專利名稱：帶穿膜序列的人Scurfin蛋白全長及片段以及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程及蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)的生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。具體的說，本發(fā)明涉及帶 穿膜序列的人Scurf in全長、去除叉頭結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)域(AForkhead domain, AFKH)人Scurf in 片段和去除富含脯氨酸結(jié)構(gòu)域(AProline-rich domain, APRD)人Scurf in片段的融合蛋 白PTD-hScurf in、PTD- A hFKH及PTD- A hPRD基因序列的重組構(gòu)建及由此制備的融合蛋白 對Jurkat T細(xì)胞(人急性T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞系)和人外周血CD4+T細(xì)胞抑制增殖、調(diào) 節(jié)細(xì)胞因子分泌和誘導(dǎo)免疫耐受的作用，以及應(yīng)用于調(diào)節(jié)性T樣細(xì)胞制備、預(yù)防和治療治 療炎性免疫相關(guān)性疾病(包括自身免疫病、移植排斥相關(guān)疾病)及免疫耐受誘導(dǎo)或腫瘤的 藥物中的用途。
背景技術(shù)：
l.Treg概述 自1995年日本京都大學(xué)Sakaguchi等首次報道CD4+CD25hi調(diào)節(jié)性T細(xì)胞 (regulatory Tcells， Treg)后，Treg隨即引起全世界相關(guān)學(xué)科學(xué)者的廣泛關(guān)注。對Treg 的分類多種多樣，目前被廣泛認(rèn)同的分類方式是根據(jù)Treg發(fā)育和其特異性以及作用機(jī) 制等的差異將其分為天然Treg(Natural Treg)和獲得性或誘導(dǎo)性Treg(Adaptive or Induced Treg)。天然Treg主要表達(dá)CD4、CD25、hScurf in、CD134 (0X40) 、GITR(TNFRSF18)、 CD62L(L-selectin)和CD152 (CTLA-4)。盡管其數(shù)量很少，但具有很強(qiáng)的免疫抑制功能。其 通過細(xì)胞間接觸抑制(活化的Treg既能夠通過自身的MHC分子與效應(yīng)性T細(xì)胞直接接觸介 導(dǎo)免疫抑制，抑制CD8+T細(xì)胞的活化；也可以通過間接抑制APC表達(dá)協(xié)同剌激分子，從而抑 制效應(yīng)性T細(xì)胞的增殖以及IL-2的產(chǎn)生。)和分泌細(xì)胞因子抑制效應(yīng)免疫細(xì)胞的作用，在 自身免疫耐受的形成和維持中發(fā)揮重要作用。其功能的誘導(dǎo)依賴抗原，而功能的實施則無 抗原特異性，但最近有研究表明其功能也存在一定的抗原特異性。獲得性Treg則主要通過 分泌細(xì)胞因子方式發(fā)揮抑制作用。隨后發(fā)現(xiàn)Treg主要受一種叉頭翼狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子家族 成員p3(forkhead box transcription factorclass p3，F(xiàn)oxp3)基因編石馬的蛋白Scurfin 的調(diào)控。 一般在表示人源的基因和蛋白時用F0XP3和Scurf in表示，而鼠源性用Fo鄧3和 scurf in表示，在非特指時用Foxp3表示和scurfin。也有用F0XP3/Foxp3代表蛋白的，本 專利申請書統(tǒng)一用hF0XP3和hScurfin分別表示人的基因和蛋白，mFoxp3和mScurfin分 別表示鼠的基因和蛋白。非特指時用Fo鄧3和scurfin分別表示基因和蛋白。
2.人Scurfin基因與其編碼產(chǎn)物 人Scurf in (human Scurfin， hScurfin)的基因為叉頭翼狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子家族 成員p3 (humanforkhead box transcription factor class p3， hF0XP3)，位于人染色體 Xpll. 23-Xpl3. 3， GenBank登錄號AF277993。屬于叉頭/翼狀螺旋轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子家族，含 有11個外顯子，在人類中高度保守。 人F0XP3 (human F0XP3， hF0XP3)基因的編碼產(chǎn)物為 一 個48_kDa的蛋白質(zhì) hScurfin，其特征性結(jié)構(gòu)為蛋白C端的叉頭螺旋(Forkhead/winged helix，F(xiàn)KH)結(jié)構(gòu)，含有這一結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)屬于DNA結(jié)合因子家族成員之一。除了叉頭區(qū)，hScurfin蛋白還包括 一個N末端的富含脯氨酸的結(jié)構(gòu)域(Proline-rich domain，PRD)。近年研究表明這些結(jié)構(gòu) 域與hScurf in的抑制活性的發(fā)揮有著密切的聯(lián)系。在FKH和PRD之間還包含一個C2H2鋅 指結(jié)構(gòu)以及一個亮氨酸拉鏈序列，但是沒有磷酸化的PKB/AKT位點。hScurfin屬于轉(zhuǎn)錄調(diào) 節(jié)子，主要作用是抑制轉(zhuǎn)錄，主要表達(dá)于淋巴組織的CD4+T細(xì)胞，對免疫穩(wěn)態(tài)的維持作用十 分重要。 3. Scurf in是Treg相對特異性標(biāo)志 對于小鼠的研究表明，缺乏mScurfin可引起一種迅速致命的淋巴細(xì)胞增生性疾 病，與缺乏CTLA-4的小鼠相似。若將mFo鄧3基因轉(zhuǎn)入CTLA-4敲除的小鼠，或?qū)TLA-4 缺陷鼠進(jìn)行mScurfin過表達(dá)，可延遲淋巴系增生性疾病的產(chǎn)生，延長該鼠140天壽命， 證實mScurfin可替代缺失的CTLA-4功能。而hScurfin突變表現(xiàn)和Treg缺乏所致的 X染色體聯(lián)鎖的免疫失調(diào)、多內(nèi)分泌腺病和腸病綜合癥綜合征(immune dysregulation， polyendocrinopathy， enteropathy, X-liked syndrome, IPEX)，也禾爾為X_相關(guān)自身免疫 性-變應(yīng)性失調(diào)綜合癥(X-linkedautoimm皿ity-allergic disregulation syndrome, XLAAD)情況相似。 早先對于mScurfin的研究顯示，mScurfin在小鼠Treg中高表達(dá)，而在 CD4+CD25—細(xì)胞中表達(dá)非常低，過表達(dá)mScurfin蛋白的小鼠，則產(chǎn)生更多的Treg。多個實驗 室的研究證實mScurfin參與CD4+CD25hi細(xì)胞發(fā)育，Sakaguchi等通過將mFoxp3基因通過 逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染，可使脾臟的初始T細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)镃D4+CD25hiT細(xì)胞，說明mScurfin蛋白能直 接或間接誘導(dǎo)Treg的相關(guān)分子表達(dá)。已證實人CD4+CD25hiT細(xì)胞部分表達(dá)hScurfin，并且 hScurfin+的這群細(xì)胞具有免疫抑制功能。但與小鼠不同的是，在TCR聯(lián)合抗CD28單抗剌 激下，CD4+CD25—T細(xì)胞可轉(zhuǎn)為CD4+CD25hiT細(xì)胞，同時表達(dá)hScurf in，并具有Treg樣的抑制 性功能。2001年，Wildin和Bennett同時提出hF0XP3基因與sf突變小鼠的mFoxp3基因 具有同源性。在對自身免疫疾病的研究中，人們發(fā)現(xiàn)，Scurf in基因可能是參與自身免疫的 一個關(guān)鍵調(diào)節(jié)物。將Scurfin基因Fo鄧3轉(zhuǎn)導(dǎo)Scurfin—的非調(diào)節(jié)性CD4+T細(xì)胞，可使后者 獲得Treg的表型，且具有無反應(yīng)性(即無能)，與天然的Treg活性和表型相似，在體內(nèi)、外 都可介導(dǎo)免疫抑制作用，說明Scurfin的表達(dá)標(biāo)志著免疫調(diào)節(jié)抑制活性，其具有調(diào)控Treg 的發(fā)育及功能的作用。目前已經(jīng)證實Fo鄧3基因轉(zhuǎn)錄的mRNA以及編碼蛋白Scurfin特異 性表達(dá)于Treg(盡管有少量報道在其他細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，但是大多數(shù)是非持續(xù)的表達(dá))，而其他 CD4+T細(xì)胞亞群包括靜息CD4+T細(xì)胞、活化的Thl/Th2甚至NK T細(xì)胞均極少表達(dá)Scurfin, 故認(rèn)為是Treg的特異分子標(biāo)記物。
4. hScurf in生物學(xué)作用 2003年，Hori S等發(fā)現(xiàn)，mScurfin特異性地表達(dá)于Treg，且和Treg的發(fā)生、發(fā)育 和功能密切相關(guān)，這為分子水平在體內(nèi)、外研究這一特殊細(xì)胞群提供了依據(jù)和特異性標(biāo)記。 此外有文獻(xiàn)報道hScurfin與介導(dǎo)Treg功能的一系列細(xì)胞膜分子和細(xì)胞因子(如CTLA-4、 GITR、 IL-10和TGF-P)的表達(dá)及其功能的發(fā)揮有著十分密切的聯(lián)系。體外實驗表明， hScurfin以IL-2依賴的受體作為轉(zhuǎn)錄阻遏物，但是體內(nèi)確切的靶點仍不十分清楚。
雖然hScurfin在Treg細(xì)胞的發(fā)育和功能發(fā)揮等方面所起的作用還有待進(jìn)一步研 究，但迄今為止的研究已能夠表明hScurfin是控制Treg發(fā)育及其功能效應(yīng)的關(guān)鍵基因，同時也揭示外周Treg來源有兩種可能①外周原初T細(xì)胞有可能分化為Treg ;②胸腺中可能 產(chǎn)生具有類似Treg功能的CD25—的細(xì)胞，這種細(xì)胞活化以后有可能轉(zhuǎn)化為CD25+Treg。
Roli K等發(fā)現(xiàn)，mscurfin高表達(dá)的小鼠免疫系統(tǒng)處于抑制狀態(tài)。將mFo鄧3基因 導(dǎo)入小鼠后發(fā)現(xiàn)，T細(xì)胞數(shù)量明顯減少，低于正常水平，并且這些T細(xì)胞的增殖能力和溶細(xì) 胞能力均較低，在TCR的剌激下分泌的IL-2水平降低。雖然這類小鼠的胸腺發(fā)育正常，但 是其外周免疫器官，尤其是淋巴結(jié)，表現(xiàn)出無細(xì)胞狀態(tài)。這說明mScurfin蛋白影響了小鼠 外周免疫系統(tǒng)的發(fā)育和功能狀態(tài)。
(l)維持免疫自穩(wěn) 免疫自穩(wěn)是機(jī)體免疫系統(tǒng)的基本功能之一，免疫系統(tǒng)通過免疫耐受和免疫調(diào)節(jié)來 達(dá)到免疫系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境的自身穩(wěn)定。自身免疫性疾病的發(fā)生是由于對自己或非己識別的調(diào)控 機(jī)制出現(xiàn)紊亂， 一些自身反應(yīng)性T細(xì)胞逃避克隆清除或免疫抑制，識別外周組織抗原。在正 常情況下，所有個體均存在自身反應(yīng)性T細(xì)胞，但是自身免疫病僅發(fā)生在5%的人身上，這 說明一定存在能夠調(diào)控那些潛在自身反應(yīng)性T細(xì)胞的細(xì)胞或因子。將除去了 CD25+細(xì)胞的 CD4單陽性T細(xì)胞過繼轉(zhuǎn)移給T細(xì)胞缺陷小鼠，能導(dǎo)致宿主的各種器官特異性自身免疫??； 而將Treg和CD4單陽性T細(xì)胞共同過繼轉(zhuǎn)移，則能防止自身免疫病的發(fā)生。這一現(xiàn)象提示 Treg是維持自身免疫耐受的主要因素。出生3天切除胸腺的小鼠因外周Treg明顯減少可 發(fā)生器官特異性自身免疫病。如果能利用Treg的強(qiáng)大免疫調(diào)節(jié)作用，去特異性抑制自身反 應(yīng)性T細(xì)胞的活化，便有可能找到自身免疫疾病新的治療方法。 2001年Brunkow等對自體免疫綜合癥scurfy缺陷的突變小鼠(Sf小鼠)研究時首 次發(fā)現(xiàn)mFo鄧3基因，并證實Sf小鼠的突變基因位點是在mFo鄧3基因第8內(nèi)含子中插入了 兩個腺苷酸殘基，造成移碼突變，形成FKH缺失的蛋白。研究證明，F(xiàn)orkhead結(jié)構(gòu)域?qū)ζ浜?定位及其與DNA的結(jié)合等起關(guān)鍵作用。缺少Forkhead結(jié)構(gòu)域的mScurfin蛋白不能發(fā)揮轉(zhuǎn) 錄因子的功能，導(dǎo)致CD4+T淋巴細(xì)胞過度增殖、浸潤。hF0XP3基因突變可引起IPEX，其表現(xiàn) 為全面的免疫失調(diào)，并伴有自身免疫性內(nèi)分泌疾病、早期發(fā)作的I型糖尿病和甲狀腺炎；在 一部分病例中可伴有嚴(yán)重的異位特異反應(yīng)，包括濕疹、食物變態(tài)反應(yīng)和嗜酸性炎癥等。IPEX 患者的hF0XP3基因有13個獨立的突變點，其中有6個突變可引起氨基酸替換。通過對大 量的IPEX患者h(yuǎn)F0XP3基因的分析發(fā)現(xiàn)，人類的IPEX 60%是由于hF0XP3基因編碼區(qū)域突 變導(dǎo)致的，另外10X是mRNA表達(dá)下降導(dǎo)致的。 Sakaguchi等研究表明，在人類和小鼠患自身免疫性疾病時，CD4+T細(xì)胞上出現(xiàn) Scurf in的表達(dá)缺失。如果將正常小鼠分離得到的Treg注入mFo鄧3基因缺陷小鼠體內(nèi)， 能阻止這種小鼠自身免疫疾病的發(fā)生。此外，使用逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)化mFo鄧3基因進(jìn)入未激活 CD4+CD25—T細(xì)胞使之成為與自然產(chǎn)生的CD4+Treg具有相類似功能的細(xì)胞。
Rundensky研究表明mScurfin轉(zhuǎn)錄因子能被CD4+CD25hiTreg特異地表達(dá)，并在T 發(fā)揮作用時成為必須因子。在致命的自體免疫綜合癥sf小鼠研究中發(fā)現(xiàn)mFo鄧3基因突變 和mFo鄧3基因無效突變導(dǎo)致CD4+CD25hiTreg缺乏，這種缺乏有別于CD4+CD25—T細(xì)胞的自身 缺陷。把CD4+CD25hiTreg轉(zhuǎn)移到新生的mFo鄧3基因缺乏的小鼠中能夠能優(yōu)先擴(kuò)大并起到
治療疾病的作用。
(2)抑制腫瘤 腫瘤的免疫逃逸機(jī)制主要包括腫瘤的抗原性弱及抗原調(diào)變，MHC-I表達(dá)低下，分泌免疫抑制因子如TGFI3 、IL-10以及缺乏協(xié)同剌激分子等。目前腫瘤免疫治療的研究主要集 中在打破免疫耐受和提高宿主T細(xì)胞反應(yīng)。許多腫瘤抗原為自身抗原，因為Treg有利于自 身抗原耐受，通過去除組織特異性Treg可以使抗腫瘤作用得到增強(qiáng)，但體內(nèi)應(yīng)用CD25單抗 去除Treg的同時也去除了活化的CD8+CD25+T細(xì)胞，從而減弱了抗腫瘤效應(yīng)。同時也發(fā)現(xiàn)體 內(nèi)剔除CD25+細(xì)胞不足以治療已經(jīng)發(fā)生的腫瘤，因此必須與其他抗腫瘤方法相結(jié)合。對于 hF0XP3表達(dá)的hScurfin蛋白來說，還存在著另外一面的作用。最近Yang Liu和Pan Zheng 報道hScurf in能表達(dá)于乳腺上皮細(xì)胞中，在乳腺癌細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，過表達(dá)hScurf in抑制 癌基因ErbB2 ;此外當(dāng)hF0XP3基因發(fā)生突變或RNAi干擾hF0XP3基因表達(dá)時癌基因SKP2表 達(dá)上調(diào)，而且發(fā)現(xiàn)抑制SKP2對hScurfin蛋白介導(dǎo)的腫瘤生長抑制十分關(guān)鍵，這些證據(jù)都證 明了 Scurf in蛋白是腫瘤抑制基因。另外眾多的文獻(xiàn)報道Fo鄧3基因的表達(dá)產(chǎn)物Scurf in 能抑制NF-AT和NF- k B，而NF-AT和NF- k B與腫瘤的生存和增殖具有重要的作用。我們的 實驗也表明hScurfin能抑制T淋巴瘤細(xì)胞系Jurkat的增殖。綜上所述，因此hScurfin可 能可成為腫瘤治療的重要手段。
(3)對移植排斥反應(yīng)影響 CD4+CD25hihSCurfin+Treg在移植耐受中起著重要的作用，是誘發(fā)機(jī)體移植耐受的 主要細(xì)胞。Treg具有抑制移植排斥的作用，隨著異體效應(yīng)T細(xì)胞數(shù)量增加，其保護(hù)性作用減 弱。從正常小鼠體內(nèi)除去Treg導(dǎo)致排斥反應(yīng)增強(qiáng)，并降低移植物的存活；相反，如果給予缺 乏T細(xì)胞的移植術(shù)后小鼠接種同系Treg和未致敏T細(xì)胞，移植物存活時間可明顯延長。在 體外MLR中，異基因淋巴細(xì)胞剌激下，Treg可以有效地抑制CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的增殖 反應(yīng)。另外，運(yùn)用異基因剌激細(xì)胞和高劑量IL-2，在體外可以誘導(dǎo)并擴(kuò)增抗原特異性Treg。 已有體外實驗克隆出針對人類移植物抗原的CD4+T細(xì)胞亞群，結(jié)果表明，與Thl或Th2克隆 引起耐受相反，Treg通過過繼性轉(zhuǎn)移誘導(dǎo)耐受。在未受外來抗原致敏的Naive小鼠體內(nèi)存 在天然抑制移植排斥的能力，只是在移植耐受鼠其抗移植排斥的能力有所增強(qiáng)，因此Treg 可以調(diào)控異基因的效應(yīng)T細(xì)胞，從而有利于建立異體移植物耐受。在移植時，Treg的活化 對移植排斥反應(yīng)具有一定的抑制作用。如果在移植前或在移植早期階段能夠產(chǎn)生足夠的 Treg，將可以降低非特異性免疫抑制藥物的用量，甚至可以完全代替免疫抑制性藥物。
移植物抗宿主病(GVHD)是異基因造血干細(xì)胞移植后在受者體內(nèi)植活的供者淋巴 細(xì)胞對宿主器官發(fā)生的免疫性損傷為主要特征的移植排斥反應(yīng)，是異基因造血干細(xì)胞移植 最大障礙。隨著對Treg的認(rèn)識，人們開始對Treg在GVHD中的作用也進(jìn)行了研究。研究發(fā) 現(xiàn)去除供者淋巴細(xì)胞中的Treg或在移植前對宿主鼠去除CD25+細(xì)胞都可增加GVHD發(fā)??； 而應(yīng)用新鮮分離純化的供鼠Treg進(jìn)行轉(zhuǎn)輸可明顯減輕GVHD，為臨床預(yù)防GVHD提供了新的 方法，但Treg占CD4+T細(xì)胞的比例較低，臨床應(yīng)用Treg受到限制。近年來通過在體外擴(kuò)增 培養(yǎng)可獲得數(shù)量較多的Treg，采用擴(kuò)增的Treg轉(zhuǎn)輸也可明顯減少致死性GVHD的發(fā)生，因此 該方法在將來很有希望應(yīng)用于臨床。轉(zhuǎn)導(dǎo)hF0XP3基因的透明質(zhì)酸特異性轉(zhuǎn)基因CD4+CD25—T 細(xì)胞能使男性皮膚移植物免受同系基因型女性排斥。
5. HIV的TAT-PTD作用特點及機(jī)制 通過細(xì)胞穿透肽進(jìn)行蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)是目前體外蛋白傳遞的一種有效方法。最常用的蛋 白轉(zhuǎn)導(dǎo)肽就是HIV-TAT基因的第一個外顯子編碼的第48-56位氨基酸殘基，其具有蛋白轉(zhuǎn) 導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(protein transduction domain, PTD)，其作用特點如下
①速度快——幾分鐘，幾小時起效。 ②溫度適應(yīng)性廣。在4t:和37t:都可以進(jìn)行；其入胞過程遵循一個非受體、非能量 和非胞吞的動力學(xué)機(jī)制。 ③蛋白質(zhì)進(jìn)入的數(shù)量依賴于培養(yǎng)液中融合蛋白的濃度
④引領(lǐng)融合蛋白穿入培養(yǎng)細(xì)胞效率高。 ⑤若將融合蛋白注射入動物的腹腔，在很短時間內(nèi)，可以在幾乎所有的組織和器 官中看到融合蛋白。 被TAT-PTD帶入細(xì)胞的分子的命運(yùn)被TAT-PTD帶入細(xì)胞的分子基本上保留了 它們各自原有的化學(xué)性質(zhì)，且具有它們本來的活性，因此它們在細(xì)胞內(nèi)會各盡其責(zé)，各顯其 能。 目前推測穿膜過程與蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域中堿性氨基酸(精氨酸和賴氨酸)的存在有關(guān)， 這些氨基酸帶有強(qiáng)的正電荷，可能是通過直接與帶正電荷的細(xì)胞膜脂類相互作用而介導(dǎo)穿 膜過程。PTD可以與其他蛋白形成的融合蛋白導(dǎo)入幾乎所有的細(xì)胞，包括破骨細(xì)胞、外周血 單核細(xì)胞及原代細(xì)胞等常規(guī)方法難以轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，甚至還可以穿過血腦屏障。PTD引導(dǎo)蛋白 和多肽入胞的主要特點是轉(zhuǎn)導(dǎo)速度快，效率高，不損傷細(xì)胞。近來應(yīng)用此轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)可以將藥 物、化合物、寡核苷酸、肽段、全長蛋白(如抗體、酶、分離的蛋白質(zhì))、金屬離子、甚至200nm 的脂質(zhì)體進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。操作也很簡便，只需將融合的分子直接加入到組織培養(yǎng)介質(zhì)中，15 30分鐘左右胞內(nèi)可達(dá)到最大濃度，并且每個細(xì)胞內(nèi)的蛋白濃度近乎相同。這樣，既可以控制 細(xì)胞內(nèi)的蛋白濃度，又可以控制作用時間，一般胞外蛋白濃度在20-1000nmol/L，即可產(chǎn)生 生物學(xué)作用。 6. PTD-融合蛋白亞細(xì)胞定位 TAT蛋白真正具有轉(zhuǎn)導(dǎo)作用的是其序列中一個富含堿性氨基酸、帶有正電荷的多 肽片段與跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)，因而被稱為蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(PTD，氨基酸47-57)。其核心序列為 YGRKKRRQRRR等電點12.7，為堿性。按照功能可以分為兩部分GRKKR起了蛋白核定位的 信號的作用；而序列中的精氨酸對蛋白的穿膜轉(zhuǎn)導(dǎo)作用十分重要。PTD通過核定位信號區(qū) (NLS)將PTD-融合蛋白固定在核上，這可能也是其低免疫原性的原因。 一般而言，在與PTD 融合后的目的蛋白，能夠通過PTD的核定位信號被定位于靶細(xì)胞核中，因此PTD融合蛋白可 以在細(xì)胞的胞漿和胞核中同時分布。
7.其他 Krosl等采用表達(dá)的TAT-H0XB4蛋白成功擴(kuò)增了造血干細(xì)胞，Veldhoen等采用酶 缺陷的Lck-HIV-Tat即酶缺陷的Lck-PTD轉(zhuǎn)導(dǎo)初始CD4+T細(xì)胞，結(jié)果其成功阻止了 CD4+T細(xì) 胞活化信號的內(nèi)傳，抑制了 T細(xì)胞活化，造成T細(xì)胞的無能。此外最近美國學(xué)者Joon-Yo皿g Kim等發(fā)現(xiàn)通過逆轉(zhuǎn)錄病毒將外源性的人 hScurfin轉(zhuǎn)染至Jurkat-T細(xì)胞，可使其轉(zhuǎn)變?yōu)門reg樣的細(xì)胞，能夠抑制與其共育的 CD4+CD25—T細(xì)胞增殖，并能夠調(diào)節(jié)Treg相關(guān)基因的表達(dá)。
8. PTD穿膜序列在造血和淋巴系統(tǒng)的應(yīng)用先例 Treg應(yīng)用于移植免疫耐受的誘導(dǎo)在國內(nèi)外已經(jīng)開始，但是天然Treg數(shù)量很少，擴(kuò) 增困難，因此近年來許多實驗室開始采用經(jīng)Fo鄧3基因轉(zhuǎn)染后具有調(diào)節(jié)性功能的T細(xì)胞誘 導(dǎo)移植免疫耐受，并取得了動物實驗的成功，但轉(zhuǎn)基因最大的缺點是轉(zhuǎn)染效率低(除逆轉(zhuǎn)錄病毒載體外)，表達(dá)調(diào)控比較困難，有潛在的危險，尤其是逆轉(zhuǎn)錄病毒載體有誘發(fā)基因突變的可能。2005年Veldhoen等采用酶缺陷的Lck-PTD轉(zhuǎn)導(dǎo)初始CD4+T細(xì)胞，成功誘導(dǎo)T細(xì)胞獲得調(diào)節(jié)功能，目前國內(nèi)外尚未見采用PTD與Fo鄧3基因構(gòu)建表達(dá)融合蛋白應(yīng)用于基礎(chǔ)和臨床研究的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供帶穿膜序列的人Scurfin蛋白全長及片段、及其制備方法。
本發(fā)明通過構(gòu)建hScurfin全長及片段的穿膜融合蛋白原核表達(dá)載體，并對表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行
改建，獲得功能性融合蛋白。 本發(fā)明提供了以下融合蛋白 PTD-hScurf in融合蛋白，具有SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列 PTD- A h FKH融合蛋白，具有SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列。 PTD- A hPRD融合蛋白，具有SEQ IDNO. 3所示的氨基酸序列。本文描述的PTD-hScurf in、PTD- A hFKH禾P PTD- A hPRD融合蛋白分別是人Scurf in
蛋白全長、缺失C端FKH及缺失N端PRD片段與HIV-TAT蛋白中PTD肽組成的融合蛋白。 本文描述的PTD-eGFP-hScurfin、 PTD-A hFKH-eGFP禾P PTD-A hPRD-eGFP融
合蛋白分別是帶穿膜序列的人Scurfin全長和eGFP融合蛋白、去除叉頭結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)域
(AForkhead domain, AFKH)的人Scurf in片段和eGFP的融合蛋白和去除富含脯氨酸結(jié)
構(gòu)域(AProline-rich domain, APRD)的人Scurf in片段和eGFP的融合蛋白。 本發(fā)明還提供了分別編碼上述6種融合蛋白的核酸構(gòu)建體，所說的核酸構(gòu)
建體，它含有編碼PTD-hScurfin、 PTD-AhFKH、 PTD-AhPRD、 PTD-eGFP-hScurfin、
PTD- A hFKH-eGFP或PTD- A hPRD-eGFP融合蛋白的氨基酸序列。 本發(fā)明提供了利用基因工程方法制備PTD-hScurfin、 PTD-AhFKH和PTD-AhPRD融合蛋白的方法，包括以下步驟①獲得編碼融合蛋白的基因序列；②將步驟①獲得的序列插入到合適的載體中，得到相應(yīng)的核酸構(gòu)建體；③將步驟②獲得的核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)化適宜的表達(dá)菌；④在適宜的培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)步驟③的表達(dá)菌，并加入適量的異丙基_ P -D-硫代半乳糖苷(Isopropyl-P-D-thiogalactoside， IPTG)，O. 2mM-lmM終濃度誘導(dǎo)表達(dá)，從中分離出表達(dá)的融合蛋白。⑤若步驟④的融合蛋白為包涵體形式表達(dá)則通過鎳柱在變性劑存在條件下親和純化。⑥純化產(chǎn)物通過去鹽柱后凍存?zhèn)溆谩?經(jīng)實驗表明，本發(fā)明所公開的融合蛋白穿入Jurkat T細(xì)胞和外周T細(xì)胞后，抑制Jurkat T細(xì)胞和外周T細(xì)胞活化增殖及調(diào)控外周T細(xì)胞分泌Treg功能相關(guān)細(xì)胞因子的。為大量制備Treg樣細(xì)胞或直接抑制T淋巴細(xì)胞增殖提供了新的方法，為體內(nèi)免疫耐受的誘導(dǎo)奠定了基礎(chǔ)。 上述融合蛋白作為活性成分可與其他藥用的稀釋劑、載體或賦形劑等制成藥物組合物。 上述的融合蛋白在制備Treg樣細(xì)胞、在制備預(yù)防和治療治療炎性免疫相關(guān)性疾病及免疫耐受誘導(dǎo)或腫瘤的藥物中的應(yīng)用。 本發(fā)明首次采用構(gòu)建PTD-hScurfin方式獲得融合蛋白，通過穿膜結(jié)構(gòu)域直接融合目的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)入Jurkat T和外周CD4+CD25—T細(xì)胞，以大量獲取Treg，突破制約Treg應(yīng)用的瓶頸，以期最終應(yīng)用于臨床的器官移植抗排斥治療。


圖1.是帶穿膜序列的載體pET28a-PTD質(zhì)粒結(jié)構(gòu)示意圖。
圖2.為融合蛋白構(gòu)建模式圖。 圖3.是hScurfin、 AhFKH禾P AhPRD PCR產(chǎn)物電泳鑒定圖。M :DL2000Marker ;1泳道:hScurfin PCR產(chǎn)物(1313bp) ;2泳道:AhFKH PCR產(chǎn)物
(1008bp) ;3泳道AhPRD PCR產(chǎn)物(705bp)。 圖4.顯示 了 PTD-hScurfin(A、 B禾口 C) 、 PTD-A hFKH、 PTD-A hPRD、 PTD-eGFP-hScurf in、 PTD- A hFKH-eGFP、 PTD- A hPRD-eGFP融合蛋白誘導(dǎo)表達(dá)及純化的 SDS-PAGE電泳圖結(jié)果。 A :PTD-hScurfin在BL21和Rosetta(DE3)中誘導(dǎo)表達(dá)，兩種工程菌在0. 2mM的 IPTG分別誘導(dǎo)2h 8h :M :蛋白低分子量標(biāo)準(zhǔn)Fermentas SM0441。 B :PTD-hScurf in在不同菌種中誘導(dǎo)表達(dá)M :蛋白低分子量標(biāo)準(zhǔn)Fermentas SM0441 ;1、2泳道超聲裂解產(chǎn)物沉淀及上清。 C :1泳道總菌體蛋白；2_7泳道PTD-hScurf in鎳柱純化洗脫產(chǎn)物(51kDa) ;M : 蛋白低分子量標(biāo)準(zhǔn)Fermentas SM0441。 D : 1-3泳道PTD- A hFKH鎳柱純化洗脫產(chǎn)物(43kDa) ;M :蛋白低分子量標(biāo)準(zhǔn) FermentasSM0441。 E : 1-5泳道PTD- A hPRD鎳柱純化洗脫產(chǎn)物(33kDa) ;M :蛋白低分子量標(biāo)準(zhǔn) FermentasSM0441。 F :1泳道PTD-hScurfin-eGFP鎳柱純化洗脫產(chǎn)物(80kDa) ;M :蛋白低分子量標(biāo)準(zhǔn) Fermentas SM0441。 G :1泳道PTD-eGFP-AhPRD鎳柱純化洗脫產(chǎn)物(70kDa) ;M :蛋白低分子量標(biāo)準(zhǔn) Fermentas SM0441。 H :1泳道PTD-eGFP-AhFKH鎳柱純化洗脫產(chǎn)物(61kDa) ;M :蛋白低分子量標(biāo)準(zhǔn) Fermentas SM0441。 圖5.顯示了 PTD-hScurfin、PTD-AhFKH和PTD-AhPRD融合蛋白表達(dá)的Western blots圖鑒定結(jié)果。 其中，1泳道PTD-hScurf in (51kDa) ;2禾口 4泳道Fermentas預(yù)染Marker ;3泳道 PTD-eGFP-hScurf in (80kDa) ;5泳道PTD-A hPRD (33kDa) ;6泳道PTD-A hFKH(43kDa) ;7 泳道PTD- A hPRD-eGFP (60kDa) ;8泳道PTD- A hFKH-eGFP (70kDa)。在該實驗中使用的一 抗為l : 1000抗6XHis-Tag ;二抗1 : 5000HRP-羊抗小鼠IgG。 圖6.顯示了融合蛋白的亞細(xì)胞定位分析的激光共聚焦照片(Hoechst33342和PI 分別染細(xì)胞核，綠色熒光是為觀察亞細(xì)胞定位構(gòu)建表達(dá)的融合蛋白PTD-hScurfin-eGFP、 PTD-A hFKH-eGFP和PTD-A hPRD-eGFP中eGFP的熒光)及Western-blot圖結(jié)果(目的蛋 白鑒定的一抗為l : 1000抗6XHis-Tag，二抗1 : 5000HRP-羊抗小鼠IgG，內(nèi)參蛋白的 一抗為抗GAPDH抗體)。 A :PTD-eGFP-hScurf in、PTD_eGFP- A hPRD和PTD-eGFP- A hFKH激光共聚焦顯微鏡分析圖(紫外激發(fā)光檢測呈藍(lán)色熒光的細(xì)胞核，綠色濾光片檢測呈紅色熒光的細(xì)胞核，藍(lán) 色濾光片檢測融合蛋白中eGFP綠色熒光)。 B :左圖PTD-hScurfin穿膜2h和24h免疫印跡分析；右圖胞漿和胞核蛋白提取
物中PTD-hScurfin、PTD-AhFKH和PTD-AhPRD的Western-blot圖。 圖7.顯示了分別使用PHA 0. 5ug/mL、lug/mL、5ug/mL，PHA lug/mL+PMA 25ng/mL、
PHA lug/mL+PMA 50ng/mL、PHA lug/mL+PMA 100ng/mL剌激Jurkat T細(xì)胞24h，剌激條件摸
索的實驗結(jié)果。 A:PHA lug/mL+PMA 50ng/mL剌激Jurkat T細(xì)胞12h顯微鏡下圖(10X ， 20X ， 40X)細(xì)胞表面出現(xiàn)突起，比較容易被分散。 B:未剌激Jurkat T細(xì)胞組，12h顯微鏡下圖(10 X ， 20 X ， 40 X)細(xì)胞保持原有容 易聚團(tuán)生長特點，表面未見突起。C :PHA lug/mL+PMA 50ng/mL剌激Jurkat T細(xì)胞24h， cck_8法測定490nm吸光度
分析細(xì)胞增殖。 圖8.顯示了 PTD-hScurf in、PTD- A hFKH和PTD- A hPRD融合蛋白640nM分別對經(jīng) PHA+PMA聯(lián)合剌激24h和48h的Jurkat T細(xì)胞增殖水平影響的CCK-8法測定的實驗結(jié)果。
A:PHA lug/mL+PMA 50ng/mL剌激Jurkat T細(xì)胞24h各融合蛋白處理組(640nM， 剌激前l(fā)h加入)及各對照組cck-8法測定490nm吸光度比較細(xì)胞增殖。
B :PHA lug/mL+PMA 50ng/mL剌激Jurkat T細(xì)胞48h各融合蛋白處理組(640nM， 剌激前l(fā)h加入)及各對照組cck-8法測定490nm吸光度比較細(xì)胞增殖(*p < 0. 05)。
圖9.顯示了 PTD-hScurf in、PTD- A hFKH和PTD- A hPRD融合蛋白640nM分別對經(jīng) PHA+PMA聯(lián)合剌激活化的外周T細(xì)胞增殖的影響。 A :不同濃度PHA+PMA或PMA+Ionomycin剌激后外周血T細(xì)胞增殖情況1 : Cells Control ;2 :PHA 0. 5 ii g/mL ;3 :PHA 1 ii g/mL ;4 :PHA 2 ii g/mL ;5 :PHA 1 ii g/ mL+PMA 50ng/mL ;6 :PHA 2 ii g/mL+PMA 30ng/mL ;7 :P廳.5 ii g/mL+PMA 100ng/mL ;8 : PMA30ng/mL+Ionomycinl. 2 u g/ml ;9 :PMA50ng/mL+Ionomycin 0. 8 u g/mL ;10 :PMA70ng/ mL+Ionomycin 0. 4iig/mL。 B :不同融合蛋白(640nm/L)和CsA (3 ii M)對經(jīng)PHA 1 ii g/mL+PMA 50ng/mL后 外周血淋巴細(xì)胞增殖的影響。[96孔板每孔接種IX 105， CsA、 PTD-eGFP、 PTD-hScurfin、 PTD-AhPRD和PTD-A hFKH融合蛋白分別與細(xì)胞共育lh，每組同時做3個復(fù)孔。而后加入 上述實驗得出的最適劑量的PHA/PMA(1 y g/mL/50ng/mL)剌激](*p < 0. 05)。
圖10.顯示了 Realtime PCR分析融合蛋白對外周T細(xì)胞經(jīng)PHA+PMA剌激后產(chǎn)生 IL-2的影響。 A :PHA 1 ii g/mL+PMA 50ng/mL剌激外周血T細(xì)胞后，不同時間點IL-2的轉(zhuǎn)錄水 平。(*p < 0. 05)B :不同融合蛋白(640nm/L)和CsA (3 ii M)對經(jīng)PHA 1 ii g/mL+PMA 50ng/mL后6 小時外周血T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生IL-2的影響。[6孔板每孔接種1X106/ml， CsA、 PTD-eGFP、 PTD-hScurf in、 PTD-AhPRD和PTD-AhFKH融合蛋白分別與細(xì)胞共育lh。而后加入上述實 驗得出的最適劑量的PHA/PMA(1 y g/mL/50ng/mL)剌激，實驗重復(fù)三次](*p < 0. 05)
圖11.顯示了 Realtime PCR分析融合蛋白對外周T細(xì)胞經(jīng)PHA+PMA剌激后產(chǎn)生IL-10的影響。 A :PHA 1 ii g/mL+PMA 50ng/mL剌激外周血T細(xì)胞后，不同時間點IL-10的轉(zhuǎn)錄水 平。(*p < 0. 05) B :不同融合蛋白(640nm/L)和CsA (3 ii M)對經(jīng)PHA 1 ii g/mL+PMA 50ng/mL后2 小時外周血T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生IL-10的影響。[6孔板每孔接種IX 106/ml， CsA、 PTD-eGFP、 PTD-hScurfin、 PTD-AhPRD和PTD-AhFKH融合蛋白分別與細(xì)胞共育lh。而后加入上述實 驗得出的最適劑量的PHA/PMA(1 y g/mL/50ng/mL)剌激，實驗重復(fù)三次](*p < 0. 05)
具體實施例方式
在具體實施方式
中所述的PTD-hScurfin、 PTD-AhFKH禾P PTD-AhPRD融合蛋白具 有SEQID NO. 1-3所示的氨基酸序列。 本發(fā)明提供了生產(chǎn)PTD-hScurf in、PTD- A hFKH禾P PTD- A hPRD融合蛋白的方法，該 方法包括下列步驟 1.獲得編碼PTD-hScurf in、 PTD- A hFKH和PTD- A hPRD融合蛋白的基因序列；
2.將步驟1獲得的序列插入到合適的載體中，得到相應(yīng)的核酸構(gòu)建體；
3.用步驟2獲得的核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)化合適的工程表達(dá)菌； 4.在適宜的培養(yǎng)條件下，誘導(dǎo)步驟3的轉(zhuǎn)化后的工程表達(dá)菌，并從中純化出 PTD-hScurf in 、 PTD- A hFKH和PTD- A hPRD融合蛋白。 5. PTD-hScurf in 、 PTD- A hFKH和PTD- A hPRD融合蛋白或攜帶eGFP作為示蹤的融 合蛋白的激光共聚焦觀察融合蛋白的亞細(xì)胞定位實驗。 6. PTD-hScurf in、PTD- A hFKH和PTD- A hPRD融合蛋白Western-blot鑒定和亞細(xì) 胞定位實驗。 7. PTD-hScurf in 、 PTD- A hFKH和PTD- A hPRD融合蛋白或攜帶eGFP作為示蹤的融 合蛋白的流式細(xì)胞儀檢測穿膜效率實驗。 8. Jurkat T細(xì)胞和外周CD4+CD25—T細(xì)胞的PHA+PMA活化增殖條件摸索實驗
9. PTD-hScurf in、PTD- A hFKH和PTD- A hPRD融合蛋白對Jurkat T細(xì)胞的增殖抑 制實驗。 10. PTD-hScurf in、PTD- A hFKH和PTD- A hPRD融合蛋白對外周T細(xì)胞的增殖抑制 實驗。 11. PTD-hScurf in、PTD- A hFKH禾P PTD- A hPRD融合蛋白抑制外周T細(xì)胞分泌IL-2 的實驗。 12. PTD-hScurf in 、 PTD- A hFKH和PTD- A hPRD融合蛋白促進(jìn)外周T細(xì)胞分泌 IL-10的實驗。 以上實驗所涉及的材料來源 pGEM T-Easy/hF0XP3質(zhì)粒(Amp抗性)為日本京都大學(xué)S. Sakaguchi教授惠贈。 pET28a(帶有His-Tag)質(zhì)粒購自Novagen公司產(chǎn)品，peGFP-Nl質(zhì)粒購自invitrogen公司 產(chǎn)品；大腸桿菌菌株DH5 a日本TAKALA公司產(chǎn)品；BL_21和Rosetta(DE3)均為Novagen公 司產(chǎn)品均由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部免疫學(xué)系陳慰峰院士贈送。pET28a-PTD質(zhì)粒(帶有His-tag)， pET28a-PTD-eGFP (帶有His-tag)載體本實驗室自行構(gòu)建。Ex TaqDNA聚合酶、T4DNA連接酶、核酸電泳分子量標(biāo)準(zhǔn)DL-2000(TaKaRa公司)；質(zhì)粒小量抽提試劑盒(Axygen公司)；質(zhì) 粒純化試劑盒(上海捷瑞公司)；限制性內(nèi)切酶(Sac I、Xho I、HindIII)及預(yù)染色低分子 量蛋白(Fermentas公司)；Bradford蛋白定量試劑盒(北京普利萊公司)；細(xì)胞增殖試劑盒 CCK8試劑盒(日本株式會社同仁化學(xué)研究所)。純化樹脂Profinity I MAC鎳金屬螯合填 料(美國Bio-Rad公司產(chǎn)品)，小鼠抗-6 XHis-Tag單克隆抗體(Cell Signaling公司)，小 鼠抗人F0XP3抗體(克隆號236A/E7， eBioscience公司)，HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG 二抗 (北京中杉金橋公司)，ECL-plus顯色試劑盒、PD-10去鹽預(yù)裝柱(美國GE公司)，E. coli Rosetta(DE3)， pET28a(+)質(zhì)粒和蛋白復(fù)性試劑盒(Novagen公司產(chǎn)品)，蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn) (Fermentas公司產(chǎn)品)，還原型谷胱甘肽(GSH)、氧化型谷胱甘肽(GSSG)、異丙基-P -D_硫 代半乳糖苷(IPTG Dioxane Free)(德國Merck公司產(chǎn)品)，PHA-P， NP_40， PMA， Hoechst 33342，青霉素，鏈霉素，卡那霉素，碘化丙啶(PI)和PMSF購自美國Sigma公司，透析袋(截 留分子量10， 000，美國Pierce公司)，小牛血清(杭州四季青公司)，Trizol， PMRH640, DMEM，小牛血清和胎牛血清購自美國Invitrogen公司，2XBri 11 iant SYBR Green QPCR Master Mix購自美國Stratagene公司，ReverTraAce購自日本T0Y0B0公司。其余常用的 各種鹽、酸、堿等化學(xué)試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純。 Jurkat T細(xì)胞株由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部T細(xì)胞研究室陳慰峰院士贈送。
引物見表l 表l.用于構(gòu)建各種表達(dá)載體的引物
Primer Pairs_Primer Sequence 5'-3'_Product Annealing (^=s
Size (bp)Temperature (。C)
Sense:AAGGATCCTATGGCAGGAAGAAGCGGAGA
CAGCGACGAAGAGAG CTCATGGTGAGCAAGG
PTD-eGFP(單劃線處為BamHl酶切位點，雙劃線處為Sac I
(N)酶切位點，BamH I和Sac I酶切位點之間為PTD序77556°C 30sec25
(primer 1)列)； Antisense:CCOAGCICTTACTTGTACAGCTCGTC (雙劃線處為Sacl酶切位點)
PTD-eGFP (C) (primer 2)Sense:AGAAAGCTTATGGTGAGCAAGG (劃線處為 HindHI酶切位點)73956°C 30sec25
Antisense:CCCTCGAGTTACTTGTACAGCTCGTC (劃線處為Xho I酶切位點)
Sense:GCCAAGCTTATGCCCAACCCCAG (劃線處為
FullFOXP3 HindIII酶切位點)129662。C30sec25
(primer 3)Antisense:GATCTCGAGTCAGGGGCCAGGTGTAG (劃 線處為XhoI酶切位點)
Sense:CATGAGCTCCGATGCCCAACCCCAG (Sac I酶
△FKH切位點)100862.9。C 30sec25
(primer 4)Antisense:GCAAGCTTCATGTTGTGGAACTTGAAG (劃線處為HindIII酶切位點)
Sense:CTGGAGCTCCGGGTGTCTGCAAGTGGCC
△PRD(SacI酶切位點)70562.9°C 30sec25
(primer 5)Antisense:TCAAGCTTGGGGCCAGGTGTAGGGTTG (劃線處為HindIII酶切位點)
以上步驟具體描述如下 1.制備并鑒定目的融合蛋白，包括步驟(1)_(4): (l)pET28a-PTD-eGFP(N)質(zhì)粒(eGFP在融合蛋白的N端)的構(gòu)建以peGFP-Nl質(zhì) 粒為模板，用引物對primer 1 (前向引物帶有PTD序列)通過PCR擴(kuò)增獲得帶PTD的eGFP 的序列，PCR產(chǎn)物使用GenClean瓊脂糖DNA凝膠回收試劑盒(上海捷瑞公司)進(jìn)行回收后， 然后插入經(jīng)BamH I和Sac I雙酶切的pET28a就完成質(zhì)粒的構(gòu)建。 (2)pET28a-PTD質(zhì)粒的構(gòu)建在pET28a-PTD-eGFP (N)質(zhì)粒構(gòu)建的基礎(chǔ)上，用Sac I 單酶切切除中間的eGFP即得到的是pET28a-PTD(圖1) (3) pET28a-PTD-eGFP (C)質(zhì)粒(eGFP在融合蛋白的C端)的構(gòu)建以peGFP-Nl質(zhì) 粒為模板，用引物對primer 2擴(kuò)增獲得的eGFP序列，PCR產(chǎn)物使用GenClean瓊脂糖DNA凝 膠回收后，插入經(jīng)Hind III和Xho I雙酶切的pET28a-PTD質(zhì)粒，即完成構(gòu)建。
(3) pET28a-PTD-hF0XP3禾口 pET28a-PTD-hF0XP3-eGFP表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建以 pGEMT-Easy/hF0XP3質(zhì)粒為模板，采用引物對primer 3通過PCR擴(kuò)增獲得h F0XP3的基因 序列，PCR產(chǎn)物使用GenClean瓊脂糖DNA凝膠回收后，分別插入經(jīng)Hind III和Xho I雙酶 切的pET28a-PTD質(zhì)粒和pET28a-PTD_eGFP (N)質(zhì)粒，即完成構(gòu)建。 (4) pET28a-PTD-A hFKH禾P pET28a-PTD_eGFP-A hFKH表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建以 pGEMT-Easy/hF0XP3質(zhì)粒為模板，采用引物對primer 4通過PCR擴(kuò)增獲得A hFKH的序列， PCR產(chǎn)物使用GenClean瓊脂糖DNA凝膠回收后，分別插入經(jīng)Sac I和Hind III雙酶切的 pET28a-PTD質(zhì)粒和pET28a-PTD_eGFP (C)質(zhì)粒，即完成構(gòu)建。 (5) pET28a-PTD-A hPRD和pET28a-PTD_eGFP-A hPRD表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建以 pGEMT-Easy/hF0XP3質(zhì)粒為模板，采用引物對primer 5，通過PCR擴(kuò)增獲得A hPRD的序列， PCR產(chǎn)物使用GenClean瓊脂糖DNA凝膠回收后，分別插入經(jīng)Sac I和Hind III雙酶切的 pET28a-PTD質(zhì)粒和pET28a-PTD_eGFP (C)質(zhì)粒，即完成構(gòu)建。 (6)構(gòu)建的質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化細(xì)菌，提取質(zhì)粒，采用T7通用引物，經(jīng)上海英駿生物 技術(shù)有限公司測序，證實PCR產(chǎn)物已經(jīng)準(zhǔn)確克隆到表達(dá)載體中。結(jié)果成功構(gòu)建了融合蛋 白的原核表達(dá)載體pET28a-PTD-hScurfin、 pET28a_PTD-A hFKH、 pET28a_PTD-A hPRD、 pET28a-PTD-eGFP-hScurfin、 pET28a_PTD-A hFKH-eGFP、 pET28a_PTD-A hPRD-eGFP (附圖 2)。將鑒定正確的克隆后的表達(dá)載體通過熱擊法轉(zhuǎn)化到工程表達(dá)菌Rosetta(DE3)大腸埃 希菌中，并通過抗生素Kana+(終濃度為50iig/ml)篩選陽性菌落。將陽性菌落抽提質(zhì)粒， 進(jìn)行PCR和酶切鑒定。(附圖3) 將鑒定正確的陽性菌落在ra7.0的LB管(Kana濃度為50iig/ml)中進(jìn)行增菌 培養(yǎng)，當(dāng)OD值二 0. 4 0. 6時，加入IPTG(Sigma公司)進(jìn)行誘導(dǎo)。經(jīng)過對誘導(dǎo)過程中 的時間梯度、溫度梯度、IPTG濃度梯度的實驗，最終確定IPTG誘導(dǎo)條件，PTD-hScurfin 和PTD-hScurfin-eGFP以30 。C、0. 2mmol/L誘導(dǎo)8h為最適誘導(dǎo)條件；PTD-AhFKH、 PTD- A hPRD、 PTD- A hFKH-eGFP和PTD- A hPRD-eGFP以30°C 、0. 5mmol/L誘導(dǎo)8h為最適誘 導(dǎo)條件。通過SDS-PAGE電泳分析確定目的蛋白的表達(dá)量最大(附圖4)。
收集在上述條件下誘導(dǎo)的部分菌體，加入適量的PBS，冰浴中超聲破碎，12000rpm/ min離心10分鐘，分別取上清和沉淀經(jīng)SDS-PAGE電泳分析，證實6種融合蛋白主要為包 涵體形式表達(dá)。然后取上清經(jīng)NitlMAC柱(Bio-Red公司)進(jìn)行親和層析純化。上樣前Ni+-IMAC柱先經(jīng)過10倍體積的上樣緩沖液洗柱。將超聲裂解完全的包涵體用結(jié)合緩沖 液(50mMNaH2P04 2H20、300mM NaCl、5mM咪唑、8M尿素，調(diào)整pH至8. 0)溶解后過濾，收 集濾液，按照Bio-Rad公司操作說明書在離心管中將濾液和Prof inity IMAC Ni-Charged Resin結(jié)合，4t:輕搖lh，然后裝柱，將流出液反復(fù)沖洗離心管，再上柱，以免蛋白丟失。將 流出液反復(fù)過柱3-4次。加洗滌緩沖液(50mM NaH2P04 2H20、300mM NaCl、 100mM咪唑、 8M尿素，調(diào)整pH至8. 0)，測定流出液的A280值，待A280趨近于0時，準(zhǔn)備加洗脫緩沖液 (50mMNaH2P04 2H20、300mM NaCl、300mM咪唑、8M尿素，調(diào)整pH至8. 0)。待洗滌緩沖液全 部流出后，加洗脫緩沖液。EP管收集流出液，并測定A280值。以上均在pH二8.0環(huán)境下進(jìn) 行，取收集的各組分樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，分析目的蛋白的純化效果和效率(附圖3)。 Ni"-IMAC純化后的蛋白過GE公司PD-10預(yù)裝柱脫鹽及尿素，而后-2(TC保存于10%甘油 溶液中備用，用時Bradford法定量融合蛋白。通過以上步驟成功誘導(dǎo)表達(dá)和分離純化了融 合蛋白PTD-hScurf in、PTD- A hFKH、PTD- A hPRD和PTD-eGFP-hScurf in、PTD- A hFKH-eGFP、 PTD-AhPRD-eGFP(附圖4)。純化的蛋白隨后進(jìn)行Western-blot鑒定( 一抗1 : 1000抗 6XHis-Tag，二抗:1 : 5000HRP-羊抗小鼠IgG)確認(rèn)為我們制備的目的蛋白(附圖5)。
2.融合蛋白進(jìn)行以下穿膜功能實驗
(1)細(xì)胞培養(yǎng)及穿膜效應(yīng)的流式細(xì)胞儀檢測 Jurkat T細(xì)胞，常規(guī)培養(yǎng)于含10 %小牛血清、100U/mL青霉素、100g/L鏈霉素的 RPMI-1640培養(yǎng)液。以2X 105/孔細(xì)胞濃度種于24孔板，與不同濃度(40nM， 160nM，640nM， 1280nM)的PTD-eGFP-目的蛋白共育2h， 4h， 12h， 24h。 1000 X g離心10min分別收集各孔細(xì) 胞用PBS洗3次，F(xiàn)ASCaliber流式細(xì)胞儀收集以及CellQuest軟件分析顯示融合蛋白最 佳穿膜濃度為640nM，穿膜的高峰在第2h，隨后隨著時間的延長穿膜效率逐漸下降。
(2)激光共聚焦顯微鏡觀測穿膜蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位 收集分別與640nM的PTD-eGFP-hScurf in、PTD- A hFKH-eGFP和PTD- A hPRD-eGFP 融合蛋白共育2h的細(xì)胞，1000Xg離心10min。預(yù)冷PBS洗2遍，1000 X g離心，5min。加 入O. 5mL 4%多聚甲醛固定液，緩緩懸起細(xì)胞，固定30分鐘。離心去固定液，用PBS洗2遍， 洗滌期間手動晃動。加入PI染色液(終濃度50i!g/mL)緩緩懸起細(xì)胞，4t:避光染色30分 鐘，PBS洗滌。加25yL PBS重懸細(xì)胞并滴加至載玻片上，蓋上潔凈的蓋玻片，指甲油封片。 共聚焦顯微鏡下使用綠色濾光片檢測呈紅色熒光的細(xì)胞核，使用藍(lán)色濾光片檢測融合蛋白 中eGFP綠色熒光。另外加入Hoechst33342(終濃度2ug/mL)到與640nM蛋白共育2h的 活細(xì)胞體系中(24孔板中，2X107孔)37t:孵箱中染色10min，共聚焦顯微鏡下使用紫外激 發(fā)光檢測呈藍(lán)色熒光的細(xì)胞核，使用藍(lán)色濾光片檢測融合蛋白中eGFP綠色熒光。結(jié)果從影 像上確認(rèn)無論活細(xì)胞還是細(xì)胞固定后對細(xì)胞核進(jìn)行染色后經(jīng)激光共聚焦斷層三維定位分 析均見大部分細(xì)胞胞內(nèi)含帶有eGFP綠色熒光的目的融合蛋白，并且該融合蛋白能夠穿入 細(xì)胞核內(nèi)。(附圖6A) (3)胞漿和胞核蛋白提取及免疫印跡檢測 1000 Xg離心10min收集分另U與640nM的PTD-hScurf in、 PTD-AhFKH和 PTD-AhPRD融合蛋白共育2h禾口24h的Jurkat T細(xì)胞，用4。C預(yù)冷的PBS洗3遍，加400 yl冷 Buffer A(10mMHEPEs、10mM KC1、0. lmM EDTA、0. lmM EGTA、0. 5mM PMSF，pH7. 9)，冰浴10min ; 加25ii 1 10% NP-40， Vortex 10s，冰浴10min， 12000Xg離心15s，收集上清，即為胞槳蛋白；力口50ii l冷Buffer B(20mM HEPEs、0. 4M NaCl、lmM EDTA、lmM EGTA、lmM PMSF、lmMDTT， pH7.9)至沉淀，置冰上30min;12000Xg離心10min，收集上清，即為胞核蛋白；加等量的 2XSDS上樣緩沖液，煮沸5min，-8(TC凍存?zhèn)溆?。提取的胞漿胞核蛋白用12% SDS-PAGE膠 分離；350mA 2h將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜；用5%脫脂牛奶(溶解于TBS/T液)封閉lh ;加抗 6XHis-Tag(1 : 1000)，4。C過夜，用TBS/T洗滌3次；加HRP-羊抗小鼠IgG(l : 5000)，室 溫lh， TBS/T洗滌3次；加ECL-Plus化學(xué)發(fā)光劑，作用5min，掃膜，拍照；一抗二抗剝脫液 洗膜5-10min，封閉lh，4。C過夜孵育抗GAPDH抗體(1 : 1000) ， TBS/T洗滌，HRP-羊抗小鼠 IgG(l : 5000)室溫靜置lh，TBS/T洗滌后ECL-Plus顯色，掃描檢測GAPDH內(nèi)參蛋白，結(jié)果 從另一方面進(jìn)一步確認(rèn)了激光共聚焦分析的結(jié)果制備的融合蛋白均能在2h-24h內(nèi)穿透 細(xì)胞膜進(jìn)入胞內(nèi)并定位于核內(nèi)，且截至穿膜第24h細(xì)胞核內(nèi)仍存在目的融合蛋白，而此時 細(xì)胞質(zhì)提取物中已無法用Western-blot檢測出靶蛋白(附圖6B)。
3.細(xì)胞增殖抑制實驗 (1) Jurkat T細(xì)胞和外周血T細(xì)胞剌激條件的摸索 分別使用PHA 0. 5ug/mL、lug/mL、5ug/mL， PHA lug/mL+PMA 25ng/mL、 PHAlug/ mL+PMA 50ng/mL、 PHA lug/mL+PMA 100ng/mL剌激Jurkat T細(xì)胞觀察6h， 12h， 24h剌激效 果，經(jīng)實驗最終選取的最適剌激劑量為PHA lug/mL+PMA 50ng/mL，剌激時間選取24h(附 圖7)。 (2) CCK-8法檢測細(xì)胞增殖 Jurkat T細(xì)胞增殖抑制試驗將細(xì)胞用含10%小牛血清的1640培養(yǎng)液調(diào)整適量 的濃度。將Jurkat T細(xì)胞分別以2 X 104每孔種于96孔板。以環(huán)孢霉素A (CsA) ， PTD-eGFP 融合蛋白及hScurfin蛋白做對照組，實驗組分別加入640nM的各融合蛋白與細(xì)胞共育lh， 每組同時做3個復(fù)孔。而后加入最適劑量的PHA(l y g/mL)+PMA(50ng/mL)剌激，將細(xì)胞置于 37°C ， 5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于PHA+PMA剌激第18h和第42h加入CCK-8試劑10 y 1/ 孔(總體積100uL/孔)，繼續(xù)培養(yǎng)6小時，用酶標(biāo)儀檢測490nm時的吸光度，分析數(shù)據(jù)顯示 PHA+PMA聯(lián)合剌激24h和48h后PTD-hScurf in、PTD- A hPRD (終濃度640nM)與對照組相比 對JurkatT細(xì)胞的增殖具有明顯的抑制作用，而在剌激48h后PTD-AhFKH(終濃度640nM) 也呈現(xiàn)出明顯抑制作用，其中PTD-hScurfin的抑制效果與CsA陽性對照組相當(dāng)(附圖8)。
外周T細(xì)胞增殖抑制試驗將外周T細(xì)胞用含10%小牛血清的1640培養(yǎng)液調(diào)整適 量的濃度。將外周血T細(xì)胞分別以1 X 105每孔種于96孔板。以CsA (終濃度為3 ii M)為陽性 對照，以PTD-eGFP及hScurfin融合蛋白(640nM)作為陰性對照組，實驗組PTD-hScurfin、 PTD- A hPRD和PTD- A hFKH融合蛋白濃度分別以640nM分別與細(xì)胞共育lh，每組同時做3個 復(fù)孔。而后加入上述實驗得出的最適劑量的PHA(ly g/mL)+PMA(50ng/mL)剌激，將細(xì)胞置 于37°C ， 5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，于PHA+PMA剌激第20h加入CCK-8試劑10 y1/孑L (總體積 100 y L/孔)，繼續(xù)培養(yǎng)4h，用酶標(biāo)儀檢測490nm時的吸光度，分析數(shù)據(jù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)不加蛋 白剌激的空白組PBMC增殖明顯；不帶穿膜序列的hF0XP3蛋白，對PBMC的增殖無明顯影響； 而帶穿膜序列的全長PTD-hScurfin顯著抑制PBMC的增殖；帶穿膜序列的PTD- A hPRD片段 的抑制能力高于PTD-AhFKH片段，但均低于全長的PTD-hScurfin，說明FKH區(qū)域在Fo鄧3 的抑制功能中起重要的作用，而PRD片段(N末端富含脯氨酸區(qū)域)也有一定的抑制功能。 試驗說明，我們所構(gòu)建的PTD-hScurf in、PTD- A hPRD和PTD- A hFKH融合蛋白具有抑制外周T細(xì)胞的增殖的生物學(xué)功能。(*P<0.05)。(附圖9)。
3.調(diào)控Treg功能相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)實驗 細(xì)胞因子IL-2和IL-10的RT-PCR檢測采集健康人肝素抗凝外周血，經(jīng)淋巴細(xì)胞
分離液分離獲得外周單個核細(xì)胞，經(jīng)貼壁去除巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞，然后采用CD19和CDS
單抗和補(bǔ)體殺傷去除B細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞，洗滌后將細(xì)胞接種于6孔板，每孔2 X 106，分別與
CsA (3 ii M) 、PTD-eGFP、PTD-hScurf in、PTD- A hPRD和PTD- A hFKH等融合蛋白(640nM)共育
lh，而后加入PHA(ly g/mL)+PMA(50ng/mL)剌激活化細(xì)胞0h， 2h， 4h， 6h， 8h，收集細(xì)胞。收集
每個樣本2X 106個細(xì)胞，按常規(guī)Trizol裂解法提取總RNA。 按照下列體現(xiàn)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄 Reagent volume 5 X reaction buffer 4. 0 li 1 d證mix (10mM each) l.Oyl Recombinant RNase inhibitor 0. 5 li 1 M-MLV reverse transcriptase l.Oul Total 6. 5ul 混勻后42"反應(yīng)20分鐘，94t:加熱5分鐘滅活以終止cDNA合成，4" 5分鐘。再 按照下列體系進(jìn)行梯度PCR擴(kuò)增在0. 2ml PCR管中建立10 y 1PCR反應(yīng)體系，加入的各成
分分別為10XPCR buffer1 ii 1d證s(10mM each)1 ii 1Forward primer0. 2ii 1Reverse primer0. 2ii 1cDNA0. 2ii 1Taq DNA聚合酶0. 06ii 1無菌水7. 34ii 1總體積10 ii 1混勻后94t:預(yù)變性2分鐘，進(jìn)行梯度PCR擴(kuò)增。
各基因擴(kuò)增所用引物和PCR反應(yīng)所選擇的溫度為
1. P —actin Forwardprimer :CAC GAA ACT ACC TTC AAC TCC ;
Reverse primer :CATACTCCTGCT TGC TGA TC ;2.IL-2Forward primer :CAA AGA AAA CAC AGC TAC AACT ;
Reverse primer :TCTCATCAGCAT ATT CAC ACAT ;3.IL-lOForward primer :AGG GCA CCC AGT CTG AGAACA ;
Reverse primer :CGGCCTTGCTCT TGT TTT CAC4.所選溫度為53. 3 °C ， 54. 2 °C ， 55. 2 °C ， 56. 4 °C ， 57. 5 °C ， 58. 5 °C ， 59. 4 °C ，60. 0°C，60. 4t:，摸索合適的退火溫度，最后確定采用56t:作為退火溫度。
將上述擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物回收，連接T載體，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，并測序鑒定。采 用realtimeRT-PCR測定細(xì)胞因子IL-2和IL-10的表達(dá)水平。以上述cDNA為模板， 2XSYBRGreen QPCRMaster MIX,在置于冰上的0. 2ml PCR管中依次加入下列成分
2XMIX7. 5ii 1腿(i : 500)0. 3ii 1Forward primer0. 2ii 1Reverse primer0. 2ii 1cDNA1. Oil 1ddH205. 8ii 1總體積15ii 1混勻，瞬時離心5秒，使各反應(yīng)成分集中于PCR管底。反應(yīng)條件如下95。C lOmin，
95°C 30sec，56。C 30sec，72。C lmin(acquire fluorescence) ，40循環(huán)。
外周血T細(xì)胞經(jīng)過剌激PHA+PMA剌激后，在6 8h時IL_2轉(zhuǎn)錄水平最高，因此 采用剌激6h作為最合適的時間點進(jìn)行試驗。結(jié)果發(fā)現(xiàn)PTD-hScurfin、 PTD-AhPRD和 PTD- A hFKH能夠抑制外周血T細(xì)胞分泌IL-2、其中PTD-hScurf in、PTD- A hPRD具有顯著性 意義，而PTD-AhFKH未見統(tǒng)計學(xué)意義(圖10)。外周血T細(xì)胞剌激后IL-10的分泌水平逐 步上升，在2h時水平比較低，因此比較適合觀察融合蛋白提高其產(chǎn)生IL-10的作用，因此選 擇2h剌激作為實驗時間點。結(jié)果發(fā)現(xiàn)PTD-hScurf in、PTD- A hPRD和PTD- A hFKH能夠促進(jìn) 外周血T細(xì)胞分泌IL-10、其中PTD-hScurf in、PTD- A hPRD具有顯著性意義，而PTD- A hFKH 未見統(tǒng)計學(xué)意義(圖ll)。
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0176]〈211>482
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0178]〈213〉人
0179]〈400>1
0180]Met Gly Ser SerHisHisHisHisHisHisSerSerGlyLeuValPro
0181]151015
0182]Arg Gly Ser HisMetAlaSerMetThrGlyGlyGinGinMetGlyArg
0183]202530
0184]Gly Ser Tyr GlyArgLysLysArgArgGinArgArgArgGluLeuArg
0185]354045
0186]Arg Gin Ala LeuProAsnProArgProGlyLysProSerAlaProSer
0187]505560
0188]Leu Ala Leu GlyProSerProGlyAlaSerProSerTrpArgAlaAla
0189]65707580
0190]Pro Lys Ala SerAspLeuLeuGlyAlaArgGlyProGlyGlyThrPhe0191]859095
0192]GinGlyArgAspLeuArgGlyGlyAlaHisAlaSerSerSerSerLeu
0193]100105110
0194]AsnProMetProProSerGinLeuGinLeuProThrLeuProLeuVal
0195]115120125
0196]MetValAlaProSerGlyAlaArgLeuGlyProLeuProHisLeuGin
0197]130135140
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0207]210215220
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0211]245250255
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0224]ProAspSerLeuPheAlaValArgArgHisLeuTrpGlySerHisGly
0225]355360365
0226]AsnSerThrPheProGluPheLeuHisAsnMetAspTyrPheLysPhe
0227]370375380
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0229]385390395400
lieLeuGluAla Pro GluLysGinArgThrLeuAsnGlulieTyrHis405410415TrpPheThrArg Met PheAlaPhePheArgAsnHisProAlaThrTrp420425430LysAsnAlalie Arg HisAsnLeuSerLeuHisLysCysPheValArg435440445ValGluSerGlu Lys GlyAlaValTrpThrValAspGluLeuGluPhe450455460ArgLysLysArg Ser GinArgProSerArgCysSerAsnProThrPro465470475■GlyPro〈210>2〈211>388〈212>PRT〈213〉人〈400>2MetGlySerSer His HisHisHisHisHisSerSerGlyLeuValPro151015ArgGlySerHis Met AlaSerMetThrGlyGlyGinGinMetGlyArg202530GlySerTyrGly Arg LysLysArgArgGinArgArgArgGluLeuArg354045ArgGinAlaSer Met ProAsnProArgProGlyLysProSerAlaPro505560SerLeuAlaLeu Gly ProSerProGlyAlaSerProSerTrpArgAla65707580AlaProLysAla Ser AspLeuLeuGlyAlaArgGlyProGlyGlyThr859095PheGinGlyArg Asp LeuArgGlyGlyAlaHisAlaSerSerSerSer100105110LeuAsnProMet Pro ProSerGinLeuGinLeuProThrLeuProLeu115120125ValMetValAla Pro SerGlyAlaArgLeuGlyProLeuProHisLeu130135140GinAlaLeuLeu Gin AspArgProHisPheMetHisGinLeuSerThr145150155160ValAspAlaHis Ala ArgThrProValLeuGinValHisProLeuGlu165170175SerProAlaMet lie SerLeuThrProProThrThrAlaThrGlyVal
180185190PheSerLeuLysAlaArgProGlyLeuProProGlylieAsnValAla195200205SerLeuGluTrpValSerArgGluProAlaLeuLeuCysThrPhePro210215220AsnProSerAlaProArgLysAspSerThrLeuSerAlaValProGin225230235240SerSerTyrProLeuLeuAlaAsnGlyValCysLysTrpProGlyCys245250255GluLysValPheGluGluProGluAspPheLeuLysHisCysGinAla260265270AspHisLeuLeuAspGluLysGlyArgAlaGinCysLeuLeuGinArg275280285GluMetValGinSerLeuGluGinGinLeuValLeuGluLysGluLys290295300LeuSerAlaMetGinAlaHisLeuAlaGlyLysMetAlaLeuThrLys305310315320AlaSerSerValAlaSerSerAspLysGlySerCysCyslieValAla325330335AlaGlySerGinGlyProValValProAlaTrpSerGlyProArgGlu340345350AlaProAspSerLeuPheAlaValArgArgHisLeuTrpGlySerHis355360365GlyAsnSerThrPheProGluPheLeuHisAsnMetAspTyrPheLys370375380PheHisAsnMet385〈210>3〈211>287〈212>PRT〈213〉人〈400>3MetGlySerSerHisHisHisHisHisHisSerSerGlyLeuValPro151015ArgGlySerHisMetAlaSerMetThrGlyGlyGinGinMetGlyArg202530GlySerTyrGlyArgLysLysArgArgGinArgArgArgGluLeuArg354045ArgGinAlaSerGlyValCysLysTrpProGlyCysGluLysValPhe
505560GluGluProGluAspPheLeuLysHisCysGinAlaAspHisLeuLeu65707580AspGluLysGlyArgAlaGinCysLeuLeuGinArgGluMetValGin859095SerLeuGluGinGinLeuValLeuGluLysGluLysLeuSerAlaMet100105110GinAlaHisLeuAlaGlyLysMetAlaLeuThrLysAlaSerSerVal115120125AlaSerSerAspLysGlySerCysCyslieValAlaAlaGlySerGin130135140GlyProValValProAlaTrpSerGlyProArgGluAlaProAspSer145150155160LeuPheAlaValArgArgHisLeuTrpGlySerHisGlyAsnSerThr165170175PheProGluPheLeuHisAsnMetAspTyrPheLysPheHisAsnMet180185190ArgProProPheThrTyrAlaThrLeulieArgTrpAlalieLeuGlu195200205AlaProGluLysGinArgThrLeuAsnGlulieTyrHisTrpPheThr210215220ArgMetPheAlaPhePheArgAsnHisProAlaThrTrpLysAsnAla225230235240lieArgHisAsnLeuSerLeuHisLysCysPheValArgValGluSer245250255GluLysGlyAlaValTrpThrValAspGluLeuGluPheArgLysLys260265270ArgSerGinArgProSerArgCysSerAsnProThrProGlyPro27528028權(quán)利要求
一種PTD-hScurfin融合蛋白，其特征在于，具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列
2. —種PTD-Ah FKH融合蛋白，其特征在于，具有SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列。
3. —種PTD-Ah PRD融合蛋白，其特征在于，具有SEQ ID NO. 3所示的氨基酸序列。
4. 一種核酸構(gòu)建體，其特征在于，它含有編碼權(quán)利要求1-3中任何一項所述的融合蛋 白的氨基酸序列。
5. —種制備權(quán)利要求1-3中任一項所述的融合蛋白的方法，其特征在于，該方法包括 下列步驟(l)獲得編碼融合蛋白的基因序列；(2)將步驟(1)獲得的序列插入到合適的載 體中，得到相應(yīng)的核酸構(gòu)建體；(3)將步驟(2)獲得的核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)化適宜的表達(dá)菌；(4) 在適宜的培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)步驟(3)的表達(dá)菌，并加入適量的異丙基-e-D-硫代半乳糖苷， 0. 2mM-lmM終濃度誘導(dǎo)表達(dá)，從中分離出表達(dá)的融合蛋白。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，當(dāng)步驟(4)的融合蛋白為包涵體形式 表達(dá)的，在步驟(4)后還有將包涵體通過鎳柱在變性劑存在條件下親和純化，純化產(chǎn)物通 過去鹽柱后凍存?zhèn)溆谩?br> 全文摘要
本發(fā)明涉及基因工程及蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)的生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及帶穿膜序列的人Scurfin全長、去除叉頭結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)域人Scurfin片段和去除富含脯氨酸結(jié)構(gòu)域人Scurfin片段的融合蛋白及制備方法。所說的帶穿膜序列的人Scurfin全長、去除叉頭結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)域人Scurfin片段和去除富含脯氨酸結(jié)構(gòu)域人Scurfin片段的融合蛋白分別具有SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ IDNO.3所示的氨基酸序列。本發(fā)明首次采用構(gòu)建PTD-hScurfin方式獲得融合蛋白，通過蛋白穿膜結(jié)構(gòu)域直接介導(dǎo)融合目的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)入Jurkat T和外周CD4+CD25-T細(xì)胞，以大量獲取Treg，突破制約Treg應(yīng)用的瓶頸，以期最終應(yīng)用于臨床的器官移植抗排斥治療。
文檔編號C07K19/00GK101704893SQ200910221169
公開日2010年5月12日 申請日期2009年11月2日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月2日
發(fā)明者徐三榮, 田雨香, 藺欣, 許遜, 邵啟祥 申請人:江蘇大學(xué)