專利名稱：一種rna性質egs的化學修飾方法及其在制備抗病毒藥物中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及核酸分子在基因治療領域的應用，具體涉及一種RNA性質 EGS的化學修飾方法及其在制備抗病毒藥物中的應用。
背景技術：
RNaseP是廣泛存在于各種細胞內的一種核蛋白復合體，它可以在體內特 異性的剪切tRNA前體(ptRNA)的5'末端，形成成熟的tRNA。 RNase P具 有識別底物二級結構而非識別底物核苷酸序列這一特點，因此只要兩個RNA 分子形成類似于ptRNA分子結構的復合物，即可被RNase P識別并切割。
能夠引導RNase P識別耙mRNA上的切割位點的RNA分子被稱為外部引 導序列(External Guide S叫uences， EGSs)。理論上說，只要耙mRNA上存在 RNase P潛在的切割位點，那么使用適合的EGS與靶mRNA上潛在的切割位 點互補，即可引導RNase P對復合物中耙mRNA進行特異性切割，從而能夠 沉默靶基因的表達。
EGS分子能夠介導RNase P核酶特異地沉默目的基因的表達，因此EGS 分子成為藥物研發(fā)的熱點。
EGS是一種核酸分子，與RNA干涉分子等一樣要有效地解決其在機體內 的穩(wěn)定性問題，以希望在一定范圍內有效地抑制靶基因的表達，因此尋求一種 能夠提高EGS分子在體內半衰期、而又不影響其活性的策略是非常必要的。
為了提高EGS分子在體內的穩(wěn)定性，磷酸化修飾、甲基化修飾等化學修 飾的方式已經被運用到EGS分子的修飾中，但這些修飾方式存在較大的毒性，同時不能提高體內細胞對核酸分子的吸收。
現(xiàn)有報道對siRNA分子進行膽固醇修飾后可以提高其血清穩(wěn)定性，同時 增加了細胞對其的吸收效率。目前尚未有對EGS分子進行膽固醇修飾的相關 報道。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術的不足，提供一種對RNA性質EGS進行 修飾，且修飾后EGS的血清穩(wěn)定性提高，而基因沉默效率未受影響的化學修 飾方法。
本發(fā)明的另一個目的在于提供上述RNA性質EGS化學修飾方法在制備抗 病毒藥物中的應用。
本發(fā)明的上述目的是通過如下方案予以實現(xiàn)的
一種RNA性質EGS的化學修飾方法，該修飾方法是采用膽固醇對RNA 性質EGS分子進行修飾。
本發(fā)明人分別對RNA性質EGS進行3'末端和5'末端的膽固醇修飾，并 以未修飾的RNA性質EGS分子為對照，采用熒光定量RT-PCR和western blot 等常用試驗方法檢測修飾后RNA性質EGS分子對耙基因的抑制效率，同時測 定修飾后的RNA性質EGS分子血清穩(wěn)定性，結果發(fā)現(xiàn)RNA性質EGS分子的 5'末端進行膽固醇修飾后不僅不會影響EGS的基因沉默活性而且可提高EGS 在血清中的半衰期12倍以上，RNA性質EGS分子的3，末端進行膽固醇修飾 后EGS的基因沉默效率有所降低，因此本發(fā)明采用5'末端為最佳的膽固醇修 飾部位。
根據(jù)靶基因篩選得到RNA性質EGS，通過化學合成方法對該EGS分子的5'末端進行膽固醇修飾，膽固醇修飾后的EGS分子進入機體后直接與靶基 因的核苷酸互補結合，形成被RNaseP核酶識別的底物分子，弓l導RNaseP對 靶基因的RNA進行切割，從而有效沉默該靶基因的表達。
本發(fā)明的一種RNA性質EGS的化學修飾方法可用于制備抗乙肝病毒、丙 肝病毒和人類巨細胞病毒等病毒性疾病的藥物。
與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有如下有益效果
1. 本發(fā)明的化學修飾方法其操作簡單，而且修飾后的RNA性質EGS分子 具有很好的血清穩(wěn)定性，尤其是在RNA性質EGS的5'末端進行膽固醇修飾可 提高EGS在血清中的半衰期12倍以上，從而使得修飾后的EGS能夠在一段 時間內有效抑制靶基因的表達；
2. 本發(fā)明采用膽固醇修飾，從而使得被修飾的RNA性質EGS分子可以 更加容易地透過細胞到達耙基因上，再加上RNaseP核酶對靶基因RNA的切 割是不可逆的，所以可以實現(xiàn)對特定耐藥基因的破壞；
3. 本發(fā)明在對RNA性質EGS進行膽固醇修飾后并不會影響EGS的沉默 基因效率，因此對于各種可采用EGS制備藥物進行治療的疾病，都可采用本 發(fā)明的方法對其所用EGS進行化學修飾，故而本發(fā)明的方法可用于治療各種 疾病的藥物研發(fā)和制備，尤其是病毒性疾病的藥物研發(fā)和生產，適于大規(guī)模的 醫(yī)藥學推廣。


圖1為熒光定量RT-PCR檢測未被修飾RNA性質EGS對UL49基因mRNA 的抑制作用柱狀圖2為熒光定量RT-PCR檢測3'末端膽固醇修飾RNA性質EGS對UL49基因mRNA的抑制作用柱狀圖3為熒光定量RT-PCR檢測5'末端膽固醇修飾RNA性質EGS對UL49 基因mRNA的抑制作用柱狀圖4為Western blot檢測未被修飾RNA性質EGS對UL49基因蛋白表達 的抑制結果電泳圖5為Western blot檢測3'末端膽固醇修飾RNA性質EGS對UL49基因 蛋白表達的抑制結果電泳圖6為Western blot檢測5'末端膽固醇修飾RNA性質EGS對UL49基因 蛋白表達的抑制結果電泳圖7為膽固醇修飾RNA性質EGS血清穩(wěn)定性實驗電泳其中，l為轉染試劑對照組，2為未被修飾RNA性質EGS對照組，3為 突變對照組，4為無義對照組，5為陽性對照組，6為Hela對照組，7為3，末 端膽固醇修飾RNA修飾EGS實驗組，8為5'末端膽固醇修飾RNA性質EGS 實驗組。
具體實施例方式
以下結合實施例對本發(fā)明做進一步的說明，但具體實施例并不對本發(fā)明做 任何限定。
實施例l RNA性質EGS分子的膽固醇修飾
在現(xiàn)有的已公開EGS分子中，隨意選擇一種RNA性質的EGS分子，本 實施例選擇能有沉默UL49基因的一種RNA性質的EGS分子，然后送交合成 公司，分別合成在該EGS的3'末端加膽固醇和在該EGS分子5'末端加膽固醇 這兩組實驗組，同時合成未做任何修飾的該EGS分子作為對照組。實施例2 建立鑒定EGS作用效率的平臺
本實施例先利用載體克隆UL49基因，然后構建可穩(wěn)定表達UL49的細胞系，實施例中所用載體、細胞系、酶以及各種試劑等均為市售產品，如載體可選擇pcDNA3.1(+)/myc質粒，細胞系可選擇Hela細胞系，雙酶切可采用B"m///禾口勘/等。
1、 UL49基因的獲得
從已知序列基因組中PCR擴增出UL49基因，如可選擇從AD169病毒株基因組中PCR擴增UL49基因。
PCR反應體系總體積為100 u 1: LA Taq酶1 u 1，反應buffer 50 u 1， AD169基因組DNA模板5p1， UL49上游引物(核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示)5 ul， UL49下游引物(核苷酸序列如SEQ ID NO: 2所示)5 u 1，用滅菌蒸餾水補充至100 ul。
PCR反應條件先95。C預處理3min，然后95°C 30 s， 60°C 45s， 72°C45s，共30個循環(huán)，再72。C 5min， 4°C 10min。
瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR結果后，凝膠回收純化UL49基因片段，這里的操作參考試劑盒說明書即可。
2、 構建pcDNA3.l-UL49-myc質粒
接種保存pcDNA3.1(+)/myc質粒的菌株并擴大培養(yǎng)后，采用市售質粒抽提試劑盒，按照試劑盒說明抽提pcDNA3.1(+)/myc質粒。
分別對上述pcDNA3.1(+)/myc質粒和UL49基因進行Baw///禾Q J^o /雙酶切，然后用T4 DNA連接酶連接UL49和pcDNA3.1(+)/myc載體的雙酶切片段，接著將DNA連接液轉化到DH5a大腸桿菌宿主菌中，在Amp+培養(yǎng)基挑克隆，并用PCR方法和&m/// 、 ^T7o/雙酶切鑒定重組子，測序結果說明已成功構建pcDNA3.1-UL49-myc質粒。這里所涉及的雙酶切、感受態(tài)細胞的制備、T4連接、連接液轉化大腸桿菌DH5 a以及PCR鑒定和雙酶切鑒定等試驗
均采用本領域人員所共知的通用方法。
3、穩(wěn)定表達UL49的HeLa細胞系的建立
本實施例根據(jù)pcDNA3.1 (+)/myc質粒商品操作指南構建穩(wěn)定表達UL49的Hda細胞系，作為驗證EGS基因沉默效率的平臺。
a. 將生長狀態(tài)良好的Hda細胞轉移到24孔板中，用無血清無抗生素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，在孔板中的細胞長到50~80%后開始進行轉染；
b. 取3 li g上述pcDNA3.1-UL49-myc質粒，12 u 1轉染試劑PlusReagent和3 y 1脂質體LipofectamineTMReagent，全部溶于400 U 1無血清無抗生素DMEM培養(yǎng)基中得到混合液；
c. 用無血清無抗生素DMEM清洗孔板中的Hda細胞，然后將上述混合液已每孔400 P 1的量加到孔板上，加樣完畢37。C處理5小時；
d. 洗去脂質體，加入完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)；
e. 轉染48小時之后，往上述培養(yǎng)基中添加G418 (G418的濃度為800mg/ml)，三周后挑選具有抗G418的細胞擴大培養(yǎng)，培養(yǎng)基中添加200mg/ml的G418作為維持穩(wěn)定表達細胞培養(yǎng)之用。
實施例3 EGS沉默UL49基因表達
l.將實施例2得到的穩(wěn)定表達UL49的Hda細胞系在37°C、5% C02的條件下置于DMEM培養(yǎng)基(含100mg/ml青霉素、lOOmg/ml鏈霉素和200ml/mlG418)中培養(yǎng)；2. 轉染試劑采用市售Lipofectamine2000，按試劑盒操作指南，將實施例1制備的3'末端膽固醇修飾RNA性質EGS、 5'末端膽固醇修飾RNA性質EGS和未做任何修飾的RNA性質EGS都以終濃度為2.5nM轉染上述Hela細胞。
3. 熒光定量RT-PCR檢測RNA性質EGS對UL49基因mRNA的抑制作
用
轉染EGS 24小時后，收集細胞進行RNA抽提，RNA抽提可采用Invitrogen公司的TRizol法，詳細的操作按說明書進行。
利用Applied Biosystem's 7300系統(tǒng)進行熒光定量RT-PCR檢測EGS對UL49基因mRNA的抑制作用，具體實驗步驟如下
a. 先根據(jù)反轉錄試劑盒的操作說明，將上述TRizol法抽提的RNA進行反轉錄得到cDNA;
b. 采用TAKARA公司的SYBR熒光染料的定量PCR試劑盒(含ROX);UL49基因的上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO: 3所示；
UL49基因的下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO: 4所示；內參(3-actin的上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO: 5所示；內參P-actin的下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO: 6所示；熒光定量PCR的反應體系以及反應條件均可參考試劑盒中的操作說明。熒光定量RT-PCR檢測EGS對UL49基因mRNA的抑制作用，其結果可以通過圖l、圖2和圖3看出，5'末端膽固醇修飾RNA性質EGS和未做任何修飾的RNA性質EGS對mRNA的抑制作用非常顯著，在未被修飾的EGS作用下mRNA下降98%，在3'末端膽固醇修飾的RNA性質EGS作用下mRNA下降8%，在5'末端膽固醇修飾的RNA性質EGS作用下mRNA下降98%，由此可得出5'末端膽固醇修飾的RNA性質EGS并不會影響EGS對靶基因 mRNA的抑制作用。
4. Western blot檢測RNA性質EGS對UL49基因蛋白表達的抑制作用
轉染EGS 24小時之后收集Hela細胞作為蛋白樣品，并用PBS沖洗蛋白 樣品，然后將蛋白樣品和4X上樣緩沖液以3:1的體積比混合后，IO(TC水中煮 沸5min使蛋白質變性。
采用Bio-Rad公司的微型垂直板電泳裝置制備凝膠，按說明書安裝好玻璃 板，并依次配制12%分離膠和5%濃縮膠制得凝膠板。凝膠板放入電泳槽后將 上述蛋白樣品點樣于凝膠板上，120V恒壓跑電泳，約90min后結束，接著參 照分子克隆指南的操作說明對該凝膠進行轉膜，恒壓15V，電轉移30min。
對轉移好的膜進行封閉以及抗原抗體反應均可參考教科書以及相關試劑 盒的操作說明進行，抗原抗體反應中， 一抗溶液為山羊抗myc IgG和山羊抗 Actin IgG，都用封閉液作1:500 (體積比)的稀釋， 一抗溶液的用量至少為 0.1ml/cm"莫面積，第二抗體采用辣根過氧化物酶標記?？股窖騃gG，并用封閉 液作1:4000 (體積比)的稀釋，二抗的用量也為0.1ml/cn^膜面積。
按照本領域通用做法對上述抗原抗體反應的結果進行發(fā)光顯影，如圖4、 圖5和圖6所示，5'末端膽固醇修飾RNA性質EGS和未做任何修飾的RNA 性質EGS對UL49基因的表達抑制作用非常顯著，在UL49基因蛋白處均未 有條帶顯示，在未被修飾的RNA性質EGS作用下蛋白水平下降99。/。，在3' 末端膽固醇修飾的RNA性質EGS作用下蛋白水平下降8°/。，在5'末端膽固醇 修飾的RNA性質EGS作用下蛋白水平下降99%，由此可見，對RNA性質EGS 的5'末端進行膽固醇修飾并不會影響EGS對靶基因蛋白表達的抑制作用。實施例4膽固醇修飾對EGS穩(wěn)定性的影響
根據(jù)實施例3的檢測結果，對RNA性質EGS進行膽固醇修飾的最佳位點 是EGS的5'末端，因此本實施例對實施例1制備的5'末端膽固醇修飾RNA 性質EGS和未被修飾RNA性質EGS進行血清穩(wěn)定性的測試。
本實施例采用T4 RNA連接酶將同位素P32分別標記到未被修飾RNA性 質EGS和5'末端膽固醇修飾RNA性質EGS中，T4RNA連接酶和同位素P32 均為市售，試驗操作可參考試劑說明進行。
將上述標記好的EGS分子分別加入到含15體積％小牛血清的DMEM培 養(yǎng)基中37。C孵育，分別在孵育到O、 2、 4、 8、 16、 24、 32、 40小時時，取出 樣品進行SDS電泳，SDS電泳的操作按照本領域的常規(guī)方法即可，然后將跑 好的SDS膠放射自顯影，測定各時間段殘留的RNA，結果如圖7所示，未修 飾的EGS在2小時后檢測不到殘留，5末端膽固醇修飾后的EGS在24小時后 仍能檢測到EGS殘留，由此說明RNA性質的EGS在采用本發(fā)明的膽固醇修 飾方法修飾后，其血清穩(wěn)定性得到了顯著的提高。一種RNA性質EGS的化學修飾方法及其在制備抗病毒藥物中的應用序列表 SEQUENCE LISTING
<110>暨南大學
<120〉一種RNA性質EGS的化學修飾方法及其在制備抗病毒藥物中的應用
<130〉
<160〉6
<170〉Patentln version 3.5
<210〉1
<211>37
<212>腿
〈213〉人工序列
〈400>1
aggcgaattc gccaccatgg ccagtcgtcg tctccga<210〉2
<211>27
<212>腿
〈213〉人工序列
<400>2
cggctcgagg acatggggca ggccgtg<210>3
<211>20
〈212〉眺
〈213〉人工序列
<400>3
cgttcttgcg tcct"tcatct<210>4
<211〉21
<212〉腿
<213〉人工序列
<400>4
cacaaagtag ggcttggtca t<210〉5
〈211〉23
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉 5
tcgtccaccg caaatgcttc tag 23
<210> 6
〈211〉 23
<212> DNA <213>人工序列
<400> 5
actgctgtca ccttcaccgt tec 23
1權利要求
1、一種RNA性質EGS的化學修飾方法，其特征在于該修飾方法是采用膽固醇對RNA性質EGS分子進行修飾。
2、 根據(jù)權利要求1所述化學修飾方法，其特征在于該修飾方法是對RNA 性質EGS的5'末端進行膽固醇修飾。
3、 權利要求1所述化學修飾方法在制備抗病毒性疾病藥物中的應用。
4、 根據(jù)權利要求3所述應用，其特征在于所述抗病毒性疾病藥物是抗乙 肝病毒藥物、抗丙肝病毒藥物或抗人類巨細胞病毒藥物。
全文摘要
本發(fā)明公開一種RNA性質EGS的化學修飾方法，該修飾方法是采用膽固醇對RNA性質的EGS分子進行修飾，優(yōu)選RNA性質EGS的5’末端為最佳的膽固醇修飾部位。本發(fā)明可用于制備抗乙肝病毒、丙肝病毒和人類巨細胞病毒等病毒性疾病的藥物。本發(fā)明操作簡單，且修飾后的EGS分子不但具有很好的血清穩(wěn)定性而且沉默基因效率并未受影響，對于各種可采用RNA性質EGS制備藥物進行治療的疾病，都可采用本發(fā)明的方法對其所用EGS進行化學修飾，故而本發(fā)明的方法可用于治療各種疾病的藥物研發(fā)和制備，適于大規(guī)模的醫(yī)藥學推廣。
文檔編號C07H21/00GK101463057SQ20091003659
公開日2009年6月24日 申請日期2009年1月13日 優(yōu)先權日2009年1月13日
發(fā)明者周天鴻, 曾志鋒, 李弘劍, 李月琴, 奕 鄒 申請人:暨南大學