專利名稱：一種蛋白質(zhì)雙向電泳方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)組學(xué)研究領(lǐng)域中的蛋白質(zhì)雙向電泳技術(shù)，具體涉及一種蛋白質(zhì)
的烷基化和雙向電泳方法。
背景技術(shù)：
蛋白質(zhì)組學(xué)研究主要分為蛋白樣本的制備分離和蛋白的鑒定兩部分。對(duì)于后者則 主要依賴于生物質(zhì)譜技術(shù)，近年來在這方面的研究已經(jīng)取得了很大的進(jìn)步，質(zhì)譜類儀器也 已經(jīng)是相當(dāng)?shù)钠占?。這一方面為蛋白質(zhì)組學(xué)研究的發(fā)展提供了便利，一方面也對(duì)蛋白樣品 的制備分離提出了更高的要求。 由于蛋白質(zhì)組學(xué)的研究對(duì)象來源廣泛且性質(zhì)復(fù)雜，在樣品的制備和分離過程中經(jīng) 常會(huì)遇到各種各樣的問題和困難。對(duì)于廣泛用于分離蛋白的雙向電泳(2-DE)技術(shù)目前主 要存在以下問題蛋白樣品的溶解需添加還原劑如DTT、 TBP等以保持蛋白上巰基殘基的 還原狀態(tài)，因?yàn)閹€基的氧化會(huì)導(dǎo)致蛋白長(zhǎng)鏈內(nèi)/間的交聯(lián)，進(jìn)而影響到蛋白的溶解和分離， 但目前常用的還原劑都不穩(wěn)定，如DTT在堿性條件下帶負(fù)電荷，會(huì)在電場(chǎng)作用運(yùn)動(dòng)而失效， TBP本身不穩(wěn)定會(huì)降解，這些問題對(duì)于聚焦窄范圍IPG膠條的影響更為明顯，因?yàn)檎秶?IPG膠條通常會(huì)需要更高的聚焦電壓和更長(zhǎng)的聚焦時(shí)間，這樣DTT在電場(chǎng)作用下的運(yùn)動(dòng)和 TBP的降解對(duì)蛋白的影響會(huì)更加明顯。聚焦完成以后的膠條需經(jīng)過十二烷基硫酸鈉(SDS) 平衡才可轉(zhuǎn)至第二向SDS-PAGE電泳，平衡通常需要兩步，首先用加DTT的平衡液平衡以還 原蛋白，再用加有IAA的平衡液平衡以烷基化蛋白，同時(shí)消耗掉多余的DTT以避免影響后面 的處理，整個(gè)平衡過程通常需要30分鐘，在這段時(shí)間內(nèi)膠面會(huì)受到含SDS、尿素和甘油的平 衡液的反復(fù)沖洗，一些分布在IPG膠表面的蛋白或小分子量蛋白可能會(huì)流失。

發(fā)明內(nèi)容
基于上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明的目的是提供一種蛋白質(zhì)雙向電泳方法，本方
法可有效提高蛋白質(zhì)的溶解性及其在等電聚焦過程中的穩(wěn)定性，同時(shí)還可以簡(jiǎn)化雙向電泳
操作，減少蛋白在操作過程中的損失。 本發(fā)明的目的通過以下的技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn) —種蛋白質(zhì)雙向電泳方法，包括以下步驟 (1)用6M鹽酸胍溶解蛋白干粉，至蛋白濃度為10-30mg/ml ;依次加入終濃度分別
為2-5mM和50-100mM的三丁基膦和2-乙烯基妣啶，避光靜置反應(yīng)60-120分鐘； (2)4°C、10， 000g離心，取上清加入3-10倍體積-2(TC預(yù)冷的無水乙醇沉淀蛋白，
凍干得到蛋白干粉； (3)步驟(2)所得蛋白干粉用等電聚焦上樣緩沖液溶解，用于固相預(yù)制膠條的水 化和聚焦； (4)聚焦完的固相預(yù)制膠條用SDS平衡液平衡，時(shí)間為10-20分鐘。優(yōu)選地，步驟(1)中，所述蛋白濃度為15-25mg/ml，所述三丁基膦和2-乙烯基吡啶
3的終濃度分別為3-4mM和70-80mM。 優(yōu)選地，步驟(2)具體為4°C、10， OOOg離心至少10分鐘，取上清加入3-10倍體 積-2(TC預(yù)冷的無水乙醇沉淀蛋白，置于0- -2(TC至少10分鐘后，于4°C、10， OOOg離心至 少10分鐘，沉淀用無水乙醇洗滌至少3次以去除鹽分，晾干或凍干。 更優(yōu)選地，步驟(2)中，所述上清中加入的5-6倍體積的_201:預(yù)冷的無水乙醇。
優(yōu)選地，步驟(3)中，所述上樣緩沖液為含尿素7M，硫尿2M，CHAPS4wt^，0. 01wt% 溴酚蘭的水溶液。 優(yōu)選地，步驟(4)中，SDS平衡液母體為pH 8. 8， 1.5M的Tris-HCl，其中含尿素6M， 甘油30X，SDS 2wt^，溴酚蘭0. 01wt% ;，平衡時(shí)間為12-15分鐘。 上述還原劑如13 -巰基乙醇(13 -ME) 、二硫蘇糖醇(DTT)、三丁基膦(TBP)等和烷 基化試劑如碘乙酰胺(IAA)、丙烯酰胺(Acrylamide)等。 相比現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明蛋白質(zhì)雙向電泳方法的優(yōu)點(diǎn)是用鹽酸胍溶解蛋白并作為 還原和烷基化反應(yīng)的介質(zhì)，鹽酸胍是應(yīng)用最廣泛的蛋白變性劑，常用于溶解包涵體中的蛋 白，用鹽酸胍溶液做為反應(yīng)介質(zhì)可避免蛋白質(zhì)在其它類常用緩沖液中受其溶解性限制而導(dǎo) 致的蛋白丟失；以TBP做為還原劑，以2-VP做為烷基化試劑，蛋白的還原和烷基化可一步 完成，并且反應(yīng)迅速、針對(duì)性強(qiáng)，不會(huì)發(fā)生副反應(yīng)。烷基化后的蛋白由于巰基被保護(hù)而無法 在長(zhǎng)鏈分子內(nèi)/間形成二硫鍵，可以提高蛋白的溶解性和穩(wěn)定性。使得蛋白在隨后的2-DE 分析中更容易被分離分析，也不用再考慮等電聚焦過程中經(jīng)常會(huì)發(fā)生的還原劑的消耗(如 DTT等)或降解(如TBP等)；聚焦完成以后常用的兩步法平衡也可以簡(jiǎn)化為一步，而縮短 的平衡時(shí)間也意味著更少的蛋白在平衡過程中流失。


圖1為花生葉片蛋白依據(jù)本方法電泳的圖譜。 圖2為花生幼莢果的全蛋白依據(jù)本方法電泳的圖譜。 圖3為未烷基化的花生葉片蛋白依據(jù)兩步平衡法電泳的2D圖譜。 圖4為甘薯葉片全蛋白依據(jù)本方法電泳的圖譜。 圖5為未烷基化的甘薯葉片蛋白依據(jù)兩步平衡法電泳的2D圖譜。
具體實(shí)施方式

試劑 尿素(電泳級(jí))，硫尿，丙烯酰胺，甲叉雙丙烯酰胺，十二烷基硫酸鈉(SDS)，DTT，三 羥甲基氨基甲烷(Tris)，甘氨酸購(gòu)自Amresco， CHAPS (3-[ (3-Cholanidopropyl) dimethyla mmonio]-l-propanesulfonate) ， TBP，2-VP購(gòu)自sigma，其它均為普通市售分析純級(jí)試劑。
下述實(shí)施例中，無特殊說明，所涉及百分?jǐn)?shù)為重量含量。
實(shí)施例1 (1)花生葉片蛋白由改進(jìn)的酚提法提取。稱取2g花生葉片在液氮中研磨粉碎， 以15%三氯醋酸(TCA)/丙酮連續(xù)洗滌至上清透明，再以丙酮洗除殘留TCA，室溫晾干后加 入3ml蛋白提取液(尿素9M， P -ME 2% (v/v) ， Tris 50mM， pH 7. 5)混合均勻，再加入3ml Tris-HCl飽和酚(pH 7. 5)混合均勻后室溫靜置10分鐘浸提蛋白，于4°C 、 10， OOOg離心10
4分鐘后取上層酚相與5倍體積-2(TC預(yù)冷的含0. 1M醋酸銨的甲醇混合，置于-2(TC沉淀蛋 白10分鐘；在于4°C 、 10， OOOg離心10分鐘，沉淀用甲醇洗滌3次，室溫晾干；
(2)稱取約10mg由上述方法制備的花生葉片蛋白以0. 5ml鹽酸胍(6M)溶解，依次 加入TBP和2-VP使其終濃度為3mM的80mM，避光靜置反應(yīng)90分鐘； (3) 4°C 、 10， 000g離心10分鐘后取上清加入5倍體積-2(TC預(yù)冷的乙醇，于_20°C 沉淀蛋白10分鐘；4°C、10， OOOg離心10分鐘，沉淀用無水乙醇洗3次，然后凍干凍存或直 接用于2-DE分析。 (4)將蛋白溶解于上樣緩沖液(尿素7M，硫尿2M，CHAPS 4%，溴酚蘭0.01% )中， BCA法定量，調(diào)整蛋白濃度至2mg/ml，取200ul直接用于2-DE分析。(pH3-10 llcm IPG水 化6h， IEF程序?yàn)?00-10， 000V 5h線性升壓，10， 000V保持至總伏時(shí)數(shù)達(dá)到60， 000V * H。
(5)將已聚焦好的IPG膠條取出，瀝干表面礦物油后用5ml SDS平衡液(尿素6M， 甘油30%， SDS 2%，溴酚蘭0.01% )平衡12分鐘。 (6)將平衡好的膠條轉(zhuǎn)至第二向SDS-PAGE膠(15% )，恒壓80V至蛋白完全轉(zhuǎn)出 IPG膠條，再120V直到溴酚蘭指示劑達(dá)到凝膠底部約0. 5cm處時(shí)，關(guān)掉電源，取出凝膠，用考 馬斯亮藍(lán)G-250染色。。 由圖1可以看出花生葉片蛋白在2-DE凝膠上得到了良好的分離，背景清晰且可識(shí) 別點(diǎn)數(shù)較多，酸性端和堿性端以及小分子量區(qū)域的蛋白都分離的很好，點(diǎn)形圓潤(rùn)且邊界分 明。 實(shí)施例2 (1)稱取約20mg由改進(jìn)的酚提法制備的花生嫩莢果蛋白以0. 5ml鹽酸胍(6M)溶 解，依次加入TBP和2-VP使其終濃度為3mM的80mM，避光靜置90分鐘以還原和烷基化蛋 白， (2)4°C、10， OOOg離心10分鐘后取上清加入5倍體積_20°C _20"預(yù)冷的乙醇， 于-2(TC沉淀蛋白10分鐘；4t:、10，000g離心，沉淀用無水乙醇洗3次，然后凍干凍存或直 接用于電泳分析。 (3)將蛋白溶解于上樣緩沖液(尿素7M，硫尿2M，CHAPS 4%，0. 01%溴酚蘭)中， BCA法定量，調(diào)整蛋白濃度至2mg/ml，取200ul直接用于2-DE分析。(pH3-10，llcm IPG水 化6h， IEF程序?yàn)?00-10， OOOV 5h線性升壓，10， 000V保持至總伏時(shí)數(shù)達(dá)到60， 000V * H。
(4)將已聚焦好的IPG膠條取出，瀝干表面礦物油后用5ml SDS平衡液(尿素6M， 甘油30%， SDS 2%，溴酚蘭0.01% )平衡12分鐘。 (5)將平衡好的膠條轉(zhuǎn)至第二向SDS-PAGE膠(15% )，恒壓80V至蛋白完全轉(zhuǎn)出 IPG膠條，再120V直到溴酚蘭指示劑達(dá)到凝膠底部約0. 5cm處時(shí)，關(guān)掉電源，取出凝膠，用考 馬斯亮藍(lán)G-250染色。 由圖2可以看出花生嫩莢果的蛋白也得到了很好的分離，蛋白點(diǎn)尖銳清晰，整張 凝膠只有很少的橫縱條紋和拖尾。特別是凝膠中部的幾個(gè)大點(diǎn)，也都得到了很好的分離，
比較實(shí)施例1 (1)用改進(jìn)的緩沖液/酚提法制備的花生葉片蛋白，蛋白干粉用加還原劑的上樣 緩沖液(尿素7M，硫尿2M， CHAPS 4%， DTT 50mM，溴酚蘭0. 01% )溶解，BCA法定量并調(diào) 整蛋白濃度至2mg/ml，取200ul用于2-DE分析。(pH3-10，llcm IPG水化6h， IEF程序?yàn)?br> 5100-10， 000V 5h線性升壓，10， 000V保持至總伏時(shí)數(shù)至60， 000V * H。 (2)聚焦完成后的膠條采用兩步平衡法進(jìn)行處理，先用5ml含1 % DTT的SDS平衡 液(尿素6M，甘油30%， SDS 2%， DTT 50mM，溴酚蘭0. 01 % )平衡12分鐘還原蛋白，再用 含碘乙酰胺55mM的SDS平衡液平衡12分鐘以烷基化蛋白。 (3)將平衡好的膠條轉(zhuǎn)至第二向SDS-PAGE膠(15% )，恒壓80V至蛋白轉(zhuǎn)出膠條， 再120V直到溴酚蘭指示劑達(dá)到凝膠底部約0. 5cm時(shí)，關(guān)掉電源，取出凝膠，用考馬斯亮藍(lán) G-250染色。 對(duì)比圖1和圖3可以看出，在圖3中蛋白較為集中在中間區(qū)域，在酸堿極性端以及
小分子量端的蛋白沒有得到良好的分析，特別是堿性端的蛋白橫紋嚴(yán)重，這表明由于還原
劑的電泳損失導(dǎo)致了蛋白的氧化，在不同蛋白分子間產(chǎn)生了交聯(lián)而無法準(zhǔn)確聚焦。拖尾則
表明在處理過程中蛋白有降解發(fā)生，畸形蛋白點(diǎn)的存在則顯示在電泳過程中一些蛋白受溶
解度控制而析出和再溶解，并對(duì)其它蛋白也產(chǎn)生了影響。 實(shí)施例3 (1)稱取約20mg由酚提法制備的甘薯葉片蛋白以0. 5ml鹽酸胍(6M)溶解，依次加 入TBP和2-VP使其終濃度為3mM的80mM，避光靜置90分鐘以還原和烷基化蛋白，
(2) 4°C 、 10， OOOg離心10分鐘后取上清加入5倍體積_20"預(yù)冷的乙醇，于_20°C 沉淀蛋白IO分鐘；4t:、10，000g離心，沉淀用無水乙醇洗3次，然后凍干凍存或直接用于電 泳分析。 (3)將蛋白溶解于上樣緩沖液(尿素7M，硫尿2M，CHAPS 4%，溴酚蘭0.01% )中， BCA法定量，調(diào)整蛋白濃度至2mg/ml，取200ul直接用于2-DE分析。(11cm pH 3-10IPG水 化6h，IEF程序?yàn)?00-10， 000V 5h線性升壓，10， 000V保持至總伏時(shí)數(shù)達(dá)到60， 000V * H。
(4)將已聚焦好的IPG膠條取出，瀝干表面礦物油后用5ml SDS平衡液(尿素6M， 甘油30%， SDS 2%，溴酚蘭0.01% )平衡12分鐘。 (5)將平衡好的膠條轉(zhuǎn)至第二向SDS-PAGE膠(15% )，恒壓80V至蛋白完全轉(zhuǎn)出 IPG膠條，再120V直到溴酚蘭指示劑達(dá)到凝膠底部約O. 5cm處時(shí)，關(guān)掉電源，取出凝膠，用考 馬斯亮藍(lán)G-250染色。 由圖4可以看出雖然中間部位有一條很明顯的水平條紋，但多數(shù)甘薯葉片蛋白還 是得到了很好的分離，蛋白點(diǎn)尖銳清晰，特別是在凝膠底部，小分子量部分蛋白也都得到了 很好了分離。相比由未烷基化蛋白所得的2-DE圖像(圖5)可知，本方法能有效提高蛋白 的溶解性和穩(wěn)定性，避免不同蛋白在電泳過程中的相互干擾，提高分辨率，同時(shí)也減少蛋白 的損失，使2-DE圖像上能展現(xiàn)更多的蛋白。
比較實(shí)施例2 (1)用改進(jìn)的緩沖液/酚提法制備的甘薯葉片蛋白，蛋白干粉用加還原劑的上樣 緩沖液(尿素7M，硫尿2M， CHAPS 4%， DTT 50mM，溴酚蘭0. 01% )溶解，BCA法定量并調(diào) 整蛋白濃度至2mg/ml，取200ul用于2-DE分析。(11cm pH 3-10IPG水化6h， IEF程序?yàn)? 100-10， 000V 5h線性升壓，10， 000V保持至總伏時(shí)數(shù)至60， 000V * H。 (2)聚焦完成后的膠條采用兩步平衡法進(jìn)行處理，先用5ml含1 % DTT的SDS平衡 液平衡12分鐘還原蛋白，再用含碘乙酰胺55mM的SDS平衡液平衡12分鐘以烷基化蛋白。
(3)將平衡好的膠條轉(zhuǎn)至第二向SDS-PAGE膠(15% )，恒壓80V至蛋白轉(zhuǎn)出膠條，
6再120V直到溴酚蘭指示劑達(dá)到凝膠底部0. 5cm時(shí)，關(guān)掉電源，取出凝膠，用膠體考馬斯亮藍(lán) (G-250)法染色。 由圖5可以看出，蛋白點(diǎn)數(shù)明顯少于烷基化蛋白樣品，原因可能是蛋白難溶而未 能提取，或者是在平衡過程中被丟失。蛋白的拖尾則表明受溶解度的影響蛋白在電泳過程 中發(fā)生了析出和再溶解，或者是在第二向電泳過程中蛋白分子之間發(fā)生了氧化交聯(lián)。
上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的 限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化， 均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
一種蛋白質(zhì)雙向電泳方法，其特征在于包括以下步驟(1)用6M鹽酸胍溶解蛋白干粉，至蛋白濃度為10-30mg/ml；依次加入終濃度分別為2-5mM和50-100mM的三丁基膦和2-乙烯基吡啶，避光靜置反應(yīng)60-120分鐘；(2)4℃、10,000g離心，取上清加入3-10倍體積-20℃預(yù)冷的無水乙醇沉淀蛋白，凍干得到蛋白干粉；(3)步驟(2)所得蛋白干粉用等電聚焦上樣緩沖液溶解，用于固相預(yù)制膠條的水化和聚焦；(4)聚焦完的固相預(yù)制膠條用SDS平衡液平衡，時(shí)間為10-20分鐘。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的蛋白質(zhì)雙向電泳方法，其特征在于步驟(1)中，所述蛋白濃 度為15-25mg/ml，所述三丁基膦和2-乙烯基妣啶的終濃度分別為3_4mM和70_80mM。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1蛋白質(zhì)雙向電泳方法，其特征在于步驟(2)具體為4°C、10，000g 離心至少IO分鐘，取上清加入3-10倍體積-2(TC預(yù)冷的無水乙醇沉淀蛋白，置于O——20°C 至少10分鐘后，于4°C、10， OOOg離心至少10分鐘，沉淀用無水乙醇洗滌至少3次以去除鹽 分，晾干或凍干。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的蛋白質(zhì)雙向電泳方法，其特征在于步驟(2)中，所述上 清中加入的5-6倍體積的_201:預(yù)冷的無水乙醇。
5. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的蛋白質(zhì)雙向電泳方法，其特征在于步驟(3)中，所述上樣緩 沖液為含尿素7M，硫尿2M， CHAPS 4%，0. 01%溴酚蘭的水溶液。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)雙向電泳方法，其特征在于步驟(4)中，SDS平衡液 母體為pH 8. 8， 1. 5M的Tris-HCl，其中含尿素6M，甘油30%，SDS 2wt% ，溴酚蘭0. 01wt%; 平衡時(shí)間為12-15分鐘。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種蛋白質(zhì)雙向電泳方法。該方法首先用鹽酸胍溶液溶解新鮮制備或凍存的蛋白干粉，再加入終濃度分別為2-5mM的三丁基膦和50-100mM的2-乙烯基吡啶以還原并烷基化蛋白；避光靜置反應(yīng)60-120分鐘后加入5-10倍體積-20℃預(yù)冷的無水乙醇沉淀蛋白；再用乙醇洗除鹽分，晾干或凍干后即得烷基化蛋白。烷基化蛋白用于雙向電泳分析時(shí)，等電聚焦上樣緩沖液中可不加還原劑，膠條的平衡也可簡(jiǎn)化為一步，同時(shí)平衡液中也無需再添加還原劑和/或烷基化試劑。本發(fā)明可提高蛋白質(zhì)的溶解性，以及在電泳過程中的穩(wěn)定性，簡(jiǎn)化雙向電泳的操作步驟進(jìn)而減少蛋白的損失。能廣泛用于蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域。
文檔編號(hào)C07K1/28GK101696230SQ200910193330
公開日2010年4月21日 申請(qǐng)日期2009年10月27日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月27日
發(fā)明者張二華, 梁炫強(qiáng), 陳小平 申請(qǐng)人:廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所;