專利名稱：遺傳改變和產(chǎn)生無變應(yīng)性貓的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因動物的產(chǎn)生，其中所識別的編碼已鑒定變應(yīng)原的基因序列被失 活。更具體地，本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因貓，其中編碼貓主要變應(yīng)原Fel d I的基因序列被中斷 (破壞或斷裂，disrupt)。
背景技術(shù)：
大約600萬美國人對貓具有變應(yīng)性(過敏，allergic)，并且盡管許多對貓具有變 應(yīng)性的人自己家中并不養(yǎng)貓，但接近三分之一的人家中養(yǎng)貓。已表明，在美國有28%的家庭 養(yǎng)有至少一只貓(相當(dāng)于至少5000萬只貓)。對貓具有變應(yīng)性的患者經(jīng)常報告在進(jìn)入有貓 的房子后快速發(fā)作哮喘和鼻炎。測試時，幾乎所有這些患者對貓毛皮屑提取物測試都表現(xiàn) 為陽性立即超敏性皮膚并且具有針對貓變應(yīng)原的血清IgE抗體。迄今為止，對貓敏感性的大多數(shù)治療集中于回避和免疫療法?；乇芸赡芤馕吨@ 著改變?nèi)藗兊木幼…h(huán)境和日常起居。例如，為了避免過多暴露于戶內(nèi)變應(yīng)原，建議將地 毯從地板上移走、床上覆蓋專用的床單、定期清潔空調(diào)機(jī)、以及用昂貴的空氣過濾器過濾空 氣?；ㄙM的時間、精力和金錢常常使得這種治療對于變應(yīng)性患者沒有吸引力。免疫化可能是一種有效的變應(yīng)性治療。但遺憾的是，定期變應(yīng)注射(allergy shot)的花費、接受治療涉及的時間、以及效力的可變性對于某些患者而言是相當(dāng)大的阻 礙。此外，存在這樣的風(fēng)險患者可能對免疫化具有嚴(yán)重反應(yīng)并且甚至可能發(fā)生過敏性休 克。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及一種對于變應(yīng)性的傳統(tǒng)治療的新型替代方案。并非建議回避或免疫治 療，本發(fā)明在其源頭消除變應(yīng)原。在貓的情況下，敏感性歸屬于貓的一種主要變應(yīng)原(Fel d I) (Ohman, JACI, 1977) 0利用新開發(fā)的基因靶向技術(shù)，可“敲除”胚胎細(xì)胞，即，胚胎干(ES) 細(xì)胞中的Fel d I基因。這些修飾的ES細(xì)胞隨后可引入發(fā)育的卵裂球中。在正常胚胎發(fā) 育過程中，ES細(xì)胞然后將被引入部分種系中(Capecchi, Science, June 1989)，(Robbins， Circulation Research, July 1993)。本發(fā)明的一種實施方式涉及一種分離的核酸，其包含SEQ ID NO. 7中示出的序列 的至少一部分。在另一種實施方式中，所述“一部分”包含SEQ ID N0. 7中的至少約5個、 至少約10個、至少約15個、至少約20個、至少約25個、至少約30個、至少約35個、至少約 40個、至少約45個、至少約50個、至少約60個、至少約70個、至少約80個、至少約90個、 至少約100個、至少約200個、至少約300個、至少約400個、至少約500個、至少約600個、
3至少約700個、至少約800個、至少約900個、或至少約1000個連續(xù)核苷酸。本發(fā)明的另一種實施方式涉及一種同源重組載體，包含(1)第一同源臂，(2)期 望多核苷酸(所需多核苷酸，desired polynucleotide)，以及(3)第二同源臂，其中，期望 多核苷酸位于第一和第二同源臂之間，并且其中，第一和第二同源臂中的每一個均包含SEQ ID NO. 7中的至少約Ikb序列。在另一種實施方式中，同源重組載體包含SEQ ID NO. 7中的 至少約5個、至少約10個、至少約15個、至少約20個、至少約25個、至少約30個、至少約 35個、至少約40個、至少約45個、或至少約50個連續(xù)氨基酸。在一種實施方式中，第一同源臂包含在SEQ ID NO. 7的核苷酸1至約核苷酸8，800 之間的任意序列。在另一種實施方式中，第一同源臂包含在SEQ ID N0. 7的核苷酸1至約 核苷酸10，000之間的任意序列。在又一種實施方式中，第一同源臂包含在SEQ ID N0. 7的 核苷酸1至約核苷酸10，800之間的任意序列。在另一種實施方式中，第一同源臂包含在 SEQ ID N0. 7的核苷酸1至約核苷酸14，800之間的任意序列。在另一種實施方式中，所述 “任意序列”包含SEQ ID N0. 7中的至少約5個、至少約10個、至少約15個、至少約20個、 至少約25個、至少約30個、至少約35個、至少約40個、至少約45個、至少約50個、至少約 60個、至少約70個、至少約80個、至少約90個、至少約100個、至少約200個、至少約300 個、至少約400個、至少約500個、至少約600個、至少約700個、至少約800個、至少約900 個、或至少約1000個連續(xù)核苷酸。在一種實施方式中，第二同源臂包含在SEQ ID N0. 7的核苷酸16，000至核苷酸 22，182之間的任意序列。在一種實施方式中，第二同源臂包含在SEQ ID N0. 7的核苷酸 14，700至核苷酸22，182之間的任意序列。在另一種實施方式中，第二同源臂包含在SEQ ID N0. 7的核苷酸10，800至核苷酸22，182之間的任意序列。在另一種實施方式中，所述 “任意序列”包含SEQ ID N0. 7中的至少約5個、至少約10個、至少約15個、至少約20個、 至少約25個、至少約30個、至少約35個、至少約40個、至少約45個、至少約50個、至少約 60個、至少約70個、至少約80個、至少約90個、至少約100個、至少約200個、至少約300 個、至少約400個、至少約500個、至少約600個、至少約700個、至少約800個、至少約900 個、或至少約1000個連續(xù)核苷酸。在一種實施方式中，任一個同源臂或兩個同源臂包含SEQ ID N0. 7序列，其具有選 自由約Ikb長、約2kb長、約3kb長、約4kb長、約5kb長、約6kb長、約7kb長、約8kb長、約 9kb長、以及約IOkb長組成的組中的長度。在另一種實施方式中，期望多核苷酸是一種可選標(biāo)記。本發(fā)明的另一個方面是一種用于中斷貓細(xì)胞基因組中的靶Fel d I序列的方法， 包括將權(quán)利要求1的同源重組載體引入貓細(xì)胞中，其中(a)載體中的同源臂起作用以與所 述細(xì)胞基因組重組，且(b)期望多核苷酸在靶序列位點整合至細(xì)胞基因組中，從而中斷該 靶序列。本發(fā)明的另一個方面是一種包含本文中所描述的任何期望多核苷酸的貓細(xì)胞。在 一種實施方式中，期望多核苷酸被整合至貓細(xì)胞基因組中。在一種實施方式中，含有期望多 核苷酸的貓細(xì)胞不表達(dá)Fel d I RNA或蛋白。在另一種實施方式中，已暴露于如本文中所描 述的同源重組載體的貓細(xì)胞不產(chǎn)生Fel d I蛋白，或者產(chǎn)生失活的Fel d I蛋白。因此，在 一種實施方式中，由不表達(dá)Fel d I蛋白的貓細(xì)胞產(chǎn)生的貓是不產(chǎn)生Fel d I變應(yīng)原的貓。因此，本發(fā)明預(yù)期這樣一種貓，其不產(chǎn)生Fel d I蛋白，因為該貓的細(xì)胞已根據(jù)本發(fā)明進(jìn)行 處理從而使Fel d I蛋白的表達(dá)減少或不表達(dá)。因此，與含有未經(jīng)受本文中所描述的同源 重組載體(作用)的細(xì)胞的貓相比，所產(chǎn)生的貓具有不同的Fel d I蛋白表達(dá)表型。因此， 與不是由根據(jù)本發(fā)明進(jìn)行處理的細(xì)胞產(chǎn)生的非轉(zhuǎn)基因貓相比，本發(fā)明的貓具有不同的或異 常的Fel d I表達(dá)特性。所得的嵌合子代對于無活性Fel d I基因是雜合的。當(dāng)與另一只雜合貓雜交時， 四分之一的后代與無活性Fel d I基因?qū)⑹羌兒系?。這些純合貓沒有主要變應(yīng)原，并且對 變應(yīng)性貓所有者的免疫療法是一種革命性替代。本發(fā)明可應(yīng)用于其中特定變應(yīng)原能夠被鑒別且其中編碼該特定變應(yīng)原的基因序 列的中斷對動物沒有弓I起傷害的所有動物。本發(fā)明是基于產(chǎn)生這樣的轉(zhuǎn)基因動物，其中用于特定變應(yīng)原的基因序列已被專用 (專化，specialized)構(gòu)建體中斷而使該基因失活。在優(yōu)選的實施方式中，改變的基因可傳 遞至子代。胚胎干細(xì)胞是源于胚泡的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(inner cell mass)的多能細(xì)胞。這些細(xì)胞保 留分化為發(fā)育主體中任何組織型的能力。ES細(xì)胞的基因組序列的改變將被傳遞至直接來源 于該改變的ES細(xì)胞系的所有其他細(xì)胞。在貓的胚胎干細(xì)胞中，編碼貓主要變應(yīng)原的Fel d I基因被中斷或“敲除”。這是 通過用基因組DNA的新序列插入或替代該功能基因的一部分，使得該基因無活性。修飾的 ES細(xì)胞可隨后通過多種公認(rèn)技術(shù)之一引入發(fā)育的卵裂球中，并隨后移植到代孕貓中。在正 常的胚胎發(fā)育過程中，來源于該改變的ES細(xì)胞的細(xì)胞被引入部分種系和身體組織中。獲得的嵌合子代對于無活性Fel d I基因是雜合的。當(dāng)與另一只雜合貓雜交時， 約四分之一的后代對于無活性Fel d I基因?qū)⑹羌兒系摹＿@些貓沒有貓主要變應(yīng)原。改變 的基因以及隨后的表型可傳遞至將來的子代。本發(fā)明提供一種編碼中斷的Fel d I基因的分離多核苷酸序列。根據(jù)本發(fā)明，這 樣的序列能夠通過全部或部分Fel d I基因的序列替代、序列插入、或缺失而中斷。在本發(fā) 明的又一種實施方式中，編碼可選標(biāo)記的核苷酸序列被插入Fel d I基因中或用于替代全 部或部分Fel d I基因。這樣的可選標(biāo)記基因的一個實例是賦予新霉素抗性的基因。在本發(fā)明的另一種實施方式中，提供了一種重組多核苷酸載體，其包含中斷的Fel d I基因的全部或部分。在本發(fā)明的又一方面，提供了一種包含中斷的Fel d I基因的貓胚 胎干細(xì)胞，以及一種包含載體的貓胚胎干細(xì)胞，該載體又包含中斷的Fel d I基因。在又一種實施方式中，本發(fā)明提供一種包含中斷的Fel d I基因的轉(zhuǎn)基因貓。這 樣的轉(zhuǎn)基因貓的體細(xì)胞、種系細(xì)胞(生殖譜系細(xì)胞，germ line cell)、或體細(xì)胞和種系細(xì)胞 二者的Fel d I基因可被中斷。根據(jù)本發(fā)明，提供了一種轉(zhuǎn)基因貓，其對于中斷的Fel d I 變應(yīng)原基因是雜合的。還提供了一種轉(zhuǎn)基因貓，其對于中斷的Fel d I基因是純合的。還 提供了具有中斷的Fel d I基因的轉(zhuǎn)基因貓，其是可繁殖的并能夠?qū)⒅袛嗟腇el d I基因 傳遞至其子代中。本發(fā)明還提供一種用于產(chǎn)生包含中斷的Fel d I基因的轉(zhuǎn)基因貓的第一方法，包 括以下步驟(a)將含有中斷的Fel d I基因的貓干細(xì)胞引入貓胚胎中；
(b)將該胚胎移植入代孕貓(pseudopregnant cat)中；以及(c)允許該貓胚胎成熟為貓。按照該方法產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因貓對于中斷的Fel d I基因可以是雜合的或純合的。純 合的轉(zhuǎn)基因貓將不產(chǎn)生Fel d I貓變應(yīng)原。最后，在本發(fā)明的另一種實施方式中，提供了一種用于產(chǎn)生包含中斷的Fel d I基 因的轉(zhuǎn)基因貓的第二方法，其中所述貓不產(chǎn)生貓變應(yīng)原Fel d I，并且其中所述貓對于中斷 的Fel d I基因是純合的，該方法包括以下步驟(a)按照上述第一方法產(chǎn)生第一雜合轉(zhuǎn)基因貓；(b)按照上述第一方法產(chǎn)生第二雜合轉(zhuǎn)基因貓，其中第二貓與第一貓性別不同；(c)使第一貓與第二貓交配；以及(d)選擇對于中斷的Fel d I基因是純合的且不產(chǎn)生Fel d I抗原的轉(zhuǎn)基因貓。前面的一般性描述及以下對附圖的簡要描述和詳細(xì)描述均是示例性和解釋性的， 旨在提供對要求保護(hù)的發(fā)明提供進(jìn)一步的解釋。根據(jù)以下對本發(fā)明的詳細(xì)描述，其他目的、 優(yōu)點和新特征對于本領(lǐng)域技術(shù)人員將是顯而易見的。


圖1是由含有靶基因中斷的胚胎源干細(xì)胞產(chǎn)生貓種系嵌合體的示意性概括。圖2示出了貓中的Fel d I基因的鏈1 (Ch 1)的核苷酸序列。Ch 1由70aa的成 熟蛋白亞單元組成。編碼Ch 1的基因的測序表明，存在兩個可替換的Ch 1前導(dǎo)序列，其中 前導(dǎo)B外顯子與前導(dǎo)A外顯子的起始間隔46bp的內(nèi)含子。前導(dǎo)B (外顯子)或前導(dǎo)A(外顯 子)與外顯子3的接合導(dǎo)致產(chǎn)生編碼Asp (前導(dǎo)B)或Asn (前導(dǎo)A)的可替換的密碼子。這 些接合(外顯子1/3和外顯子2/3)位于距離成熟Ch 1的N端2aa處，其起始于Glu1。結(jié) 構(gòu)基因僅由兩個外顯子3和4(它們編碼成熟蛋白)組成。圖3示出了貓中Fel d I基因的鏈2 (Ch 2)的核苷酸序列。Ch2由92aa的成熟蛋 白亞單元組成。前導(dǎo)序列和成熟蛋白的前3個aa由外顯子1(61個核苷酸(nt) :20aa)編 碼。成熟蛋白大部分由外顯子2和3(分別為aa 4_64和65-90)編碼。Griffith公布的序 列的前 18nt 的外顯子 3 編碼殘基 IAINEY (aa 65-70) (Expression and Genomic Structure of the Genes Encoding FdI,the Major Allergen from the Domestic Cat,Gene (1992)), 而非Morgenstern公布的序列TTISSSKD，表明Ch 2具有兩種形式(Morgenstern, et al.， Proc. Nat' 1. Acad. Sci. USA, 88 :9690 (1991))。圖4繪出了用于序列替代載體的示意圖。序列替代載體設(shè)計為使得在線性化后， 該載體序列與內(nèi)源性序列保持共線。載體和基因組序列之間同源配對后，重組事件用含有 nec/(新霉素抗性)基因的載體序列替代基因組序列。Strps(鏈霉素敏感性)基因可置于 該替代載體的同源編碼區(qū)的外部以使進(jìn)一步篩選ES細(xì)胞集落更方便?？瞻卓虮硎緝?nèi)含子； 封閉框表示外顯子；畫有陰影交叉線的框表示nec/基因。圖5繪出了用于序列插入載體的示意圖。序列插入載體設(shè)計為使得線性化載體的 兩端在Fel d I圖譜上彼此鄰近。這些載體與它們的基因組同源物的配對，隨后在雙鏈斷 裂處的重組，導(dǎo)致整個載體被插入內(nèi)源性基因中。這產(chǎn)生一部分Fel d I基因的復(fù)制?？?白框表示內(nèi)含子；封閉框表示外顯子；畫有陰影交叉線的框表示nec/基因。
圖6繪出了 nec/基因的構(gòu)建。結(jié)構(gòu)基因和其控制元件包含在由pUC來源質(zhì)粒中的 Xhol位點(χ)和Sail位點(s)側(cè)掛的Ikb盒上。(a)來自多瘤病毒突變體PYF441、由堿基 5210-5274組成的增強(qiáng)子區(qū)的銜接重復(fù)。(b) HSV_tk啟動子，來自堿基92-218。(c)合成的 翻譯初始序列GCCAATATGGGATCGGCC。(d)來自Tn5的nec/結(jié)構(gòu)基因，包括堿基1555-2347。圖7繪出了 Fel d I基因座的示意圖，其中示出了鏈1和鏈2與Fel d I啟動子， 以及可用于設(shè)計適用于重組載體同源臂的序列的序列區(qū)域。
具體實施例方式I.轉(zhuǎn)基因?qū)W盡管本發(fā)明披露內(nèi)容涉及轉(zhuǎn)基因貓，但并不局限于貓。本發(fā)明涉及其中編碼變應(yīng) 原性蛋白的基因能夠被鑒別且失活而無害于動物的所有動物。本文中術(shù)語“動物”用于包括 所有脊椎動物，除人之外。其還包括在所有發(fā)育階段，包括胚胎和胎兒階段的個體動物。轉(zhuǎn) 基因“動物”是任何包含帶有通過在亞細(xì)胞水平的精細(xì)基因(遺傳)操作，如通過微注射、 注射重組病毒、或電穿孔而直接或間接接受的遺傳信息的一種或多種細(xì)胞的動物?；虿?作可以直接定向于染色體或者其可以定向于染色體外復(fù)制的DNA。“轉(zhuǎn)基因動物”是指這樣 的動物，其中遺傳信息被引入種系細(xì)胞中，從而賦予將該信息傳遞至子代的能力。如果這樣 的子代實際上具有某些或全部該信息，則它們也為轉(zhuǎn)基因動物。以下通過舉例方式呈現(xiàn)并且不應(yīng)解釋為對本發(fā)明范圍的限制。II.胚胎干細(xì)胞產(chǎn)生無變應(yīng)性貓的關(guān)鍵是將新DNA成功引入ES細(xì)胞中。胚胎干(ES)細(xì)胞系或克 隆和胚胎之間的嵌合體的產(chǎn)生是這些過程中的基本步驟，成功時其導(dǎo)致獲得具有改變基因 組的新的貓系。目前應(yīng)用的大多數(shù)ES系具有XY或雄性基因型。這有兩個優(yōu)勢。第一個優(yōu)勢在于 雄性XY ES系，當(dāng)注入雌性XX胚泡中時，將傾向于使獲得的嵌合體的發(fā)育偏向于雄性表型。 在表型為雄性的嵌合體中，僅帶有XY的生殖細(xì)胞(即，那些源于ES細(xì)胞的細(xì)胞)將形成功 能性配子。XX原始生殖細(xì)胞(即，那些源于宿主胚泡的細(xì)胞)將不形成功能性配子并被丟 失。因此，這將有利于源于ES細(xì)胞的配子的發(fā)育。第二個優(yōu)勢在于，雄性嵌合體在其育齡 期間能夠產(chǎn)生比雌性更多的子代，使得甚至是具有相對較低百分?jǐn)?shù)的ES細(xì)胞對種系的貢 獻(xiàn)的嵌合體，也能夠被檢測。自從ES細(xì)胞衍生開始，培養(yǎng)ES細(xì)胞所花費的時間長度也能夠影響它們形成種系 嵌合體的能力。最強(qiáng)壯且具有最高頻率的嵌合體通常是那些用早代克隆(即，最高10-15 代)的嵌合體；之后，已經(jīng)注意到，嵌合的程度和頻率可能常常，但并不總是，開始下降。為了有效地產(chǎn)生種系嵌合體，在任何操作或篩選之前，測試ES系以高頻率產(chǎn)生嵌 合體的能力，是基本的。標(biāo)準(zhǔn)是出生的超過50%的子代應(yīng)當(dāng)是嵌合的，其中，這些中的大 多數(shù)能夠?qū)S表型在種系中傳遞。另外建議在注射入胚泡之前，確定通過選擇而分離的任 何后繼克隆的核型(染色體組型，karyotype)，從而避免具有不會產(chǎn)生種系嵌合體的非整 倍體(異倍體)核型的任何克隆。這一程序?qū)?dǎo)致很大程度上節(jié)省時間和精力，并且如果 使用的ES細(xì)胞系已經(jīng)評估其產(chǎn)生種系嵌合體的能力，則僅需涉及使用C-帶染色技術(shù)來計 數(shù)染色體。與染色體平均數(shù)的任何偏離幾乎都將不可避免地導(dǎo)致產(chǎn)生弱的嵌合體，其中ES
7細(xì)胞貢獻(xiàn)于種系的可能性較小。然而，例外是從雄性ES系中丟失Y染色體。這樣的克隆能 夠產(chǎn)生非常好的嵌合體，導(dǎo)致通過雌性的種系傳遞。A.胚胎干細(xì)胞的衍化以下禾呈序是由在 Abbondanzo, Gadi, and Stewart, "Derivation of Embryonic Stem Cell Lines. "Methods in Enzymology，1993 中描述的方案改編的。胚胎干(ES) 細(xì)胞是胚泡的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICM)的多能性衍生物。ES細(xì)胞直接來源于體外移植的胚泡 的IOL已經(jīng)采用各種各樣的程序來獲得ES細(xì)胞，包括使用已進(jìn)行延時移植的胚泡以 及直接由分離自免疫手術(shù)后的胚泡的ICM而培養(yǎng)細(xì)胞。胚胎干細(xì)胞的衍化完整披露于 Abbondanzo,Gadi,and Stewart,"Derivation of Embryonic Stem Cell Lines.，，Methods in Enzymology (1993)中。ES細(xì)胞的體內(nèi)生長依賴于細(xì)胞因子白血病抑制因子(LIF)。這種蛋白對于維持體 外ES細(xì)胞的生長是必須的，因為在其缺乏的情況下，ES細(xì)胞分化并最終將停止增殖。白血病抑制因子能夠以不同方式供給ES細(xì)胞。目前最佳途徑、并且對于長期培養(yǎng) 是最有效的途徑，是在成纖維細(xì)胞的飼養(yǎng)層上培養(yǎng)ES細(xì)胞。飼養(yǎng)層合成并分泌LIF至培養(yǎng) 基中，并且，另外，也產(chǎn)生LIF的替代形式，其保持與由成纖維細(xì)胞沉積的細(xì)胞外基質(zhì)緊密 相關(guān)聯(lián)。LIF是由飼養(yǎng)層所產(chǎn)生的唯一因子，其對于ES細(xì)胞生長是必需。胚胎干細(xì)胞系也能夠在沒有飼養(yǎng)層的情況下由胚胎建立和維持。在這些條件下， 培養(yǎng)基補充有重組LIF，其可購自供應(yīng)商(GIBC0-BRL，Grand Island,NY ；R and D Systems, Minneapolis, MN)。也可以使用補充有通過生長分泌相對大量LIF至培養(yǎng)基中的某些細(xì)胞 系(參見下文)進(jìn)行“調(diào)節(jié)”的介質(zhì)的常規(guī)培養(yǎng)基?？梢允占摻橘|(zhì)并以適當(dāng)稀釋用作LIF 源。B.培養(yǎng)條件為了建立和培養(yǎng)ES細(xì)胞，要求配備有標(biāo)準(zhǔn)組織培養(yǎng)設(shè)施的實驗室，即，無菌/過 濾空氣培養(yǎng)罩、37C02-通氣孵育箱、以及裝配有用于觀察細(xì)胞的相襯(phase-contrast)光 學(xué)元件的組織_培養(yǎng)顯微鏡。此外，需要具有X40放大的良好立體解剖顯微鏡，連同用于 轉(zhuǎn)移胚泡以及用于挑選ICM或ES群的嘴控吸移管(mouth-controlled pipette)。參見 (Abbondanzo et al. , Methods in Enzymology,1993)。C.培養(yǎng)基ES細(xì)胞的有效維持要求所有培養(yǎng)基都用非常純的水制備。Millipore (Bedford， MA)Five-bowl Milli-Q純化系統(tǒng)提供質(zhì)量令人滿意的水。各種不同的培養(yǎng)基已用于培養(yǎng) 胚胎和ES細(xì)胞=Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)、Glasgow改良的Eagle培養(yǎng)基、以 及DMEM/Ham’ s F 12混合物。用含有高(含量)葡萄糖(4. 5g/升)、L_谷酰胺、以及不含 丙酮酸鈉的DMEM獲得較好的結(jié)果。購買的培養(yǎng)基是粉末形式，但可獲得IX至IOX濃度 的液體形式。按照制造商的說明書配制并用2. 2g/升的碳酸氫鈉緩沖。補充MEM非必需氨 基酸至終濃度為0. ImM[這些可作為IOOX (IOmM)溶液獲自GIBC0-BRL]。另外，連同終濃度 為0. ImM的2-巰基乙醇[通過向IOml的磷酸緩沖鹽(PBS)中加入70 μ 1的標(biāo)準(zhǔn)14Μ溶液 (Sigma, St. Louis,MO)而制備0. IM的儲液]，添加L-谷酰胺至終濃度為2mM。青霉素(50IU/ ml)和鏈霉素(50IU/ml)也包含在最終的制劑中，并且100X溶液可獲自GIBC0-BRL。該制 劑被稱為 ES-DMEM。參見(Abbondanzo et al. , Methods in Enzymology, 1993)。
D.飼養(yǎng)層的制備胚胎干細(xì)胞依賴于細(xì)胞因子LIF以維持其為未分化的增殖種群。該細(xì)胞因 子通常通過在產(chǎn)生LIF的G41V成纖維細(xì)胞的有絲分裂無活性飼養(yǎng)層上生長細(xì)胞而供 應(yīng)。(Ramirez-Solis et al. , Methods in Enzymology,1993), (Robins, Circulation Research，1993)。重組LIF是可商購獲得，但是較為昂貴。在缺少飼養(yǎng)物但具有補充重組 LIF的培養(yǎng)基的情況下，ES細(xì)胞來源于胚細(xì)胞培養(yǎng)物。然而，大多數(shù)這些細(xì)胞系含有大百分 比的非整倍體核型，使得它們不適合用于產(chǎn)生種系嵌合體。僅在少數(shù)情況下，種系嵌合體由 在無飼養(yǎng)物的含LIF培養(yǎng)基中建立的ES細(xì)胞產(chǎn)生。至今仍不清楚飼養(yǎng)物是否提供除LIF 之外的有助于建立和維持ES細(xì)胞的其他因子?？赡艿?，LIF的基質(zhì)相關(guān)形式，連同由飼養(yǎng)物 沉積的細(xì)胞外基質(zhì)，在維持ES細(xì)胞方面比單獨的可溶形式更加有效。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)在由成 纖維細(xì)胞沉積的細(xì)胞外基質(zhì)上而非在單獨的明膠(其為標(biāo)準(zhǔn)程序)上培養(yǎng)ES細(xì)胞時，在存 在LIF的無飼養(yǎng)物條件下，飼養(yǎng)物依賴性ES細(xì)胞的維持更加有效(在抑制ES分化方面)。 還參見(Abbondanzo et al. , Methods in Enzymology, 1993)。飼養(yǎng)物可以是永久的生長系(例如，STO成纖維細(xì)胞)。STO細(xì)胞的優(yōu)點是，它 們持續(xù)增殖，因此它們不需要重復(fù)衍生。用STO細(xì)胞的缺點是，不同亞系之間存在變異 性，其中在維持ES細(xì)胞方面一些亞系比其他亞系更加有效?？墒褂靡韵鲁绦颍涿枋鲈?Ramirez-Solis et al. ，Methods in Enzymology，1993 中。1.通過在板底部覆蓋0. 的明膠溶液并在室溫下孵育2hr完成用明膠涂覆組織 培養(yǎng)板(明膠溶液(w/v)組織培養(yǎng)級明膠混合于水中并對其高壓蒸氣滅菌；工作溶液 為0. 且通過在無菌水中稀釋的儲液而制備。在室溫下儲存)。在鋪放失活的飼養(yǎng)細(xì) 胞之前吸出明膠。2.生長6418^細(xì)胞直至在DMEM加7 % FCS和1 X GPS的15cm明膠化組織培養(yǎng)板上 匯合。為了使細(xì)胞失活，將絲裂霉素C儲液(0.5mg/ml)加入培養(yǎng)基中以達(dá)到10 μ g/ml的 終濃度，并將板于37°C、5% (v/v) CO2孵育2hr。3.吸出含有絲裂霉素的培養(yǎng)基并用PBS洗板兩次。4.加入2ml的胰蛋白酶溶液并在37°C、5% CO2孵育5min。5.加入5ml培養(yǎng)基并通過劇烈吸打來懸浮細(xì)胞。將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至50_ml的無菌離 心管中。再次用培養(yǎng)基洗板。集中所有經(jīng)絲裂霉素處理的細(xì)胞并在室溫下以IOOOrpm離心 5min。6.吸出上清液并在5-10ml的培養(yǎng)基中重懸浮沉淀物。計數(shù)細(xì)胞并加入培養(yǎng)基(介 質(zhì)，medium)至達(dá)到3. 5 X IO5細(xì)胞/ml的濃度。7.將飼養(yǎng)物等份樣轉(zhuǎn)移至明膠化板上，每ΙΟ-cm板12ml (4. 2 X IO6細(xì)胞/板)、每 6-cm板4ml(1.4X106細(xì)胞/板)等。使用前將板置于孵育箱中過夜，以給予細(xì)胞附著至板 上的時間。飼養(yǎng)板可在孵育箱中儲存3-4周，但在使用前應(yīng)在顯微鏡下進(jìn)行檢測以確認(rèn)飼 養(yǎng)層的完整性。E.從胚泡分離胚胎干細(xì)胞可使用以下程序，其描述在Ramirez-Soliset al. ,Methods in Enzymology, 1993 中1.按照14h光照和IOh黑暗的光照安排圈養(yǎng)實驗貓。每天飼喂貓一次并允許隨意
9飲水。每天檢查貓一次以確保它們未處于發(fā)情期或鄰近下次發(fā)情期。允許處理開始距離上 次發(fā)情期間隔2周。2.將沒有LH活性的pFSH在生理鹽水中重構(gòu)至濃度為2iu/ml (liu = 10 μ g)。可 將溶液等分并儲存于-20°C備用。3.每天向每只貓皮下注射2. Oiu的pFSH，共注射五天(每只貓接受總共10. Oiu 的 pFSH)。4.第六天皮下注射1. Oiu的pFSH并肌內(nèi)注射250. Oiu的人絨促性素(hCG)。第
七天重復(fù)這些注射。5.在第5、6、7和8天，將雌貓與育齡雄貓安置在一起直至發(fā)生至少四次交配。6.在處理開始后的第11天和第13天之間通過子宮灌洗實施手術(shù)取回胚胎。用 100 μ g美托咪定/kg和5mg氯胺酮/kg經(jīng)肌內(nèi)注射麻醉動物。7.中線切割后，將卵巢、子宮輸卵管接合處以及子宮體從腹部取出。8.在子宮體中切割1. Omm切口并插入三通Swan-Ganz兒科用導(dǎo)管至一個子宮角 中。膨脹管頭(cuff)以密封該子宮角的遠(yuǎn)端。在子宮輸卵管接合處，將無損傷縫合針引入 子宮腔內(nèi)并將20ml加熱至39°C的磷酸緩沖鹽水(PBS)[無Ca和Mg，加上丙酮酸-Na(0. 36g/ 1)、硫酸卡那霉素(0. 25g/l)和酚紅(0.05g/l)]兩次注射至子宮角中。借助在無菌小瓶中 的Swan-Ganz導(dǎo)管回收沖洗液體。9.回收后，用vicryl ( 一種可吸收的縫合材料)縫合切口。10.將胚胎轉(zhuǎn)移至35-mm的含有具有10%胎牛血清的PBS(PBS-FCS)的培養(yǎng)皿中。還進(jìn)行以下附力口步驟,其描述在 Abbondanzo et al. , Methods in Enzymology, 1993 中。11.利用立體解剖顯微鏡以X 20或X40放大來定位胚胎。一旦鑒別胚胎/胚泡， 則使用嘴控吸移管將其從培養(yǎng)皿中移出。12.將胚胎轉(zhuǎn)移至新的PBS-FCS皿中以洗去任何污染的血細(xì)胞或子宮組織并丟棄 任何未受精的卵/胚胎。13.將胚泡轉(zhuǎn)移至60-mm皿中，其中包含預(yù)修邊(pre-pared)的飼養(yǎng)物，向每個皿 中添加不超過20。向ES-DMEM中補充1000IU的重組LIF (鼠或人同樣有效)。將具有胚胎 的皿轉(zhuǎn)至37°C孵育箱中并在無干擾下放置2天。14.在該期間之后，胚胎從透明帶(zona pellucida)孵化并附著于皿的表面。 營養(yǎng)細(xì)胞(滋養(yǎng)層，trophoblast)向外蔓延而形成細(xì)胞單層，在其上能夠看到內(nèi)細(xì)胞團(tuán) (ICM)。在接下來的2天(即，直至移植胚泡時間后的第4天)后，ICM生長并在營養(yǎng)細(xì)胞 單層上形成特定的細(xì)胞堆。4天結(jié)束時以及在培養(yǎng)第五天的前半天，應(yīng)挑選ICM進(jìn)行解聚。 似乎存在較佳的時間窗，此時ICM最適于產(chǎn)生ES系。通常，如果在移植5天后的任意時期 挑選，則胚泡發(fā)育太久，且形成ES系的頻率降低。這個點常常能夠通過ICM核心周圍的內(nèi) 胚層的形成而識別。15.為了挑選ICM，吸出培養(yǎng)基并在無Ca2+/Mg2+的PBS中清洗皿兩次，其中胚胎保 持用PBS覆蓋。在石蠟油中固定含0. 25%胰蛋白酶和l.OmM EDTA加1 %雞血清的微滴。雞 血清包含在胰蛋白酶-EDTA溶液中，與FCS不同，其不包含胰蛋白酶抑制劑，并且所加蛋白 質(zhì)防止細(xì)胞溶解。
使用嘴控吸移管，通過輕輕移出ICM而從營養(yǎng)細(xì)胞中挑選出ICM。隨后將每個ICM 轉(zhuǎn)移至胰蛋白酶-EDTA溶液加雞血清的單個微滴中并放置約3-5min。ICM團(tuán)叢中的細(xì) 胞開始不再彼此接觸。使用另一個嘴控吸移管，其尖端已進(jìn)行火焰拋光以去除任何尖銳邊 緣并且其直徑為50至100 μ m，通過上下吸打幾次，將ICM團(tuán)打碎為較小的細(xì)胞簇和單個細(xì) 胞。將整個細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移至16-mm組織培養(yǎng)皿的單個孔中，該培養(yǎng)皿已含有成纖維細(xì)胞 飼養(yǎng)層。培養(yǎng)基(Iml)是補充有1000IU LIF的ES-DMEM。使用Nunclone 4X 16mm多孔皿 (Nunc)作為解聚ICM的培養(yǎng)容器，允許每個ICM —個孔。當(dāng)所有ICM已解聚且每個已被轉(zhuǎn) 移至孔中時，將培養(yǎng)皿放回至孵育箱中。16.在移植ICM后第3至4天之間，應(yīng)檢查孔以核實ICM細(xì)胞確實存在并已開始 形成集落。移植的ICM細(xì)胞不只產(chǎn)生ES細(xì)胞。在許多情況下，通過持續(xù)培養(yǎng)初始外植體而 出現(xiàn)其他細(xì)胞類型。這些集落可能首先類似于ES集落。然而，隨著時間過去，它們分化并 停止增殖。具有特征形態(tài)的ES細(xì)胞集落，通常作為具有平滑邊緣的緊密圓形集落而繼續(xù)增 殖。很難區(qū)分該集落中的個體細(xì)胞，盡管它們的細(xì)胞核能夠被識別且包含一個或兩個明顯 的核。通過每日的觀察孔，可以了解集落是否隨著其增殖(無分化)而繼續(xù)增大尺寸。這 些集落最經(jīng)常在孔的周邊發(fā)現(xiàn)，有時利用組織培養(yǎng)顯微鏡很難對其進(jìn)行觀察。因此應(yīng)當(dāng)仔 細(xì)檢查周邊以確保沒有錯過任何集落。在挑選和解聚(分解，disaggregate) ICM后7-10天 內(nèi)，ES集落應(yīng)當(dāng)是明顯的?？雌饋硎褂迷绱?P2-3)成纖維細(xì)胞以及將重組LIF包含在培養(yǎng)基中能夠有助于 從解聚的ICM建立ES細(xì)胞。大體上，ES系能夠從挑選的ICM以10-30%的頻度建立。F.胚胎干細(xì)胞的擴(kuò)增(expansion)當(dāng)ES細(xì)胞集落已經(jīng)在初始外植體(primary explants)中鑒別出時，它們的數(shù)量 可以被擴(kuò)增。不必將初始培養(yǎng)物中的ES細(xì)胞與可能存在的其他分化細(xì)胞類型分離，因為ES 細(xì)胞的特征之一是快速且持續(xù)的增殖。含有ES集落的整個孔在PBS中清洗2次，并吸出PBS。向每個孔中，加入0. 2ml的 胰蛋白酶溶液加雞血清，并使孔胰蛋白酶化5min。然后加入0. 5ml的ES-DMEM，并通過 輕輕吸打懸浮液而將所有細(xì)胞團(tuán)打碎，其中需小心確保不要將氣泡引入孔中。如果孔中僅 存在一個或兩個ES集落，則將細(xì)胞懸浮液留在孔中以再附著。第二天用Iml的ES-DMEM加 1000IU/ml LIF替換培養(yǎng)基。在接下來的3_5天，如果正確鑒別ES集落，則許多新的ES細(xì) 胞集落應(yīng)當(dāng)是可見的。然后可再次使孔胰蛋白酶化并將內(nèi)含物轉(zhuǎn)移至含有成纖維細(xì)胞飼養(yǎng) 層的60-mm皿中。ES細(xì)胞集落應(yīng)繼續(xù)增殖而不分化。在這點上，不再必須包含LIF且細(xì)胞 能夠在ES-DMEM中的飼養(yǎng)層上維持。參見上述Abbondanzo中描述的程序。G.胚胎干細(xì)胞的擴(kuò)增、冷凍和常規(guī)培養(yǎng)一旦已發(fā)現(xiàn)ES系含有高百分比的具有正常二倍體核型的細(xì)胞，應(yīng)當(dāng)進(jìn)行擴(kuò)增以 使盡可能多的早代細(xì)胞在液氮中冷凍。這將為將來的實驗提供足夠的資源，因為相比于使 用15-20代及更晚代，早代ES細(xì)胞傾向于以較高頻率形成較好的嵌合體。然而，沒有絕對 的相關(guān)性，因為已報道相對晚代的系如D3產(chǎn)生種系嵌合體。如果以足夠低的密度將細(xì)胞涂布開，那么通過每5-6天將細(xì)胞胰蛋白酶化和重涂 布于含有新鮮飼養(yǎng)物的皿中，ES細(xì)胞能夠維持為未分化的細(xì)胞群。60-mm皿以最大密度將 含有約1-2X107個ES細(xì)胞，而150-mm皿以最大密度可含有多達(dá)2-3X108個細(xì)胞。如果細(xì)胞超過最大密度水平，則細(xì)胞將開始分化或死亡，因此在它們必須傳代之前所能維持的最 佳時間段是約5-7天。為了維持細(xì)胞系，使半?yún)R合(semiconfluent)皿胰蛋白酶化并將稀 釋度為1 100至1 500的單個細(xì)胞懸浮液涂布開是足夠的。如果以合理低的密度再涂 布細(xì)胞，則需要每隔一天更換培養(yǎng)基以保持細(xì)胞在最佳的條件下。如果要求更多細(xì)胞和更 高密度，則應(yīng)當(dāng)每天重新飼養(yǎng)細(xì)胞。如果條件是亞最佳，則將出現(xiàn)分化的衍生物，并且ES細(xì) 胞堆將開始變平，伴隨個體細(xì)胞變得更加明顯。在極端條件下，大多數(shù)細(xì)胞將已發(fā)生分化。 關(guān)于這種技術(shù)的全面描述，參見在前的Abbondanzo。H.胚胎干細(xì)胞的冷凍可使用上述Abbondanzo描述的以下程序。1. ES細(xì)胞的培養(yǎng)物應(yīng)當(dāng)處于log生長階段(對數(shù)生長階段)，即，未處于最大密 度。在PBS中清洗皿2次并進(jìn)行胰蛋白酶化。2.收集細(xì)胞，重懸浮于培養(yǎng)基(介質(zhì)，medium)中，并用血球計進(jìn)行計數(shù)。3.用于冷凍細(xì)胞的培養(yǎng)基由DMEM和FCS的50 50混合物構(gòu)成，其含有終濃度為 10% (ν/ν)的二甲亞砜(DMSO) (Sigma)。4. Iml含1-5 X IO6ES細(xì)胞的介質(zhì)被等分至l_ml的具有螺旋蓋和橡皮密封的無菌 冷凍小瓶(Nunc)中。5.在小瓶上標(biāo)記ES系以及代數(shù)，將其置于支撐架上，并在-70°C冷凍機(jī)中存放過 夜。6.第二天應(yīng)當(dāng)將該經(jīng)冷凍的小瓶轉(zhuǎn)移至液氮容器中用于長時間保存。7.為了解凍ES細(xì)胞，應(yīng)當(dāng)提前準(zhǔn)備含有ES-DMEM培養(yǎng)基中的飼養(yǎng)層的60-mm 組織培養(yǎng)皿。取出具有ES細(xì)胞的小瓶并將其置于具有預(yù)熱至37°C的無菌蒸餾水的燒杯 中直至小瓶中內(nèi)含物融化。取出小瓶，用100%的乙醇擦洗以消毒外部，并用無菌巴斯 德(Pasteur)吸移管移出細(xì)胞懸浮液。可將細(xì)胞立即涂布在60_mm皿中。第二天用新鮮 ES-DMEM替換培養(yǎng)基以除去所有DMSO和任何死細(xì)胞。如果ES細(xì)胞的冷凍和解凍都正確完 成，那么在培養(yǎng)皿中應(yīng)該已經(jīng)可看到ES集落。III.基因靶向基因靶向、或定點重組是標(biāo)準(zhǔn)實驗室技術(shù)，其利用天然細(xì)胞機(jī)制已知的用于交換 DNA序列的同源性重組，從而用另一種期望的多核苷酸替換或中斷(打亂)內(nèi)源基因組序列 的全部或部分。因此，基因靶向能夠用于例如敲除、缺失、或防止整個基因或其外顯子的正 常表達(dá)或者用于引入點突變。在天然細(xì)胞機(jī)制下，共享序列同一性的任何DNA序列對(即，它們是“同源”序列) 都能夠相互作用而形成新的重組DNA物種(species)。然而，隨著共享核苷酸DNA序列長度 的增加，所期望的這種同源重組事件的成功率也增加，并且利用線性化質(zhì)粒分子比利用環(huán) 形質(zhì)粒分子成功率更高。在同一性較低的兩條DNA序列之間可以發(fā)生同源重組，但重組頻 率隨著兩序列之間的趨異(分歧)增大而降低。因此，感興趣的多核苷酸能夠在載體中連接至與宿主細(xì)胞的內(nèi)源序列共享同源性 的序列。這些序列在本文中被稱為“同源臂”。最后，同源序列(載體中的那些同源序列及 其基因組對應(yīng)序列)相互作用或“重組”，以在同源基因組DNA序列的位置處插入期望多核 苷酸(在載體中它們連接于該期望多核苷酸)。因此，對于作為同源臂的序列的選擇將決定
12期望多核苷酸整合至基因組中的位置(位點)。如果期望多核苷酸插入子(insert)連接于與單拷貝基因共享同源性的同源臂， 那么該期望多核苷酸將經(jīng)由同源性重組僅在單個特定位點被插入。另一方面，如果期望多 核苷酸連接于與多拷貝基因共享同源性的同源臂，那么該期望多核苷酸可能經(jīng)由同源性重 組在基因拷貝所定位的每一個特異性位點處被插入。期望DNA序列能夠通過涉及(1)單相互重組(其導(dǎo)致插入引入DNA的全長)、或 (2)雙相互重組(其導(dǎo)致插入僅僅定位在兩次重組事件之間的DNA)的同源重組反應(yīng)而被插 入基因組中。為了將外來基因插入基因組位點(如，F(xiàn)el d I)中，引入的載體應(yīng)當(dāng)包含與基因 組Fel d I基因同源的序列。單次同源重組事件會導(dǎo)致整個引入的DNA序列被插入至基因 組Fel d I基因座中。可替換地，雙重組事件可以通過用與Fel d I基因的序列同源的同 源臂來側(cè)接將要被插入基因組中的期望多核苷酸的每一端而實現(xiàn)。同源臂中的一個或兩個 也可包含位于Fel d I基因或基因座以外的序列，例如處于感興趣的具體Fel d I基因的 5’-端或3’-端的上游或下游的鄰近側(cè)接序列。涉及側(cè)接期望多核苷酸的這兩個同源臂中 的每一個的同源重組事件，將導(dǎo)致將期望多核苷酸插入至基因組中。依據(jù)這種背景，并且根據(jù)本發(fā)明，F(xiàn)el d I基因座的任何部分可以被中斷。即，基因 靶向技術(shù)可用于(A)敲除或缺失整個Fel d I基因座，其包括編碼“鏈1”和“鏈2”的Fel d I基因序列(參見下面的B) ； (B)敲除編碼鏈1的基因的全部或部分或者編碼鏈2的基因 的全部或部分；(3)敲除一條鏈的全部以及另一條鏈的部分；(4)敲除來自任一條Fel d I 鏈序列的一個或多個特異性外顯子；(5)敲除Fel d I啟動子序列的全部或部分；(6)用另 一不同的核苷酸、其他多個不同的核苷酸、或與靶序列的序列同一性不為100%的另一段連 續(xù)核苷酸，取代(即替換)一個或多個核苷酸或者存在于Fel d I基因座中的一段連續(xù)核 苷酸；(7)將期望多核苷酸插入基因組序列中。本發(fā)明并不限于這些示例性基因靶向事件。因此，本發(fā)明考慮了敲除、缺失、替換、取代、或以其他方式中斷至少某個部分的 Fel d I基因序列，其包括編碼鏈1的Fel d I序列的外顯子和內(nèi)含子、編碼鏈2的Fel d I序列的外顯子和內(nèi)含子、以及Fel d I基因的啟動子序列。本發(fā)明還考慮了將期望序列 插入基因組中。這些方法中的任一種可以中斷內(nèi)源基因組Fel d I序列的正常表達(dá)，中斷 程度為不產(chǎn)生或僅產(chǎn)生部分Fel d I RNA轉(zhuǎn)錄本，使得如果有，也只產(chǎn)生極少量的Fel d I 蛋白。這可能是因為鏈1和2中的任一條不表達(dá)或兩條都不表達(dá)，或是因為這種中斷引起 Fel d I突變蛋白被表達(dá)。因此，基于本發(fā)明期望的是，在根據(jù)本發(fā)明靶向動物基因組后，任 何Fel d I基因序列的表達(dá)產(chǎn)生(如果有)極少量的天然Fel d I蛋白變應(yīng)原。在這種情況下，可以靶向和中斷Fel d I基因的任何外顯子，只要該中斷的作用是 減少或防止功能性和正常Fel d I蛋白的表達(dá)?？梢酝ㄟ^僅靶向一個或少數(shù)外顯子的中斷 (由此可產(chǎn)生突變Fel d I蛋白，其仍然包含變應(yīng)原表位)。然而，在Fel d I系統(tǒng)中，中斷 第一外顯子可能是非常期望的，因為該基因的起始密碼子存在于該外顯子中，其操控用于 轉(zhuǎn)錄和翻譯目的的閱讀框。因此，中斷該特定外顯子以去除起始密碼子能夠很好地防止該 基因序列完整地表達(dá)。還可期望的是，去除Fel d I的兩條鏈(鏈1和鏈2)基本上所有的 編碼序列以及也去除Fel d I啟動子的所有序列。Fel d I長度中約21，939bp的核苷酸序列通過本發(fā)明鑒別并示出在SEQ IDN0.7(圖7)中。其包含由本申請發(fā)明人鑒別的DNA序列，該序列用于實施這些同源重組事 件中的任一個。如圖7中所示出的，上鏈為正鏈，而最下鏈為代表基因組Fel d I序列的 DNA雙鏈中的負(fù)鏈。包含F(xiàn)el d I鏈1的外顯子和內(nèi)含子的編碼序列在正鏈上從位于SEQ ID NO. 7的約14，410的核苷酸延伸至約核苷酸16，028。包含F(xiàn)el d I鏈2的外顯子和內(nèi) 含子的編碼序列在負(fù)鏈上從核苷酸位10，520延伸至約8，437。在鏈1和鏈2各自的起始密 碼子之間間隔約3，888核苷酸。Fel d I啟動子大約位于10，521-14，409的區(qū)域中。該單 獨啟動子驅(qū)動鏈1和鏈2的表達(dá)。參見圖7，是Fel d I基因組座位組織的示意圖。如果期望在整個Fel d I基因上進(jìn)行同源重組，即，敲除鏈1和鏈2以及啟動子， 那么可以由側(cè)接于所指示的鏈端點的SEQ ID NO. 7的任意部分來產(chǎn)生同源臂。因此，根據(jù) 本發(fā)明，可以由從SEQ ID NO. 7的核苷酸1延伸至約核苷酸8，437的任意序列(其鄰接鏈2 的序列)或者由約16，029至核苷酸21，939 (SEQ ID W).7的末端)產(chǎn)生同源臂。因此，用 于此目的的第一同源臂可包含1-8437序列的任意長度。用于此目的的第二同源臂可包含 16029-21939序列的任意長度。當(dāng)然，在本發(fā)明的任何實施方式中，任何特定同源臂的序列 不包括特定的鏈DNA序列并不是關(guān)鍵的。也就是說，在這種具體的實施方式中，其中鏈1和 2以及啟動子將被敲除，如果一個或兩個同源臂的序列分別延伸到鏈1或鏈2中，則對于重 組或本發(fā)明來說并非致命的。例如，第一同源臂可從核苷酸7，000延伸至核苷酸9，000,并 因此延伸進(jìn)入鏈2編碼序列的3’-端，但在功能上仍然可用于同源重組目的。事實上，本發(fā) 明明確考慮了這樣的序列設(shè)計。因此，本發(fā)明用于敲除鏈1、鏈2、以及啟動子的同源重組構(gòu)建體可包括(1)第一同 源臂，其例如包含SEQ ID NO. 7的核苷酸5，000-8, 000 ； (2)第二同源臂，其例如包含核苷酸 15，000-18，000;以及(3)期望多核苷酸，其位于第一和第二同源臂之間。通過類似方法，可將同源臂設(shè)計為側(cè)接于內(nèi)源基因組中期望靶向的任何部 分。因此，為了僅中斷鏈1，例如，可將第一同源臂設(shè)計為包含在SEQ ID N0.7的核苷 酸5，000-8，000之間的序列，并將第二同源臂設(shè)計為包含在SEQ ID N0.7的核苷酸 11，000-13，000之間的序列。將目的在于整合至天然基因組中的期望多核苷酸再次定位在 這兩個同源臂之間。重組后，期望多核苷酸將替代鏈1序列。同樣，為了中斷鏈2，可將第一 同源臂設(shè)計為從SEQ ID NO. 7的核苷酸12，000延伸至核苷酸14，000，并將第二同源臂設(shè)計 為從SEQ ID N0. 7的核苷酸17，000延伸至19，000。類似地，為了中斷Fel d I啟動子，可 將第一同源臂設(shè)計為包含SEQ ID N0. 7中8，000-10，000的序列，并將第二同源臂設(shè)計為包 含SEQ ID N0. 7中15，000-17，000的序列。當(dāng)然，這些實施例僅為可能同源臂的實例，這些 同源臂可被設(shè)計為靶向SEQ ID N0. 7所示的Fel d I基因序列中的一個或多個區(qū)域。同源臂可以具有任意長度，例如長度小于約1，000個核苷酸、或約1，100個核苷 酸、約1，200個核苷酸、約1，300個核苷酸、約1，400個核苷酸、約1，500個核苷酸、約1，600 個核苷酸、約1，700個核苷酸、約1，800個核苷酸、約1，900個核苷酸、約2，000個核苷酸、 約2，100個核苷酸、約2，200個核苷酸、約2，300個核苷酸、約2，400個核苷酸、約2，500個 核苷酸、約2，600個核苷酸、約2，700個核苷酸、約2，800個核苷酸、約2，900個核苷酸、約 3，000個核苷酸、約3，100個核苷酸、約3，200個核苷酸、約3，300個核苷酸、約3，400個核苷 酸、約3，500個核苷酸、約3，600個核苷酸、約3，700個核苷酸、約3，800個核苷酸、約3，900 個核苷酸、約4，000個核苷酸、約4，100個核苷酸、約4，200個核苷酸、約4，300個核苷酸、
14約4，400個核苷酸、約4，500個核苷酸、約4，600個核苷酸、約4，700個核苷酸、約4，800個 核苷酸、約4，900個核苷酸、約5，000個核苷酸、約5，100個核苷酸、約5，200個核苷酸、約 5，300個核苷酸、約5，400個核苷酸、約5，500個核苷酸、約5，600個核苷酸、約5，700個核苷 酸、約5，800個核苷酸、約5，900個核苷酸、約6，000個核苷酸、約6，100個核苷酸、約6，200 個核苷酸、約6，300個核苷酸、約6，400個核苷酸、約6，500個核苷酸、約6，600個核苷酸、 約6，700個核苷酸、約6，800個核苷酸、約6，900個核苷酸、約7，000個核苷酸、約7，100個 核苷酸、約7，200個核苷酸、約7，300個核苷酸、約7，400個核苷酸、約7，500個核苷酸、約 7, 600個核苷酸、約7，700個核苷酸、約7，800個核苷酸、約7，900個核苷酸、約8，000個核苷 酸、約8，100個核苷酸、約8，200個核苷酸、約8，300個核苷酸、約8，400個核苷酸、約8，500 個核苷酸、約8，600個核苷酸、約8，700個核苷酸、約8，800個核苷酸、約8，900個核苷酸、 約9，000個核苷酸、約9，100個核苷酸、約9，200個核苷酸、約9，300個核苷酸、約9，400個 核苷酸、約9，500個核苷酸、約9，600個核苷酸、約9，700個核苷酸、約9，800個核苷酸、約 9，900個核苷酸、約10，000個核苷酸、約10，100個核苷酸、約10，200個核苷酸、約10，300 個核苷酸、約10，400個核苷酸、約10，500個核苷酸、約10，600個核苷酸、約10，700個核苷 酸、約10，800個核苷酸、約10，900個核苷酸、約11，000個核苷酸、約12，000個核苷酸、約 13，000個核苷酸、約14，000個核苷酸、約15，000個核苷酸、約16，000個核苷酸、約17，000 個核苷酸、約18，000個核苷酸、約19，000個核苷酸、約20，000個核苷酸、約21，000個核苷 酸、約22，000個核苷酸、或大于約22，000個核苷酸。第一和第二同源臂的長度不必須彼此相同。此外，根據(jù)本發(fā)明，同源臂不必須在其 序列的整個長度上100%與其將重組的Fel d I基因的對應(yīng)序列相同。因此，同源臂與內(nèi)源 序列可共享一定百分比的序列同一性，約70 %、約71 %、約72 %、約73 %、約74%、約75 %、 約 76 %、約 77 %、約 78 %、約 79 %、約 80 %、約 81 %、約 82 %、約 83 %、約 84 %、約 85 %、 約 86%、約 87%、約 88%、約 89%、約 90%、約 91%、約 92%、約 93%、約 94%、約 95%、約 96%、約97%、約98%、或約99%與其將要重組的內(nèi)源序列相同并仍然履行功能以促進(jìn)同 源重組。從上文可以看出，同源臂可以非常長。因此，根據(jù)本發(fā)明，同源臂可以包含僅在其 長度的一部分上與內(nèi)源序列的100%序列同一性，而同源臂的其他部分與內(nèi)源序列共享小 于100%的序列同一性，但這樣的臂對于同源重組目的仍然是功能性的。因此，本發(fā)明考慮 了含有與內(nèi)源序列具有高序列同一性和低序列同一性的區(qū)域的同源臂，但其仍然具有實施 同源重組的功能。如本文中所使用的，在兩個核酸或多肽序列的情況下，“序列同一性”或“同一性” 包含這樣的含義當(dāng)在指定區(qū)域上以最大對應(yīng)性比對時，兩條序列的殘基是相同的。當(dāng)序列 同一性百分比用于提及蛋白時，應(yīng)當(dāng)理解不相同的殘基位置常常不同在于保守的氨基酸 取代，其中氨基酸殘基被取代為其他具有相似化學(xué)特性(例如，電荷或疏水性)的氨基酸殘 基，因而不改變分子的功能特性。當(dāng)序列的不同在于保守性取代時，序列同一性百分比可向 上調(diào)整以校正取代的保守特性。不同之處在于這樣的保守性取代的序列被說成是具有“序 列相似性”或“相似性”。用于進(jìn)行這種調(diào)整的方式是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。通常這涉 及將保守性取代評分為部分錯配而非完全錯配，從而提高序列同一性百分比。因此，例如， 在對相同氨基酸評分為1而對非保守取代評分為0的情況下，對保守性取代評分為0至1
15之間。保守性取代的評分，例如按照 Meyers and Miller,Computer Applic. Biol. Sci. ,4 11-17(1988)的算法，例如以程序PC/GENE(Intelligenetics，Mountain View，加利福尼亞， USA)執(zhí)行，而計算得出。如本文中所使用的，“序列同一性的百分比”意指通過在比較窗中比較兩條最佳比 對(對齊，align)的序列而確定的值，其中針對兩條序列的最佳比對在比較窗中的多核苷 酸序列部分與參考序列(其不包含添加或缺失)相比，可包含添加或缺失(即，間隙)。這 樣計算百分比通過確定兩條序列中相同核酸堿基或氨基酸殘基出現(xiàn)的位置數(shù)以產(chǎn)生匹配 位置的數(shù)目；匹配位置數(shù)除以比較窗中總的位置數(shù)并將結(jié)果乘以100而獲得序列同一性的 百分比。用于比較的序列的比對方法是本領(lǐng)域已知的。用于比較的序列的最佳比對可通 過 Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2 482 (1981)的局部同源算法；通過 Needleman and ffunsch, J. Mol. Biol. 48 443 (1970)的同源比對算法；通過 Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. 85 =2444(1988)的搜索相似性方法；通過這些算法的計算機(jī)實施 (包括但不限于Jntelligenetics, Mountain View,加利福尼亞的PC/Gene程序中的 CLUSTAL ；Wisconsin Genetics 軟件包中的 GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA,以及 TFASTA, Genetics Computer Group (GCG) ,575 Science Dr. , Madison, Wisconsin, USA ；CLUSTAL
細(xì)描述于 Higgins and Sharp, Gene 73:237-244(1988) ；Higgins and Sharp, CABIOS 5 151-153(1989) ；Corpet, et al.，Nucleic Acids Research 16 10881-90(1988) ；Huang, et al. , Computer Applications in the Biosciences 8:155-65(1992)以及 Pearson, et al.，Methods in Molecular Biology 24 :307_331 (1994))而進(jìn)行。能夠用于數(shù)據(jù)庫相似性搜索的BLAST系列程序包括BLASTN，用于針對核苷酸 數(shù)據(jù)庫序列的核苷酸詢問序列；BLASTX，用于針對蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫序列的核苷酸詢問序列； BLASTP，用于針對蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫序列的蛋白質(zhì)詢問序列；BLASTN，用于針對核苷酸數(shù)據(jù)庫 序列的蛋白質(zhì)詢問序列；BLASTX，用于針對核苷酸數(shù)據(jù)庫序列的核苷酸詢問序列；參見， Current Protocols in Molecular Biology,第 19 章，Ausubel, et al. , Eds. , Greene Publishing and ffiley-Interscience, New York(1995) ；Altschul et al. ,J. Mol. Biol., 215:403-410(1990)；以及 Altschul et al.，Nucleic Acids Res. 25 :3389_3402 (1997)。用于進(jìn)行BLAST分析的軟件可公開獲得(例如通過國家生物技術(shù)信息中心 (http://www. ncbi. nlm. nih. gov/))。這種算法涉及首先通過鑒別詢問序列中的長度W的 短字(當(dāng)與數(shù)據(jù)庫序列中相同長度的字相比對時，其匹配或滿足某個正值閾值分值T)來鑒 別高評分序列對(HSP)。T是指相鄰字分值閾值。這些起始的相鄰字命中(word hits)用 作啟動搜索的種子以尋找含有它們的更長HSP。字命中隨后在兩個方向上沿每條序列而延 伸，直至累積比對分值增加。累積分值對于核苷酸序列使用參數(shù)M(對于匹配殘基對獎分； 總是>0)和N(對于錯配殘基罰分；總是<0)計算。對于氨基酸序列，利用評分矩陣來計 算累積分值。當(dāng)累積比對分值從其最大實現(xiàn)值下降量X時；由于一個或多個負(fù)計分殘基 比對的累積，累積分值變?yōu)?或更低時；或者到達(dá)任一序列的末端時，每個方向上字命中的 延伸被停止。BLAST算法參數(shù)W、T和X確定比對的靈敏度和速度。BLASTN程序(用于核 苷酸序列)采用字長(W) 11、預(yù)期值(E) 10、截止值100、M = 5、N = -4，以及兩個鏈的比較 作為默認(rèn)值(缺省值)。對于氨基酸序列，BLASTP程序采用字長(W) 3、預(yù)期值(E) 10、以及BL0SUM62 評分矩陣(參見 Henikoff&HenikofT (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 10915) 作為默認(rèn)值。除了計算序列同一性百分比，BLAST算法還進(jìn)行兩條序列之間相似性的統(tǒng)計分析 (參見，例如，Karlin&Altschul，Proc. Nat，1. Acad. Sci. USA 90:5873-5877(1993))。通過 BLAST算法提供的相似性的一種度量是最小和概率(P (N))，其提供對于兩條核苷酸或氨基 酸序列偶然匹配的概率的指示。BLAST搜索假定可將蛋白模擬為隨機(jī)序列。然而，許多真正的蛋白包含非隨機(jī)序列 的區(qū)域，其可能是均聚束、短周期重復(fù)、或者富集一種或多種氨基酸的區(qū)域。這樣的低復(fù)雜 性區(qū)域可在不相關(guān)的蛋白之間進(jìn)行比對，即使蛋白的其他區(qū)域完全不同。許多低復(fù)雜性過 濾程序可用來減少這樣的低復(fù)雜性比對。例如，SEG(Wooten and Federhen，Comput. Chem.， 17 149-163(1993))和 XNU(Claverie and States, Comput. Chem. , 17 191-201(1993))低 復(fù)雜性過濾程序(filters)可單獨使用或組合使用。序列的多重比對可利用CLUSTAL 比對方法(Higgins and Sharp (1989) CABI0S. 5 151-153)、利用默認(rèn)參數(shù)(GAP PENALTY(間隙罰分)=10，GAP LENGTH PENALTY(間隙長度 罰分)=10)而進(jìn)行。利用CLUSTAL方法用于成對比對的默認(rèn)參數(shù)(缺省參數(shù))是KTUPLE UGAP PENALTY = 3、WINDOW = 5 以及 DIAGONALS SAVED = 5。因此，基因靶向同源重組載體可利用本文中所提出的原則和原理而產(chǎn)生，從而將 實施期望靶基因組中斷的DNA序列連接在一起。以下更加詳細(xì)地討論這樣的同源重組載體 構(gòu)建體，但其可包含(1)感興趣的多核苷酸序列，其側(cè)接于(2)第一同源臂和(3)第二同源 臂，如本文中所述。如上所述，本發(fā)明的同源臂例如可按照以上段落描述的原理而設(shè)計，以 包含SEQ ID N0. 7中的任意序列，且具有任意長度，如上述的那些長度。此外，本發(fā)明并不限 于僅靶向基因組序列。為了方便描述本發(fā)明，使用術(shù)語“基因組”和“內(nèi)源(性)的”，但用 于這些環(huán)境下靶向DNA序列的構(gòu)思也在本發(fā)明中考慮，例如靶向其他DNA源，如線粒體DNA、 染色體外DNA、來自另一載體的DNA或者已感染特定細(xì)胞的DNA，如病毒、真菌或細(xì)菌DNA。如在本文中使用的，期望多核苷酸、基因、或者Fel d I基因的“一部分”或“片斷”， 可包含任意延伸的連續(xù)核苷酸。因此，含有Fel d I基因的“一部分”的核酸或核苷酸例如 可包含約10個連續(xù)核苷酸、約15個連續(xù)核苷酸、約20個連續(xù)核苷酸、約25個連續(xù)核苷酸、 約30個連續(xù)核苷酸、約35個連續(xù)核苷酸、約40個連續(xù)核苷酸、約45個連續(xù)核苷酸、約50 個連續(xù)核苷酸、約55個連續(xù)核苷酸、約60個連續(xù)核苷酸、約65個連續(xù)核苷酸、約70個連 續(xù)核苷酸、約75個連續(xù)核苷酸、約80個連續(xù)核苷酸、約85個連續(xù)核苷酸、約90個連續(xù)核苷 酸、約95個連續(xù)核苷酸、約100個連續(xù)核苷酸、約110個連續(xù)核苷酸、約115個連續(xù)核苷酸、 約120個連續(xù)核苷酸、約125個連續(xù)核苷酸、約130個連續(xù)核苷酸、約135個連續(xù)核苷酸、約 140個連續(xù)核苷酸、約145個連續(xù)核苷酸、約150個連續(xù)核苷酸、約200個連續(xù)核苷酸、約300 個連續(xù)核苷酸、約400個連續(xù)核苷酸、約500個連續(xù)核苷酸、約600個連續(xù)核苷酸、約700個 連續(xù)核苷酸、約800個連續(xù)核苷酸、約900個連續(xù)核苷酸、約1，000個連續(xù)核苷酸、約2，000 個連續(xù)核苷酸、約3，000個連續(xù)核苷酸、約4，000個連續(xù)核苷酸、約5，000個連續(xù)核苷酸、約 6，000個連續(xù)核苷酸、約7，000個連續(xù)核苷酸、約8，000個連續(xù)核苷酸、約9，000個連續(xù)核苷 酸、或約10，000個連續(xù)核苷酸、或多于約10，000個連續(xù)核苷酸，包括落入本文中所述核苷 酸的任意范圍中的任意數(shù)量的連續(xù)核苷酸，即Fel d I基因的“一部分”包括，但不限于這
17樣的長度，其某種程度上在約100-1，000核苷酸之間、在約1，000-5, 000核苷酸之間、或在 約5，000-10, 000或更多核苷酸之間。連接至同源臂的期望多核苷酸可以是任意DNA序列，如不同的基因、或者陽性或 陰性可選標(biāo)記，或者期望多核苷酸可以是內(nèi)源序列的突變形式。在Fel d I基因的情況下， 例如，期望多核苷酸可基本上與天然編碼鏈1的DNA序列的部分相同，但包含一個或多個點 突變、缺失或插入，因此，利用針對Fel d I序列而設(shè)計的側(cè)接特定靶位點的同源臂的同源 重組，將有效導(dǎo)致天然的鏈IDNA序列替代如設(shè)計成期望多核苷酸的突變形式。以下的其他 實施方式對敲除某些或全部Fel d I基因序列的這一總體設(shè)計進(jìn)行詳細(xì)描述。A.胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)以下禾呈序是基于在 Ramirez-Solis, Davis, and Bradley, "Gene Targeting in Embryonic Stem Cells. ”Methods in Enzymology, (1993).中描述的方案改編的。利用US細(xì)胞用于基因靶向的目的是將培養(yǎng)中產(chǎn)生的突變轉(zhuǎn)移至貓種系中。由于 這一原因，防止異常細(xì)胞過度生長的培養(yǎng)條件是關(guān)鍵。ES細(xì)胞應(yīng)當(dāng)在有絲分裂失活的飼養(yǎng) 細(xì)胞層上生長。另外，細(xì)胞應(yīng)當(dāng)以高密度以及1 3至1 6的傳代頻率生長；這通常意味 著每日更換培養(yǎng)基。ES細(xì)胞應(yīng)當(dāng)在傳代前飼養(yǎng)4小時。為了傳代，應(yīng)當(dāng)將細(xì)胞用PBS清洗 兩次并胰蛋白酶化(用胰蛋白酶處理)10min ；無需預(yù)熱胰蛋白酶。加入ES-DMEM培養(yǎng)基，通 過劇烈吸打(抽吸，pipetting)來機(jī)械地打亂細(xì)胞團(tuán)。重要的是，在傳代前產(chǎn)生單個的細(xì) 胞懸浮液作為具有分化趨勢的細(xì)胞團(tuán)。應(yīng)當(dāng)記錄細(xì)胞系的傳代數(shù)以估測細(xì)胞培養(yǎng)的時間。 如果不是立即使用細(xì)胞，則應(yīng)將它們冷凍并在需要時恢復(fù)。培養(yǎng)的ES細(xì)胞群包括全能性細(xì)胞，以及具有貢獻(xiàn)于貓的所有組織的有限潛能的 細(xì)胞。由于靶向事件通常是罕見的而單個細(xì)胞克隆是必需的，因而建議優(yōu)化靶向載體及條 件，以使得能夠重新獲得多個靶向克隆。另外，克隆涉及低細(xì)胞濃度下并且可能為長期地進(jìn) 行培養(yǎng)，同時篩選期望克隆。B.編碼Feld I的基因兩種基因編碼包含貓主要變應(yīng)原Fel d I的蛋白鏈。將蛋白鏈指定為“鏈1”(或 Chl)和“鏈2”(或Ch2)。Fel d I基因的一條已公開的多核苷酸序列描述在Griffith， et al. Expression and Genomic Structure of the Genes Encoding Fdl, the Maj or Allergen from the Domestic Cat,Gene, 113(2) :263_8 (1992)中，其在圖 2和圖 3 中示出。 另外參見 Morgenstern et al.，Proc. Nat’ 1. Acad. Sci. USA, 88 9690 (1991)。Ch 1由70aa的成熟蛋白亞單元組成。對編碼Ch 1的基因的測序表明存在兩種 可替換Ch 1前導(dǎo)序列，其中前導(dǎo)B外顯子與前導(dǎo)A外顯子起始間隔46bp的內(nèi)含子。前導(dǎo) B (外顯子1)或前導(dǎo)A (外顯子2)與外顯子3的接合導(dǎo)致產(chǎn)生編碼Asp (前導(dǎo)B)或Asn (前 導(dǎo)A)的可替換密碼子。這些接合(外顯子1/3和外顯子2/3)位于距成熟Ch 1的N末端的 2aa處，其起始于Glu1。結(jié)構(gòu)基因僅由兩個外顯子3和4(其編碼成熟蛋白)組成(圖2)。Ch 2由92aa的成熟蛋白亞單元組成。前導(dǎo)序列和成熟蛋白的前3aa由外顯子 l(61nt ；20aa)編碼。成熟蛋白大部分由外顯子2和3 (分別為aa 4_64和65-90)編碼。外 顯子3的前ISnt編碼殘基IAINEY (aa 65-70)，而非公開的序列TTISSSKD，這表明Ch 2具 有兩種形式(圖3)。盡管載體構(gòu)建體能夠靶向任何外顯子，但優(yōu)先允許在所靶向外顯子的任一側(cè)上具有至少IOOObp的同源性。已經(jīng)證實這有助于重組事件的更大成功率。C.載體設(shè)計1.具有可選突變的一般載體設(shè)計通常，通過同源重組的基因靶向相比于隨機(jī)整合事件以較低頻率發(fā)生。對于大多 數(shù)基因，如前述段落中描述的載體，可以設(shè)計為降低隨機(jī)整合事件殘存選擇的頻率。ES細(xì)胞 中表達(dá)的基因可使用不合啟動子的可選標(biāo)記進(jìn)行靶向?？蛇x標(biāo)記可具有其自身的翻譯啟動 信號或者與所靶向基因形成融合蛋白。可替換地，可選標(biāo)記可置于基因內(nèi)，以使多腺苷酸化 信號必須通過基因組整合位點提供。對于任何基因，陰性可選標(biāo)記(即，Strps)可在靶向載體的同源區(qū)外部使用。在正 確的靶向事件中，陰性可選標(biāo)記將被切除并且細(xì)胞將對鏈霉素具有抗性，但在隨機(jī)事件中， 陰性標(biāo)記通常被整合并表達(dá)，使得經(jīng)由有毒核苷類似物的代謝而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。這些策略 可單獨使用或聯(lián)合使用以有助于提高相對的基因靶向頻率。殘存選擇的利用隨機(jī)整合事件 的克隆數(shù)將減少，這將使所靶向的事件更易于檢測。決定基因組座位的靶向頻率的因素目前還沒有完全確定。真正影響靶向頻率的因 素包括靶向載體和基因組座位之間具有理想同源性的長度、可選標(biāo)記在同源段內(nèi)的放置、 以及載體的線性化位點。利用陽性_陰性選擇的標(biāo)準(zhǔn)替代載體已表現(xiàn)出對于許多基因的 1/10至l/lOOOGMSistrpS集落的靶向頻率。關(guān)于靶向載體中同源序列的長度，載體構(gòu)建、 靶向事件的診斷、以及靶向頻率之間的一種適當(dāng)折衷，可以例如為約3kb，其中至少約Ikb 在可選標(biāo)記的任一側(cè)上，但本發(fā)明并不限于如上闡述的這種具體實施方式
。在這方面，本發(fā)明考慮了來自SEQ ID NO. 7的任意序列在用于構(gòu)建這樣的同源重 組載體中的應(yīng)用。SEQ ID NO. 7是用于這方面的22，250核苷酸長度的基因組Fel d I DNA 序列。Fel d I鏈1編碼序列，包括內(nèi)含子和外顯子，在SEQ ID N0. 7的正鏈(上方)上 位于核苷酸14，720至16，338之間。Fel d I鏈2編碼序列，包括內(nèi)含子和外顯子，位于 SEQ ID N0. 7的負(fù)鏈(下方)的核苷酸10，830至8，747之間。Fel d I啟動子位于核苷酸 10，831-14，719 之間。SEQ ID N0. 7的任意連續(xù)核苷酸段可用于構(gòu)建同源重組載體，隨后可將其用于靶 向貓基因組中的內(nèi)源Fel d I基因或Fel d I的內(nèi)源RNA轉(zhuǎn)錄本，從而減少、中斷或消除 Fel d I及所得蛋白的表達(dá)。因而，SEQ ID N0. 7提供可用于產(chǎn)生同源“臂”的有用序列，該 同源“臂”可被設(shè)計為側(cè)接期望Fel d I核苷酸靶位點。因此，本發(fā)明考慮了通過載體靶向 內(nèi)源Fel d I，該載體具有定向于側(cè)接靶位點的兩個同源臂。同源臂的長度可以是如上所述 的任意長度。期望構(gòu)建所具有的DNA來自與ES細(xì)胞系相同的貓系的靶向載體，因為多態(tài)性可以 中斷具有理想同源性的長度并導(dǎo)致較低的靶向頻率。應(yīng)當(dāng)仔細(xì)考慮期望重組事件之后的座 位的結(jié)構(gòu)，尤其是當(dāng)需要無效等位基因時。對于小基因，替代載體可設(shè)計為其中編碼序列被 可選標(biāo)記替代。對于較大的基因，第一編碼外顯子的中斷最可能產(chǎn)生無效等位基因。也可通過缺失全部或部分Fel d I基因來中斷Fel d I基因并失活，以便防止產(chǎn) 生功能性Fel d I蛋白。在首輪靶向之后，通過“mini-Southern (微小DNA)，，分析(F部分)常規(guī)篩選500 個集落。如果發(fā)現(xiàn)靶向的克隆，應(yīng)將它們通過幾次消化，利用特異于內(nèi)源序列的5’和3’端
19的探針和酶在Southern分析中進(jìn)行檢測，以確保已發(fā)生期望重組事件。如果沒有鑒別到克 隆，則最好重新設(shè)計載體而不是繼續(xù)進(jìn)一步的篩選。已表明插入載體比替代載體的靶向頻率高5至12倍，并且能夠用于隨后的靶向 嘗試中。取決于原始替代載體的設(shè)計，可能可以在同源區(qū)域內(nèi)線性化相同的載體以利用插 入事件的較高靶向頻率。載體設(shè)計的總體性討論參見Ramirez-Solis et al. ,Methods in Enzymology,1993。2.FeldI 載體設(shè)計Fel d I具有這樣的優(yōu)勢具有兩個編碼主要變應(yīng)原的基因。這意味著可以設(shè) 計構(gòu)建體以中斷鏈l(Ch 1)、或鏈2(Ch 2)、或這兩條鏈的編碼序列。對于靶基因的定位
Thomas and Capecchi, "Site-Directed Mutagenesis by Gene Targeting in Mouse Embryo-Derived Stem Cells，，Cell (1987)。將新霉素抗性(nec/)基因的專用構(gòu)建體引入Ch 1或Ch 2的克隆片段的外顯子 之一中。然后這種構(gòu)建體用于轉(zhuǎn)染ES細(xì)胞。nec/基因既用于中斷靶基因的編碼序列又用 作標(biāo)簽以監(jiān)控新引入的DNA整合于受體基因組中。nec/基因作為標(biāo)簽的有效應(yīng)用需要基因 在適當(dāng)?shù)腇el d I座位的表達(dá)。新霉素基因被設(shè)計以優(yōu)化在ES細(xì)胞中的表達(dá)同時維持其最小尺寸。為此目的已 對nec/進(jìn)行修飾并稱為pMClNeo，該構(gòu)建體的整體結(jié)構(gòu)示于圖6中。新霉素蛋白編碼序列 (d)來自于細(xì)菌轉(zhuǎn)座子Tn5，包含堿基1555-2347。驅(qū)動nec/基因的啟動子(b)獲自單純皰 疹病毒胸苷激酶基因(HSV-tk)的堿基92-218。這種啟動子看起來在胚胎癌(EC)細(xì)胞中 有效。為了提高tk啟動子的效力，引入由PyF441多瘤病毒增強(qiáng)子的堿基5210-5247組成 的合成65bp片段(a)的復(fù)制體(雙重體)。該片段涵蓋允許多瘤突變體有效感染EC細(xì)胞 的DNA序列改變。最后，由于天然nec/基因翻譯起始信號對于哺乳動物翻譯是特別不利的， 因此合成翻譯初始序列(c) (GCCAATATGGGATCGGCC)利用Kozak規(guī)則為指導(dǎo)被取代(Kozak， 1986)(圖6)。參見上述Thomas and Capecchi關(guān)于該構(gòu)建體的討論。有兩種中斷Fel d I基因的方案一種是通過序列替代載體、一種是通過序列插入 載體。兩種載體均含有用nec/基因中斷的外顯子。序列替代載體設(shè)計為使得在線性化后，載體序列與內(nèi)源序列保持共線。在載體與 基因組序列之間同源配對后，重組事件用含有nec/基因的載體序列替代該基因組序列(圖 4)。序列插入載體設(shè)計為使得線性化載體的末端在基因圖譜上彼此相鄰。這些載體與 它們的基因組類似物的配對，以及隨后在雙鏈斷裂處的重組，導(dǎo)致整個載體被插入內(nèi)源基 因中(圖5)。電穿孔后，成功的同源重組使得ES細(xì)胞對藥物G4181 具有抗性。為了使最初的篩 選更加方便，可在替代載體的同源編碼區(qū)域外部添加鏈霉素敏感基因。在成功的基因替代 后，該Strps基因丟失且ES細(xì)胞集落在含有鏈霉素的培養(yǎng)基上生長。如果重組在基因組DNA 中是隨機(jī)的，則Strps基因?qū)⒈Ａ舨⑶褽S細(xì)胞將不生長。D.電穿孔任何靶向?qū)嶒灥牡谝徊蕉际菍NA引入受體細(xì)胞中。對于ES細(xì)胞，DNA微注射和 電穿孔已表明可用于允許進(jìn)行基因靶向。DNA微注射在技術(shù)上時困難的并且具有可導(dǎo)致嚴(yán)重的染色體中斷的可能，這可能降低ES細(xì)胞形成嵌合體種系的潛力。另一方面，電穿孔已 廣泛用于產(chǎn)生經(jīng)歷種系的靶向克隆。使用的電穿孔方案基本上類似于那些用于其他細(xì)胞型 的那些，但某些事情對于ES細(xì)胞的特定情形是特別重要的。細(xì)胞應(yīng)當(dāng)在電穿孔時正在積極 地生長；這可通過在電穿孔前一天傳代ES細(xì)胞并在收集細(xì)胞前幾個小時添加新鮮培養(yǎng)基 而實現(xiàn)。胰蛋白酶處理時間應(yīng)當(dāng)足夠長以允許細(xì)胞團(tuán)的機(jī)械解聚從而避免分化。經(jīng)電穿孔 的細(xì)胞應(yīng)在5-lOmin內(nèi)涂布在具有M15培養(yǎng)基的飼養(yǎng)細(xì)胞上?？梢岳靡韵鲁绦颍涿枋?在 Ramirez-Solis et al. , Methods in Enzymology,1993 中1.通過CsCl綁扎(CsCl banding)技術(shù)制備靶向載體。2.用適合的限制性酶切割200 μ g的靶向載體DNA以將其線性化。通過瓊脂糖凝 膠電泳來評估限制性消化的完成情況。3.用苯酚-氯仿、氯仿清洗DNA并用NaCl和乙醇使其沉淀。將DNA重懸浮于無菌 的0. IX TriS-EDTA緩沖液(TE)中并調(diào)節(jié)濃度至lmg/ml。4.在電穿孔前一天，傳代積極生長的ES細(xì)胞( 80%融合)1 2。5.收集細(xì)胞用于電穿孔前4小時用新鮮M15培養(yǎng)基飼養(yǎng)細(xì)胞。6.用PBS清洗板兩次并通過用胰蛋白酶溶液(Iml胰蛋白酶溶液用于ΙΟ-cm板) 在37°C下處理IOmin使細(xì)胞脫附。7.通過加入1體積的M15培養(yǎng)基終止胰蛋白酶的作用并通過用轉(zhuǎn)移吸移管上下移 動懸浮液而使細(xì)胞團(tuán)離解。8.在臨床離心機(jī)中以IOOOrpm離心細(xì)胞5min并去除上清。將細(xì)胞重懸浮于IOml 的PBS中并確定細(xì)胞總數(shù)。9.重離心細(xì)胞，吸出上清，并將細(xì)胞以1. IX IO7細(xì)胞/ml的終密度重懸浮在PBS中。10.在電穿孔槽中混合25 μ g線性化的靶向載體與0. 9ml的細(xì)胞懸浮液。在室溫 下孵育5min。11.在230V、500yF的Bio-Rad基因脈沖儀中進(jìn)行電穿孔。在室溫下孵育5min。12.將槽中全部內(nèi)含物涂布在ΙΟ-cm具有飼養(yǎng)細(xì)胞的組織培養(yǎng)板上。飼養(yǎng)板上的 培養(yǎng)基應(yīng)當(dāng)在涂布細(xì)胞前更換為M15。13.在電穿孔后24小時施加G418選擇。如果遵循的是利用單純皰疹病毒_1胸苷 激酶(HSV-1 tk)基因的陽性-陰性選擇方案，那么也可以施加FIAU選擇。14.當(dāng)培養(yǎng)基開始變黃時，重新飼養(yǎng)細(xì)胞，在開始的5天通常為每天進(jìn)行。15.電穿孔后10天，準(zhǔn)備進(jìn)行集落挑選。E.電穿孔后集落的挑選和擴(kuò)增電穿孔后，ES細(xì)胞集落生長8-12天而變得肉眼可見，并在此時進(jìn)行挑選。應(yīng)當(dāng) 注意的是，每孔只接種單個集落以避免進(jìn)一步的克隆步驟。參見Ramirez-Solis et al., Methods in Enzymology,1993。1.用PBS清洗含有集落的板兩次并加入PBS以覆蓋板。2.通過在每孔中加入25 μ 1胰蛋白酶溶液而制備96-孔U-底板。3.將最初的10-cm板置于倒置顯微鏡上并用微量吸移管及最大體積為10 μ 1的一 次性無菌管頭(tip)挑選單個集落。將每個集落轉(zhuǎn)移至步驟2中制備的板孔中的胰蛋白酶溶液中。4.在已挑選96個集落后，將96-孔板置于37°C、5% CO2孵育箱中達(dá)lOmin。5.孵育期間，取之前制備的96-孔飼養(yǎng)板(平底孔)、吸出培養(yǎng)基、并在每孔中加 入150μ1的M15。將多通道吸移管(12通道)用于所有以下步驟。6.從孵育箱中取回胰蛋白酶化的集落并在每孔中加入25 μ 1的Μ15。通過用多通 道吸移管上下移動懸浮液大約5-10次來破碎細(xì)胞團(tuán)。7.將每孔中的全部內(nèi)含物轉(zhuǎn)移至步驟5中制備的96-孔板的孔中，每次更換管頭。8.將板置于孵育箱中并生長3-5天，需要時更換培養(yǎng)基。9.當(dāng)孔接近匯合時，用PBS清洗兩次并在IOmin內(nèi)每孔用50 μ 1的胰蛋白酶溶液 進(jìn)行胰蛋白酶化。加入50 μ 1的Μ15并通過劇烈吸打來破壞細(xì)胞團(tuán)。重新涂布50 μ 1至沒 有飼養(yǎng)細(xì)胞的明膠化96-孔板上。在原來的96-孔板中剩余的細(xì)胞可通過加入50μ 1的 2Χ冷凍培養(yǎng)基并進(jìn)行步驟4以后的方案而進(jìn)行冷凍。明膠化板可生長至DNA制備物匯合并通過“mini-Southern (微小DNA) ”印跡(G 部分)進(jìn)行分析。一旦已鑒別靶向的克隆，可從冷凍機(jī)中取回合適的孔并擴(kuò)增用于胚泡注 射以及后續(xù)的DNA分析(F部分)。F.在96-孔板中冷凍和解凍ES細(xì)胞在單個小瓶中冷凍ES克隆同時靶向克隆的篩選，是費力且耗時的工作，尤其是如 果待篩選的克隆數(shù)非常大的時候更是如此。已建議在96-孔組織培養(yǎng)皿中冷凍ES細(xì)胞，這 可一直允許解凍的克隆 100%回收。參見Ramirez-Solis et al. ,Methods in Enzymology, 1993。1.冷凍前4小時更換細(xì)胞上的培養(yǎng)基。2.通過吸出而去除M15培養(yǎng)基并用PBS漂洗細(xì)胞兩次。3.用多通道吸移管每孔加入50 μ 1的胰蛋白酶溶液并在37°C、5% CO2下孵育板 IOmin04.每孔加入50 μ 1的2X冷凍培養(yǎng)基并使集落離解。5.每孔加入100μ 1的無菌輕質(zhì)石蠟油以防止在-70°C保存期間脫氣和揮發(fā)。6.用封口膜(Parafilm)密封96-孔板并將其置于泡沫聚苯乙烯箱中；封閉該箱 并將其保存在_70°C下至少24小時。為了長期保存，將板轉(zhuǎn)移至零下135°C的冷凍機(jī)中。7.為了解凍，將96-孔板從冷凍機(jī)取出并將其置于37°C孵育箱中10-15min。8.鑒別所選的克隆并將孔中全部內(nèi)含物置于具有飼養(yǎng)細(xì)胞且含2ml的M15培養(yǎng)基 的1-cm板(24-孔)中。第二天更換培養(yǎng)基以去除DMSO和油。G.使用在多孔板上直接制備的DNA進(jìn)行Southern印跡(DNA印跡)分析通過Southern印跡進(jìn)行篩選，必需對集落進(jìn)行體外擴(kuò)增以提供足夠的DNA進(jìn)行這 樣的分析。在這種情況下，非常重要的是，提高提取過程中DNA回收的效率，這將因此減少 細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增的時間。克隆的復(fù)制品可在進(jìn)行該分析時冷凍。已給出在96-孔板中直接冷 凍細(xì)胞的方案(F部分)。為了進(jìn)一步提高基因靶向方案的效率，開發(fā)了一種DNA提取技術(shù)， 該技術(shù)提供快速、簡單并且可信賴的方式以通過Southern分析篩選大量的克隆。在將細(xì)胞 懸浮液分為兩個半份且一個半份已冷凍后，將另一半份涂布在明膠涂覆的96-孔復(fù)制板上 (E部分)。這一最后的板提供用于DNA微量提取程序的起始材料。細(xì)胞的溶解在板中通過加入溶胞緩沖液并在潮濕氣氛下于60°孵育過夜而實施。核酸在板中沉淀并保持附著于其 上，同時通過快速翻轉(zhuǎn)板而去除溶液；然后漂洗核酸、干燥、并在板中用限制性酶切割DNA。 所有96個樣品通過在同一塊膠中進(jìn)行電泳而分離。這大大加快了通過Southern印跡進(jìn)行 篩選的速率。這種方案已用于測試多種限制性酶，并且使用這種方法全都獲得完全的DNA 限制性酶切。然而，應(yīng)當(dāng)在大量篩選前與所選酶進(jìn)行先導(dǎo)反應(yīng)。當(dāng)處理大量板時，標(biāo)記底部 和蓋以避免混淆。參見 Ramirez-Solis et al.，Methods in Enzymology，1993。1.每天(4-5天)允許明膠涂覆的板上的細(xì)胞生長直至它們使培養(yǎng)基變黃。2.當(dāng)細(xì)胞準(zhǔn)備用于DNA提取程序時，用PBS漂洗孔兩次并向每孔中加入50 μ 1的 溶胞緩沖液。3.在潮濕氣氛下于60°孵育板過夜。這可通過在密閉容器(Tupperware)用濕紙 巾于常規(guī)60°箱中孵育板而容易地實現(xiàn)。4.第二天，使用多通道吸移管向每孔加入100 μ 1的NaCl和乙醇(150 μ 1的5Μ NaCl至IOml冷的無水乙醇中)的混合物。5.在室溫下同時沒有混合地將96-孔板置于試驗臺上30min。核酸沉淀為絲狀網(wǎng)6.小心翻轉(zhuǎn)板以去除溶液；核酸保持附著于板。在紙巾上印跡過量液體。7.使用多通道吸移管，通過每孔滴入150 μ 1的70%乙醇漂洗核酸3次。通過每 次翻轉(zhuǎn)板去除乙醇。8.在最后清洗后，翻轉(zhuǎn)板并使其在試驗臺上干燥。DNA準(zhǔn)備用限制性酶切割。9.制備限制性消化混合物，包含以下成分1Χ限制性(酶)緩沖液、Iml亞精胺 (spermidine)、牛血清白蛋白(BSA，100 μ g/ml)、RNA 酶(100 μ g/ml)、以及 10 單位的每種 限制性酶。10.用多通道吸移管每孔加入30 μ 1的限制性消化混合物；使用吸移管管頭混合 孔中內(nèi)含物并在濕潤氣氛下于37°C孵育該反應(yīng)過夜。11.向樣品中加入凝膠電泳上樣緩沖液并進(jìn)行常規(guī)電泳，并將DNA轉(zhuǎn)移至印跡膜。 使用6x10英寸的(w/v)瓊脂糖凝膠，其具有3個33-齒的梳子，每個之間間隔3.3英 寸。每個梳子提供足夠的空間用于96個樣品加1個分子量標(biāo)記物泳道。于80V在IXTAE 中進(jìn)行凝膠電泳4-5小時，獲得在I-IOkb范圍內(nèi)良好分離。H.在小瓶中冷凍和解凍胚胎干細(xì)胞應(yīng)該擴(kuò)增看起來具有期望突變的克隆并在小瓶中進(jìn)行冷凍。參見Ramirez-Solis et al. , Method in Enzymology,1993。1.在37°C用0. 2ml的胰島素溶液將已經(jīng)在l_cm平板(E部分)中擴(kuò)增的細(xì)胞解 離10分鐘，然后通過加入1體積的M 15使胰蛋白酶的作用停止并如前文所述使細(xì)胞團(tuán)解
聚ο2.取用于胚泡注射和用于進(jìn)一步DNA分析擴(kuò)增所需的細(xì)胞，并將其他細(xì)胞如下冷 凍。3.緩慢加入1體積的2x冷凍介質(zhì)(培養(yǎng)基)并將細(xì)胞懸浮液溫和地與其混合。4.在無菌冷凍小瓶中將細(xì)胞懸浮液分配成等分試樣。將小瓶置于泡沫聚苯乙烯 (tyrofoam)容器中，將容器封閉，并在-70°C儲存過夜。第二天，將小瓶轉(zhuǎn)移到_135°C的冷
23凍器或液氮中。5.為了解凍，將裝有冷凍細(xì)胞的小瓶轉(zhuǎn)移到37°C的水浴中。6.當(dāng)細(xì)胞懸浮液解凍時，將其轉(zhuǎn)移到無菌的15-ml試管中。邊搖動試管邊緩慢加 入M 15介質(zhì)；用M 15介質(zhì)填充試管并通過在室溫下IOOOrpm離心5分鐘來收集細(xì)胞。7.通過吸出而去除上清，將細(xì)胞沉淀重懸浮于2ml的M 15介質(zhì)中，確保沒有細(xì)胞 簇，并將細(xì)胞懸浮液與飼養(yǎng)細(xì)胞(feeder cell) 一起鋪到l_cm平板上。在37°C孵育。IV.使突變進(jìn)入到種系中至此，所描述的方案的目的均在于，在ES細(xì)胞中產(chǎn)生突變，其方式是細(xì)胞保持全 能并因此能夠有助于貓的體細(xì)胞組織，并且更重要的是，有助于貓的種系。因此，使ES細(xì)胞 在飼養(yǎng)層上生長、保持培養(yǎng)的時間最短(尤其是在低密度下)、以及在每次傳代時使細(xì)胞的 團(tuán)簇解離總是十分重要的。為了測試每一靶向克隆的多能性，應(yīng)注射足夠的胚泡以達(dá)到兩 升。應(yīng)確定后代的性別。ES細(xì)胞系通常來源于雄性胚泡，并且廣泛有助于注射的胚胎將雌性胚泡轉(zhuǎn)化為雄 性動物。這使得一窩幼崽中的雄性的數(shù)目不成比例。另外，希望轉(zhuǎn)化為雌性胚泡的雄性，因 為它們僅將ES細(xì)胞來源基因傳遞給它們的后代。它們的生育能力通常會下降，而這個缺點 在更大程度上被能育動物(fertile animal)的突變的有效傳遞所抵消。經(jīng)驗表明，如果克 隆體不能在10-12個后代中得到高ES細(xì)胞貢獻(xiàn)的嵌合體或良好的性別反常，那么對該克隆 體進(jìn)行重復(fù)注射也不太可能導(dǎo)致生殖種系傳遞。應(yīng)對那些克隆體中的雄性嵌合體進(jìn)行試驗 繁殖。理想地，對于任何突變，應(yīng)在種系中構(gòu)建兩個克隆體以確認(rèn)表型是基因工程改變的結(jié) 果。在理想的條件下，80-90%的注射克隆體應(yīng)通過種系傳遞。對于技術(shù)的總體討論，請參 見 Ramirez-Solis et al. , Methods in Enzymology,1993。Α.具有胚胎干細(xì)胞的8-細(xì)胞期胚胎的聚集TfMji ^/Λ Stewart “ Production of Chimeras Between Embryonic Stem Cells and Embryos. “ Methods in Enzymology，1993 中所描述的方案改編的?，F(xiàn)在，有三種產(chǎn)生ES細(xì)胞嵌合體的方法(1)胚泡注射，(2)桑椹胚注射(morula injection)，以及(3)桑椹胚聚集。本方案將利用桑椹胚聚集。對于聚集程序而言，所有必需的是具有放大率為40x的優(yōu)良的立體解剖顯微鏡和 嘴控微吸移管。也可以對這種程序進(jìn)行修改，以產(chǎn)生完全來源于ES細(xì)胞的胚胎/貓。這涉 及ES細(xì)胞與兩種四倍體4-細(xì)胞期胚胎的聚集。四倍體胚胎通常是通過在2細(xì)胞期對二倍 體卵裂球?qū)嵤╇娙诤隙a(chǎn)生的。二倍體ES細(xì)胞與四倍體卵裂球的聚集導(dǎo)致ES細(xì)胞形成大 多數(shù)ICM，而四倍體胚胎的衍生物傾向于形成胚外膜，例如滋養(yǎng)外胚層和卵黃囊內(nèi)胚層。因 此，在出生時，來源于ICM的胚胎將很大程度地或完全來源于ES細(xì)胞。來源于四倍體胚胎 的胚外膜，以胎盤和卵黃囊的形式，在出生時喪失。B.用于聚集的8細(xì)胞期胚胎的制備1.想在開始進(jìn)行FSH和hCG處理后的第11天和第13天之間，通過子宮灌洗實施胚 胎的手術(shù)回收。分離8-細(xì)胞期胚胎。將該胚胎在M2中沖洗兩次以除去任何細(xì)胞碎屑、血細(xì) 胞等，并在石蠟油下的CZB液滴加葡萄糖培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。參見上文中提到的Stewart。I^TzvifiVerstegenjJournals of Reproduction and Fertility, 1993 了
2.為了使ES細(xì)胞與胚胎聚集，有必要除去透明帶。這是通過在預(yù)熱的(37°C )酸 化臺羅德溶液(Tyrode，s solution)的培養(yǎng)皿中孵育胚胎20-40秒來實現(xiàn)的。在第10批 次中，應(yīng)該將該8-細(xì)胞期胚胎引入到含有酸化臺羅德溶液的35mm皿中。臺羅德溶液的較 低PH導(dǎo)致透明帶溶解于鹽水溶液中。如果胚胎要完全游離于它們的透明帶，則酸化的臺羅 德溶液應(yīng)為PH 2到3之間。該透明帶一消失，就將胚胎從臺羅德溶液中取出并在M2培養(yǎng) 基中沖洗3次。3.在60-mm細(xì)菌級培養(yǎng)皿中，建立三滴含有50 50的DMEM加FCS和CZB加葡萄 糖的混合物的培養(yǎng)基的20-μ1液滴。另外，建立20滴相同培養(yǎng)基的l-μ 液滴。用淺色 石蠟油覆蓋。三滴20-μ 1的液滴將會保持為與胚胎聚集而成的ES塊(見下文)。向每一 個1-μ 1的培養(yǎng)基液滴中轉(zhuǎn)移兩個8-細(xì)胞期胚胎。小液滴的益處在于它們不僅為過夜培 養(yǎng)提供足夠的營養(yǎng)，而且還在物理上限制了胚胎。當(dāng)已建立20對液滴后，將培養(yǎng)皿放回到 孵育器中。C.用于聚集的胚胎干細(xì)胞的制備以下的程序在前文提到的Stewart中已經(jīng)進(jìn)行了描述。1.將ES細(xì)胞制成每5至10個細(xì)胞的聚集體而不是單個細(xì)胞(其很難操作)。2.用不含Ca2+/Mg2+的PBS清洗35_mm或60_mm的ES細(xì)胞培養(yǎng)皿兩次，在該培養(yǎng) 皿中細(xì)胞在飼養(yǎng)器上生長(在對數(shù)期)為集落。然后用含有0. 5mM EGTA的無Ca2+/Mg2+的 PBS覆蓋細(xì)胞并靜置5min。這使得集落中的細(xì)胞松開它們彼此之間的附著。利用用嘴控吸 移管吸取松開的ES細(xì)胞集落，該移液管的內(nèi)部開口直徑約為50-75 μ m,且尖端邊緣通過火 焰拋光而變得平滑。然后將集落轉(zhuǎn)移到50 50的DMEM加10% FCS和CZB培養(yǎng)基混合物 的20-μ 1微滴。通過在移液管和微滴之間溫和地來回吹動該集落，使集落破裂為ES細(xì)胞 塊。該團(tuán)塊允許停留在培養(yǎng)皿的表面上。選擇5-10個細(xì)胞的單個團(tuán)塊，然后將其引入到含 有兩個8-細(xì)胞期胚胎的1- μ 1液滴中。3.聚集程序包括利用嘴控吸移管將ES細(xì)胞的團(tuán)塊推入到兩個卵裂細(xì)胞之間的縫 隙中。重要的是確保胚胎還沒有由于更容易與未緊密結(jié)合的胚胎發(fā)生聚集并且通常會導(dǎo)致 產(chǎn)生粘附于卵裂細(xì)胞的細(xì)胞團(tuán)塊而開始變得緊密。然后通過將培養(yǎng)基擠壓/輕輕地吹動至 某個位置來操縱第二個胚胎，以使其夾住附著于第一個胚胎的ES團(tuán)塊。兩個胚胎必須彼此 接觸。ES細(xì)胞粘附于胚胎以及隨后的聚集是溫度依賴性的，并且如果培養(yǎng)皿和胚胎允許顯 著冷卻，則整個過程就變得更加困難。當(dāng)所有的胚胎已經(jīng)被聚集時，將培養(yǎng)皿放回到培養(yǎng)箱 中。15至20min后，應(yīng)檢查每一個聚集體以確保胚胎仍然彼此附著，并且附著至ES細(xì)胞的 團(tuán)塊。如果ES細(xì)胞的團(tuán)塊沒有粘附于胚胎(這能夠通過將整個聚集體繞著微滴吹動以確 保所有的組分彼此粘附而確定)，則用另一組替代這些細(xì)胞。然后將聚集的ES細(xì)胞/胚胎 培養(yǎng)過夜。第二天早上，大多數(shù)聚集體應(yīng)形成胚泡。然后將這些胚泡通過手術(shù)地轉(zhuǎn)移到代 孕受體的子宮中。V.將胚胎轉(zhuǎn)移至代孕受體A.(pseudopregnant recipient)白勺對于處理的胚胎發(fā)育至足月，它們必須回到子宮中用于正確移植和發(fā)育。雌貓必 須與雄貓交配，以使它們啟動與妊娠有關(guān)的生理學(xué)變化。如果雌貓與正常的雄貓交配，它們 就會由于交配而懷上能存活的胚胎。這些胚胎的存在會與轉(zhuǎn)移到受孕雌貓的子宮中的任何實驗操作的胚胎進(jìn)行競爭。為了避免這種競爭但仍誘導(dǎo)妊娠，使雌性受體與輸精管被切除 的雄貓交配，該雄貓能夠與雌性交配，但不會產(chǎn)生受精卵。參見上文中的Stewar。B.切除輸精管的雄貓以下程序在上文中提到的Stewart中描述。1.通過單次注射阿佛丁(Avertin)來麻醉4至6個月大的雄貓(Taylor，The Mltimate Cat Book, Dorling and Kindersley Ltd.，N. Y.，N. Y.，1989)。通過將 0. 5g 的 2，2，2-三溴乙醇加入到在1-ml微量離心管(印pendorf tube)中的0. 63ml叔戊醇中來制 備阿佛丁。渦旋震蕩以使三溴乙醇溶解。將0. 5ml的該溶液加入到19. 5ml預(yù)熱的0.9%鹽 水溶液中，其中，麻醉劑將在振蕩后溶解并將其冷卻。注射的劑量為0. 012ml/g體重。2.將麻醉的雄貓仰面放置，用70%乙醇溶液擦拭其腹部，然后用剪刀穿過皮膚橫 向切開其腹部。所有的手術(shù)程序均在具有入射光源的立體解剖顯微鏡(stereo dissection microscope)下進(jìn)行。3.暴露下層的腹膜并進(jìn)行橫切。這應(yīng)該暴露出兩個脂肪墊(髕后脂墊，fat pad)。4.利用一副平頭鑷子(blunt forcep)夾住其中的一個脂肪墊并將其拉出體腔 外。這導(dǎo)致睪丸也隨之被拉出。在脂肪墊之下并與睪丸相連的是一條肌肉管(muscular tube)，即輸精管。這能夠通過沿著其側(cè)邊延伸的一條血管來識別。5.利用一副精細(xì)鑷在輸精管上形成一個環(huán)。鑷子的尖端已被預(yù)先加熱，從而燒灼 并切斷該輸精管的環(huán)。這會導(dǎo)致組織的一部分被去除，并且其剩余端被密封。6.然后將睪丸/脂肪墊輕輕地放回到腹膜腔中，并對另一個睪丸重復(fù)進(jìn)行該處 理。7. 一旦操作完成，就利用手術(shù)針和線將腹膜切口縫合在一起。然后利用創(chuàng)口夾將 皮膚切口夾在一起。8.然后使雄貓復(fù)原。安排該動物與雌貓進(jìn)行交配以確保其沒有生育能力。在手術(shù) 后10-14天除去創(chuàng)口夾。C.將經(jīng)處理的胚胎轉(zhuǎn)移至代孕受體使注射/聚集的胚胎發(fā)育至足月，它們已經(jīng)被轉(zhuǎn)移到代孕受體(即切除了輸精管 的雄貓交配后的雌貓)的子宮中。對于桑椹胚注射/聚集，在第二天發(fā)生轉(zhuǎn)移，即，一旦它 們發(fā)育至胚泡期，接著在體外培養(yǎng)過夜。參見前文中Stewart所描述的。最好將胚泡轉(zhuǎn)移至胚泡期后妊娠期為1天的代孕受體。在正常妊娠期中，在13只 懷孕的貓的子宮中發(fā)現(xiàn)了胚泡，因此將該經(jīng)處理的胚胎轉(zhuǎn)移到1天的代孕受體的子宮中。 這顯然為從體外處理到體內(nèi)恢復(fù)提供了時間。(Verstegen，Journals of Reproduction and Fertility, 1993) 0向12天的受體的轉(zhuǎn)移還導(dǎo)致了與將胚泡轉(zhuǎn)移到同步受體(S卩，懷孕第 12天的雌貓)時相比較的高移植發(fā)生率。如果可能，6-7個胚胎應(yīng)轉(zhuǎn)移至每個子宮角(uterine horn)。如果可用的子宮角 較少，則僅向一個角轉(zhuǎn)移也是滿足要求的。1.通過注射阿佛丁來麻醉與之前已切除輸精管的雄貓交配后12天的雌貓。雌 貓的年齡應(yīng)為 18 至 36 個月(Taylor，The Mltimate Cat Book, Dorling and Kindersley Ltd.，N. Y.，N. Y.，1989)。2.稱重后，對雌貓腹膜內(nèi)注射適當(dāng)體積的阿佛丁(參見關(guān)于切除雄貓輸精管的部
26分)。動物應(yīng)被完全麻醉2-3分鐘，這通過輕輕擠壓其中一只后爪來確定。如果動物出現(xiàn)迅 速地反復(fù)搖動的反應(yīng)，則動物沒有被麻醉，并且需要更長時間的麻醉以取得完全麻醉的效 果或再給予原始劑量的約三分之一的額外注射。3. 一旦完全麻醉，將雌貓仰面放置，用70%乙醇溶液擦拭其腹部，然后用剪刀穿 過皮膚橫向切開其腹部。所有的手術(shù)程序均在具有入射光源的實體解剖顯微鏡下進(jìn)行。打 開切口，切除或撥開一些使皮膚附著于緊貼在皮膚下方的腹膜的透明腸系膜。皮膚切口使 腹膜移動至能夠看到右側(cè)卵巢就在腹膜下方的位置處。通過辨認(rèn)淺櫻桃紅色(由于含有大 量的黃體酮(copora Iutea))來識別卵巢。穿過腹膜的切口不大于0. 5厘米，小心操作以避 免切到腹膜中的任何血管。卵巢附著于脂肪墊并附著于輸卵管和子宮。通過抓住脂肪墊， 用一副平頭鑷子將卵巢、輸卵管、和子宮拉出腹膜腔，暴露子宮的卵巢一側(cè)。為了防止子宮 滑回到腹膜腔內(nèi)，用一對小的動脈瘤夾夾住脂肪墊，該動脈瘤夾足夠重而防止該器官滑回。 在手術(shù)過程中不接觸子宮是非常重要的，因為外傷會導(dǎo)致胚胎移植的失敗。4.將子宮的卵巢端放置在腹膜壁上，利用新的(滅菌的)25號注射針頭在子 宮-輸卵管接合處上方的子宮中開一個小孔。只需要用該極其鋒利的針頭的尖端貫穿子宮 即可，針的插入應(yīng)不超過l_2mm。5.在此處，已經(jīng)取得了待轉(zhuǎn)移的胚泡并置于轉(zhuǎn)移管中。這些轉(zhuǎn)移管能夠容易地在 氣體或酒精燈火焰上拉緊。其內(nèi)徑應(yīng)為約100μ m，并且尖端的長度應(yīng)不超過2-4cm。用嘴將 淺色的石蠟油吸入到吸移管的腔內(nèi)。石蠟油的粘度能夠在吸移培養(yǎng)基中獲得更精細(xì)水平的 控制，這需要拾起胚泡并將其轉(zhuǎn)移至子宮內(nèi)腔中。將待用于轉(zhuǎn)移的胚胎置于其中裝有預(yù)熱 的M2培養(yǎng)基、其中未用石蠟油覆蓋培養(yǎng)基的35-mm培養(yǎng)皿中。將尖端填充有石蠟油的吸移 管引入到M2培養(yǎng)基中。將少量的培養(yǎng)基吸入到尖端中，之后產(chǎn)生一個小氣泡。吸取更多的 培養(yǎng)基至約0. 5-lcm，然后產(chǎn)生第二個小氣泡。然后以盡可能小體積的M2培養(yǎng)基吸取6_7 個胚泡，之后形成第三個氣泡。氣泡充當(dāng)用于確定胚胎位置的標(biāo)記，因為它們在吸移管中比 胚胎更容易被觀察到。夾住胚胎的兩個最下端的氣泡指示吸移管中胚胎的位置。第一個最 上端的氣泡起到指示所有的胚胎都已經(jīng)被轉(zhuǎn)移到子宮中的標(biāo)記的作用。6.用一副精細(xì)鑷夾住輸卵管以穩(wěn)定子宮。將轉(zhuǎn)移管的尖端插入到子宮壁中的小孔 中，并向子宮內(nèi)腔中推進(jìn)約3-5mm。這種操作應(yīng)輕輕地進(jìn)行；任何抵抗表明接觸到了子宮內(nèi) 膜。將吸移管足夠深地插入到子宮中之后，將其抽回l_2mm以確保尖端(仍在腔內(nèi))處的 開口不與子宮內(nèi)膜接觸，與子宮內(nèi)膜的接觸會阻斷胚胎離開吸移管進(jìn)入子宮內(nèi)腔中。將胚 胎排入到子宮內(nèi)腔中，之后通過觀察氣泡來進(jìn)行轉(zhuǎn)移。當(dāng)觀察到最后一個氣泡(即距石蠟 油最近的氣泡)進(jìn)入子宮時，抽回吸移管。尖端立即放入含有剩余胚泡的培養(yǎng)皿中，使培養(yǎng) 基通過該尖端逐漸反復(fù)吸放。這樣就清除了可能附著于尖端的任何血液，如果血液凝結(jié)，就 會堵塞尖端。這樣的清洗還確保了所有的胚胎都被轉(zhuǎn)移到子宮中。然后利用相同的培養(yǎng)基 和氣泡的安排，將下一組胚泡吸入到吸移管中。7.在從脂肪墊將動脈瘤夾除去后，將轉(zhuǎn)移到子宮中的胚胎溫和地推回腹膜腔內(nèi)。 將壁夾在一起并將其縫合，盡管這通常不是必需的。對剩余的子宮角重復(fù)該過程。當(dāng)手術(shù) 完成后，通過兩個或三個0.9mm創(chuàng)口夾將形成切口處的皮膚邊緣釘在一起(Clay Adams, Becton-Dickinson and Co.，Parsippany，NJ)。將受體置于37°C的暖箱中以保持貓的溫暖， 直至其恢復(fù)意識。經(jīng)過處理的胚胎應(yīng)在轉(zhuǎn)移后的60-70天內(nèi)出生(Taylor, The MltimateCat Book, Dorling and Kindersley Ltd.，KY.，KY.，1989)?？梢栽贓S細(xì)胞水平敲除兩個等位基因并直接產(chǎn)生純合的動物。然而，在正常情 況下，注入雜合細(xì)胞，然后繁育攜帶期望靶位點的貓以產(chǎn)生純合體。一般參見Robbins， Circulation Research 73:3-9(1993)。已經(jīng)描述了本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員明顯地，對所披露 的實施方式可以進(jìn)行各種修改，并且這樣的修改也包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。VI.利用包括核移植的其他技術(shù)來產(chǎn)生無變應(yīng)原的轉(zhuǎn)基因動物盡管以上的程序描述了胚胎干細(xì)胞在產(chǎn)生無變應(yīng)原動物中的應(yīng)用，但是其他克隆 技術(shù)也能夠用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物。一種這樣的技術(shù)是核轉(zhuǎn)移。在這種程序中，例如能夠通過 用包含滅活的變應(yīng)原基因的靶載體來轉(zhuǎn)染成熟的體細(xì)胞而改變來自發(fā)育成熟的體細(xì)胞的 DNA。當(dāng)確認(rèn)基因失活后，通過血清饑餓3-4天使供體細(xì)胞在GO-Gl期休眠。這些技術(shù)都是 本領(lǐng)域中公知的，參見例如Wilmut et al. (1997)，Nature 385 :810和Kato et al, (1998), Science282 :2095_2098，它們均具體結(jié)合于本文作為參考。使這些供體細(xì)胞與來自相同動 物種類的摘除細(xì)胞核的卵母細(xì)胞(oocyte)融合。胚胎環(huán)境中的分子使分化的成熟DNA恢 復(fù)成胚胎DNA。然后這些細(xì)胞開始分開，就好像它們是新發(fā)育中的胚胎的一部分。因此，將 這種衍生的核移植體在體外培養(yǎng)成胚泡，并將胚泡通過上文中描述的手術(shù)方法或非外科手 術(shù)方法在發(fā)情期開始后的適當(dāng)時間轉(zhuǎn)移到代孕母體內(nèi)。所得到的懷孕胚胎能夠懷孕至足月 并且分娩得到轉(zhuǎn)基因動物，優(yōu)選通過引導(dǎo)分娩或利用本領(lǐng)域已有的公知技術(shù)通過外科手術(shù) 輔助分娩。作為一種用于研究胚胎發(fā)生的工具并且作為一種倍增胚胎的方法，核轉(zhuǎn)移已經(jīng)被 用于哺乳動物。已經(jīng)從所構(gòu)建細(xì)胞系獲得了核轉(zhuǎn)移后得到的各種活的哺乳動物幼崽。例如， 在來自綿羊胚胎的細(xì)胞出生后，在將細(xì)胞核摘除到卵母細(xì)胞中之前通過血清饑餓誘導(dǎo)已培 養(yǎng)6至13代的小羊沉默。供體細(xì)胞中的沉默的誘導(dǎo)可以更改供體染色體結(jié)構(gòu)，從而有助于 細(xì)胞核的程序重排并且能夠發(fā)育。參見Campbell等人，Nature 380，64-66 (1996)。據(jù)預(yù) 測，核轉(zhuǎn)移將為分析和修改其他牲畜物種的基因功能提供強(qiáng)有力的機(jī)會。實際上，在工作之前和之后，科學(xué)家已經(jīng)能夠使用核轉(zhuǎn)移來產(chǎn)生非小鼠動物克隆。 因此，Sims et al, (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 :6143_6147 通過從培養(yǎng)的內(nèi)部 細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞轉(zhuǎn)移細(xì)胞核來產(chǎn)生幼崽(calve) ；Wilmut et al. (1997)，Nature 385 :810和 Schnieke et al. (1997) Science 278 :2130指出，來自胎兒成纖維細(xì)胞的細(xì)胞核直接形成 小羊；Cibelli et al. (1998) Science 280 1256利用來自胎兒成纖維細(xì)胞的細(xì)胞核克隆 了家牛幼崽；Wakayama et al. (1998)Nature394 369使用核轉(zhuǎn)移由細(xì)胞分裂中期II的 卵母細(xì)胞收集的卵丘細(xì)胞(cumy Ius cells)來產(chǎn)生具有生育能力的小鼠；Kato et al., (1998)，Science 282 :2095_2098利用核轉(zhuǎn)移技術(shù)由單個成體的卵丘細(xì)胞和輸卵管細(xì)胞克 隆了八只幼崽；以及 Chesne et al.，(2002)，Nature Biotechnology, vol. 20 :366_369 利 用核轉(zhuǎn)移技術(shù)產(chǎn)生克隆家兔。此外，Kuroiwa et al.，Nature Genetics, vol. 36，no. 7，第 775-780 頁(2004)和 Yang et al.，Nature Genetics, vol. 36.，no. 7，第 671-672 頁報道 了經(jīng)由同源重組在牛中成功基因靶向，而特定地修飾了免疫球蛋白基因。因此，已知核轉(zhuǎn)移 和同源重組產(chǎn)生具有修飾的基因型的克隆動物。核轉(zhuǎn)移還成功應(yīng)用于克隆貓科動物貓。因此，Gomez et al.，Biology OfReproduction 69，1032-1041 (2003)，使用核轉(zhuǎn)移來克隆非洲野貓，其全部內(nèi)容結(jié)合于本文 作為參考。在該報道中，通過以下處理之一使非洲野貓和家貓成纖維細(xì)胞同步化(1)接 觸抑制、(2)血清饑餓、或(3)r0SC0Vitine(細(xì)胞周期蛋白依賴激酶)；并且然后在37°C利 用附著于裝配有Hoffman調(diào)節(jié)對照目鏡和溫度控制臺裝置的倒置顯微鏡(Olympus，Tokai Hit,日本)的顯微操作器(Model MM0-202D ；Narishige Instrument，東京，日本)來實施 核轉(zhuǎn)移。裸露的M-II卵母細(xì)胞在補充有非必需氨基酸和其他營養(yǎng)物質(zhì)的鹽溶液中孵育15 分鐘，然后從卵母細(xì)胞摘除細(xì)胞核。將第一極化體和約10%的下層細(xì)胞質(zhì)吸入到摘除吸移 管中，隨后通過表面熒光顯微鏡(印ifluorescence microscopy)證實除去了分裂中期紡錘 體。然后，Gomez將非洲野貓成纖維細(xì)胞引入到在體內(nèi)或在體外成熟的摘除細(xì)胞核的 卵母細(xì)胞的卵黃周空間中。通過將每個核移植偶聯(lián)體置于附著于顯微操作器的兩個不銹鋼 電極之間而在融合介質(zhì)中發(fā)生融合，然后向供體細(xì)胞/細(xì)胞質(zhì)的共享膜空間垂直地遞送各 種脈沖。在這些融合脈沖之后，沖洗核移植偶聯(lián)體并進(jìn)行培養(yǎng)，然后通過確認(rèn)在卵黃周空 間中存在或不存在供體細(xì)胞來可視地評價融合。為了確定細(xì)胞融合方法是否誘導(dǎo)同時發(fā)生 的卵母細(xì)胞活化，通過與上文所述相同的程序使體外成熟的DSH卵母細(xì)胞在存在或不存在 鈣的融合培養(yǎng)基中經(jīng)受電脈沖，并進(jìn)行培養(yǎng)以確定卵裂頻率。融合偶聯(lián)體的活化是通過進(jìn)一步施加脈沖，然后重新構(gòu)建偶聯(lián)體來實現(xiàn)的，并且 對單性生殖活化的卵母細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)直至胚胎轉(zhuǎn)移的那一天或直到第8天。參見Gomez (在 前文提到)的材料和方法部分。此外，Gomez之后報道了成功產(chǎn)生了克隆的非洲野貓幼崽。參見Gomez et al, Cloning Stem Cells. 2004 ；6 (3) 247-58(" Birth of African Wildcat cloned kittens born from domestic cats" )。Gomez利用核轉(zhuǎn)移并通過使非洲野貓成纖維細(xì)胞核與家貓 的細(xì)胞質(zhì)融合而產(chǎn)生克隆的胚胎。克隆的胚胎是通過使一個非洲野貓體細(xì)胞在體內(nèi)或體外 融合到摘除細(xì)胞核的家貓細(xì)胞質(zhì)中而產(chǎn)生的?？偣渤錾?17只克隆的小貓，其中7只生下 來就是死胎，8只在分娩后數(shù)小時內(nèi)死亡或活到6周，兩只健康并存活。圍產(chǎn)期死亡是由于 早產(chǎn)分娩的肺部發(fā)育不成熟、胎盤分離以及細(xì)菌性敗血癥。隨后對12只貓進(jìn)行的特異性小 隨體基因座(microsatellite loci)的DNA分析證實了所有的17只小貓都是非洲野貓雄 性供體的克隆體。因此，Gomez (2004)報道了通過核轉(zhuǎn)移成功產(chǎn)生了存活的非洲野貓小貓。 因此，Gomez最近報道的核轉(zhuǎn)移在貓類中的成功應(yīng)用通過以與其他哺乳動物種類相同的效 率水平出生家貓和非家貓而得到證實。在貓類中，已經(jīng)證實在體內(nèi)或體外成熟的卵母細(xì)胞 都能夠用作供體細(xì)胞質(zhì)。參見 Gomez et al. , Theriogenology, Volume 66，Issue 1,2006 年7月1日，第72-81頁。此外，Choiet al. ,Cloning and Stem Cells，Vol. 9，No. 2，第 281-290 頁(2007) 最近報道了來源于成體體細(xì)胞核轉(zhuǎn)移的克隆的雄性貓成功地具有繁殖能力，其披露內(nèi)容結(jié) 合于本文作為參考。它們已經(jīng)被用于核轉(zhuǎn)移而成功地產(chǎn)生了四只克隆的貓。參見Yin et al.，Reproduction, 129，第245-249頁。其中，Yin利用上文中所述的各種貓的卵母細(xì)胞，通 過使貓細(xì)胞經(jīng)受核轉(zhuǎn)移、核轉(zhuǎn)移胚胎的體外培養(yǎng)以及細(xì)胞計數(shù)、受體雌貓的同步化和胚胎 轉(zhuǎn)移、小隨體分析、以及統(tǒng)計分析的步驟來處理各種貓的卵母細(xì)胞。簡言之，通過輕輕地吸
29移而除去來自卵母細(xì)胞的卵丘細(xì)胞并對得到的裸露卵母細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。然后利用顯微操作 將單個核供體細(xì)胞置于去除細(xì)胞核的卵細(xì)胞的卵黃周空間中，然后經(jīng)由電融合來融合。然 后對克隆的胚胎進(jìn)行培養(yǎng)直至胚胎轉(zhuǎn)移。然后，對融合的偶聯(lián)體進(jìn)行培養(yǎng)并且在當(dāng)利用熒光顯微鏡評價胚泡中的細(xì)胞數(shù)時 的第二天評價核轉(zhuǎn)移胚胎的卵裂和胚泡發(fā)育。然后通過手術(shù)將這些克隆的胚胎轉(zhuǎn)移到受體 雌貓的輸卵管中。在融合后的單細(xì)胞期或在培養(yǎng)后的二細(xì)胞或四細(xì)胞期將克隆的胚胎轉(zhuǎn)移 到同步化的雌貓的輸卵管中，并稍后在胚胎轉(zhuǎn)移后第40天或第45天通過觸診來確定懷孕 并在第60天通過X射線照相來證實。Yin確認(rèn)了通過核轉(zhuǎn)移和代孕受體雌貓成功獲得的貓家系分析以證實用于核轉(zhuǎn)移 的供體細(xì)胞的同一性。從每一只新生貓、受體和供體細(xì)胞的耳穿孔器或尾截取物提取DNA。 五種貓DNA小隨體標(biāo)記(FCA229、FCA290、FCA441、FCA201、和FCA224)用于確認(rèn)克隆貓、胎 兒和作為供體細(xì)胞的皮膚細(xì)胞的基因(遺傳)同一性。因此，Yin推斷他們已經(jīng)從雄性供 體的胎兒成纖維細(xì)胞生產(chǎn)出了克隆貓并通過自然分娩形成了雌性供體的成體體細(xì)胞。因此，已知同源染色體重組和核移植的組合靶向并將特異性突變體引入到體 細(xì)胞中，其然后能夠經(jīng)受核移植的克隆。因此，Wang&Zhou，R印roductive Biology and Endocrinology，1 :103，2003，綜述了用于不同動物物種的同源染色體重組和核移植的這種 成功組合方法。因此，根據(jù)本發(fā)明的一種實施方式，產(chǎn)生了移植轉(zhuǎn)基因非人脊椎動物，其中該動物 的基因組包含失活的等位基因。更優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因動物不產(chǎn)生等位基因的功 能性產(chǎn)物。根據(jù)本發(fā)明的另一種實施方式，所產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因動物的體細(xì)胞和生殖譜系細(xì)胞 的等位基因是失活的。根據(jù)本發(fā)明的另一種實施方式，轉(zhuǎn)基因動物是貓科動物并且能夠?qū)?失活的等位基因傳遞給它的后代。因此，如下文的實施例部分中將要詳細(xì)描述的，本發(fā)明構(gòu)建了貓體細(xì)胞系，其提供 了用于靶向FeI d I的目的的可替代貓胚胎干細(xì)胞的可行替代。簡言之，本發(fā)明通過在懷孕 第3周至第6周利用標(biāo)準(zhǔn)的卵巢子宮切除術(shù)從懷孕的母貓的子宮角分離胎兒組織而得到了 貓體細(xì)胞系。然后分離結(jié)締組織，將其切碎，并進(jìn)行培養(yǎng)，之后從剩余的未消化的組織分離 胚胎成纖維細(xì)胞。然后如在本申請其他地方描述的，在描述用于使胚胎干細(xì)胞生長的條件 下對原代貓體細(xì)胞進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)、擴(kuò)增并冷凍?；镜?，使貓科動物胚胎成纖維細(xì)胞生長然 后連續(xù)培養(yǎng)并連續(xù)冷凍和解凍。然后用FeI d I的外源性DNA靶標(biāo)構(gòu)建體對這些細(xì)胞實施 電穿孔。保留可選陽性標(biāo)記基因(新霉素抗性基因)的貓細(xì)胞存活，而不具有Neo基因的 細(xì)胞死亡。類似地，由于不存在HSV-I tk基因，陰性可選標(biāo)記對于更昔洛韋(ganciclovir) 上的存活，有助于進(jìn)一步確證和鑒別成功的同源重組事件。因此，隨后鑒別了存活陽性/陰 性選擇的貓體細(xì)胞系的集落。本發(fā)明還教導(dǎo)了一種用于產(chǎn)生包含失活等位基因的轉(zhuǎn)基因非人脊椎動物的方法， 該方法包括(a)將包含失活等位基因的動物干細(xì)胞引入到動物胚胎中；(b)將動物胚胎移 植到代孕動物體內(nèi)；以及(c)允許動物胚胎成熟成為動物。根據(jù)本發(fā)明，用于產(chǎn)生包含失活等位基因、而不產(chǎn)生等位基因，并且其是失活等位 基因的純合體的轉(zhuǎn)基因非人脊椎動物的另一種優(yōu)選方法，包括(a)將失活動物等位基因引 入到動物的細(xì)胞中；(b)篩選僅包含失活等位基因但不包含功能性等位基因的動物細(xì)胞；
30(C)分離步驟(b)中的包含失活等位基因的細(xì)胞的細(xì)胞核；(d)將步驟(C)中的細(xì)胞核轉(zhuǎn) 移到動物的去核卵細(xì)胞中；(e)將該卵細(xì)胞移植到代孕動物體內(nèi)并使該動物懷孕；以及(f) 使動物妊娠至足月并獲得轉(zhuǎn)基因動物。還可以根據(jù)本發(fā)明選擇具有失活等位基因和功能 性等位基因的細(xì)胞，即該細(xì)胞是雜合的，然后如前面的段落中描述的，孵育克隆動物至純合 (homozygosity)。以下的實施例僅僅是出于舉例說明本發(fā)明的目的。然而，應(yīng)該理解，本發(fā)明不限于 這些實施例中的特定條件或細(xì)節(jié)。本文中引用的所有公開文獻(xiàn)，包括但不限于美國專利，均 特別地結(jié)合于本文作為參考。實施例1靶載體的構(gòu)建A.同源臂分離并鑒別包含并圍繞FeI d I的鏈1和鏈2的連續(xù)延伸的22182個堿基對的 DNA序列。每個鏈的啟動子序列，并發(fā)現(xiàn)兩條鏈共用該啟動子。鏈1和鏈2在互補DNA鏈上 編碼，并在相反方向上轉(zhuǎn)錄(圖7)。另外，鑒別了鏈1和鏈2基因的3'端的序列下游。利用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增和DNA測序來實施含F(xiàn)eI d I的序列數(shù)據(jù)(i)鏈 l、(ii)鏈2、(iii)啟動子和(iv)下游同源臂的組裝。公開的FeI d I基因的多核苷酸序 列(Griffith et al.，Gene, 113(2) :263_8，1992，禾口 Morgenstern et al.，Proc. Nat' 1. Acad. Sci. USA, 88 9690,1991)被用作在 Liu&Whittier，Genomics 25(3) :674_81，1995 中 描述的熱不對稱交錯的PCR(TAIL-PCR)的變異的起始點。B.同源臂的產(chǎn)生1.在公開的FeI d I鏈1和鏈2的序列上設(shè)計具有高退火溫度的三個單向巢式正 向引物。參見圖2和圖3。2.具有低退火溫度的隨機(jī)引物用于在反方向上擴(kuò)增未知序列。正向引物和反向引 物的熱不對稱性允許從由在FeI d I鏈1和鏈2中的已知序列的控制擴(kuò)增。對于正向引物， 通過利用高退火溫度來控制擴(kuò)增的方向，然后用低退火溫度來控制反向引物的擴(kuò)增方向。3. 一旦擴(kuò)增，就利用所得擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物作為用于第二輪擴(kuò)增的模板，利用第二 巢式引物作為其他特異性的來源，接著利用第三巢式引物進(jìn)行第三輪擴(kuò)增。4.利用凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進(jìn)行分析，將產(chǎn)物從瓊脂糖凝膠上切下，克隆到DNA質(zhì) 粒中，并利用自動化的二脫氧核苷酸染料_終止子測序進(jìn)行測序。5.然后合成與新產(chǎn)生的序列匹配的寡核苷酸測序引物以完成PCR產(chǎn)物的測序，并 組裝一個連續(xù)序列。6. 一旦DNA測序完成，組裝體的末端用作TAIL-PCR反應(yīng)其他循環(huán)的起始點。將其 他的重疊序列組裝成一個長度為X個堿基對的連續(xù)序列。鏈1和鏈2的上游啟動子序列的 序列同一性使得能夠正確定位兩條鏈的序列數(shù)據(jù)。7.設(shè)計與鏈1和鏈2的下游序列匹配的巢式PCR引物，利用長范圍的PCR擴(kuò)增來 分離側(cè)接鏈1和鏈2的同源臂。利用在25 μ L的反應(yīng)體積中在含有IOmM Tris-HCl、50mM KCl、1.5mM MgCl2 (pH 8.3)的反應(yīng)緩沖液中的Taq聚合酶，在20ng貓基因組DNA上進(jìn)行初 始PCR反應(yīng)。以各自最終濃度為0.4mM加入dNTP。1. 5 μ L的第一反應(yīng)(產(chǎn)物)用作利用 巢式引物或半巢式引物的第二反應(yīng)的模板。以最終濃度為0.4μ M加入正向引物和反向引物8.所有反應(yīng)的循環(huán)條件是在95°C 3分鐘的初始變性步驟；之后20個循環(huán)的在 980C 10秒鐘的變性步驟；在60°C 20秒的退火步驟；以及在72°C 6分鐘的伸展步驟。在 720C 10分鐘的最后伸展步驟以終止反應(yīng)。引物序列鏈1同源臂第一反應(yīng)正向ATGACAGAAGAGGATAAGGAGAATGC反向GTAGGCCATTAGATTTTGTATTTGG第二反應(yīng)正向GGATCTTCAAACTGTTTGCACTAGG反向GTTCTTTTTTTCCTTTTAAAAAATGTG鏈2同源臂第一反應(yīng)正向AGTGTTTCTGATACTAAACAAAGTCCAG反向GTTCTTTACACCTAAAGCTGGAATCC第二反應(yīng)正向GCATTTCTCTGGAATTAAGTGGC反向GTTCTTTACACCTAAAGCTGGAATCCC.詵擇標(biāo)記為了有助于檢測哪些細(xì)胞被正確靶向，將選擇標(biāo)記加入到載體中。將新霉素抗性 (neo. sup. r)和胸苷激酶(HSV-I tk)整合到載體中分別作為陽性和陰性選擇標(biāo)記。對于貓 體細(xì)胞系而言，已經(jīng)確定了選擇試劑慶大霉素(G418)和更昔洛韋的具體濃度。1.通過克隆鼠3'-磷酸甘油酸酯激酶(PGK)啟動子的新霉素抗性基因下游，以 及牛生長激素多核苷酸化位點(bGH-pA)的上游來構(gòu)建陽性選擇盒。PGK啟動子已經(jīng)證實在 幾乎所有真核細(xì)胞，包括胚胎細(xì)胞中被表達(dá)(Adra et al.，1987，Gene 60 :65_74)。bGH-pA 位點作為轉(zhuǎn)染的終止子是高度有效的，并且在mRNA的3'端加入多聚腺苷酸尾(Campbell， N. Α. 1996. Biology, Fourth Edition. Menlo Park, CA :Benjamin/Cummings Publishing Company p.370-374)。2.在FeI d I鏈1和鏈2同源臂之間克隆陽性選擇盒。同源臂的相對取向是保守 的，使得鏈1和鏈2的編碼序列以及它們的啟動子在靶載體中被陽性選擇盒代替。在貓基 因組中正確重組后，兩種基因和啟動子的整個編碼序列由陽性選擇盒代替。3.通過克隆MCl啟動子的HSV-I tk基因下游來構(gòu)建陰性選擇盒。MCl啟動子在 幾乎所有類型的細(xì)胞中均表達(dá)(Thomas&Capecchi，1987，Cell 51 :503_512)。4.在靶載體的同源臂外部克隆陰性選擇盒，使得在貓基因組正確克隆后切去陰性 選擇盒，同時陽性選擇盒保持完整。參見圖9。實施例2胚胎成纖維細(xì)胞系已經(jīng)構(gòu)建了貓體細(xì)胞系，其為用于靶向FeI d I基因目的的貓胚胎成纖維細(xì)胞提
32供了一種可行的替代選擇。A.貓體細(xì)胞系的衍化-貓胚胎成纖維細(xì)胞FEF1.通過標(biāo)準(zhǔn)的卵巢子宮切除術(shù)在妊娠的第3周-第6周之間從懷孕的母貓的子宮 角中分離胎兒組織。從胎兒組織切除外胚膜。2.然后分離結(jié)締組織，將其切碎，并在含有2mg/ml膠原酶和0. 25%胰蛋白酶的 DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基中在37°C在周期性攪拌下孵育15分鐘。3.通過50微米孔拉緊、用PBS沖洗并通過離心濃縮從殘余的未消化組織分離胚胎 的成纖維細(xì)胞。B.貓胚胎成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)和擴(kuò)增在上文中所描述的G部分中的生長胚胎干細(xì)胞的條件下對原代貓體細(xì)胞進(jìn)行連 續(xù)培養(yǎng)、擴(kuò)增和冷凍。1. FEF在具有5% 二氧化碳的濕潤保溫箱中在37 °C迅速生長2. FEF在ES-DMEM培養(yǎng)基但沒有添加白血病抑制因子(LIF)中生長。在不使用小 雞血清的情況下，在分別稀釋1/4或1/8的條件下每2或3天對FEF進(jìn)行傳代。3.然后成功地對FEF進(jìn)行15至20個傳代，同時保持穩(wěn)定的核型。這些FEF被成 功地冷凍和解凍。實施例3胚胎體細(xì)胞系的靶向體細(xì)胞中的基因靶向已經(jīng)在許多不同的物種中成功進(jìn)行了許多年。我們使用上文 中描述的載體來靶向貓成纖維細(xì)胞系中的靶標(biāo)FeI d I。L電穿孔如上文中描述的用于貓胚胎干細(xì)胞，用外源性DNA靶向構(gòu)建體來對貓胚胎體細(xì)胞 系(FEF)實施電穿孔。B.詵擇1. FEF用慶大霉素(G418)的陽性選擇在電穿孔24小時后，當(dāng)在500微克G418/ ml ES-DMEM中進(jìn)行培養(yǎng)時，保持新霉素抗性基因(Neo)的FEF細(xì)胞存活。而沒有新霉素基 因的FEF在G418中培養(yǎng)2-7天后死亡。FEF用更昔洛韋的陰性選擇隨后在含有500納克更昔洛韋的ES-DMEM中培養(yǎng)2_7 天內(nèi)，保留HSV-I tk基因的FEF細(xì)胞在電穿孔后24小時死亡。而缺少HSV-Itk基因的FEF 細(xì)胞在更昔洛韋中培養(yǎng)后存活。2.如上文中所述，在電穿孔和擴(kuò)增8-10天后取得存活的陽性/陰性選擇的貓體細(xì) 胞系的集落。C.通過PCR基因分型確認(rèn)成功重組1.從在陽性/陰性選擇中存活的擴(kuò)增細(xì)胞系制備DNA，并使用PCR擴(kuò)增來驗證在 內(nèi)源性FeI d I基因座中的正確整合。PCR引物被設(shè)計成與FeI d I鏈1同源臂的右側(cè)外 部以及陽性選擇標(biāo)記的多腺苷酸化位點(bGH-pA)中的DNA序列；以及與鏈2同源臂的右側(cè) 外部和陽性選擇標(biāo)記內(nèi)部的啟動子序列(PGK)相匹配。只有正確靶向的FeI d I，其中在兩 個同源臂中的重組事件替代FeI d I鏈1、鏈2和啟動子，攜帶具有足夠短距離以能夠進(jìn)行 PCR擴(kuò)增的正向引物和反向引物。
2.如上文所述的實施PCR反應(yīng)。所有反應(yīng)的循環(huán)條件如下95°C 3分鐘的初始變 性步驟；接著是40個循環(huán)的98°C 10秒鐘的變性步驟；60°C 20秒鐘的退火步驟；以及72°C 7 分鐘的伸展步驟。在72°C 10分鐘的最后伸展步驟終止每一個反應(yīng)。引物序列bGH-pA位點-鏈1同源臂正向CGACTGTGCCTTCTAGTTGCC反向GTAGGCCATTAGATTTTGTATTTGG鏈2同源臂-PGK 正向AGTGTTTCTGATACTAAACAAAGTCCAG反向TTGTGTAGCGCCAAGTGCCP.利用熒光原位雜奪確認(rèn)FEF中的FeI d I某因座的成功重會目1.貓胚胎成纖維細(xì)胞的有絲分裂伸展體(嵌合伸展體，mitotic spread)的制備FEF的積極生長板在含有1. 5mg秋水仙酰胺(colcemid) /ml的ES-DMEM中培養(yǎng)2 小時。除去培養(yǎng)基并用PBS代替。輕輕地敲打板以分離分裂的細(xì)胞，其更容易地從板上脫 離。通過離心使上清中的細(xì)胞沉淀并除去上清。將細(xì)胞重懸浮于Iml 0.075M KCl的低滲 溶液中并在室溫下孵育20分鐘，以使細(xì)胞質(zhì)膜溶解。用1滴含3份甲醇和1份乙酸的溶液 固定該細(xì)胞懸浮液。將沉淀物在1000RPM離心5分鐘，并重懸浮于2ml固定劑中。重復(fù)該 程序3-5次，直至懸浮液中沒有團(tuán)塊。通過將幾滴細(xì)胞懸浮液滴加在玻璃載片上并使其風(fēng) 干來制備有絲分裂染色體伸展體。2.用于雙色FISH的探針的制備綠色熒光探針由克隆的FeI d I鏈1和鏈2同源臂制備，并通過在平移緩沖液 (translation buffer) (New England Nuclear)中的用熒光素-dUTP 和 DNA 聚合酶 I 的缺 口平移(nick translation)來進(jìn)行標(biāo)記。通過生物素化-dUTP的缺口平移產(chǎn)生第二紅色熒 光探針，以用于含PGK-Neo盒的靶向構(gòu)建體的外來基因部分。該探針被可視化并通過與結(jié) 合于德克薩斯紅的鏈霉素一起孵育而使信號放大。綠色熒光探針用作用于成功雜交至FeI d I基因座的陽性對照，因為其結(jié)合于靶向等位基因和非靶向等位基因。紅色探針結(jié)合于靶 向等位基因中的外來PGK-NEO序列。兩個探針共同定位于適當(dāng)?shù)陌蠪eI d I基因座，并且 它們出現(xiàn)重疊，作為在熒光顯微鏡下的黃色信號。3.探針與載片的雜交用200微克的胰核糖核酸酶A (RNAse-A) /ml的2X SSC溶液(0. 3M氯化鈉、0. 03M 檸檬酸鈉、PH 7. 0)在37°C處理有絲分裂伸展體1小時。然后將載片在2X SSC沖洗5分 鐘，重復(fù)4次，然后在一系列70%、80 %、90%和95 %的乙醇溶液中脫水并在室溫下分別用 水沖洗5分鐘。然后使載片在2X SSC的70%甲酰胺溶液中變性2分鐘，然后再次在相同的 乙醇系列中在4°C再次脫水。將10納克的每一標(biāo)記的探針樣品在含有50%甲酰胺、10%硫 酸右旋糖苷、2X SCC、20mM磷酸鈉、IOx Denhardt' s溶液、和5mg剪切的鮭魚精液DNA的 雜交溶液中稀釋。探針混合物在70°C下變性5分鐘，然后將其置于冰上。通過在37°C孵育 16小時而使載片與探針溶液雜交。在用熒光顯微鏡可視化之前，用含50%甲酰胺的2X SSC 沖洗載片5分鐘，重復(fù)5次，然后再在40°C用2X SSC沖洗5分鐘重復(fù)5次。E.利用DNA印跡分析確認(rèn)體細(xì)胞系(FEF)中的FeI d I基因座的成功重組
體細(xì)胞系中的FeI d I基因座的成功重組能夠容易地利用常規(guī)的DNA印跡分析來 確定，例如，通過采用以下步驟1.允許置于涂覆有明膠的板上的細(xì)胞生長，直至其每天都使培養(yǎng)基變黃(4-5 天)。2.當(dāng)細(xì)胞準(zhǔn)備用于DNA提取程序時，用PBS漂洗孔兩次并向每個孔中加入50 μ 1 的溶胞緩沖液。3.在潮濕的環(huán)境下在60°C孵育板過夜。這可通過將板在具有潮濕紙巾的封閉容 器(Tupperware)中在常規(guī)的60°C烘箱中孵育而容易地實現(xiàn)。4.第二天，利用多通道吸移管向每一個孔中加入100 μ 1的NaCl和乙醇的混合物 (150 μ 1 5Μ NaCl加入到IOml冷無水乙醇中)。5.在室溫下將96孔板置于工作臺上30分鐘同時不進(jìn)行混合。核酸沉淀為絲狀網(wǎng)6.小心地將板倒置以去除溶液；核酸保持附著于板。在紙巾上印跡過量液體。7.利用多通道吸移管向每個孔中滴加150 μ 1的70%乙醇來漂洗核酸3次。每次 將板倒置來除去酒精。8.在最后一次沖洗后，將板倒置并允許其在工作臺上干燥。DNA備用以用限制性 酶對其進(jìn)行切割。9.制備含有以下物質(zhì)的限制性消化混合物每份樣品Ix的限制性(酶)緩沖液、 ImM亞精胺、牛需求白蛋白(BSA，100yg/ml)、核糖核酸酶(100 μ g/ml)以及10單位的每一 種限制性酶。10.用多通道吸移管向每個孔中加入30 μ 1限制性消化混合物；利用吸移管尖端 將孔中的物質(zhì)混合并在潮濕的環(huán)境下在37°C下孵育反應(yīng)過夜。11.向樣品中加入凝膠電泳負(fù)載緩沖液并進(jìn)行常規(guī)電泳，并將DNA轉(zhuǎn)移到印跡膜 上。使用6X 10英寸的(w/v)的3. 3英寸間隔的33齒梳的瓊脂糖凝膠。這為96孔板 加上每個梳子的一個分子量標(biāo)記泳道提供了足夠的空間。凝膠電泳在Ix TAE中在80V進(jìn) 行4-5hr，獲得在I-IOkb范圍的良好分離。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說很明顯地，在不背離本發(fā)明的精神或范圍的前提下，能 夠?qū)Ρ景l(fā)明的方法和組合物進(jìn)行各種改變和變化。因此，本發(fā)明計劃包括在所附權(quán)利要求 和其等同替換的范圍內(nèi)所提供的本發(fā)明的各種改變和變化。
3權(quán)利要求
一種分離的核酸，包含在SEQ ID NO.7中示出的序列的至少五個連續(xù)核苷酸。
2.一種同源重組載體，包含(1)第一同源臂、(2)期望多核苷酸和(3)第二同源臂，其 中，所述期望多核苷酸位于所述第一同源臂和第二同源臂之間，并且其中所述第一同源臂 和第二同源臂中的每一個包含SEQ ID NO. 7中的至少約Ikb序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的同源重組載體，其中，所述第一同源臂包含在SEQID NO. 7的 核苷酸1至約核苷酸8，800之間的任意序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的同源重組載體，其中，所述第一同源臂包含在SEQID NO. 7的 核苷酸1至約核苷酸10，000之間的任意序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的同源重組載體，其中，所述第一同源臂包含在SEQID NO. 7的 核苷酸1至約核苷酸10，800之間的任意序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的同源重組載體，其中，所述第一同源臂包含在SEQID N0. 7的 核苷酸1至約核苷酸14，800之間的任意序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的同源重組載體，其中，所述第二同源臂包含在SEQID N0. 7的 約核苷酸16，000至約核苷酸21，939之間的任意序列。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的同源重組載體，其中，所述第二同源臂包含在SEQID N0. 7的 約核苷酸14，700至約核苷酸21，939之間的任意序列。
9.根據(jù)權(quán)利要求2所述的同源重組載體，其中，所述第二同源臂包含在SEQID N0. 7的 約核苷酸10，800至約核苷酸21，939之間的任意序列。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的同源重組載體，其中，所述同源臂中的一個或二個包含長度 選自由約Ikb長、約2kb長、約3kb長、約4kb長、約5kb長、約6kb長、約7kb長、約8kb長、 約9kb長以及約IOkb長組成的組中的SEQ ID N0. 7序列。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的同源重組載體，其中，所述期望多核苷酸是一種可選標(biāo)記。
12.一種用于中斷貓細(xì)胞基因組中的靶FeI d I序列的方法，包括將權(quán)利要求1所述的 同源重組載體引入到貓細(xì)胞中，其中，(a)所述載體的同源臂用于與所述細(xì)胞基因組進(jìn)行重 組，以及(b)所述期望多核苷酸在所述靶序列位點整合到所述細(xì)胞基因組中，從而中斷所 述靶序列。
13.一種貓細(xì)胞，包含權(quán)利要求12所述的期望多核苷酸。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種轉(zhuǎn)基因貓，其具有特征為基本上沒有貓主要變應(yīng)原Fel d I的表型。通過用專用構(gòu)建體中斷靶基因的編碼序列而在轉(zhuǎn)基因貓中提供該表型。這種轉(zhuǎn)基因貓的表型可傳遞給其子代。
文檔編號C07K14/435GK101918557SQ200880123567
公開日2010年12月15日 申請日期2008年10月31日 優(yōu)先權(quán)日2007年10月31日
發(fā)明者戴維·B·阿夫納, 斯文·博克蘭特, 詹姆斯·凱勒 申請人:戴維·B·阿夫納;斯文·博克蘭特;詹姆斯·凱勒