專利名稱：一種快速誘導提取豬肝金屬硫蛋白的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及金屬硫蛋白的制取方法，更具體涉及一種快速誘導豬肝金屬硫 蛋白的方法。
背景技術(shù)：
金屬硫蛋白(MT)具有強烈的消除自由基的作用，可作為營養(yǎng)添加劑單獨 使用或與谷胱甘肽(GSH)、維生素C (VC)、維生素E (VE)等配合使用，能 夠有效地抑制脂質(zhì)過氧化損傷、保護細胞、降低血液粘度、改善血液循環(huán)和提 髙機體免疫等多種生物學功能。金屬硫蛋白還可以作為一種抗氧化劑使用，防 止食品或詞料氧化變質(zhì)。另外，金屬硫蛋白能與許多金屬離子結(jié)合，參與機體 金屬代謝調(diào)節(jié)，平衡機體金屬離子穩(wěn)態(tài)，參與金屬離子運轉(zhuǎn)與排泄，對礦物質(zhì) 營養(yǎng)起著重要作用。金屬硫蛋白作為保健、防護以及美容化妝品的添加劑和某 些疾病的治療藥物在醫(yī)學、食品加工、營養(yǎng)學等各個領(lǐng)域業(yè)己廣泛應(yīng)用。
含有鋅的金屬硫蛋白(Zn-MT)是一種正四面體金屬巰基螯合族，結(jié)晶構(gòu) 相相當穩(wěn)定，但它仍可通過提供Zn而激活許多以Zn為輔基的酶。因此開展鋅 誘導金屬硫蛋白合成的研究有著重要的理論價值和廣闊的應(yīng)用前景。
本發(fā)明較已有的豬肝金屬硫蛋白提取方法誘導時間短，采用先口腹再注射 的誘導方法，豬只應(yīng)激小，提取工程較己有的豬肝金屬硫蛋白提取方法減少了 離心的次數(shù)，而誘導提取的金屬硫蛋白含量與己有的方法提取的金屬硫蛋白含 量相當。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就在于克服原有技術(shù)存在的問題和不足，在于提供了一種快 速誘導提取豬肝金屬硫蛋白的方法。采用先口腹再注射的誘導方法，變3次離 心為2次離心，每克豬肝可含金屬硫蛋白8mg左右，與原有技術(shù)誘導提取金屬
硫蛋白量相當。本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的用哺乳豬作為供體，經(jīng)口腹4-6天含有自配 微量元素鋅添加劑的仔豬飼料，然后腹腔注射誘導，2-4次誘導后宰殺，從豬 的肝臟中分離提取一種具有穩(wěn)定性好，純度高的金屬硫蛋白，誘導時間較"一
種豬肝金屬硫蛋白提取方法"縮短三分之一，并且口腹誘導4-6天可以大大緩
解豬的應(yīng)激及其副作用，減少注射誘導的次數(shù)和時間，提取過程簡化，而得率
與"一種豬肝金屬硫蛋白提取方法"相當(專利號為200410013212. X)。更具 成本低，效果好，產(chǎn)量高，誘導劑來源廣，無副作用等特點。且豬是一種飼養(yǎng) 非常普遍的動物，來源廣，金屬硫蛋白可用于人類保健、防輻射、美容、傷口 修復和畜禽飼料抗氧化與抗應(yīng)激效應(yīng)中。經(jīng)誘導提取金屬硫蛋白后，豬肉可照 常供食用。
一種快速誘導提取豬肝金屬硫蛋白的方法，其步驟如下
① 豬肝金屬硫蛋白的誘導
選用健康的小豬關(guān)在籠內(nèi)，用自配的含1500-2500ppm硫酸鋅添加劑的仔 豬飼料飼喂小豬4-6天，再用硫酸鋅(ZnS04)溶液腹腔注射，進行2-4次的劑 量遞增的誘導，每次劑量為50-150mg/kg體重。
采用先口腹鋅，再鋅劑量逐漸遞增的溶液進行腹腔注射誘導，先口腹 1500卯m-2500ppm的鋅，當體內(nèi)鋅濃度大幅度增加時，再注射鋅，可以增強豬 對鋅的耐受性和適應(yīng)性，小豬不會發(fā)生瘁死現(xiàn)象，從而開發(fā)了小豬對MT誘導 合成的潛能，又保證了有充足的時間誘導MT的大量合成。
② 金屬硫蛋白的檢測
誘導完1-3天后屠宰，并將所取新鮮肝臟樣品直接按巰基顯色法對金屬硫 蛋白的含量進行檢測；同時將各樣品冷凍溫度控制在-18°C—一22°C， 10-15 天后取出對金屬硫蛋白含量進行再檢測。要求每lg豬肝中可提取的金屬硫蛋 白》5mg。
③ 粗提
將檢測合格的新鮮豬肝臟搗碎，用Tris-HCl攪拌勻漿，倒入燒杯，再加入 500mLTris-HCl和250mL乙醇-氯仿混合溶液，攪拌8-12分鐘，低溫離心 (10000rZmin， 4°C， 20min)。取上清液于另一離心管，放入78-82。C的水浴鍋內(nèi)水浴4-6min，取出后迅速冷卻至室溫(20°C-25t)，低溫離心(10000r/min， 4°C, 20min)，離心后的上清液即為金屬硫蛋白粗提液，放置于4。C備用。 ④純化
將粗提液經(jīng)超濾濃縮，得濃縮液，在濃縮液中按體積比為l: 3于金屬硫蛋
白粗提液中加入乙醇放置過夜，取沉淀離心(10000r/min， 4'C， 20min)，離 心后的沉淀用O. lmol/L的NH4HC03溶液溶解至3倍體積，濾紙過濾。對濾液進行 S印hedex G-100柱層析，在柱面加入MT顯色試劑(巰基試劑)對MT組分著色； 用O. lmol/LNH4HC03進行洗脫，流速控制20mL/min，每5分鐘收集1管。將收集的 著色部分進行S印harose Fast Flow柱(30咖X300咖)層析，用O. OIM—O. 30 朋03進行梯度洗脫，自動收集器分管收集，每管5ml，紫外254nm監(jiān)控，收集 兩個峰尖部分洗脫液；在冷凍干燥箱中按程序升溫冷凍干燥25小時，所得凍干 粉，即為MT自制純品，含量為95X以上。
分裝
將凍干粉分裝待用。
本發(fā)明具有以下優(yōu)點和積極效果
1、 現(xiàn)有技術(shù)從豬肝中提取金屬硫蛋白是經(jīng)過5次誘導，而本發(fā)明縮短了 誘導時間，由原來的5次縮短成3次，提取合成也優(yōu)化了，由原來的3次低溫 離心優(yōu)化成2次低溫離心。
2、 一般誘導為單一的皮下注射或腹腔注射，因為注射次數(shù)多，不僅操作 繁雜、勞動強度大和成本高，而且豬只的應(yīng)激強度大，易出現(xiàn)誘導液擴散不暢、 堆滯的現(xiàn)象。采用先飼喂再腹腔注射，增強豬只對鋅的耐受性和適應(yīng)性，當鋅 濃度大幅度增加時豬也不會發(fā)生瘁死現(xiàn)象，從而開發(fā)了豬對MT誘導合成的潛 能，又保證了有充足的時間誘導MT的大量合成。
3、 得率高，每克豬肝可含金屬硫蛋白8mg左右；
4、 穩(wěn)定性好，在低溫條件下儲藏時間較長。
5、 本發(fā)明所提取的產(chǎn)品適用于人類保健、防輻射、美容、傷口修復和畜 禽詞料抗氧化與抗應(yīng)激效應(yīng)中。
具體實施例方式
實施例1:一種豬肝金屬硫蛋白的提取方法，其步驟如下
① 豬肝金屬硫蛋白的誘導
選用健康5-10kg左右的商品豬，關(guān)在籠內(nèi)。用含1500-2500ppm鋅添加劑 的自配仔豬飼料飼喂小豬4天或5天或6天，再用ZnS04溶液采用腹腔注射法， 進行2次或3次或4次的劑量遞增的誘導，每次劑量為50-150mg/kg體重。
用配制好的ZnSO,. 7H20溶液采用腹腔注射法進行誘導，每隔一天誘導一次， 共誘導2次或3次或4次，每次劑量分別為50mg/kg、 100mg/kg、 150mg/kg， 累計300mg/kg。
用豬為供體，通過3次誘導后使豬肝內(nèi)所產(chǎn)生的MT的量為7.5mg/g，與5 次誘導的相當，卻減少了豬只的應(yīng)激和因應(yīng)激和溶液擴散慢導致的死亡。
② 檢測
誘導完后第二天屠宰取肝臟，并將所取新鮮肝臟樣品直接按巰基顯色法進
行金屬硫蛋白含量的檢測，同時將各樣品放置-18t:或-19"C或-2(TC或-2rC或 -22"C下冷凍，10天或11天或12天或13天或14天或15天后取出再檢測金屬
硫蛋白含量。
-18"或-19"或-20°(:或-2rC或-22"C下冷凍，10天或11天或12天或13 天或14天或15天后，各處理豬肝中MT的量均有所降低，但各處理下降幅度 不大(P〉0.05)。因此，本發(fā)明認為誘導豬肝MT合成的累計最佳鋅誘導劑量為 330mg/kg，并且低溫條件下金屬硫蛋白較穩(wěn)定，降解較緩慢，適合-4'C以下低
溫保存。
③ 粗提
將檢測合格的新鮮肝臟搗碎，按新鮮豬肝25g用0. 02M Tris-HCl(pH8. 6)50ml攪拌勻漿，低溫離心(10000r/min， 4。C， 20min)，取上 清液于另一離心管；取上清液于另一離心管；放入78。C或79。C或8(TC或8rC 或82"C的鍋內(nèi)水浴4或5或6rain，取出后迅速冷卻至室溫(20_25°C)，再冷凍 離心(10000r/min， 4°C， 20min)，取上清液并將上清液置于半透膜中，用PBS (pH7.4) IO倍體積，透析24小時。半透膜中剩余的溶液即為金屬硫蛋白的粗
6提液，放置于4匸備用。 ④純化
金屬硫蛋白粗提液經(jīng)3倍體積的無水乙醇沉淀，4-C放置過夜，取沉淀離 心(10000r/min， 4°C， 20min)，離心后的沉淀用0. lmol/L的朋4110)3溶液溶 解至3倍體積，濾紙過濾。對濾液進行S印hedex G-100柱層析，在柱面加入 MT顯色試劑(巰基試劑)對MT組分著色；用0. lmol/U^HC03進行洗脫，流速 控制20mL/min，每5分鐘收集l管。將收集的著色部分進行S印harose Fast Flow 柱(30咖X300mm)層析，用0. 01M—0. 30 NH4HC03進行梯度洗脫，自動收集 器分管收集，每管5ml，紫外254nm監(jiān)控，收集兩個峰尖部分洗脫液；在冷凍 干燥箱中按程序升溫冷凍干燥25小時，所得凍干粉，即為MT自制純品，含量 為95%以上。
分裝
按每支25mg分裝。
權(quán)利要求
1、一種快速誘導提取豬肝金屬硫蛋白的方法，其步驟是①、豬肝金屬硫蛋白的誘導選用小豬，用含1500-2500ppm硫酸鋅添加劑的仔豬飼料飼喂小豬4-6天，再用硫酸鋅溶液腹腔注射，進行2-4次的劑量遞增的誘導，每次劑量為50-150mg/kg體重；②、金屬硫蛋白的檢測誘導完1-3天后屠宰，并將所取新鮮肝臟樣品直接按巰基顯色法對金屬硫蛋白的含量進行檢測，同時將各樣品冷凍溫度控制在-18℃——22℃，10-15天后取出對金屬硫蛋白含量進行再檢測，每1g豬肝中提取的金屬硫蛋白≥5mg；③、粗提將檢測合格的新鮮豬肝臟搗碎，用Tris-HCl攪拌勻漿，倒入燒杯，再加入500mLTris-HCl和250mL乙醇-氯仿混合溶液，攪拌8-12分鐘，低溫離心10000r/min，4℃，20min，取上清液于另一離心管，放入78-82℃的水浴鍋內(nèi)水浴4-6min，取出后迅速冷卻至室溫，低溫離心10000r/min，4℃，20min，離心后的上清液為金屬硫蛋白粗提液，放置于4℃?zhèn)溆?；④、純化將粗提液?jīng)超濾濃縮，得濃縮液，在濃縮液中按體積比為1∶3于金屬硫蛋白粗提液中加入乙醇放置過夜，取沉淀離心10000r/min，4℃，20min，離心后的沉淀用0.1mol/L的NH4HCO3溶液溶解至3倍體積，濾紙過濾，對濾液進行Sephedex G-100柱層析，在柱面加入MT顯色試劑對MT組分著色；用0.1mol/LNH4HCO3進行洗脫，流速控制20mL/min，每5分鐘收集1管，將收集的著色進行Sepharose Fast Flow柱層析，用0.01M-0.30NH4HCO3進行梯度洗脫，自動收集器分管收集，每管5ml，紫外254nm監(jiān)控，收集兩個峰尖洗脫液；在冷凍干燥箱中按程序升溫冷凍干燥25小時，所得凍干粉。
2、按權(quán)利要求1所述的一種豬肝金屬硫蛋白的提取方法，其特征在于所 述的小豬選用5-10kg，關(guān)在籠內(nèi)飼喂含2500ppm鋅的飼料，連續(xù)飼喂4_6天， 用配制好的ZnS04.7H20溶液采用腹腔注射法進行誘導，每隔一天誘導一次，共 誘導2-4次，每次劑量分別為50mg/kg、 100mg/kg、 150mg/kg。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種快速誘導豬肝金屬硫蛋白的方法，其步驟是①誘導用鋅添加劑的飼料飼喂小豬，再用ZnSO₄溶液采用腹腔注射法，進行劑量遞增的誘導；②檢測誘導完后屠宰，將所取新鮮肝臟樣品直接按巰基顯色法對金屬硫蛋白的含量進行檢測；③粗提將檢測合格的新鮮豬肝臟搗碎，攪拌勻漿，倒入燒杯，再加入乙醇-氯仿混合溶液，低溫離心，放人水浴鍋內(nèi)水浴，取出后冷卻至室溫，離心后的上清液即為金屬硫蛋白粗提液；④純化將粗提液經(jīng)超濾濃縮，得濃縮液，在濃縮液中加入乙醇放置過夜，取沉淀離心，沉淀，對濾液層析，洗脫，收集，冷凍干燥，得凍干粉。本發(fā)明成本低，效果好，產(chǎn)量高，誘導劑來源廣，MT自制純品，含量為95％以上。
文檔編號C07K14/825GK101585879SQ200910062168
公開日2009年11月25日 申請日期2009年5月19日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月19日
發(fā)明者彬 張, 李麗立 申請人:中國科學院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所