專利名稱：異核苷化合物或其亞磷酰胺衍生物及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一類異核苷化合物或其亞磷酰胺衍生物，還涉及其制備方法以及該類化合物在修飾SiRNA和脫氧寡核苷酸上的應(yīng)用。反義寡核苷酸(ASONs)是研究最為廣泛和深入的一類核酸類藥物，長約15_20bp， 能夠與同源的RNA序列雜交，抑制特定基因的轉(zhuǎn)錄翻譯過程或者破壞靶RNA的結(jié)構(gòu)，從而達(dá)到治療疾病的目的。天然結(jié)構(gòu)的寡核苷酸作為藥物，不能透過細(xì)胞膜，且易被體內(nèi)核酶降解，生物利用度不高，因此需要對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾以改善其生物性質(zhì)。硫代磷酸二酯鍵修飾的寡核苷酸Vitravene ，作為抑制細(xì)胞巨化病毒引起的視網(wǎng)膜炎的反義藥物，采用靜脈注射的方式能夠安全有效的治療此種疾病，是第一個(gè)獲準(zhǔn)在美國、歐洲和南美上市的反義藥物。目前，各種不同化學(xué)修飾的反義寡核苷酸正處于臨床研究的不同階段，希望能夠用于治療癌癥。繼反義寡核苷酸和核酶技術(shù)之后，上世紀(jì)90年代后期科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)了 RNA 干擾技術(shù)，具有不同于反義技術(shù)的基因靶向機(jī)理。RNA干擾作用使長鏈尤其是雙鏈的 RNA轉(zhuǎn)變?yōu)榧s21堿基長度的RNA信號(hào)分子，包括siRNAs (small interfering RNAs)和 miRNAs(microRNAs)。siRNAs和miRNAs參與特異性的蛋白復(fù)合物的形成，抑制mRNA的轉(zhuǎn)錄或翻譯，或者催化mRNA的降解。由于RNA干擾作用能夠高效、特異的阻斷基因表達(dá)，因此在基因功能以及蛋白質(zhì)相互作用等方面展示了誘人的前景，同時(shí)siRNAs在抗腫瘤抗病毒的基因治療中也表現(xiàn)出巨大的潛力。與ASONs類似，天然結(jié)構(gòu)的siRNAs不能夠完全滿足作為基因藥物的需要，必要的化學(xué)修飾能夠改善其體內(nèi)穩(wěn)定性、透膜性、生物利用度等特性， 提高其沉默效應(yīng)。ASONs化學(xué)修飾方法的研究對(duì)siRNAs的結(jié)構(gòu)修飾有很大的幫助，但由于 siRNAs作用機(jī)制和自身結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，其化學(xué)修飾也比ASONs要復(fù)雜，仍需要深入的研究。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服未經(jīng)修飾的反義寡核苷酸和SiRNA的缺點(diǎn)，本發(fā)明的目的在于提供一種能夠用來修飾反義寡核苷酸和siRNA以提高其生物學(xué)或藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)的一類異核苷化合物或其亞磷酰胺衍生物。該類化合物能夠有效地提高經(jīng)過其修飾的寡核苷酸的酶穩(wěn)定性，并且還能夠保持該寡核苷酸的基因沉默效率。為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案一類異核苷化合物，具有如式I所示的結(jié)構(gòu)
權(quán)利要求
1.類異核苷化合物，具有如式I所示的結(jié)構(gòu)
2.制備權(quán)利要求1所述異核苷化合物的方法，式I中η = 1時(shí)的異核苷采用如下合成方法Α.將式II中所示化合物，通過微波輔助加熱法與1，8_二氮雜雙環(huán)(5. 4. 0)十一-7-烯 (DBU)和不同堿基反應(yīng)生成式III中所示化合物，其中的堿基包括胸腺嘧啶基(T)、尿嘧啶基(U)、胞嘧啶基(C)和腺嘌呤基㈧或鳥嘌呤基(G)；B.將式III中所示的化合物，經(jīng)過酸水解二甲縮醛，再經(jīng)硼氫化鈉還原得式I所示化合物，其中水解的酸包括不同濃度的鹽酸或不同濃度的三氟乙酸； 或，式I中η = 2時(shí)的異核苷采用如下合成方法Α.將式IV中所示中間體與苯甲酰氯反應(yīng)，使苯甲酰氯對(duì)3’羥基進(jìn)行保護(hù)；
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其中所述微波輔助加熱法的反應(yīng)條件是利用微波合成儀，以N，N-二甲基甲酰胺為溶劑，時(shí)間30min，溫度180°C，吸收水平為高，預(yù)攪拌時(shí)間 30 60s。
4.一類異核苷亞磷酰胺單體，具有式XIX所示的通式
5.制備權(quán)利要求4所述的異核苷亞磷酰胺單體的方法，其中，異核苷亞磷酰胺單體中堿基B為腺嘌呤基或胞嘧啶基時(shí)采取如下合成方法A.將式I所述化合物，先與三甲基氯硅烷反應(yīng)，再與苯甲酰氯反應(yīng)，再脫除三甲基硅醚鍵，使苯甲酰基保護(hù)腺嘌呤或胞嘧啶上的氨基，將具有苯甲?；Ｗo(hù)的式I所示的化合物與組分M反應(yīng)，得到化合物D，所述組分M為4，4’ - 二甲氧基-三苯甲基氯；B.將化合物D與組分C反應(yīng)，得到具有苯甲?；Ｗo(hù)式XIX所示的化合物；所述組分C 為2-氰乙氧基-N，N- 二異丙基-氯代亞磷酰胺或2-氰乙氧基-N，N，N’，N’ -四異丙基-亞磷酰胺；或者，其中，異核苷亞磷酰胺單體中堿基B為胸腺嘧啶基、尿嘧啶基和鳥嘌呤基時(shí)采取如下合成方法將式I中所述化合物與組分M反應(yīng)，得到化合物E，所述組分M為4，4’- 二甲氧基-三苯甲基氯；將化合物E與組分C反應(yīng)，得到式XIX所示的化合物；所述組分C為2-氰乙氧基-N，N- 二異丙基-氯代亞磷酰胺或2-氰乙氧基-N，N, N’，N’ -四異丙基-亞磷酰胺。
6.權(quán)利要求1所述的異核苷化合物或權(quán)利要求4所述的異核苷亞磷酰胺單體在修飾 siRNA和脫氧寡核苷酸領(lǐng)域中的應(yīng)用。
7.一種異核苷修飾的反義寡核苷酸或siRNA，其包括一個(gè)或多個(gè)權(quán)利要求1所述的異核苷化合物或權(quán)利要求4所述的異核苷亞磷酰胺單體。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的反義寡核苷酸鏈或siRNA鏈，其還可以包括2’-0_甲基核苷酸(2’ -OMe)、2’ -脫氧-2’ -氟代(2’ -F)核苷酸、鎖定核酸(LNA)核苷酸，以及它們的混I=I ο
9.合成權(quán)利要求7或8所述的反義寡核苷酸或siRNA的方法，是使用固相合成，采用亞磷酰胺法，在DNA合成儀上摻入一個(gè)或多個(gè)權(quán)利要求1所述的異核苷化合物或權(quán)利要求 4所述的異核苷亞磷酰胺單體。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的合成方法，其特征在于一般每偶聯(lián)一個(gè)核苷為一個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括四個(gè)反應(yīng)脫DMT、偶聯(lián)、封閉、氧化。
11.根據(jù)權(quán)利要求9所述的合成方法，其特征在于在摻入位使用異核苷亞磷酰胺單體代替天然核苷的亞磷酰胺單體在相應(yīng)位置進(jìn)行偶聯(lián)。
12.根據(jù)權(quán)利要求9所述的合成方法，其特征在于由于異核苷常規(guī)條件下的偶聯(lián)收率較低，需增加異核苷亞磷酰胺單體的進(jìn)樣次數(shù)和每次進(jìn)樣后的偶聯(lián)時(shí)間以保證合成的收率。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的合成方法，其特征在于合成寡核苷酸鏈的條件是采用增加異核苷亞磷酰化單體的進(jìn)樣次數(shù)(3次)和每次進(jìn)樣后的偶聯(lián)時(shí)間(300秒/次)；合成 siRNA的條件是每個(gè)循環(huán)偶聯(lián)時(shí)間增加至45分鐘(900秒/次x3次)。
14.一種寡核苷酸鏈和siRNA鏈5’ -端磷酸化的方法，其特征在于是使用DNA合成儀固相合成的，可用于研究5’ -端磷酸化后的寡核苷酸和siRNA對(duì)其生物學(xué)功能的影響。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的固相合成方法，其特征在于在5’端延長一位使用組分C代替正常的亞磷酰胺單體在相應(yīng)位置進(jìn)行偶聯(lián)，組分C為2-氰乙氧基-N，N- 二異丙基-氯代亞磷酰胺或2-氰乙氧基-N，N, N’，N’ -四異丙基-亞磷酰胺。
全文摘要
本發(fā)明提供了一類異核苷化合物或其亞磷酰胺衍生物，該類化合物能夠有效地提高經(jīng)過其修飾的寡核苷酸的基因沉默效率，并且還能夠保持該寡核苷酸的酶穩(wěn)定性。本發(fā)明還提供了該類異核苷化合物或其亞磷酰胺衍生物的制備方法，還提供了寡核苷酸5’端磷酸化的固相合成方法，以及該類化合物在修飾寡核苷酸中的應(yīng)用。
文檔編號(hào)C07D405/04GK102212065SQ20101014667
公開日2011年10月12日 申請(qǐng)日期2010年4月12日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月12日
發(fā)明者關(guān)注, 張亮仁, 張俊, 張禮和, 楊振軍, 王卓, 黃野 申請(qǐng)人:北京大學(xué)