、2,2'-二吡啶基二硫醚(0.340mmol)和tea(0.108mmol)。然后將pph3(0.343mmol)加至反應(yīng)物中，使其變?yōu)辄S色。在rt攪拌18h后，加入1mnaclo4的丙酮溶液(0.375mmol)，隨后加入4ml丙酮。將得到的混懸液在4℃冷卻20min并離心。傾出上清液并將得到的沉淀用丙酮(5ml)洗滌，在4℃冷卻20min并離心。將該洗滌操作再重復(fù)兩次。將得到的灰白色固體在真空下干燥，得到標(biāo)題化合物的鈉鹽(45mg)。將該化合物直接用于步驟4。lcms方法5ms(es-):m/z＝580.4(m-h+).步驟4:n7-(2-(4-氯苯氧基)乙基)-3’-o-甲基-5’-gdptea鹽向p1-咪唑陰離子-n7-(2-(4-氯苯氧基)乙基)-3’-o-甲基-5’-gmpna鹽(0.075mmol)的1ml無水dmf溶液中滴加加入正磷酸三丁基銨鹽(如:a.r.kore,g.parmar,syn.comm.2006,36,3393-3399中所述制備；1m的dmf溶液,0.375mmol)，隨后加入zncl2(0.076mmol)。將rxn在rt攪拌4.5h，然后用水(1ml)淬滅并濃縮至油性固體。將該固體溶取在dmf(1ml)中，并加入1mnaclo4的丙酮溶液(1.00mmol)，隨后加入丙酮(7ml)。將得到的混懸液冷卻至0℃持續(xù)10min，離心并傾倒上清液。將固體用丙酮洗滌一次，離心并傾倒上清液。然后將得到的固體在真空下干燥，以除去任何殘留物有機(jī)物，并采用制備離子交換色譜法純化[(tosohtskgeldead-5pw,13μm,21.5x150mm,0-100％1mteab,5ml/min)]。合并產(chǎn)物級(jí)分，濃縮，并與乙醇共沸，得到標(biāo)題化合物的三乙基銨鹽，為白色固體(14.3mg,4.21μmol,8％).lcms方法5ms(es-):m/z＝610.2(m-h+)；1hnmr(d2o)δ:9.30(s,1h),7.15(d,j＝9.0hz,2h),6.80(d,j＝9.0hz,2h),5.92(d,j＝4.0hz,1h),4.77-4.87(m,2h),4.71-4.75(m,1h),4.39-4.49(m,3h),4.23-4.32(m,1h),4.06-4.17(m,2h),3.43(s,3h),3.13(q,j＝7.4hz,net3),1.21(t,j＝7.3hz,net3).步驟5:p2-咪唑陰離子-n7-(2-(4-氯苯氧基)乙基)-3’-o-甲基-5’-gdpna鹽向2-氨基-7-(2-(4-氯苯氧基)乙基)-9-((2r,3r,4s,5r)-3-羥基-5-(((羥基(膦酰基氧基)磷?；?氧基)甲基)-4-甲氧基四氫呋喃-2-基)-6-氧代-6,9-二氫-1h-嘌呤-7-(4.20μmol)的0.5ml無水的dmf混懸液中加入咪唑(88μmol)、2,2'-二吡啶基二硫醚(27.2μmol)和tea(14.3μmol)。然后將pph3(26.7μmol)加至反應(yīng)物中，使其變?yōu)辄S色。在rt攪拌18h后，將1mnaclo4的丙酮溶液(0.100mmol)加入反應(yīng)物中，隨后加入丙酮(2ml)，產(chǎn)生白色沉淀。將該混懸液在4℃冷卻20min并離心。傾出上清液并將得到的沉淀用丙酮(3ml)洗滌，在4℃冷卻10min。并離心。將該丙酮洗滌操作再重復(fù)一次。將得到的白色固體在真空下干燥，得到標(biāo)題化合物的鈉鹽(7.2mg).將該化合物直接用于mrna加帽反應(yīng)。lcms方法5ms(es-):m/z＝660.2(m-h+).實(shí)施例26:7-([1,1'-聯(lián)苯]-4-基甲基)-2-氨基-9-((2r,3r,4s,5r)-3,4-二羥基-5-(((羥基((羥基(1h-咪唑-1-基)磷?；?甲基)磷?；?氧基)甲基)四氫呋喃-2-基)-6-氧代-6,9-二氫-1h-嘌呤-7-步驟1:n7-([1,1'-聯(lián)苯]-4-基甲基)-鳥苷將鳥苷(2.65mmol)和4-溴甲基聯(lián)苯(6.07mmol)溶取在無水的dmso(7.5ml)中，并在rt攪拌60h。將反應(yīng)物用dmso稀釋并通過制備rp-hplc純化。將合并的產(chǎn)物級(jí)分濃縮，同時(shí)與甲苯共沸，溶取在1:1h2o/乙腈中，冷凍并凍干，得到標(biāo)題化合物的三氟乙酸鹽，為白色固體。lcms方法1rt＝0.94mins；msm/z[m+h]+450.0.步驟2:7-([1,1'-聯(lián)苯]-4-基甲基)-2-氨基-9-((2r,3r,4s,5r)-3,4-二羥基-5-(((羥基(膦?；谆?磷?；?氧基)甲基)四氫呋喃-2-基)-6-氧代-6,9-二氫-1h-嘌呤-7-向在-10℃的n7-([1,1'-聯(lián)苯]-4-基甲基)-鳥苷(0.266mmol)的1.0ml磷酸三甲酯溶液中緩慢加入到冷卻至-10℃的亞甲基二膦酰二氯(1.00mmol)的1.0ml磷酸三甲酯溶液中。將反應(yīng)在-10℃-0℃攪拌6.5h，然后置于-20℃保持60h。通過將其在0℃加入1mteab(9ml)中，緩慢淬滅反應(yīng)。一旦加入完成，將反應(yīng)升溫至rt，以確保淬滅過量的亞甲基二膦酰二氯。將得到的溶液直接在制備hplc上純化[(phenomenexgemini-nx5μmc18100mmx30mm柱；0-15min:10至40％acn/0.1mteab的h2o溶液,25ml/min)]。合并產(chǎn)物級(jí)分，冷凍并凍干，得到標(biāo)題化合物的三乙基銨鹽，為白色固體(16mg,0.02mmol,7％).lcms方法2rt＝1.46mins；msm/z[m+h]+608.1；1hnmr(d2o)δ:9.51(s,1h),7.25-7.35(m,4h),7.10-7.25(m,5h),5.70(d,j＝3.4hz,1h),5.42-5.58(m,2h),4.50(t,j＝3.9hz,1h),4.40(t,j＝5.1hz,1h),4.28-4.33(m,1h),4.20-4.28(m,1h),4.06-4.17(m,1h),3.12(q,j＝7.3hz,net3),2.17(t,j＝19.7hz,2h),1.20(t,j＝7.3hz,net3).步驟3:7-([1,1'-聯(lián)苯]-4-基甲基)-2-氨基-9-((2r,3r,4s,5r)-3,4-二羥基-5-(((羥基((羥基(1h-咪唑-1-基)磷?；?甲基)磷?；?氧基)甲基)四氫呋喃-2-基)-6-氧代-6,9-二氫-1h-嘌呤-7-向7-([1,1'-聯(lián)苯]-4-基甲基)-2-氨基-9-((2r,3r,4s,5r)-3,4-二羥基-5-(((羥基(膦?；谆?磷酰基)氧基)甲基)四氫呋喃-2-基)-6-氧代-6,9-二氫-1h-嘌呤-7-(0.016mmol)的1.0ml無水的dmf溶液中加入咪唑(0.176mmol)、2,2’-二吡啶基二硫醚(0.082mmol)和tea(0.029mmol)。將反應(yīng)在rt攪拌10min，然后加入三苯基膦(0.084mmol)，使反應(yīng)物變?yōu)辄S色。在rt攪拌18h后，將1mnaclo4的丙酮溶液(0.250mmol)加入反應(yīng)物中，隨后加入丙酮(5ml)，產(chǎn)生白色沉淀。將得到的混懸液在4℃冷卻20min并離心。傾出上清液并將沉淀用丙酮(5ml)洗滌，在4℃冷卻10min并離心。將該洗滌操作再重復(fù)一次。將得到的沉淀在真空下干燥，得到標(biāo)題化合物的鈉鹽，為白色固體(10.8mg,0.013mmol,81％)。將該化合物直接用于mrna加帽反應(yīng)。lcms方法5ms(es-):m/z＝657.5(m-h+).實(shí)施例27:7-([1,1'-聯(lián)苯]-4-基甲基)-2-氨基-9-((2r,3r,4s,5r)-3,4-二羥基-5-(((羥基((羥基(1h-咪唑-1-基)磷?；?氨基)磷?；?氧基)甲基)四氫呋喃-2-基)-6-氧代-6,9-二氫-1h-嘌呤-7-步驟1:7-([1,1'-聯(lián)苯]-4-基甲基)-2-氨基-9-((2r,3r,4s,5r)-3,4-二羥基-5-(((羥基(膦?；被?磷酰基)氧基)甲基)四氫呋喃-2-基)-6-氧代-6,9-二氫-1h-嘌呤-7-在0℃將n7-([1,1'-聯(lián)苯]-4-基甲基)-鳥苷(0.177mmol)加至二氯氧膦基亞氨代磷酰三氯(dichlorophosphinylphosphorimidictrichloride)(j.emsley,j.moore,p.b.udy,j.chem.soc.a1971,2863-2864；0.891mmol)的磷酸三甲酯(2.0ml)溶液中。將反應(yīng)在0℃攪拌1.5h，然后冷卻至-20℃并放置16h。將反應(yīng)升溫至0℃，將另外的二氯氧膦基亞氨代磷酰三氯(0.891mmol)加入反應(yīng)物中。將反應(yīng)在0℃攪拌5h，直到通過lcms(方法2rxnmon_acidic_polar_posneg.olp-zq1)監(jiān)測(cè)，僅剩余痕量的起始原料。通過在0℃緩慢地將反應(yīng)物加入1mteab(10ml)中，將反應(yīng)淬滅。一旦加入完成，將反應(yīng)升溫至rt，以確保淬滅過量的二氯氧膦基亞氨代磷酰三氯。將得到的混懸液過濾并將濾液提供至制備hplc[(phenomenexgemini-nx5μmc18100mmx30mm柱；0-15min:10至50％acn/0.1mteab的h2o溶液,25ml/min)]。合并產(chǎn)物級(jí)分，冷凍并凍干，得到標(biāo)題化合物的三乙基銨鹽，為白色固體(13.5mg,0.018mmol,10％).lcms方法6計(jì)算值:608.1186；實(shí)測(cè)值:609.1290[m+h+]；1hnmr(d2o)δ:9.51(s,1h),7.49-7.57(m,4h),7.38-7.44(m,4h),7.31-7.38(m,1h),5.90(d,j＝3.6hz,1h),5.55-5.68(m,2h),4.63(t,j＝4.3hz,1h),4.48(t,j＝5.1hz,1h),4.29-4.38(m,1h),4.17-4.26(m,1h),4.04-4.17(m,1h),3.13(q,j＝7.3hz,net3),1.21(t,j＝7.3hz,net3).步驟2:7-([1,1'-聯(lián)苯]-4-基甲基)-2-氨基-9-((2r,3r,4s,5r)-3,4-二羥基-5-(((羥基((羥基(1h-咪唑-1-基)磷?；?氨基)磷?；?氧基)甲基)四氫呋喃-2-基)-6-氧代-6,9-二氫-1h-嘌呤-7-將7-([1,1'-聯(lián)苯]-4-基甲基)-2-氨基-9-((2r,3r,4s,5r)-3,4-二羥基-5-(((羥基(膦?；被?磷?；?氧基)甲基)四氫呋喃-2-基)-6-氧代-6,9-二氫-1h-嘌呤-7-(0.007mmol)溶取在1.0ml無水dmf中，并加入咪唑(0.073mmol)、2,2'-二吡啶基二硫醚(0.036mmol)和tea(0.014mmol)。將反應(yīng)在rt攪拌5min，然后加入三苯基膦(0.038mmol)，使反應(yīng)物變?yōu)辄S色。在rt攪拌16h后，將1mnaclo4的丙酮溶液(0.100mmol)加入反應(yīng)物中，隨后加入丙酮(5ml)，產(chǎn)生白色沉淀。將得到的混懸液在4℃冷卻20min并離心。傾出清液并將沉淀用丙酮(5ml)洗滌，在4℃冷卻10min并離心。將該洗滌操作再重復(fù)一次。將得到的沉淀在真空下干燥，得到標(biāo)題化合物的鈉鹽，為白色固體(2.3mg,3.4μmol,33％).將該化合物直接用于mrna加帽反應(yīng)。lcms方法5ms(es-):m/z＝658.3(m-h+).咪唑活化的gdp衍生物的分析數(shù)據(jù)提供在表5中。根據(jù)上面所述的用于咪唑活化的通過方法或類似于實(shí)施例21-27中所述的方法制備下面的實(shí)施例。表5.咪唑活化的gdp衍生物的分析數(shù)據(jù)。咪唑活化的gmp衍生物的分析數(shù)據(jù)提供在表6中。根據(jù)上面所述的用于咪唑活化的通過方法或類似于實(shí)施例21-27中所述的方法制備下面的實(shí)施例。表6.咪唑活化的gmp衍生物的分析數(shù)據(jù)。對(duì)于寡核苷酸和rna的加帽，將如上面所示的實(shí)施例中獲得的咪唑活化的單-和二磷酸酯溶解在無rnase的水中，得到20mm咪唑活化的gmp/gdp衍生物的h2o溶液(基于樣品中存在的活化的咪唑的量，通過1h-nmr測(cè)定)。寡核苷酸的3’-末端修飾的通用方法：寡5-/5phos/rgrararararararararara-3(寡核苷酸1)和5-/5phos/rgru/ifluort/rurcrgrcrcraruru/i6-tamn/rararararararararara-3(寡核苷酸2)購(gòu)自idt。方法a(縮合反應(yīng))：將含有在pbs緩沖液中的10μm寡核苷酸的溶液用50xnaio4(5mm貯備液，500μm終濃度)處理并在0℃保持1h。將獲得的溶液用100xna2so3(10mm貯備液，1mm終濃度)處理，并升到rt。10min后，加入100x親核試劑的水溶液(10mm貯備液，1mm終濃度)，并將溶液保持在rt過夜。使用princetonseparationcs100spin柱將溶液脫鹽。方法b(還原胺化反應(yīng))：將含有在pbs緩沖液中的10μm寡核苷酸的溶液用50xnaio4(5mm貯備液，500μm終濃度)處理并在0℃保持1h。將獲得的溶液用200xna2so3(10mm貯備液，2mm終濃度)處理，并升到rt。10min后，加入100x親核試劑(10mm在水中的貯備液，1mm終濃度)和nabh3cn(100mm在水中的貯備液，10mm終濃度)。將溶液在37℃振搖過夜，并使用princetonseparationcs100spin柱脫鹽。3’-修飾的寡核苷酸的分析數(shù)據(jù)提供在表7中。根據(jù)上面所述的通用方法制備下面的實(shí)施例。表7：3’-修飾的寡核苷酸的分析數(shù)據(jù)。a顯示的結(jié)構(gòu)代表可能的區(qū)域異構(gòu)的縮合產(chǎn)物之一。b如果無親核試劑加入獲得的化合物。clcms方法9mrna的3’-末端修飾的通用方法:將mrna的水溶液(0.5-1.5mg/ml,90μl)用naiio4(0.1m在3mnaoac緩沖液中,ph5.2,終濃度10mm)處理，并將溶液在冰上在暗處保持1h。采用用pbs緩沖液平衡的princetonseparationscentrispin柱使樣品脫鹽。將溶液用適當(dāng)?shù)挠H核試劑(在h2o或dmso中，終濃度5mm)處理，用h2o稀釋0.75x，并在500rpm在室溫振搖2h。將得到的溶液采用princetonseparationscentrispin10柱(pbs平衡，然后h2o平衡的)脫鹽兩次。將獲得的rna溶液通過licl沉淀進(jìn)一步純化。生物學(xué)數(shù)據(jù)結(jié)合生物素化和表面固定的heif4e的帽類似物的分析:將雙重組氨酸和avi標(biāo)記的人eif4e(his6-3c-avi-eif4e)表達(dá)在8ltb培養(yǎng)基中。在2.0od600發(fā)生通過0.4mmiptg的誘導(dǎo)，在15od600收獲細(xì)胞。將225克沉淀物在緩沖液(50mmtris，500mmnacl，2mmmgcl2,1mmtcep,ph7.5，含有10％甘油，蛋白酶抑制劑和dnase)中稀釋至體積為600ml，并在微流化器上通過一次。在5mlhistraphpimac上以4.0ml/minimac運(yùn)行樣品，對(duì)于一柱體積25mm至500mm咪唑梯度。將gst-prescission蛋白酶(2mg，內(nèi)部制備)加入到樣品中，并在4℃下反應(yīng)過夜。使切割的集合物在重力柱中通過0.5mlgst和0.5imac樹脂。使用50mmtrisph7.5,1mmtcep使樣品體積增加至800ml，并以4.0ml/min通過5mlhitrapspff，采用歷經(jīng)20柱體積的0至1mnacl梯度。然后將樣品以20mg/ml注射到124mls75凝膠過濾柱上。將最終的avi-eif4e(26931da)在1xn-二(羥乙基)甘氨酸(bicine)緩沖液中稀釋至1mg/ml，至2.5mg的體積，并與atp/生物素混合物(10mmatp，10mmmg(oac)2,50μmd-生物素最終)混合。將生物素連接酶(25μg內(nèi)部制備的bira)加入到反應(yīng)中。在eppendorfthermomixerr上在30℃下混合(500rpm)反應(yīng)60分鐘，并使用lc-ms檢查其完全性。向樣品中加入100μl固定化的谷胱甘肽(1：1，與緩沖液)，并在4℃下混合15分鐘，以結(jié)合c3和bir3，并通過離心除去。使用用20mmhepes,100mmkcl,1mmdtt,ph7.5平衡的兩個(gè)連續(xù)的pd-10柱緩沖交換樣品。由于低的eif4e穩(wěn)定性，制備了鏈霉親和素包被的芯片，并在biacoret200上在10℃下運(yùn)行。將eif4e(0.04mg/ml,150μl)與s系列sensorchipsa(gelifesciences，br-1005-31)的樣品通道結(jié)合，至5000至7000ru(響應(yīng)單位)的表面密度。使用1xpbs、50mmnacl、0.1％甘油、0.1％chaps和1％dmso，緩沖液以30μl/min流過芯片。將各種帽類似物的樣品稀釋至在100μm至小于1nm的范圍內(nèi)的各濃度。將樣品以兩分鐘的締合時(shí)間和5分鐘的解離時(shí)間注入到biacore芯片中。對(duì)于每個(gè)樣品進(jìn)行幾次緩沖液注入，用于空白扣除。使用biacoret200評(píng)價(jià)軟件對(duì)所有組進(jìn)行分析。所有化合物的結(jié)合分析報(bào)告為1微摩爾化合物的響應(yīng)單位，其中ru的更高值被解釋為與表面固定的eif4e蛋白質(zhì)結(jié)合更高的配體。一亞組化合物被進(jìn)一步表征，以使用動(dòng)力學(xué)結(jié)合和熱力學(xué)(穩(wěn)態(tài)親和力)結(jié)合分析中的一種或兩者確定解離常數(shù)。使用默認(rèn)設(shè)置(注射停止前4秒，具有5秒窗口)完成穩(wěn)態(tài)親和力擬合。動(dòng)力學(xué)擬合通常用1：1結(jié)合模型進(jìn)行，常數(shù)ri＝0，所有其他變量設(shè)置為全局?jǐn)M合。使用上述方法的帽類似物的biacore結(jié)合數(shù)據(jù)示于表8中。表8.帽類似物的biacore結(jié)合數(shù)據(jù)n/d＝未測(cè)定帽類似物與eif4e的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合的fret測(cè)定材料：his標(biāo)記的eif4e蛋白購(gòu)自fitzgeraldindustriesinternational(80r-125；acton,ma)，trna購(gòu)自sigma(r5636；st.louis,mo)。生物素化的20個(gè)核苷酸的rna寡(5’phos/rgrgrarcrcrcrcrurcrurcrcrcrurcrcrcrcrcrc生物素-3’)購(gòu)自integrateddnatechnologies(coralville,ia)。銪標(biāo)記的抗his抗體購(gòu)自perkinelmer(ad0110；waltham,ma)和鏈霉親和素綴合的alexafluor647購(gòu)自lifetechnologies(s32357；grandisland,ny)。用于eif4e結(jié)合的tr-fret測(cè)定：使用四個(gè)單獨(dú)的加入步驟，在pbs(ph7.4)、0.02％吐溫和0.1％bsa的測(cè)定緩沖液中進(jìn)行tr-fret測(cè)定。最初，將5μlhis-eif4e(10nm)和trna(0.1mg/ml)加入到黑色有圍墻的384孔小體積板中。接下來，使用beckmancoulterbiomekfx液體分配器加入1μl/孔新鮮稀釋的化合物，最終dmso濃度為1％。使化合物和eif4e在室溫下結(jié)合15分鐘。第三個(gè)添加由以下組成：向每個(gè)孔中加入4μl化學(xué)加帽的7mgdp咪唑mrna-生物素(10nm)，除了僅含有緩沖液的一列用作背景對(duì)照。將結(jié)合反應(yīng)物在室溫下孵育1小時(shí)。最后，將5μl的銪標(biāo)記的抗his抗體(10nm)和鏈霉親和素綴合的alexafluor647(10nm)tr-fret檢測(cè)試劑加入每個(gè)孔中，并使其在室溫下避光1小時(shí)。在envision板讀數(shù)器(perkin-elmer)上讀取板以測(cè)量來自alexafluor(665nm)和銪(615nm)的信號(hào)。計(jì)算作為帽類似物濃度的函數(shù)的alexafluor和銪熒光的比例用于數(shù)據(jù)分析，并且在graphpad中將數(shù)據(jù)擬合至標(biāo)準(zhǔn)ec50抑制曲線。使用上述方法的n7-烷基化gmp衍生物的fret測(cè)定數(shù)據(jù)提供在表9中。表9：n7-烷基化gmp衍生物的fret測(cè)定數(shù)據(jù)。*報(bào)告單次測(cè)量的值，除非另外指出.a超過22次測(cè)量的平均值b超過2次測(cè)量的平均值c超過33次測(cè)量的平均值d超過3次測(cè)量的平均值表10:n7-烷基化gdp衍生物的fret測(cè)定數(shù)據(jù)*報(bào)告單次測(cè)量的值，除非另外指出。a超過2次測(cè)量的平均值表11:n7-烷基化肌苷衍生物的fret測(cè)定數(shù)據(jù)編號(hào)nac50/μm*111.21220.49a*報(bào)告單次測(cè)量的值，除非另外指出。a超過2次測(cè)量的平均值表12:c8-取代的嘌呤衍生物的fret測(cè)定數(shù)據(jù)5’-單磷酸mrna的產(chǎn)生:如果在最終產(chǎn)物中需要三磷酸結(jié)構(gòu)，則標(biāo)準(zhǔn)t7轉(zhuǎn)錄反應(yīng)導(dǎo)致5’-三磷酸mrna，其與咪唑磷酸酯活化的帽類似物不相容。為了使用本文所述的咪唑活化的帽類似物產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)的三磷酸帽結(jié)構(gòu)，rna底物必須具有用于化學(xué)加帽的5’-單磷酸mrna(當(dāng)使用咪唑二磷酸帽類似物時(shí))或5’-二磷酸mrna(當(dāng)使用咪唑單磷酸帽類似物時(shí))。為了產(chǎn)生單磷酸或二磷酸5’-末端mrna，將向轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中加入10mmgmp或10mmgdp進(jìn)行測(cè)試。雖然10mmgmp產(chǎn)生>95％的5’-單磷酸mrna，10mmgdp完全抑制轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。因此，為了產(chǎn)生5’-三磷酸帽mrna結(jié)構(gòu)，我們專注于使用含有10mmgmp的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和咪唑二磷酸活化的帽類似物。mrna(瘦素和熒光素酶)的體外轉(zhuǎn)錄：為了產(chǎn)生用于體外轉(zhuǎn)錄的dna模板，根據(jù)制造商的方案將質(zhì)粒pgem-ot7-tev-ok-gluc(ncoi)--2hbg-(noti)-120a或pgem-ot7-tev-hleptin-gaopt-2hbg-120a用限制酶bspq1(newenglandbiolabs,ipswich,ma)線性化。通過用三體積的100％乙醇和1/10體積的3mnaoac，ph5.1沉淀來純化線性化的dna載體。然后用70％乙醇洗滌，將dna重新懸浮于水中。體外轉(zhuǎn)錄在40mmtris-hcl，ph8、8mmmgcl2、1mm各ntp、10mmdtt、2mm亞精胺、0.004u/ul無機(jī)焦磷酸酶(newenglandbiolabs,ipswich,ma)、1u/ulrnase抑制劑(newenglandbiolabs,ipswich,ma)、5u/μlt7rna聚合酶(newenglandbiolabs,ipswich,ma)和0.2μg/μl的線性化質(zhì)粒dna中進(jìn)行。如果mrna制品用于5’-末端化學(xué)加帽，則將10mmgmp(sigma-aldrich,st.louis,mo)摻入轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中。將反應(yīng)物在37℃下孵育1.5小時(shí)。通過加入0.04u/μlturbodnase(thermofisher,waltham,ma)消化dna模板，并在37℃下再溫育30分鐘。轉(zhuǎn)錄物用licl(終濃度2.81mm)沉淀，然后用70％乙醇洗滌。將沉淀重新懸浮于不含核酸酶的水中。rna的化學(xué)加帽：使用的rna是用5’-單磷酸(integrateddnatechnologies:5’-p-rgrgrarcrcrcrcrurcrurcrcrcrurcrcrcrcrcrc-3’)合成的20個(gè)核苷酸的合成rna分子或如上所述體外轉(zhuǎn)錄的含有5’-單磷酸的mrna(gaussialuciferasemrna或人瘦素mrna)。使用3’修飾和未修飾的rna。首先通過在65℃加熱10分鐘使rna溶液變性。將混合物在冰上冷卻5分鐘，然后加入到加帽緩沖液(100mmmes緩沖液,ph6.0,100mmnacl和5mmmncl2)中。然后將咪唑活化的帽類似物加入反應(yīng)中至終濃度為5mm。使反應(yīng)在thermoshaker(grantinstrument，cambridge，uk)中在室溫下進(jìn)行過夜。通過加入edta終止反應(yīng)，至終濃度為50mm。加帽的產(chǎn)物使用amicon超離心過濾器(millipore,billerica,ma)脫鹽。將產(chǎn)物用licl沉淀(最終2.81mmlicl)進(jìn)一步純化，并用70％乙醇洗滌。將沉淀重新懸浮于不含核酸酶的水中。在一些情況下，使用watersxbridgeshieldrp183.5um2.1x100mm柱(表13)，采用反相hplc進(jìn)一步純化化學(xué)加帽的mrna。流動(dòng)相a為在水中的0.1m乙酸三乙基銨(teaa)，流動(dòng)相b為在75％水/25％乙腈中的0.1mteaa。柱流速為0.8ml/分鐘，柱溫為65℃。手動(dòng)收集級(jí)分。表13:hplc純化梯度.時(shí)間(min)％流動(dòng)相b0.1443.04413641490159015.144204420個(gè)核苷酸合成rna寡聚體的加帽的lc/ms分析：在watersacquityuplcbehc18,1.7μm,2.1x75mm柱上分離加帽的和未加帽的寡核苷酸。含水流動(dòng)相含有0.8μmedta,7.15mm三乙胺和192.3mm六氟異丙醇。有機(jī)流動(dòng)相為甲醇。將柱保持在65℃，流速為0.35ml/min。典型的梯度在2分鐘內(nèi)從5％升至16％，隨后在20分鐘內(nèi)從16％升至25％。使用thermoltq-orbitrapxl或absciex6500qtrap進(jìn)行寡核苷酸的posthplcms分析。質(zhì)譜儀以從735到1550m/z掃描的esi-ms負(fù)模式運(yùn)行。表14：通過lc/ms測(cè)定的化學(xué)加帽的效率。表15:通過lc/ms測(cè)定的化學(xué)加帽的效率。表16:通過lc/ms測(cè)定的化學(xué)加帽的效率。表17:通過lc/ms測(cè)定的化學(xué)加帽的效率。熒光素酶mrna的轉(zhuǎn)染和發(fā)光讀數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)：將hek293以30,000個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種在96孔聚d賴氨酸包被的平板中，并在37℃,5％co2培養(yǎng)箱中孵育過夜。培養(yǎng)基是emem(atcc,cat#30-2003)，10％fbs(invitrogen)，無抗生素。mrna轉(zhuǎn)染：使用0.4μl/孔的dharmafect制劑2(thermoscientifict-2002-01)轉(zhuǎn)染100ng/孔的mrna。這是mrna與轉(zhuǎn)染試劑的1：4比例。將mrna和轉(zhuǎn)染試劑在optimem中混合以獲得10μl/孔的終體積。將混合物在室溫下溫育20分鐘。通過輕擊板從細(xì)胞中除去過夜的培養(yǎng)基。向每個(gè)孔中加入90μl新鮮培養(yǎng)基。向每個(gè)孔中加入10μlmrna混合物。將板在37℃,5％co2下孵育24小時(shí)。培養(yǎng)基收集：gaussia熒光素酶蛋白被分泌在培養(yǎng)基中。為了收集培養(yǎng)基，將90μl培養(yǎng)基從細(xì)胞轉(zhuǎn)移到v-底的96孔板中。將板以1000rpm離心5分鐘。將80μl上清液轉(zhuǎn)移到新的v-底板中，并冷凍或直接用于熒光素酶表達(dá)測(cè)定。熒光素酶表達(dá)測(cè)定：bioluxgaussia熒光素酶測(cè)定試劑盒(newenglandbiolabscat#e3300l)用于進(jìn)行熒光素酶測(cè)定。將bioluxgluc底物在測(cè)定緩沖液進(jìn)行1:100稀釋(10μl底物：1000μl測(cè)定緩沖液)。將20μl轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基加入到96孔白色透明底板(greinerbio-one655095)中。使用flexstation3微孔板讀數(shù)器(moleculardevices)讀取板。在時(shí)間0，將50ul的底物混合物加入到培養(yǎng)基板中，收集數(shù)據(jù)持續(xù)60秒。相對(duì)發(fā)光單位(rlu)在30秒處達(dá)峰值，并使用該時(shí)間點(diǎn)計(jì)算結(jié)果。通過將每一修飾的mrna的rlu針對(duì)酶促加帽的帽-0mrna的rlu標(biāo)準(zhǔn)化并乘以100來計(jì)算％熒光素酶活性。流程16：與hplc純化的化學(xué)加帽的mrna相比，酶促加帽的hplc純化的mrna(帽-1)的熒光素酶活性。流程17:與化學(xué)加帽的mrna相比的酶促加帽的mrna(帽-0)的熒光素酶活性。加帽的瘦素mrna的轉(zhuǎn)染和發(fā)光讀數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)：將hek293以30,000個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種在96孔聚d賴氨酸包被的平板中，并在37℃,5％co2培養(yǎng)箱中孵育過夜。培養(yǎng)基是emem(atcc,cat#30-2003)，10％fbs(invitrogen)，無抗生素。mrna轉(zhuǎn)染：使用0.4μl/孔的dharmafect制劑2(thermoscientifict-2002-01)轉(zhuǎn)染100ng/孔的mrna。這是mrna與轉(zhuǎn)染試劑的1：4比例。將mrna和轉(zhuǎn)染試劑在optimem中混合以獲得10μl/孔的終體積。將混合物在室溫下溫育20分鐘。通過輕擊板從細(xì)胞中除去過夜的培養(yǎng)基。向每個(gè)孔中加入90μl新鮮培養(yǎng)基。向每個(gè)孔中加入10μlmrna混合物。將板在37℃,5％co2下孵育24小時(shí)。培養(yǎng)基收集：蛋白質(zhì)被分泌在培養(yǎng)基中。為了收集培養(yǎng)基，將90μl培養(yǎng)基從細(xì)胞轉(zhuǎn)移到v-底的96孔板中。將板以1000rpm離心5分鐘。將80μl上清液轉(zhuǎn)移到新的v-底板中。人瘦素蛋白elisa測(cè)定：通過elisa測(cè)量小鼠血漿中的人瘦素(leptin)。從r&dsystemsduoset購(gòu)買的抗體(cat#dy398e，用于捕獲抗體的部分#840279和用于檢測(cè)抗體的部分#840280)用pbs重新配制，并再次用pbs滴定(titered)。在白色maxisorp384孔板(cat#460372)上在30μl/孔中，以4μg/ml包被捕獲抗體。在室溫下孵育過夜后，吸取捕獲抗體，室溫下用90μl/孔的kpl乳封閉劑(cat#50-82-00)封閉板2小時(shí)。一旦孵育完成，吸取板，并將重組標(biāo)準(zhǔn)品和樣品在37℃下以30μl/孔加入到板中保持2小時(shí)，同時(shí)以600rpm振蕩。使用酪蛋白樣品稀釋液(0.7％酪蛋白，1.7mm磷酸二氫鈉，8.1mm磷酸氫二鈉七水合物，0.15mnacl，0.7％tritonx-100和0.1％疊氮化鈉)制備樣品/標(biāo)準(zhǔn)稀釋液。然后使用teknova板洗液(cat#p1192)，以100μl/孔洗滌/抽吸3次。接下來，使用酪蛋白檢測(cè)抗體稀釋劑(0.4％酪蛋白，1.7mm磷酸二氫鈉，8.1mm磷酸氫二鈉七水合物，0.15mnacl和0.1％疊氮化鈉)將檢測(cè)抗體稀釋至12.5ng/ml，并以30μl/孔室溫加入，保持2小時(shí)。孵育后，再次洗滌平板，將在hrp稀釋緩沖液(1.7mm磷酸二氫鈉，8.1mm磷酸氫二鈉七水合物，0.145mnacl溶液，0.1％氯乙酰胺，1％無蛋白酶的bsa和0.05％吐溫20)中以1:1250稀釋的聚-鏈霉親和素-hrp(cat#21140)溶液加入到各孔(30μl/孔)中并在室溫下溫育30分鐘。最后洗滌/抽吸除去hrp溶液，并以30μl/孔加入化學(xué)發(fā)光底物(cat#1859678&1859679)。采用50ms積分時(shí)間，使用spectramaxm5讀板器快速讀取該板。elisa的動(dòng)態(tài)范圍是5-150pm的人瘦素。流程18：采用化學(xué)加帽的hplc純化的mrna的瘦素表達(dá)數(shù)據(jù)。hek293細(xì)胞s100提取物：s100提取物按照s100制備的標(biāo)準(zhǔn)方案制備。hek293(thermoscientificsh30521.02)細(xì)胞在80％的freestyle293(invitrogen12338)和20％的sfm4中、在8％的co2中，在加濕的氣氛下在以100rpm旋轉(zhuǎn)的軌道搖床上生長(zhǎng)。將2.5x109個(gè)細(xì)胞在臨床離心機(jī)中以1500rpm離心5分鐘。將沉淀物在1l冰冷的dpbs中洗滌，并在臨床離心機(jī)中在4℃下以1,500rpm再次旋轉(zhuǎn)10分鐘。去除上清液，將細(xì)胞沉淀重新懸浮于250ml冰冷的pbs中，通過移液破碎，并在臨床離心機(jī)中于4℃以1,700rpm離心6分鐘。去除上清液，將沉淀物重新懸浮于5體積的緩沖液a(10mmhepes-koh,ph7,9、1.5mmmgcl2、10mmkcl、新加入的0.5mmdtt)中。將細(xì)胞在冰上孵育10分鐘，以2,000rpm離心10分鐘，除去上清液。加入另外體積的緩沖液a，使用5沖程松散杵杜恩斯(dounce)均質(zhì)器將沉淀物破碎。使用15沖程緊杵杜恩斯均質(zhì)器裂解細(xì)胞，并采用顯微鏡確認(rèn)裂解。將裂解的材料在臨床離心機(jī)中以4,500rpm在4℃離心10分鐘。移出上清液并用于制備s100提取物。將0.11體積的緩沖液b(0.3mhepes-koh,ph7.9,1.4mkcl,30mmmgcl2)加入到s100中，通過倒置輕輕混合，并在超速離心機(jī)中在4℃下以102,000g旋轉(zhuǎn)1小時(shí)。移出上清液并置于冷卻的15ml錐形管中。從脂質(zhì)層下面的底層移出清澈上清液，并在4℃用1l緩沖液d(20mmhepes-koh,ph7.9,20％甘油,0.1mkcl,0.2mmedta,0.5mmdtt,0.5mmpmsf)透析>5小時(shí)。s100提取物在80℃下以小的等分試樣儲(chǔ)存，直到準(zhǔn)備使用。fretrna降解測(cè)定：按照uhler等人j.am.chem.soc.2003,125,14230-14231中的方案(進(jìn)行了一些修改)進(jìn)行rna降解測(cè)定。寡5-/5phos/rgru/ifluort/rurcrgrcrcraruru/i6-tamn/rararararararararara-3和5-/5phos/rgru/ifluort/rurcrgrcrcraruru/i6-tamn/rararararararararara/3bio-3購(gòu)自idt并用于rna降解測(cè)定。測(cè)定緩沖液由130mm的谷氨酸k鹽ph7.5,1mmmgcl2組成。在即將實(shí)驗(yàn)之前，將dtt加至終濃度為10mm。根據(jù)反應(yīng)體積分別為25ul和50ul，使用100um或200um的寡核苷酸(oligo)。s100提取物從0.3％-20％v/v變化，對(duì)于所有樣品，緩沖液d為總反應(yīng)體積的20％。所有反應(yīng)在37℃的384孔板中進(jìn)行。在100秒時(shí)，將s100提取物加入到寡核苷酸緩沖液混合物中。熒光素在490nm處被激發(fā)，并且在520nm和585nm處測(cè)量熒光發(fā)射。每分鐘收集數(shù)據(jù)，持續(xù)2小時(shí)。計(jì)算fret比率qq(＝f585/f520)并針對(duì)初始值q0標(biāo)準(zhǔn)化。使用prism5.0，將數(shù)據(jù)擬合為單指數(shù)衰減函數(shù)y＝y(tǒng)o–plateau*exp(-k*x)+plateau。為了提取michaelis-menten參數(shù)，使用prism5.0將速率常數(shù)kdec對(duì)％s100[x]的依賴性擬合至michaelis-menten方程y＝vmax*x/(km+x)。表18：在1.2％hek293s-100提取物中fretrna寡核苷酸的穩(wěn)定性。mrna的3’-末端修飾熒光素酶3’末端修飾的mrna的轉(zhuǎn)染和發(fā)光讀數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)：將hek293以30,000個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種在96孔聚d賴氨酸包被的平板中，并在37℃,5％co2培養(yǎng)箱中孵育過夜。培養(yǎng)基是emem(atcc,cat#30-2003)，10％fbs(invitrogen)，無抗生素。mrna轉(zhuǎn)染：使用0.4μl/孔的dharmafect制劑2(thermoscientifict-2002-01)轉(zhuǎn)染30ng/孔的mrna。將mrna和轉(zhuǎn)染試劑在optimem中混合以獲得10μl/孔的終體積。將混合物在室溫下溫育20分鐘。通過輕擊板從細(xì)胞中除去過夜的培養(yǎng)基。向每個(gè)孔中加入90μl新鮮培養(yǎng)基，并向每個(gè)孔中加入10μlmrna混合物。將板在37℃,5％co2下孵育24小時(shí)。培養(yǎng)基收集：gaussia熒光素酶蛋白被分泌在培養(yǎng)基中。為了收集培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，將90μl培養(yǎng)基從細(xì)胞轉(zhuǎn)移到v-底的96孔板中，并以1000rpm離心5分鐘。將80μl上清液轉(zhuǎn)移到新的v-底板中，并冷凍或直接用于熒光素酶表達(dá)測(cè)定或瘦素elisa。熒光素酶表達(dá)測(cè)定：bioluxgaussia熒光素酶測(cè)定試劑盒(newenglandbiolabscat#e3300l)用于進(jìn)行熒光素酶測(cè)定。將bioluxgluc底物在測(cè)定緩沖液中進(jìn)行1:100稀釋(10μl底物：1000μl測(cè)定緩沖液)。將20μl轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基加入到96孔白色透明底板(greinerbio-one655095)中。使用flexstation3微孔板讀數(shù)器(moleculardevices)讀取板。在時(shí)間0，將50ul的底物混合物加入到培養(yǎng)基板中，收集數(shù)據(jù)持續(xù)60秒。相對(duì)發(fā)光單位(rlu)在30秒處達(dá)峰值，并使用該時(shí)間點(diǎn)計(jì)算結(jié)果。通過將每一修飾的mrna的rlu針對(duì)酶促加帽的帽1mrna的rlu標(biāo)準(zhǔn)化并乘以100來計(jì)算％熒光素酶活性。表19:hek293細(xì)胞中的3’修飾的gluc-mrna表達(dá)數(shù)據(jù)。*相對(duì)轉(zhuǎn)染后24小未修飾的標(biāo)準(zhǔn)化在本申請(qǐng)中，已經(jīng)引用了各種出版物。這些出版物的全部?jī)?nèi)容通過引用并入本申請(qǐng)中，以便更充分地描述本發(fā)明所屬領(lǐng)域的狀態(tài)。雖然已經(jīng)參考所公開的實(shí)施方案描述了本發(fā)明，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將容易地理解，上面具體實(shí)施例和詳細(xì)研究?jī)H僅是對(duì)本發(fā)明的說明。應(yīng)當(dāng)理解，在不脫離本發(fā)明的精神的情況下，可以進(jìn)行各種修改。因此，本發(fā)明僅由所附權(quán)利要求限制。當(dāng)前第1頁(yè)12