專利名稱：靶向cd138的試劑及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于改進(jìn)的抗原CD138用靶向劑以及包含所述靶向劑的組合物和它 們的使用方法。
背景技術(shù)：
作為細(xì)胞外基質(zhì)的受體的⑶138在多發(fā)性骨髓瘤(MM)細(xì)胞上過表達(dá)，并且已經(jīng)表 現(xiàn)出影響MM細(xì)胞發(fā)育和/或增殖。舉例而言，CD138還在卵巢癌、腎癌、膽囊癌、乳腺癌、前列 腺癌、肺癌、結(jié)腸癌細(xì)胞和霍奇金氏淋巴瘤與非霍奇金氏淋巴瘤、慢性淋巴性白血病(CLL) 的細(xì)胞上表達(dá)。在此用于說明本發(fā)明，特別是提供關(guān)于實(shí)施的額外詳細(xì)說明的出版物和包括專利 等的其它材料，均通過參考并入。方便起見，所述出版物在下文中按照作者和日期引用，和 /或按照所附目錄中的作者依照字母順序列出。Tassone等(2004)已經(jīng)報(bào)道了鼠IgGl抗體B-B4對(duì)在MM細(xì)胞表面上表達(dá)的 ⑶138抗原的良好結(jié)合。Tassone還報(bào)道了包含類美登素(maytansinoid)DMl作為效應(yīng)分 子的免疫綴合物B-B4-DM1對(duì)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的高細(xì)胞毒性活性(還參見美國專利公開 20070183971)。仍然存在對(duì)靶向劑、特別是基于B-B4而缺乏與B-B4有關(guān)的某些性質(zhì)和/或功能 的靶向抗體的需要。此類靶向抗體可以包含一種或多種人類抗體的抗體區(qū)。特別是存在對(duì) 基于B-B4的嵌合抗體的需要，該嵌合抗體與B-B4 —樣有效地結(jié)合CD138，但是可以施用于 人類而無顯著的副作用。還存在對(duì)結(jié)合親和力超過B-B4的結(jié)合親和力的靶向劑的需要。還 存在對(duì)于相對(duì)于其小鼠對(duì)應(yīng)物顯示一個(gè)或多個(gè)有利的性質(zhì)的此類基于B-B4的靶向劑的需 要。這些性質(zhì)包括改進(jìn)的抗原結(jié)合、特別是與表達(dá)CD138的腫瘤細(xì)胞和其輔助細(xì)胞的結(jié)合， 以及更均勻的結(jié)合。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及一種用于均勻地結(jié)合⑶138的方法，所述方法包括提供基因工程靶向抗體，其中所述基因工程靶向抗體包含抗CD138抗原結(jié)合區(qū)，其中所述抗原結(jié)合區(qū)出自非人類抗體，和另外的抗體區(qū)，其中所述另外的抗體區(qū)的至少一部分出自人類抗體，和對(duì)表達(dá)⑶138的細(xì)胞施用所述基因工程靶向抗體，其中所述基因工程靶向抗體均勻地與所述表達(dá)⑶138的細(xì)胞上表達(dá)的⑶138結(jié)
口 O
4
本發(fā)明還涉及一種分離的多肽，所述多肽包含免疫球蛋白重鏈或其一部分的氨基 酸序列，其中所述免疫球蛋白重鏈或其部分與SEQ ID NO :1具有至少70%、至少80%、至少 90%、至少95%或至少98%序列同一性，其中包含所述免疫球蛋白重鏈或其部分的靶向劑 靶向CD138。所述免疫球蛋白重鏈或其部分可以與SEQ ID NO :1的殘基31 35、殘基51 68 和殘基99 111具有至少80 %、至少85 %、至少90 %或至少95 %序列同一性，并且所述靶 向劑可以為基因工程靶向抗體。所述免疫球蛋白重鏈或其部分的恒定區(qū)可以為IgG4同型的恒定區(qū)。所述靶向劑可以為小鼠人類嵌合抗體。所述靶向劑或基因工程靶向抗體可以為人源化抗體。所述分離的多肽可以還包含免疫球蛋白輕鏈或其一部分的氨基酸序列，其中所述 免疫球蛋白輕鏈或其部分與SEQ ID NO :2具有至少70%、至少80%、至少90%、至少95% 或至少98%序列同一性。所述分離的多肽可以還包含免疫球蛋白輕鏈或其一部分的氨基酸序列，其中所述 免疫球蛋白輕鏈或其部分與SEQ ID NO :2的殘基24 34、殘基50 56和殘基89 97具 有至少75%、至少85%、至少95%或至少97%序列同一性。所述免疫球蛋白重鏈可以與SEQ ID NO 1的序列相同。所述免疫球蛋白輕鏈可以與SEQ ID NO 2的序列相同。本發(fā)明還涉及一種識(shí)別⑶138的基因工程靶向抗體，所述基因工程靶向抗體包 含抗CD138抗原結(jié)合區(qū)，其中所述抗原結(jié)合區(qū)出自非人類抗體，和另外的抗體區(qū)，其中所述另外的抗體區(qū)的至少一部分出自人類抗體，其中所述基 因工程靶向抗體(a)以比所述非人類抗體的結(jié)合親和力更高的結(jié)合親和力與CD138結(jié)合；和/或(b)提供表達(dá)⑶138的細(xì)胞與⑶138的均勻結(jié)合。所述另外的抗體區(qū)可以為至少一個(gè)包含出自人類抗體的重鏈恒定區(qū)或其一部分 的恒定區(qū)，并且其中所述基因工程抗體出自IgG4同型。所述基因工程靶向抗體可以為嵌合抗體，并且所述非人類抗體可以為B-B4。所述基因工程靶向抗體可以為人源化抗體，并且所述非人類抗體可以為B-B4。所述重鏈可以與SEQ ID NO :1具有至少約70%、至少80%、至少90%、至少95% 或至少98%序列同一性。所述基因工程靶向抗體可以包含至少一個(gè)輕鏈，其中所述輕鏈與SEQ ID NO :2具 有至少約70%、至少80%、至少90%、至少95%或至少98%序列同一性。所述重鏈可以與SEQ ID NO 1的殘基31 35、殘基51 68和/或殘基99 111具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或100%序列同一性。所述輕鏈與SEQ ID NO 2的殘基24 34、殘基50 56和/或殘基89 97具有至少75%、至少85%、至 少95%、至少97%或100%序列同一性。所述另外的抗體區(qū)可以分別包含(a) SEQ ID NO 1的氨基酸殘基123 448，和/或
(b) SEQ ID NO 2的氨基酸殘基108 214，以及其突變體，所述(a)和/或(b)及 其突變體維持或降低所述基因工程靶向抗體的抗體依賴性細(xì)胞毒性和/或補(bǔ)體依賴性細(xì) 胞毒性、和/或穩(wěn)定所述基因工程靶向抗體。所述另外的抗體區(qū)可以為人類抗體的重鏈恒定區(qū)。所述基因工程靶向抗體與⑶138結(jié)合的靶向差異可以小于150%、小于140%、小 于130%、小于120%、小于110%、小于100%、小于90%、小于80%、小于70%、小于60% 或小于50%。所述重鏈可以與SEQ ID NO :1具有至少約70%、至少80%、至少90%、至少95% 或至少98%序列同一性。所述基因工程靶向抗體可以包含至少一個(gè)輕鏈，其中所述輕鏈與SEQ ID N0:2具 有至少約70%、至少80%、至少90%、至少95%或至少98%序列同一性。所述重鏈可以與SEQ ID NO :1的殘基31 35、殘基51 68和殘基99 111具 有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少100%序列同一性。所述輕鏈與SEQ ID NO 2的殘基24 34、殘基50 56和殘基89 97具有至 少75%、至少85%、至少95%、至少97%或至少100%序列同一性。本發(fā)明還涉及一種藥物組合物，所述藥物組合物包含所述基因工程靶向抗體和藥 物可接受載劑，或者所述藥物組合物基本上由所述基因工程靶向抗體和藥物可接受載劑組 成。產(chǎn)生所述基因工程靶向抗體的雜交瘤也是本發(fā)明的一部分。本發(fā)明還包括基于抗體的測試，所述測試包含所述基因工程靶向抗體。本發(fā)明提供用于醫(yī)學(xué)的本文所述的基因工程靶向抗體。特別地，所述基因工程靶 向抗體包含抗CD138抗原結(jié)合區(qū)，其中所述抗原結(jié)合區(qū)出自非人類抗體，和另外的抗體區(qū)，其中所述另外的抗體區(qū)的至少一部分出自人類抗體。更特別地，所述基因工程靶向抗體用于靶向腫瘤細(xì)胞的治療。本發(fā)明還提供本文所述基因工程靶向抗體在用于靶向腫瘤細(xì)胞的藥物制備中的 應(yīng)用，所述基因工程靶向抗體包含抗CD138抗原結(jié)合區(qū)，其中所述抗原結(jié)合區(qū)出自非人類抗體，和另外的抗體區(qū)，其中所述另外的抗體區(qū)的至少一部分出自人類抗體。更特別地，在本發(fā)明的這些醫(yī)學(xué)應(yīng)用中，對(duì)具有表達(dá)⑶138的細(xì)胞的個(gè)體施用所 述基因工程靶向抗體。此外，所述基因工程靶向抗體能夠均勻地與在所述表達(dá)⑶138的細(xì) 胞上表達(dá)的⑶138相結(jié)合。


圖1提供連接有效應(yīng)分子的ΠΒΤ062的示意圖。圖2為BT062的化學(xué)示意圖。圖3顯示安絲菌素P-3向美登醇的轉(zhuǎn)換(簡化起見省略立體化學(xué))。圖4顯示DM4的代表性合成圖。圖5為抗體綴合(nBT062至DM4)的示意圖。
圖 6 顯示對(duì) nBT062-SPDB-DM4、nBT062-SPP-DMl、nBT062-SMCC-DMl 和 nBT062 抗體 與0PM-2細(xì)胞的結(jié)合的分析。將不同濃度的ΠΒΤ062和綴合物給予所述細(xì)胞，并通過FACS 分析測定平均熒光。圖 7(A) (D)描述 nBT062-DMx 綴合物對(duì) M0LP-8(CD138+)和 BJAB (CD138-)細(xì) 胞的體外細(xì)胞毒性。在平底板中培養(yǎng)所述細(xì)胞，并且與指定濃度的免疫綴合物一起溫育5 天。加入WST試劑，過3個(gè)小時(shí)估算細(xì)胞活力。在(D)中，在存在或不存在阻斷抗體(IyM ηΒΤ062)時(shí)分析nBT062-SPDB-DM4的細(xì)胞毒性活性。圖8顯示用(A) PBS、(B)nBT062抗體、(C)游離DM4或⑶非靶向綴合物 huC242-DM4處理的個(gè)體小鼠，在用M0LP-8腫瘤細(xì)胞接種后隨時(shí)間(天)推移的腫瘤體積。圖 9 顯示用(A)PBS, (B) nBT062-SPDB_DM4、(C) B-B4-SPP-DM1 或(D) nBT062-SPP-DMl處理的個(gè)體小鼠，在用M0LP-8腫瘤細(xì)胞接種后隨時(shí)間(天)的腫瘤體積。圖10描述CB. 17SCID小鼠中M0LP-8人類多發(fā)性骨髓瘤異種移植物，在接種后隨 時(shí)間(天)的平均腫瘤體積(+/-SD)。圖IlA和B顯示在SCID小鼠的大體積(bulky)M0LP_8腫瘤模型中，nBT062_DMx針 對(duì)CD138+M0LP-8腫瘤細(xì)胞的抗腫瘤活性。對(duì)于各組，腫瘤體積以平均值(+/-SD)給出。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明涉及靶向劑，特別是涉及CD138靶向抗體，更特別的是涉及基因工程CD138 靶向抗體。包含所述靶向劑的免疫綴合物允許將效應(yīng)分子輸送至靶點(diǎn)，并允許效應(yīng)分子在 靶細(xì)胞、組織和器官中、其上或其附近的位點(diǎn)特異性釋放。所述效應(yīng)分子可以通過在靶點(diǎn)處 從免疫綴合物的靶向劑部分切割/分離而激活?？梢詫?duì)需要治療性治療的受試對(duì)象或分離自需要治療性治療的此類受試對(duì)象的 細(xì)胞施用本發(fā)明的抗體和/或包含其的免疫綴合物?？梢酝ㄟ^在靶細(xì)胞、組織或器官中、其 上或其附近切割/分離而從所述免疫綴合物釋放效應(yīng)分子。在一個(gè)實(shí)例中，將抗體ΠΒΤ062用于色譜測試。提供了經(jīng)福爾馬林固定、石蠟包埋 的患者組織。添加作為一抗的抗體nBT062，且組織的表面表達(dá)的⑶138與抗體結(jié)合。添加 檢測抗體以與nBT062結(jié)合。在最后步驟中，確定包含色素原的檢測抗體的這種結(jié)合。抗體 nBT062用于鑒定造血細(xì)胞中的人類漿細(xì)胞，由此允許診斷各種惡性血液病。該方法還允許 追蹤特定癌癥的進(jìn)展。當(dāng)使用nBT062時(shí)，與其小鼠對(duì)應(yīng)物相反，觀察到由于與Fc受體的交 叉反應(yīng)性降低而導(dǎo)致的非特異性檢測的降低。在第二實(shí)例中，提供nBT062抗體和包含nBT062抗體和作為效應(yīng)分子的至少一種 高細(xì)胞毒性藥物或免疫毒素的免疫綴合物，并且將其施用于患有癌癥的患者。在該實(shí)例中， 有效量的nBT062保護(hù)表達(dá)CD138的非腫瘤細(xì)胞免受稍后對(duì)患者靜脈內(nèi)施用的治療有效量 的免疫綴合物的作用，從而使該免疫綴合物在癌細(xì)胞中富集。通過外部手段使所述效應(yīng)分 子從所述抗體靶釋放，從而誘導(dǎo)癌細(xì)胞中的細(xì)胞死亡或連續(xù)的細(xì)胞周期停滯。CD138 或粘結(jié)蛋白聚糖-l(syndecan-l)(也稱 SYNDl ；SYNDECAN ；SDC ；SCDl ；CD138 抗原，SwissProt登錄號(hào)P18827人類)為一種膜糖蛋白，最初記載其存在于源自上皮的細(xì) 胞上，隨后發(fā)現(xiàn)于造血細(xì)胞上(Sanderson，1989)。⑶138具有長的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域，該細(xì)胞外 結(jié)構(gòu)域與可溶性分子(例如生長因子EGF、FGF、HGF)和不溶性分子(例如細(xì)胞外基質(zhì)成分膠原蛋白和纖連蛋白)通過硫酸乙酰肝素鏈結(jié)合(Langford，1998 ；Yang，2007)，并且充當(dāng) 細(xì)胞外基質(zhì)的受體。CD138還通過由粘附細(xì)胞表達(dá)的肝素結(jié)合分子來介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞的粘 著。已經(jīng)顯示⑶138起骨髓瘤細(xì)胞的生長因子的共受體的作用(Bisping，2006)。血漿細(xì)胞 分化的研究表明，⑶138也必須被視為一種分化抗原(Bataille，2006)。在惡性造血中，⑶138在大多數(shù)的以下細(xì)胞上高度表達(dá)MM細(xì)胞、卵巢癌、腎癌、膽 囊癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、結(jié)腸癌細(xì)胞和霍奇金氏淋巴瘤與非霍奇金氏淋巴瘤、慢性淋 巴性白血病(CLL) (Horvathova，1995)、急性淋巴性白血病(ALL)、急性髓細(xì)胞白血病(AML) (Seftalioglu, 2003 (a) ；Seftalioglu, 2003 (b))、實(shí)體組織肉瘤、結(jié)腸癌以及表達(dá) CD138 的其它惡性血液病和實(shí)體瘤的細(xì)胞(Carbone等，1999 ；Sebestyen等，1999 ；Han等，2004 ； Charnaux 等，2004 ；0，Connell 等，2004 ；Oroszh 和 Kopper，2001)。已經(jīng)對(duì)⑶138表達(dá)顯示為陽性的其它癌癥為多種卵巢腺癌、膀胱移行細(xì)胞癌、腎 透明細(xì)胞癌、肺鱗狀細(xì)胞癌、乳腺癌和子宮癌(參見，例如，Davies等，2004 ；Barbareschi 等，2003 ；Mennerich 等，2004 ；Anttonen 等，2001 ；Wijdenes, 2002)。在正常人類造血腔中，CD138表達(dá)局限于血漿細(xì)胞(ffi jdenes, 1996 ；Chilosi, 1999)，并且⑶138不在外周血淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、粒細(xì)胞和紅細(xì)胞上表達(dá)。特別地，⑶34+ 干細(xì)胞和祖細(xì)胞(progenitor cell)不表達(dá)⑶138，并且抗⑶138 mAb不影響造血干細(xì)胞培 養(yǎng)物中集落形成單位的數(shù)量(Wijdenes，1996)。在非造血腔中，⑶138主要在肺、肝、皮膚、 腎和腸內(nèi)的單層上皮和復(fù)層上皮上表達(dá)。在內(nèi)皮細(xì)胞上僅看到弱的染色(Bernfield，1992 ； Vooijs，1996)。據(jù)報(bào)道，CD138以多態(tài)性形式存在于人類淋巴瘤細(xì)胞中(Gattei，1999)。已經(jīng)報(bào)道單克隆抗體 B-B4、BC/B-B4、B-B2、DL-101、1D4、MI15、1. BB. 210、2Q1484、 5卩7、104-9、281-2，特別是8-84對(duì)0)138有特異性。其中B-B4、1D4和MI15既識(shí)別CD138 的完整分子也識(shí)別其核心蛋白，并且據(jù)顯示識(shí)別相同或密切相關(guān)的表位(Gattei，1999)。此 前的研究報(bào)道，B-B4不識(shí)別可溶性CD138，但僅識(shí)別膜結(jié)合形式的CD138 (Wi jdenes，2002)。B-B4，一種鼠IgGlmAb，與人類粘結(jié)蛋白聚糖-1(⑶138)上的核心蛋白的90 95 位殘基之間的線性表位結(jié)合(Wi jdenes，1996 ；Dore, 1998)。與CD138的表達(dá)模式一致，據(jù)顯 示B-B4與血漿細(xì)胞系RPMI8226強(qiáng)烈地反應(yīng)，但不與內(nèi)皮細(xì)胞反應(yīng)。同樣與⑶138的表達(dá) 模式一致，B-B4還與上皮細(xì)胞系A(chǔ)431(源自角質(zhì)形成細(xì)胞)和H印G2(源自肝細(xì)胞)反應(yīng)。 免疫毒素B-B4-皂草素對(duì)血漿細(xì)胞系RPMI8226也是高度毒性的，事實(shí)上比游離皂草素的毒 性明顯更強(qiáng)。然而，從兩個(gè)受測的上皮細(xì)胞系看出，B-B4-皂草素僅對(duì)細(xì)胞系A(chǔ)431顯示毒 性，但在集落形成測試中皂草素對(duì)A431細(xì)胞的生長暈未顯示出抑制作用(Vooi js，1996)。 其它研究者報(bào)道了 MM相關(guān)抗原抗腫瘤缺少特異性(Couturier，1999)。在本發(fā)明的背景下，抗體“基本上由特定成分組成”是指抗體由指定的成分和任何 不會(huì)在實(shí)質(zhì)上影響所述抗體的基本特性的其它材料或成分組成。本發(fā)明使用術(shù)語“腫瘤細(xì)胞”來包括癌細(xì)胞以及可能形成或可能不形成實(shí)體瘤的 部分的癌前細(xì)胞。本發(fā)明的“靶向劑”能夠與由靶細(xì)胞表達(dá)的分子相連，并且包括肽和非肽類。特別 地，本發(fā)明的靶向劑包括靶向抗體和非免疫球蛋白靶向分子，所述非免疫球蛋白靶向分子 可以基于包括但不限于AFFILIN 分子、ANTICALINS⑥和AFFIB0DIES 的非免疫球蛋白蛋 白。非免疫球蛋白靶向分子還包括非肽靶向分子(例如靶向DNA和RNA寡核苷酸(適體))，以及生理學(xué)配體，特別是所關(guān)注的抗原的配體，例如CD138。本發(fā)明的“靶向抗體”為天然抗體或基于天然抗體，或通過合成或通過基因工程而 產(chǎn)生，并且與目的細(xì)胞(靶細(xì)胞)上的抗原結(jié)合。本發(fā)明的靶向抗體包括單克隆抗體、多克 隆抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、或抗體片段。所述靶向抗體可以被基因工程 化以便例如提高其與靶細(xì)胞的親和力(Ross，2003)，或減少其免疫原性。所述靶向抗體可以 與包括效應(yīng)分子的脂質(zhì)體制劑相連(Carter，2003)。抗體片段包含完整抗體的一部分，優(yōu)選 完整抗體的抗原結(jié)合區(qū)或可變區(qū)。本發(fā)明的抗體片段的實(shí)例包括Fab、Fab'、F(ab' )2和 Fv片段以及雙鏈抗體(diabody)；結(jié)構(gòu)域抗體(domain antibody) (dAb) (Ward，1989 ；美國 專利6，005, 079)；線性抗體；單鏈抗體分子；和由抗體片段形成的多特異性抗體。在單鏈可 變片段抗體(scFv)中，重鏈和輕鏈(VH和VL)可以通過短的氨基酸連接子連接，所述連接 子具有例如(Gly4Ser)n的序列并且具有足夠的柔性而使兩個(gè)結(jié)構(gòu)域能裝配成功能性抗原 結(jié)合袋。添加各種信號(hào)序列可以使得靶向抗體具有更精確的靶向性。添加輕鏈恒定區(qū)(CL) 可以允許經(jīng)由二硫鍵的二聚化，從而提供更高的穩(wěn)定性和親合力。如果可獲得針對(duì)所關(guān)注 的靶標(biāo)的mAb，可以通過RT-PCR獲得用于構(gòu)建scFv的可變區(qū)，所述RT-PCR從提取自親本雜 交瘤的mRNA克隆出該可變區(qū)。作為另一種選擇，所述scFv可以通過噬菌體展示技術(shù)從頭 產(chǎn)生(Smith，2001)。如本文所用，當(dāng)參照靶向抗體使用時(shí)，術(shù)語“功能片段”是指能夠特異 性結(jié)合抗原的靶向抗體的一部分，所述抗原與所參照的抗體特異性地結(jié)合。本發(fā)明的雙特 異性抗體可以例如具有對(duì)靶組織有反應(yīng)性的至少一條臂，以及對(duì)連接子部分有反應(yīng)性的一 條臂(美國專利公開20020006379)。本發(fā)明的雙特異性抗體還可以與靶細(xì)胞上的超過一種 抗原結(jié)合(Carter，2003)。本發(fā)明的抗體可以通過例如引入半胱氨酸殘基來引入巰基來修 飾(01afsen,2004)。根據(jù)本發(fā)明，所述靶向抗體可以源自任何來源，并且可以為但不限于駱駝抗體、小 鼠抗體、嵌合人類/小鼠抗體或嵌合人類/猴抗體，特別是例如ΠΒΤ062等的嵌合人類/小 鼠抗體。人源化抗體為含有源自人類抗體和源自非人類抗體的序列的抗體，其也在本 發(fā)明范圍內(nèi)。用于將抗體人源化的合適方法包括CDR移植(互補(bǔ)決定區(qū)移植)(EP 0 239 400 ；WO 91/09967 ；美國專利 5，530，101 ；和 5，585，089)、表面修飾(veneering) 或表面重塑(resurfacing) (EP 0 592 106 ；EP 0 519 596 ；Padlan, 199 ；Studnicka 等，1994 ；Roguska 等，1994)、鏈改組(chain shuffling)(美國專利 5，565，332)以及 De ImmunosationTM (Bi ο vat ion，LTD)。在 CDR 移植中，將來自例如 mAb B-B4 等的小鼠互 補(bǔ)決定區(qū)(CDR)移植至人類可變框架，然后將該人類可變框架與人類恒定區(qū)連接，從而形 成人類B-B4抗體(hB-B4)?，F(xiàn)在已經(jīng)將幾種通過⑶R-移植人源化的抗體用于臨床，包括 MYLOTARG (Sievers 等，2001)和 HECEPTIN(Pegram 等，1998)。表面重塑技術(shù)使用分子模塑、統(tǒng)計(jì)分析和誘變的組合來將抗體可變區(qū)的非CDR 表面改變成與靶標(biāo)宿主的已知抗體表面類似。在例如美國專利5，639，641中公開了用于 將抗體表面重塑的策略和方法，以及用于降低不同宿主內(nèi)抗體免疫原性的其它方法?？?以通過包括噬菌體展示方法的本領(lǐng)域已知的各種方法來制備人類抗體。還參見美國專利 4，444，887,4, 716，111,5, 545，806 和 5，814，318 ；以及國際專利申請公開 WO 98/46645、WO 98/50433、WO 98/24893、WO 98/16654、WO 96/34096、WO 96/33735 和 WO 91/10741。
經(jīng)受任何非天然修飾的靶向抗體，例如，嵌合人類/小鼠抗體或嵌合人類/猴抗 體、人源化抗體或經(jīng)基因工程化以便例如提高與靶細(xì)胞的親和力或減少其免疫原性的抗 體，以及抗體片段、特別是已經(jīng)經(jīng)受任何非天然修飾的此類靶向抗體的功能片段、雙鏈抗 體；結(jié)構(gòu)域抗體；線性抗體；單鏈抗體分子；和多特異性抗體在本文也稱為基因工程靶向抗 體。嵌合抗體保留非人類抗體(例如它們所基于的小鼠抗體)的抗體結(jié)合區(qū)(ABR或 Fab區(qū))，同時(shí)可以由例如人類抗體提供任何恒定區(qū)。通常，抗體恒定區(qū)的嵌合和/或交換不 會(huì)影響抗體的親和力，這是因?yàn)橛兄诳乖Y(jié)合的抗體區(qū)不受交換的影響。在本發(fā)明的優(yōu) 選實(shí)施方式中，本發(fā)明的基因工程抗體，特別是嵌合的抗體可以比其所基于的對(duì)應(yīng)各非人 類抗體具有更高的結(jié)合親和力(通過Kd值表達(dá))。具體地，ΠΒΤ062抗體和基于該抗體的抗 體可以比小鼠B-B4具有更高的抗體親和力。在本發(fā)明的另一實(shí)施方式中，包含這些基因工 程抗體/嵌合抗體的免疫綴合物也顯示出這種更高的抗體親和力。在某些實(shí)施方式中這些 免疫綴合物也可以顯示其它有利性質(zhì)，例如比其含有B-B4的對(duì)應(yīng)物使腫瘤負(fù)荷降低得更 多。在優(yōu)選實(shí)施方式中，基因工程化、特別是嵌合的靶向抗體顯示出特征為解離常數(shù)K11(IiM) 小于1. 6、小于1. 5或?yàn)?. 4或約小于1. 4的結(jié)合親和力，而其小鼠對(duì)應(yīng)物的特征在于解離 常數(shù)K11(IiM)為約1.6或大于1.6。優(yōu)選包含靶向抗體等靶向劑的免疫綴合物的特征在于， 解離常數(shù)Kd (nM)小于2. 6、小于2. 5、小于2. 4、小于2. 3、小于2. 2、小于2. 1、小于2. 0、小于 1.9或?yàn)榧s1.9，而包含小鼠對(duì)應(yīng)物抗體的免疫綴合物的特征可以在于解離常數(shù)K11(IiM)為 約2. 6或大于2. 6 (比較表3、材料和方法)。也可以使用完全人類抗體?？梢酝ㄟ^噬菌體展示方法篩選這些抗體，其中CD138 或其抗原性決定子用于選擇性地與表達(dá)例如B-B4可變區(qū)的噬菌體結(jié)合(參見，Krebs, 2001)。有利的是，該方法可以與親和突變技術(shù)聯(lián)合，來提高抗體的親和力。本文涉及的所 有抗體為分離的抗體。在一個(gè)實(shí)施方式中，未綴合形式的靶向抗體被中等或較弱地內(nèi)化。在37°C溫育3 小時(shí)后，中等內(nèi)化構(gòu)成約30 % 約75 %的抗體內(nèi)化，弱內(nèi)在化包含約0.01% 最大約30% 內(nèi)在化。在另一優(yōu)選實(shí)施方式中，所述靶向抗體結(jié)合⑶138，例如抗體B-B4、BC/B-B4、B-B2、 DL-101、1D4、ΜΙ15、1· BB. 210、2Q1484、5F7、104_9、281_2，特別是 B-B4。通過將 SP02/0 骨 髓瘤細(xì)胞與Balb/c小鼠的脾細(xì)胞雜交產(chǎn)生的雜交瘤細(xì)胞，已經(jīng)于2007年12月11日保藏 在 DSMZ—Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH,Mascheroder Weg l，D-38124Braunschweig。這些表達(dá)B-B4的雜交瘤細(xì)胞的識(shí)別號(hào)為DSM ACC2874。在 另一實(shí)施方式中，所述靶向抗體基本上不結(jié)合非細(xì)胞表面表達(dá)的CD138。在本發(fā)明的背景 下，當(dāng)特異性抗體的名稱與術(shù)語“靶向抗體”結(jié)合，例如“ΠΒΤ062靶向抗體”時(shí)，這是指該靶向 抗體具有抗體ΠΒΤ062的結(jié)合特異性。如果說靶向抗體“基于”一種特異性抗體，這是指該靶 向抗體具有該抗體的結(jié)合特異性，但可以采用與靶向抗體的上述描述一致的任何形式。在 本發(fā)明的背景下，當(dāng)特異性抗原的名稱與術(shù)語“靶向抗體”結(jié)合(例如“CD138靶向抗體”) 時(shí)，這是指該靶向抗體具有對(duì)CD138的結(jié)合特異性。在本發(fā)明的背景下，如果例如描述靶向 抗體“選擇性地”進(jìn)行某事，例如“選擇性地靶向細(xì)胞表面表達(dá)的CD138”，或?qū)δ呈率恰斑x擇 性的”，這是指在所提供的實(shí)例的情況下，與任何其它抗原相比，對(duì)細(xì)胞表面表達(dá)的CD138存 在顯著的選擇性(即，對(duì)CD138陽性細(xì)胞比對(duì)于CD138陰性細(xì)胞更高的親和力)。由于該選擇性，顯著減少甚至避免了給定環(huán)境中不利的副作用。本發(fā)明的“非免疫球蛋白靶向分子”包括源自非免疫球蛋白蛋白的靶向分子以及 非肽靶向分子。將包括在該定義中的小的非免疫球蛋白蛋白設(shè)計(jì)成對(duì)特別是表面表達(dá)的 ⑶138具有特異性親和力。這些小的非免疫球蛋白蛋白包括基于支架的基因工程分子，例如 具有相對(duì)低分子量(例如IOkDa 20kDa)的Affilin 分子。合適的支架包括例如Y晶 體。這些分子在其自然狀態(tài)對(duì)靶標(biāo)分子無特異性結(jié)合活性。通過對(duì)蛋白表面經(jīng)由溶劑暴露 的氨基酸的局部限定隨機(jī)化而進(jìn)行基因工程化，形成全新的結(jié)合位點(diǎn)。由此將此前的非結(jié) 合蛋白轉(zhuǎn)變成特異性結(jié)合蛋白?？梢詫⒋祟惙肿犹禺惖卦O(shè)計(jì)成結(jié)合例如CD138等的靶標(biāo)， 并允許特異性輸送一種或多種效應(yīng)分子(參見，www. scilproteins. com的scil Proteins GmbH, 2004) 0另一種非免疫球蛋白靶向分子源自脂鈣蛋白(lipocalin)，并且包括例如 ANTICALINS ，所述ANTICALINS 與免疫球蛋白在結(jié)構(gòu)上具有某種程度的相似性。然而脂鈣 蛋白由具有160 180個(gè)氨基酸殘基的單鏈多肽構(gòu)成?？梢詫⒅}蛋白的結(jié)合袋改造以便 以高親和力和特異性來識(shí)別所關(guān)注分子(參見，例如，Beste等，1999)。人工細(xì)菌受體(例 如商標(biāo)為Affibody (Affibody AB)的受體)也在本發(fā)明范圍內(nèi)。這些人工細(xì)菌受體分子 為較小的簡單蛋白，并且可以由基于蛋白A(金黃色葡萄球菌)的一種IgG結(jié)合結(jié)構(gòu)域的支 架的三螺旋束構(gòu)成。這些分子具有與許多免疫球蛋白類似的結(jié)合性質(zhì)，但是明顯更小，分子 量通常不超過IOkDa,并且相對(duì)穩(wěn)定。合適的人工細(xì)菌受體分子例如美國專利5，831，012 ； 6，534，628 和 6，740，734 中所述。本發(fā)明的“效應(yīng)分子”為如下的分子或衍生物或其類似物所述分子連接至靶向 劑、特別是靶向抗體和/或基因工程靶向抗體，并且對(duì)靶細(xì)胞發(fā)揮所期望的作用，例如凋 亡、或另一類型的細(xì)胞死亡、或連續(xù)的細(xì)胞周期停滯。本發(fā)明的效應(yīng)分子包括在靶細(xì)胞中 能夠發(fā)揮所期望作用的分子，并且包括，但不限于，毒素、藥物(特別是低分子量細(xì)胞毒性 藥物)、放射性核素、生物響應(yīng)修飾劑、成孔劑、核糖核酸酶、具有凋亡誘導(dǎo)活性的凋亡信號(hào) 傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)的蛋白、細(xì)胞毒性酶、前藥激活酶、反義寡核苷酸、抗體或細(xì)胞因子以及其功能衍 生物或類似物/片段。毒素可以包括細(xì)菌性毒素，例如但不限于白喉毒素或外毒素A ；植物 毒素，例如但不限于蓖麻毒蛋白。具有凋亡誘導(dǎo)活性的凋亡信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)的蛋白包括但不 限于粒酶B、粒酶A、半胱天冬酶-3、半胱天冬酶-7、半胱天冬酶-8、半胱天冬酶-9、截短的 Bid(tBid)、Bax 和 Bak。在優(yōu)選實(shí)施方式中，所述效應(yīng)子增加免疫綴合物的內(nèi)部效應(yīng)子輸送，尤其當(dāng)免疫 綴合物的靶向抗體所基于的抗體的天然形式可被較弱地內(nèi)化時(shí)。在另一優(yōu)選實(shí)施方式中， 所述效應(yīng)子的天然形式是非選擇性的。在某些實(shí)施方式中，當(dāng)處于天然形式時(shí)，所述效應(yīng) 子具有高度的非選擇性毒性，包括系統(tǒng)毒性。本發(fā)明效應(yīng)分子的“天然形式”為在與靶向 劑連接而形成免疫綴合物之前的效應(yīng)分子。在另一優(yōu)選實(shí)施方式中，與靶向劑綴合后基本 上消除了效應(yīng)分子的非選擇性毒性。在另一優(yōu)選實(shí)施方式中，當(dāng)?shù)竭_(dá)靶細(xì)胞時(shí)，所述效應(yīng) 分子在靶細(xì)胞中引起死亡或連續(xù)的細(xì)胞周期停滯。本發(fā)明的藥物效應(yīng)分子包括但不限于 如下的藥物包括例如充當(dāng)微管蛋白聚合的抑制劑的小型高細(xì)胞毒性藥物(例如類美登素 類、多拉司他汀(dolastatins)、奧雷司他汀(auristatin)和念珠藻環(huán)肽(cryptophycin)) 的藥物；DNA烷基化劑，如CC-1065類似物或衍生物(美國專利5，475，092 ；5, 585，499 ； 6，716，821)和倍癌霉素(duocarmycin)；烯二炔類(enediyne)抗生物例如卡里奇霉素
11(calicheamicin)和埃斯培拉霉素(esperamicin)；以及強(qiáng)效類紫杉烷(taxoid)(紫杉烷) 藥物(Payne，2003)。特別優(yōu)選類美登素類和卡里奇霉素類。效應(yīng)子類美登素包括任何 來源的類美登素，包括但不限于合成的美登醇和美登醇類似物和衍生物。多柔比星、道諾 霉素、甲氨蝶呤、長春堿、新制癌菌素、大分子霉素、三亞胺醌(trenimon)和α -鵝膏菌素 (amanitin)為本發(fā)明范圍內(nèi)的一些其它效應(yīng)分子。作為效應(yīng)分子的反義DNA分子也在本發(fā) 明范圍內(nèi)。當(dāng)特定藥物或藥物種類的名稱與術(shù)語“效應(yīng)子”或“效應(yīng)分子”結(jié)合時(shí)，是指基 于該特定藥物或藥物種類的本發(fā)明的免疫綴合物的效應(yīng)子。美登素是最初源自埃塞俄比亞灌木齒葉美登木(Maytenus serrata)的一種天然 產(chǎn)物(Remillard，1975 ；美國專利3，896，111)。該藥物抑制微管蛋白聚合，從而導(dǎo)致阻斷 有絲分裂和細(xì)胞死亡(Remillard，1975 ；Bhattacharyya, 1977 ；Kupchan, 1978)。美登素的 細(xì)胞毒性比臨床使用的影響微管蛋白聚合的抗癌藥(例如長春花生物堿類或紫杉醇)高 200 1000倍。然而，美登素的臨床試驗(yàn)表明，其由于高系統(tǒng)毒性而缺少治療窗。美登素和 類美登素類是高度細(xì)胞毒性的，但是其在癌癥治療中的臨床應(yīng)用受其嚴(yán)重的系統(tǒng)性副作用 限制，該副作用主要?dú)w因于其對(duì)腫瘤的不良選擇性。使用美登素的臨床試驗(yàn)顯示出對(duì)中樞 神經(jīng)系統(tǒng)和胃腸系統(tǒng)的嚴(yán)重副作用。類美登素類也已經(jīng)從其它植物、包括滑桃樹(Trewia nudiflora)的種子組織分離 出(美國專利4，418，064)。某些微生物也產(chǎn)生類美登素類，例如美登醇和C-3美登醇酯(美國專利 4，151，042)。本發(fā)明還涉及任何來源的類美登素，包括合成的美登醇和美登醇類似物，其公開 于例如美國專利 4，137，230,4, 248，870,4, 256，746,4, 260，608,4, 265，814,4, 294，757、 4，307，016,4，308，268,4，308，269,4，309，428,4，313，946,4，315，929,4，317，821, 4，322，348,4, 331，598,4, 361，650,4, 362，663,4, 364，866,4, 371，533,4, 424，219 和 4，151，042 中。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，類美登素為含巰基的類美登素，并且更優(yōu)選根據(jù)Chari 等的美國專利6，333，410或Chari等(Chari, 1992)中公開的方法產(chǎn)生。在本發(fā)明的背景下，DM-I (N2-脫乙?；?N2-(3-巰基氧代丙基)美登素)為 一種優(yōu)選的效應(yīng)分子。DMl比美登素的細(xì)胞毒性高3倍 10倍，并且通過借助于二硫鍵將 其連接至針對(duì)腫瘤相關(guān)抗原的單克隆抗體而已被轉(zhuǎn)化成前藥。某些此類綴合物(有時(shí)稱為 “腫瘤激活的前藥” (TAP))在血液腔中無細(xì)胞毒性，因?yàn)樗鼈冊谂c靶細(xì)胞連接時(shí)被激活而內(nèi) 化，由此釋放藥物(BlSttler，2001)。已經(jīng)開發(fā)出幾種抗體-DMl綴合物(Payne，2003)，并 且在臨床試驗(yàn)中評(píng)價(jià)。例如，在結(jié)直腸癌患者中huC242-DMl治療被良好耐受，不會(huì)誘導(dǎo)任 何可檢測的免疫響應(yīng)，并且具有長循環(huán)時(shí)間(TOlcher，2003)。其它特別優(yōu)選的類美登素包含含有空間位阻巰基鍵的側(cè)鏈，該類美登素例如但 不限于類美登素N2’-脫乙?；?N2’-(4-巰基-1-氧代戊基)美登素(也稱為“DM3”)和 N2’-脫乙酰基-N2’-(4-甲基-4-巰基-1-氧代戊基)美登素(也稱為“DM4”)。DM4的合 成如圖3和圖4所示并且在本文其它部分有所描述。DM4與DMl和DM3的不同之處在于其 在α C處攜帶有甲基。當(dāng)將DM4經(jīng)由連接子(具體為但不限于包含二硫鍵的連接子)連接 至例如ΠΒΤ062等靶向劑時(shí)，會(huì)導(dǎo)致空間位阻。攜帶有空間位阻巰基的各種類美登素(擁有一個(gè)或兩個(gè)取代基、特別是烷基取代基，例如DM4的甲基取代基)公開于2004年11月25 日公布的美國專利申請2004/0235840，本文通過參考并入其全部內(nèi)容。如Goldmahker等在 美國專利公開2006/0233814中所報(bào)道，一旦在靶標(biāo)處釋放藥物，此類空間位阻誘導(dǎo)游離藥 物的烷基化(例如，甲基化)。烷基化可以增加該藥物的穩(wěn)定性，從而提供所謂的旁觀者效 應(yīng)。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員將意識(shí)到，當(dāng)將效應(yīng)子經(jīng)由連接子連接至靶向劑時(shí)，其它包含處 在導(dǎo)致空間位阻的位置的例如烷基等取代基的效應(yīng)分子也是本發(fā)明的一部分。優(yōu)選的是， 這種位阻誘導(dǎo)游離藥物的化學(xué)修飾(例如烷基化)從而增加其總體穩(wěn)定性，這使得該藥物 在表達(dá)CD138的腫瘤細(xì)胞中不僅誘導(dǎo)細(xì)胞死亡或連續(xù)的細(xì)胞周期停滯，而且在必要時(shí)還影 響例如支持或保護(hù)腫瘤免受藥物影響且通常不表達(dá)CD138的輔助細(xì)胞(特別是腫瘤基質(zhì)的 細(xì)胞和腫瘤血管的細(xì)胞)以致減少或喪失其支持或保護(hù)功能。還特別優(yōu)選DNA烷基化劑作為效應(yīng)分子，并且所述DNA烷基化劑包括但不限于 CC-1065類似物或衍生物。CC-1065為分離自澤耳鏈霉菌(Sti^ptomyces zelensis)的培養(yǎng) 物的強(qiáng)效抗腫瘤抗生物，并且在體外已經(jīng)顯示出特殊的細(xì)胞毒性(美國專利4，169，888)。 例如美國專利5，475，092,5, 585，499和5，739，350所述的CC-1065類似物或衍生物落在本 發(fā)明范圍內(nèi)。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)容易地意識(shí)到，美國專利5，846，545所述的修飾的CC-1065 類似物或衍生物，和例如美國專利6，756，397所述的CC-1065類似物或衍生物的前藥也 在本發(fā)明范圍內(nèi)。在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中，CC-1065類似物或衍生物可以如美國專利 6，534，660中所述而合成。作為優(yōu)選效應(yīng)分子的另一組化合物為紫杉烷，特別是高強(qiáng)效紫衫烷和含有巰基或 二硫基的紫杉烷。紫杉烷為抑制微管蛋白解聚從而導(dǎo)致維管組裝和細(xì)胞死亡速率增加的有 絲分裂紡錘體毒劑。在本發(fā)明范圍內(nèi)的紫杉烷公開于例如美國專利6，436，931、6，340，701、 6，706，708 和美國專利公開 20040087649,20040024049 和 20030004210 中。其它紫杉燒 公開于例如美國專利6，002，023、美國專利5，998，656、美國專利5，892，063、美國專利 5，763，477、美國專利5，705，508、美國專利5，703，247和美國專利5，367，086。本領(lǐng)域技術(shù) 人員可以理解，PEG化(PEGylated)的紫杉烷(例如描述于美國專利6，596，757中的紫杉 烷)也在本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明的卡里奇霉素效應(yīng)分子包括Y II、N-乙?；ɡ锲婷顾睾涂ɡ锲婷顾氐?其它衍生物。卡里奇霉素以序列特異性方式與DNA的小槽結(jié)合，進(jìn)而重排并使自由基暴露， 從而引起雙鏈DNA的斷裂，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和死亡?？捎糜诒景l(fā)明背景下的卡里奇霉素 效應(yīng)分子的一個(gè)實(shí)例描述于美國專利5，053，394中。本發(fā)明的免疫綴合物包含至少一種靶向劑(特別是靶向抗體，例如基因工程靶向 抗體)和一種效應(yīng)分子。所述免疫綴合物可以包含例如用于穩(wěn)定化的其他分子。對(duì)于免疫 綴合物，術(shù)語“綴合物”通常用于定義靶向劑與一種或多種效應(yīng)分子的有效結(jié)合，并不旨在 僅指任一類有效結(jié)合，特別是不限于化學(xué)“綴合”。只要所述靶向劑能夠與靶點(diǎn)結(jié)合，并且 連接的效應(yīng)子(特別是當(dāng)輸送至靶點(diǎn)時(shí))如預(yù)期地充分起作用，任何連接模式都是適合的。 本發(fā)明的綴合方法包括但不限于在將效應(yīng)分子和/或靶向抗體事先修飾或未事先修飾時(shí) 將效應(yīng)分子直接連接至靶向抗體，或經(jīng)由連接子連接。連接子可以在功能上分類成例如酸 不穩(wěn)定性連接子、光不穩(wěn)定性連接子、酶可切割連接子，例如可以被肽酶切割的連接子。在 本發(fā)明許多實(shí)施方式中優(yōu)選可切割連接子?？梢栽诩?xì)胞環(huán)境、特別是細(xì)胞內(nèi)環(huán)境中存在的
13條件下切割此類可切割連接子，當(dāng)切割時(shí)所述環(huán)境對(duì)藥物釋放無有害作用。如存在于特定 的細(xì)胞內(nèi)區(qū)室的PH4 5等低pH會(huì)切割酸不穩(wěn)定連接子，而光不穩(wěn)定連接子可以通過例如 紅外光切割。然而，優(yōu)選被大多數(shù)細(xì)胞中存在的生理?xiàng)l件切割或者在該生理?xiàng)l件下切割的 連接子，本文將之稱為生理性可切割連接子。因此，在本發(fā)明許多實(shí)施方式中優(yōu)選二硫鍵連 接子。這些連接子可通過能在生理?xiàng)l件下發(fā)生的二硫鍵交換而切割。優(yōu)選的異雙官能二硫 鍵連接子包括但不限于N-丁二酰亞胺基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)(參見，例如 Carlsson等(1978))、N- 丁二酰亞胺基4_(2_吡啶基二硫代)丁酸酯(SPDB)(參見，例如 美國專利號(hào)4，563，304)、N-丁二酰亞胺基4-(2-吡啶基二硫代)戊酸酯(SPP)(參見，例如 CAS登記號(hào)341498-08-6)、N_ 丁二酰亞胺基4_(N_馬來酰亞胺基甲基)環(huán)己烷甲酸酯 (SMCC)(參見，例如Yoshitake等，(1979))和N-丁二酰亞胺基4-甲基_4-[2-(5_硝基吡 啶基)二硫代]戊酸酯(SMNP)(參見，例如美國專利號(hào)4，563，304)。用于本發(fā)明組合物的 最優(yōu)選的連接子分子為SPP、SMCC和SPDB。其它合適的連接子可以包括“非可切割性”鍵，例如但不限于磺酸丁二酰亞胺基 馬來酰亞胺基甲基環(huán)己烷甲酸酯(SMCC)，其為能夠?qū)⒒衔锱c含SH化合物連接的異雙官 能連接子。雙官能連接子分子和異雙官能連接子分子，例如針對(duì)糖的異雙官能連接子分子 (例如S- (2-硫代吡啶基)-L-半胱氨酸酰胼(TPCH))，也在本發(fā)明范圍內(nèi)(Vogel，2004)。例 如類美登素等效應(yīng)分子可以經(jīng)由兩步反應(yīng)法綴合至靶向抗體，所述兩步反應(yīng)法包括第一 步，將靶向抗體用交聯(lián)劑(例如N-丁二酰亞胺基吡啶基二硫代丙酸酯(SPDP))修飾，以向 所述靶向抗體引入二硫代吡啶基。在第二步中，可以將具有巰基的反應(yīng)性類美登素(例如 DMl)加入經(jīng)修飾的抗體，從而引起在所述經(jīng)修飾的抗體中硫代吡啶基的置換和二硫鍵連接 的細(xì)胞毒性類美登素/抗體綴合物的產(chǎn)生(美國專利5，208，020)。然而，一步綴合法，例如 在Chari等的美國專利公開20030055226中描述的方法，也在本發(fā)明范圍內(nèi)。在本發(fā)明的 一種實(shí)施方式中，將同類或不同類的多種效應(yīng)分子與靶向抗體相連?？梢越?jīng)由例如美國專利6，716，821中所述的PEG連接基團(tuán)，將CC-1065類似物或 衍生物綴合至所述靶向劑?？ɡ锲婷顾乜梢越?jīng)由連接子綴合至靶向抗體(美國專利5，877，296和美國專利 5，773，001)，或根據(jù)美國專利5，712，374和美國專利5，714，586中公開的綴合方法綴合至 靶向抗體。用于制備卡里奇霉素綴合物的另一優(yōu)選方法記載于美國專利公開20040082764。 本發(fā)明的免疫綴合物可以采用重組融合蛋白的形式。術(shù)語“序列同一性”是指對(duì)核苷酸序列或氨基酸序列同一性的量度。通常，比對(duì)所 述序列，從而獲得最高量級(jí)的匹配?！巴恍浴北旧碓诒绢I(lǐng)域具有公知的含義，并且可以使用 已公開的技術(shù)計(jì)算(參見，例如 Computational Molecular Biology,Lesk,Α. Μ.編，Oxford University Press, New York,1988 ；Biocomputing Informatics and Genome Projects, Smith,D. W.編，Academic Press,New York, 1993 ；Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M.禾口 Griffin, H. G.編，Humana Press, New Jersey, 1994 ；Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G. , Academic Press,1987 ；禾口 Sequence Analysis Primer,Gribskov,M. and Devereux,J.編，M Stockton Press,New York,1991)。 盡管存在許多測定兩個(gè)多核苷酸或多肽序列之間同一性的方法，術(shù)語“同一性”對(duì)本領(lǐng)域技 術(shù)人員而言是公知的(CariIlo, H. & Lipton, D. , SIAM J Applied Math 48:1073(1988))。
任何特定的核酸分子是否與例如ΠΒΤ062核酸序列或其一部分具有至少50%、 60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98% 或 99% 的同一性，可以如下常規(guī) 確定使用已知的計(jì)算機(jī)程序例如DNAsis軟件(Hitachi Software, San Bruno，Calif.)進(jìn) 行初始序列比對(duì)，然后使用ESEE3. 0版DNA/蛋白質(zhì)序列軟件(cabotOtrog. mbb. sfu. ca)進(jìn) 行多重序列比對(duì)。氨基酸序列是否與例如SEQ ID NO :1或SEQ ID NO 2或其一部分具有至少50%、 60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%，96%、97%、98%或 99% 的同一性，能夠使用已知 的計(jì)算機(jī)程序例如 BESTFIT 程序(Wisconsin Sequence Analysis Package，Unix 用第 8 版，Genetics Computer Group,University Research Park,575 Science Drive,Madison, Wis. 53711)而常規(guī)地確定。BESTFIT 使用 Smith 和 Waterman，Advances in Applied Mathematics 2 =482-489(1981)的局部同源性算法，來尋找兩個(gè)序列之間同源性最高的片 段。當(dāng)使用DNAsis、ESEE, BESTFIT或任何其它序列比對(duì)程序來確定特定序列是否與 本發(fā)明的參照序列具有例如95%同一性時(shí)，將參數(shù)設(shè)置如下在參照核酸或氨基酸序列的 全長上計(jì)算同一性百分比，允許同源性中間隔(gap)至多為參照序列中核苷酸總數(shù)的5%。在本發(fā)明的背景下，如果提及與特定序列的殘基組合的序列同一性，則該序列同 一性涉及所指定的所有殘基的總和?；究贵w分子為雙官能結(jié)構(gòu)，其中可變區(qū)與抗原結(jié)合，而剩下的恒定區(qū)可以引起 非抗原依賴性響應(yīng)。大多數(shù)抗體類型(IgA、IgD、IgE、IgG和IgM)由恒定區(qū)確定。這些類 型可以進(jìn)一步分成亞類(同型)。例如，IgG類具有四種同型，即根據(jù)恒定區(qū)確定的IgGl、 IgG2、IgG3、和IgG4。各種人類抗體類型中，已知僅人類IgGl、IgG2、IgG3和IgM有效地激 活補(bǔ)體系統(tǒng)。盡管恒定區(qū)不形成抗原結(jié)合位點(diǎn)，恒定區(qū)和鉸鏈區(qū)的排布可以對(duì)所述分子賦 予片段柔性，這使其可與抗原結(jié)合。不同的IgG同型能夠與例如單核細(xì)胞、B細(xì)胞和NK細(xì)胞等細(xì)胞上的Fc受體結(jié)合， 從而激活細(xì)胞以釋放細(xì)胞因子。不同的同型還可以激活補(bǔ)體，導(dǎo)致局部或系統(tǒng)性炎癥。特別 是，不同的IgG同型可以以不同的程度結(jié)合Fc y R0 Fc Y R為一組屬于Ig超家族的表面糖蛋 白，主要在白細(xì)胞上表達(dá)。將Fc γ R糖蛋白分成三類，稱為Fc γ RI (⑶64) ,FcyRII (⑶32)和 FcyRIII(CD16)0盡管IgGl、IgG2和IgG3與各種此類Fc γ R糖蛋白強(qiáng)烈地結(jié)合，IgG4顯 示出弱得多的結(jié)合。具體而言，化64為？(^1 1的中間體結(jié)合劑，其產(chǎn)生相對(duì)低的ADCC(抗 體依賴性細(xì)胞毒性)甚至不產(chǎn)生ADCC，并且不與Fc γ RIIIA或Fc γ RIIA結(jié)合。IgG4也是 Fc y RIIB的弱結(jié)合劑，所述Fc y RIIB為抑制性受體。此外，IgG4僅介導(dǎo)微弱的補(bǔ)體固定或 不介導(dǎo)補(bǔ)體固定，具有微弱的補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)或不具有CDC。在本發(fā)明的背景 下，IgG4可以具體用于預(yù)防Fc介導(dǎo)的肝FcR靶向，這是因?yàn)槠錄]有顯示出與LSEC(肝竇狀 內(nèi)皮細(xì)胞)上的FcR γ II的相互作用，還顯示出與Kupffer細(xì)胞(巨噬細(xì)胞)上的FcRy I III無相互作用或具有弱相互作用，并且與肝NK細(xì)胞上的FcR γ III無相互作用。進(jìn)一步降 低任何⑶C的某些突變也是本發(fā)明的一部分。例如在327、330和331位的IgG4殘基顯示 出ADCC (抗體依賴性細(xì)胞毒性)和CDC的降低(Amour, 1999 ；Shields, 2001)。使抗體穩(wěn)定 化的多種突變之一也是本發(fā)明的一部分(本文也稱為“穩(wěn)定化突變”)。這些突變特別包括 IgG4的CH2區(qū)中的亮氨酸突變成谷氨酸，和IgG4鉸鏈核心中的絲氨酸交換為脯氨酸。在
15本發(fā)明的某些實(shí)施方式中，這些突變使半分子(half-molecule)的量減少至小于10%、小 于5%且優(yōu)選小于2%或1%。此外，如此穩(wěn)定化的抗體的體內(nèi)半衰期可以增加幾天，包括1 天、2天、3天、4天和超過5天(Schuurman，1999)。本文所述的包括靶向抗體、特別是基因工程靶向抗體等靶向劑，還可以根據(jù)它們 與抗原、特別是CD138的結(jié)合親和力來描述或說明。例如靶向抗體、特別是基因工程靶向抗 體等靶向劑的優(yōu)選結(jié)合親和力的特征在于，解離常數(shù)K11(IiM)小于1. 6、小于1. 5或約為1. 4 或小于1.4。對(duì)于包含如靶向抗體等所述靶向劑的免疫綴合物而言，解離常數(shù)K11(IiM)優(yōu)選 小于1. 6、小于1. 5或小于2. 5、小于2. 4、小于2. 3、小于2. 2、小于2. 1、小于2. 0、小于1. 9 或約為1.9。本發(fā)明的抗原結(jié)合區(qū)(ABR)會(huì)基于所用的靶向抗體或基因工程靶向抗體的類型 而變化。在天然存在的抗體中和在大多數(shù)嵌合抗體和人源化抗體中，抗原結(jié)合區(qū)由重鏈的 前兩個(gè)結(jié)構(gòu)域和輕鏈組成。然而，在沒有輕鏈的重鏈抗體中，抗原結(jié)合區(qū)僅由例如重鏈的 前兩個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，而在將抗體分子的輕鏈和重鏈可變區(qū)合并于單個(gè)多肽鏈中的輕鏈抗體 (ScFv)中時(shí)，ABR僅由一個(gè)多肽分子提供。FAB片段通常通過木瓜蛋白酶消化而獲得，并且 具有一條輕鏈和重鏈的一部分，因此包含僅具有一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的ABR。另一方面，雙鏈 抗體為具有兩個(gè)抗原結(jié)合區(qū)的小的抗體片段。然而，在本發(fā)明的背景下，靶向抗體或基因工 程靶向抗體的抗原結(jié)合區(qū)為任何主要決定靶向抗體或基因工程靶向抗體的結(jié)合特異性的 區(qū)域。如果據(jù)稱ABR或另一靶向抗體區(qū)“出自某種抗體”，例如人類或非人類抗體，這是 指在本發(fā)明的背景下ABR或者與相應(yīng)的天然存在的ABR相同，或者基于該相應(yīng)的天然存在 的ABR。如果ABR具有天然存在的ABR的結(jié)合特異性，則該ABR基于天然存在的ABR。然而， 此類ABR可以包含例如點(diǎn)突變、添加、缺失或例如糖基化等翻譯后修飾。特別地，此類ABR可 以與天然存在的ABR的序列具有超過70 %、超過80 %、超過90 %、優(yōu)選超過95 %、超過98 % 或超過99%的序列同一性。在本發(fā)明的背景下，靶向劑(例如靶向抗體，特別是包含靶向抗體的免疫綴合物) 的均勻靶向(homogenous targeting)是對(duì)與用該靶向劑獲得所述靶向的期望結(jié)果相關(guān)的 差異的量度。在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中，所期望的結(jié)果通過與靶標(biāo)的簡單結(jié)合而獲得。 即，例如，其中某種靶向劑提供抵抗隨后結(jié)合的防護(hù)的實(shí)施方式的情況。然而，靶向劑的均 勻性(homogeneity)可以通過例如包含所述靶向劑的免疫綴合物的效力而容易地估算。例 如，所述免疫綴合物針對(duì)例如CD138等腫瘤抗原(該腫瘤抗原包含旨在破壞腫瘤細(xì)胞和/ 或使腫瘤生長停滯的效應(yīng)子)的效力可以通過包含表達(dá)CD138抗原的細(xì)胞的腫瘤的生長抑 制程度而確定。此類免疫綴合物可以在其效力方面顯示出較高的差異。例如，有時(shí)其可以以 高效力使腫瘤生長停滯，但其它時(shí)候該效力很難超過對(duì)照的效力。另一方面，免疫綴合物在 效力方面的較低 異，顯示出免疫綴合物和/或靶向劑分別一致地提供所期望的結(jié)果。一 種靶向均勻性定量方法為計(jì)算靶向差異(targeting variation) 0在包含某種靶向劑的免 疫綴合物使腫瘤生長停滯的情況下，靶向差異可以如下計(jì)算首先確定腫瘤達(dá)到預(yù)定體積 (例如300mm3)的時(shí)間。優(yōu)選地，選擇預(yù)定體積從而使在達(dá)到所述預(yù)定體積之前和之后的任 何腫瘤生長均以大致相同的速率穩(wěn)定地增加。在對(duì)于一組受試對(duì)象已經(jīng)確定所述時(shí)間后， 計(jì)算受試對(duì)象組(例如，SCID小鼠或顯示均勻腫瘤生長的另一合適的模型)中這些時(shí)間的平均值(Tm)。然后將Tm與觀察值相關(guān)聯(lián)，所述觀察值獲自顯示出最低靶向效力并因此與達(dá) 到所述預(yù)定體積所需時(shí)間(Tf)最少的腫瘤相關(guān)的組內(nèi)受試對(duì)象，并在另一方面，獲自顯示 出最高靶向效力并因此與達(dá)到所述預(yù)定體積所需時(shí)間(Ts)最多的腫瘤有關(guān)的組內(nèi)受試對(duì) 象，所述相關(guān)性通過根據(jù)下式計(jì)算預(yù)定體積的靶向差異而獲得靶向差異[%] = Ts-Tf/TmX 100在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明的基因工程靶向抗體的靶向差異小于150%、小于 140%、小于130%、小于120%、小于110%、小于100%、小于90%、小于80%、小于70%、小 于60%或小于50%，在某些實(shí)施方式中甚至小于45%。優(yōu)選地，所述靶向差異為約10% 約150%，優(yōu)選約10% 約100%、約10% 約80%、約10% 約70%、約10% 約60%、 約10% 約50%。靶向的均勻性(本文還稱為對(duì)特定抗原的結(jié)合均勻性)還可以通過其它手段(例 如確定腫瘤生長延遲)而定量。另外，本領(lǐng)域技術(shù)人員易于理解，特定尺寸的腫瘤體積僅僅 是一個(gè)可以基于其而確定靶向差異的參數(shù)。根據(jù)所期望的結(jié)果，可以使用其它參數(shù)，包括時(shí) 間(例如根據(jù)腫瘤生長延遲的時(shí)間)或結(jié)合百分比(％)。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠容易地確 定這些其它參數(shù)。nBT062(也參見圖1)為小鼠人類嵌合IgG4 mAb，為B_B4的一種嵌合形式。創(chuàng)造 該嵌合形式的B-B4來降低HAMA(人類抗小鼠抗體)響應(yīng)，同時(shí)維持B-B4的抗體結(jié)合區(qū)對(duì) CD138的功能。令人驚奇的是，發(fā)現(xiàn)該嵌合抗體相對(duì)于B-B4展示出改善的結(jié)合親和力。還 令人驚奇的是，該嵌合抗體與均勻靶向有關(guān)，而均勻靶向在使用所述抗體或包含該抗體的 免疫綴合物時(shí)減小了所獲結(jié)果中的差異。以下描述用于產(chǎn)生ΠΒΤ062的方案。表達(dá)ΠΒΤ062 的中國倉鼠卵巢細(xì)胞已經(jīng)于2007年12月11日保藏于DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1, D-38124 Braunschweig。 識(shí)別號(hào)為DSM ACC2875?；贐-B4的CD138特異性嵌合抗體在本文通稱為c_B_B4。已從nBT062用核苷酸序列的翻譯物預(yù)測了重鏈和輕鏈的氨基酸序列。重鏈和輕 鏈的預(yù)測氨基酸序列如表1所示。預(yù)測的可變區(qū)用粗體標(biāo)出，預(yù)測的CDR用下劃線標(biāo)出。表1. nBT062的預(yù)測的氨基酸序列ΠΒΤ062 重鏈預(yù)測序列(SEQ ID NO 1)
權(quán)利要求
一種識(shí)別CD138的基因工程靶向抗體，所述基因工程靶向抗體包含抗CD138抗原結(jié)合區(qū)(ABR)，其中所述抗原結(jié)合區(qū)出自非人類抗體，和另外的抗體區(qū)，其中所述另外的抗體區(qū)的至少一部分出自人類抗體，其中所述基因工程靶向抗體(a)以比所述非人類抗體的結(jié)合親和力更高的結(jié)合親和力與CD138結(jié)合；和/或(b)提供表達(dá)CD138的細(xì)胞與CD138的均勻結(jié)合。
2.如權(quán)利要求1所述的基因工程靶向抗體，其中所述另外的抗體區(qū)為至少一個(gè)包含出 自人類抗體的重鏈恒定區(qū)或其一部分的恒定區(qū)，并且其中所述基因工程抗體出自IgG4同型。
3.如權(quán)利要求2所述的基因工程靶向抗體，其中所述抗體以比所述非人類抗體的結(jié)合 親和力更高的結(jié)合親和力與CD138結(jié)合。
4.如權(quán)利要求2所述的基因工程靶向抗體，其中所述抗體提供表達(dá)CD138的細(xì)胞與 ⑶138的均勻結(jié)合。
5.如權(quán)利要求4所述的基因工程靶向抗體，其中所述基因工程靶向抗體與CD138結(jié)合 的靶向差異小于150%、小于140%、小于130%、小于120%、小于110%、小于100%、小于 90%、小于80%、小于70%、小于60%或小于50%。
6.如權(quán)利要求1或2所述的基因工程靶向抗體，其中所述ABR分別包含(a)包含SEQID NO 1的氨基酸殘基99 111的重鏈可變區(qū)⑶R3，和(b)包含SEQID NO 2的氨基酸殘基89 97的輕鏈可變區(qū)⑶R3。
7.如權(quán)利要求6所述的基因工程靶向抗體，其中所述ABR還分別包含(a)包含SEQID NO 1的氨基酸殘基31 35和51 68的重鏈可變區(qū)⑶R1和⑶R2， 和/或(b)包含SEQID NO 2的氨基酸殘基24 34和50 56的輕鏈可變區(qū)⑶R1和⑶R2。
8.如權(quán)利要求6所述的基因工程靶向抗體，其中所述另外的抗體區(qū)分別包含(a)SEQ ID NO 1的氨基酸殘基123 448，和/或(b)SEQ ID NO 2的氨基酸殘基108 214， 以及其突變體，所述(a)和/或(b)及其突變體(i)維持或降低所述基因工程靶向抗體的抗體依賴性細(xì)胞毒性和/或補(bǔ)體依賴性細(xì)胞 毒性，和/或(ii)穩(wěn)定所述基因工程靶向抗體。
9.如權(quán)利要求1或2所述的基因工程靶向抗體，其中所述非人類抗體的所述抗原結(jié)合 區(qū)出自小鼠抗體。
10.如權(quán)利要求1或2所述的基因工程靶向抗體，其中所述基因工程靶向抗體為嵌合抗 體，并且所述非人類抗體為B-B4。
11.如權(quán)利要求3所述的基因工程靶向抗體，其中所述基因工程靶向抗體包含至少一 條重鏈和至少一條輕鏈，并且其中(a)所述重鏈與SEQID N0:1具有至少約70%序列同一性；和/或(b)所述輕鏈與SEQID NO 2具有至少約70%序列同一性。
12.如權(quán)利要求8所述的基因工程靶向抗體，其中2(a)所述重鏈與SEQID NO 1具有至少約90%序列同一性；和(b)所述輕鏈與SEQID NO 2具有至少約90%序列同一性。
13.如權(quán)利要求1或2所述的基因工程靶向抗體，其中所述ABR基本上由非人類抗體的 ABR組成。
14.一種藥物組合物，所述藥物組合物包含權(quán)利要求1或2所述的抗體和藥物可接受載劑。
15.一種雜交瘤，所述雜交瘤產(chǎn)生權(quán)利要求1或2所述的抗體。
16.一種基于抗體的測試，所述測試包含權(quán)利要求1或2所述的抗體。
17.一種分離的多肽，所述分離的多肽包含免疫球蛋白重鏈或其一部分的氨基酸序列， 其中所述免疫球蛋白重鏈或其一部分與SEQ ID NO :1具有至少70%、至少80%、至少90%、 至少95%或至少98%序列同一性，其中包含所述免疫球蛋白重鏈或其一部分的靶向劑靶 向 CD138。
18.如權(quán)利要求17所述的分離的多肽，其中所述免疫球蛋白重鏈或其一部分的恒定區(qū) 為IgG4同型的恒定區(qū)。
19.如權(quán)利要求17所述的分離的多肽，其中所述靶向劑為小鼠人類嵌合抗體。
20.如權(quán)利要求17所述的分離的多肽，其中所述分離的多肽還包含免疫球蛋白輕鏈 或其一部分的氨基酸序列，其中所述免疫球蛋白輕鏈或其一部分與SEQ ID NO :2具有至少 70%、至少80%、至少90%、至少95%或至少98%序列同一性。
21.如權(quán)利要求17所述的分離的多肽，其中所述免疫球蛋白重鏈與SEQID N0:1的序 列相同。
22.如權(quán)利要求20或21所述的分離的多核苷酸，其中所述免疫球蛋白輕鏈與SEQID NO 2的序列相同。
23.一種用于均勻地結(jié)合⑶138的方法，所述方法包括 提供權(quán)利要求1或2所述的基因工程靶向抗體，和 對(duì)表達(dá)⑶138的細(xì)胞施用所述基因工程靶向抗體，其中所述基因工程靶向抗體均勻地與所述表達(dá)CD138的細(xì)胞上表達(dá)的CD138相結(jié)合。
24.如權(quán)利要求23所述的方法，其中所述基因工程靶向抗體與CD138結(jié)合的靶向差異 小于150%、小于140%、小于130%、小于120%、小于110%、小于100%、小于90%、小于 80%、小于70%、小于60%或小于50%。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種人類小鼠嵌合抗體，所述嵌合抗體基本上保留其小鼠對(duì)應(yīng)物的抗原結(jié)合區(qū)，并且展示出改進(jìn)的對(duì)抗原的結(jié)合親和力和/或?qū)Π屑?xì)胞的更均勻結(jié)合。
文檔編號(hào)C07K16/30GK101952315SQ200880126932
公開日2011年1月19日 申請日期2008年12月23日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月26日
發(fā)明者克里斯托夫·尤爾克, 克里斯托夫·布魯切爾, 埃爾瑪·克勞澤, 弗蘭克·奧斯特羅斯, 斯特芬·岑, 本杰明·德爾肯, 西爾克·艾格納, 馬蒂亞斯·杰默 申請人:生物測試股份公司