專利名稱：一種別藻藍(lán)蛋白標(biāo)記的熒光抗抗體的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種別藻藍(lán)蛋白(Allophycocyanin，APC)標(biāo)記的熒光抗抗體的制備 方法，屬于免疫熒光檢測領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
免疫熒光檢測法是一種歷史悠久的標(biāo)記分析法，兼具抗原、抗體反應(yīng)的特異性及 熒光檢測的靈敏性，廣泛應(yīng)用于疾病檢測和生物學(xué)研究中。免疫熒光檢測法的特異性和敏 感性依賴于熒光染料、抗體及熒光探針的屬性和質(zhì)量。實(shí)際應(yīng)用時(shí)，由于血清和其他生物樣 品發(fā)射波長為400-600nm的本底熒光，與常用的FITC等傳統(tǒng)熒光染料的熒光發(fā)射光譜重 疊，嚴(yán)重降低熒光檢測的靈敏度，造成一段時(shí)期內(nèi)熒光檢測法發(fā)展緩慢。藻膽蛋白是存在于紅藻和藍(lán)藻細(xì)胞中的一類水溶性的色素蛋白的總稱，是藻類捕 光天線復(fù)合物的重要組成部分，能夠高效捕獲并傳遞光能。藻膽蛋白分為藻紅蛋白(PE)、 藻藍(lán)蛋白(PC)、別藻藍(lán)蛋白(APC)和藻紅藍(lán)蛋白(PEC)四大類，具有水溶性大、無毒性、穩(wěn) 定性好、熒光量子產(chǎn)率高、斯托克位移大、熒光明亮、熒光不易淬滅等優(yōu)點(diǎn)，是優(yōu)秀的熒光染 料。藻膽蛋白應(yīng)用于熒光檢測，極大地提高了熒光檢測的靈敏度，促使多色熒光檢測和能量 共振轉(zhuǎn)移(FRET)熒光探針檢測成為現(xiàn)實(shí)。別藻藍(lán)蛋白(APC)的穩(wěn)定態(tài)為(α β )3，分子量約為IlOkDa, Amax = 620_650nm， Em = 660nm，摩爾消光系數(shù)為7 X IO5CnT1M-1,熒光量子產(chǎn)率為68%。APC是藻膽蛋白中發(fā)射 熒光波長最大的一類，能夠發(fā)射明亮的紅色熒光，極易與生物質(zhì)本底的藍(lán)色或綠色熒光區(qū) 分，因此APC幾乎不受生物質(zhì)本底熒光影響，熒光檢測靈敏度明顯提高，APC的檢測靈敏度 是cy5的7倍。APC是少有的長波長發(fā)射的熒光染料，紅光激發(fā)紅光發(fā)射，促進(jìn)了 633nm氦 氖激光器的應(yīng)用。APC是優(yōu)秀的發(fā)射紅色熒光的染料，但由于APC分離純化困難、穩(wěn)定性差，蛋白質(zhì) 交聯(lián)時(shí)難以定量控制，造成APC標(biāo)記得率低，生產(chǎn)成本高，甚至造成APC失活、熒光喪失，限 制了這一優(yōu)秀染料在臨床檢測中的應(yīng)用。國內(nèi)外尚沒有APC標(biāo)記熒光抗體應(yīng)用于動(dòng)物疫病 檢測的報(bào)道。本發(fā)明采用適宜摩爾比的化學(xué)交聯(lián)劑SPDP分別將APC、抗抗體衍生，然后定量 交聯(lián)高效制備了 APC標(biāo)記的熒光抗抗體，可作為通用熒光探針用于雞或豬傳染病的間接免 疫熒光檢測。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及一種別藻藍(lán)蛋白(APC)標(biāo)記的熒光抗抗體的制備方法。本發(fā)明采用的螺旋藻別藻藍(lán)蛋白(APC)是優(yōu)秀的熒光染料，具有無毒性、水溶性 大、熒光明亮且不易淬滅等特點(diǎn)，檢測靈敏度顯著高于傳統(tǒng)的FITC等熒光染料。APC在熒光 染料中獨(dú)樹一幟，在波長550-650nm的光激發(fā)下，APC能發(fā)射明亮的紅色熒光，是少有的發(fā) 射長波長熒光染料，而且APC等紅色熒光染料的發(fā)現(xiàn)促進(jìn)了 633nm氦氖激光器在熒光檢測 中大量應(yīng)用。
3
APC的組成和晶體結(jié)構(gòu)特點(diǎn)決定了其穩(wěn)定性低于其它藻膽蛋白，因此交聯(lián)時(shí)控制 使用交聯(lián)劑的濃度是關(guān)鍵，交聯(lián)劑濃度不僅影響交聯(lián)得率還影響熒光特性。本發(fā)明選擇 SPDP與APC和抗抗體的摩爾比分別為20-50 U50-100 1，衍生后的APC與抗體以摩 爾比1-2 1交聯(lián)，制備的APC標(biāo)記的熒光抗抗體交聯(lián)效率高、純度高、熒光明亮、抗體活性 好、穩(wěn)定性好。本發(fā)明的解決方案如下別藻藍(lán)蛋白(APC)的制備APC為采用陰離子交換層析法由鈍頂螺旋藻 (Spirulina platensis)中分離純化。純化步驟為藻體細(xì)胞加入5倍體積(v/w)的2OmM 磷酸緩沖液(PH6. 8-7. 0)，反復(fù)凍融3次，4°C IOOOOrpm離心，上清液中加入硫酸銨至終濃 度為60% (w/v)，4°C冰箱放置24h，離心，沉淀溶于20mM的磷酸緩沖液(pH7)中，用20mM 的磷酸緩沖液(PH7)透析，透析液經(jīng)DEAE Sepharose Fast Flow陰離子交換色譜柱層析， 離子交換柱經(jīng)20mM醋酸緩沖液(pH5. 0，含50mM NaCl)預(yù)平衡，洗脫液為20mM醋酸緩沖液 (pH3. 6，含50mM NaCl)，洗脫速度為60mL/h，收集天藍(lán)色液體即為純化的螺旋藻別藻藍(lán)蛋 白。純化的APC硫酸銨沉淀4°C避光保存，使用前用50mM pH7. 5PBS充分透析除鹽，調(diào)整濃 度為 5-10mg/mLoAPC標(biāo)記熒光抗抗體的制備抗抗體(抗雞IgG抗體、抗豬IgG抗體)購自Sigma 公司，電泳檢測純度達(dá)電泳純，對(duì)流免疫電泳法檢測抗抗體具有良好的生物學(xué)活性，使用時(shí) 用PBS透析，調(diào)整蛋白濃度為5-10mg/ml。APC與抗抗體的交聯(lián)采用蛋白質(zhì)交聯(lián)法技術(shù)，利 用異型雙功能交聯(lián)劑SPDP分別在APC、抗抗體上衍生吡啶二硫基團(tuán)，然后用DTT還原抗抗體 的衍生物為其引入游離-SH，將攜帶吡啶二硫基的APC衍生物與攜帶巰基的抗抗體按一定 摩爾比交聯(lián)制備熒光抗抗體。SPDP與APC、抗抗體的摩爾比分別為20-50 1,50-100 1， DTT與衍生抗體的摩爾比為50-100 1，SPDP衍生的APC與帶-HS的抗抗體再以摩爾比 1-2 1液相交聯(lián)制備APC標(biāo)記的熒光抗抗體。APC標(biāo)記的熒光抗抗體的高效純化和交聯(lián)效率分析液相色譜工作站上采用HPLC 法進(jìn)行熒光抗抗體的純化和交聯(lián)效率分析，流動(dòng)相為50mM pH7. 5的PBS，流速0. 5mL/min, 檢測波長190-800nm。采用分子篩高壓液相色譜柱純化，液相柱型號(hào)為TSK G3000sw (規(guī)格 7. 5mmX60cm)，熒光標(biāo)記抗抗體最先被洗脫下來(附圖1)。收集洗脫峰，進(jìn)行光譜學(xué)、抗體 活性、電泳檢測。目標(biāo)產(chǎn)物的洗脫峰面積占所有洗脫峰面積的比例即為交聯(lián)得率。APC標(biāo)記熒光抗抗體的光譜檢測吸收光譜在紫外_可見光分光光度計(jì)上測定， 掃描波長區(qū)間250-700nm。吸收光譜檢測可判定交聯(lián)是否成功及交聯(lián)反應(yīng)是否導(dǎo)致APC 變性。室溫?zé)晒獍l(fā)射光譜在熒光分光光度計(jì)上測定，激發(fā)波長580·，熒光掃描范圍為 600-700nmo APC標(biāo)記熒光抗抗體在紫外區(qū)的吸光度明顯高于對(duì)照APC，吸收峰位置相同，這 是因?yàn)锳PC表面交聯(lián)了 280nm有較強(qiáng)的光吸收的抗抗體分子，而在450-700nm區(qū)間，交聯(lián)物 的吸收光譜與APC的吸收峰及吸光度相似，這是因?yàn)榭箍贵w在此范圍內(nèi)無光吸收。APC標(biāo)記 光抗抗體與對(duì)照APC在580nm激發(fā)光的激發(fā)下，室溫?zé)晒獍l(fā)射波長均位于660nm，沒有發(fā)生 斯托克位移改變，仍具有APC的特征熒光發(fā)射光譜，且熒光亮度無明顯降低(附圖2)。APC標(biāo)記熒光抗抗體的效價(jià)檢測對(duì)流免疫電泳法檢測APC標(biāo)記熒光抗抗體的免 疫學(xué)活性。APC標(biāo)記熒光抗抗體與雞IgG形成天藍(lán)色免疫沉淀線，不用染色就可清晰地觀察 到沉淀線的位置(附圖3)。天藍(lán)色免疫沉淀線的形成進(jìn)一步說明抗抗體與APC交聯(lián)成功，同時(shí)也說明交聯(lián)反應(yīng)對(duì)抗抗體的免疫學(xué)活性影響不大，交聯(lián)物仍保留較高的抗體活性。APC標(biāo)記熒光抗抗體的電泳檢測=SDS-PAGE在垂直板不連續(xù)電泳裝置上進(jìn)行，分 離膠濃度為12. 5%，濃縮膠濃度為5%，218V恒壓電泳。用0. 25% (w/v)考馬斯亮藍(lán)R-250 染色，脫色后觀察結(jié)果。SDS-PAGE電泳發(fā)現(xiàn)APC標(biāo)記熒光抗抗體既具有APC的α、β亞基 條帶，又具有抗體的H、L鏈條帶(附圖4)，電泳結(jié)果證實(shí)APC與抗抗體交聯(lián)成功。APC標(biāo)記熒光抗抗體的穩(wěn)定性檢測純化的APC標(biāo)記熒光抗抗體中加入0. 02%疊 氮化鈉，4°C避光保存，每隔30天測定一次熒光光譜和抗體效價(jià)，觀察熒光亮度和抗體活性 的變化。研制的APC標(biāo)記熒光抗抗體在0. 05mol/L的磷酸緩沖液中4°C保存60天，熒光強(qiáng) 度保持不變，隨后隨著保存時(shí)間推移熒光強(qiáng)度緩慢降低，但降幅較小。熒光抗抗體4°C保存 90天抗體效價(jià)維持在5Log 2，隨后抗體效價(jià)隨保存時(shí)間推遲而緩慢降低(附圖5)。總之，APC標(biāo)記熒光抗抗體發(fā)射明亮紅色熒光，4°C保存60天熒光亮度和抗體活性 無衰減，可作為通用熒光探針用于雞、豬等動(dòng)物傳染病的間接免疫熒光檢測，省去了直接免 疫熒光檢測時(shí)需要針對(duì)每種病原制備熒光標(biāo)記抗體的麻煩，采用間接免疫熒光抗體即可方 便地進(jìn)行雞、豬等畜種的傳染病的病原的免疫熒光檢測，而且抗抗體可具有信號(hào)放大功能。


附圖1為APC標(biāo)記抗雞IgG熒光抗抗體的HPLC純化圖。液相柱型號(hào)為TSK G3000sw，流動(dòng)相為50mM pH7. 5的PBSr1^iI 0. 5mL/min,APC標(biāo)記熒光抗抗體的洗脫時(shí)間為 19. 57min，抗抗體和APC的洗脫時(shí)間分別為27. 32,31. 26min。附圖2為APC標(biāo)記抗雞IgG熒光抗抗體(虛線)及對(duì)照APC(實(shí)線)的吸收光譜 (A)和熒光光譜(B)。APC標(biāo)記熒光抗抗體在紫外區(qū)的吸光度明顯高于對(duì)照APC，吸收峰位 置相同，在450-700nm區(qū)間，交聯(lián)物的吸收光譜與APC的吸收峰及吸光度相似。APC標(biāo)記熒 光抗抗體與對(duì)照APC在580nm激發(fā)光的激發(fā)下，室溫?zé)晒獍l(fā)射波長均位于660nm，沒有發(fā)生 斯托克位移改變，仍具有APC的特征熒光發(fā)射光譜，且熒光亮度無明顯降低。附圖3為APC標(biāo)記抗雞IgG熒光抗抗體與雞IgG的對(duì)流免疫電泳。APC標(biāo)記熒光 抗抗體與雞IgG形成天藍(lán)色免疫沉淀線，不用染色就可清晰地觀察到沉淀線的位置。 附圖4為APC標(biāo)記抗雞IgG熒光抗抗體的SDS-PAGE電泳。APC標(biāo)記熒光抗抗體既 具有APC的α、β亞基條帶，又具有抗體的H、L鏈條帶。附圖5為不同保存時(shí)間的APC標(biāo)記抗雞IgG熒光抗抗體的熒光亮度(A)和抗體活 性⑶。APC標(biāo)記熒光抗抗體在0. 05mol/L的磷酸緩沖液中4°C保存60天，熒光強(qiáng)度保持不 變，隨后隨著保存時(shí)間推移熒光強(qiáng)度緩慢降低。熒光抗抗體4°C保存90天抗體效價(jià)維持在 5Log 2，隨后抗體效價(jià)隨保存時(shí)間推遲而緩慢降低。
具體實(shí)施例方式實(shí)施方式1 :APC標(biāo)記的抗雞IgG熒光抗抗體的制備方法別藻藍(lán)蛋白(APC)的制備APC由鈍頂螺旋藻(Spirulina platensis)中分 離純化。藻體細(xì)胞加入5倍體積(V/w)20mM磷酸緩沖液(pH6. 8-7.0)，反復(fù)凍融3次， 40C IOOOOrpm離心，上清液中加入硫酸銨至終濃度為60% (w/v)，4°C冰箱放置24h，離心， 沉淀溶于20mM的磷酸緩沖液(pH7)中，20mM的磷酸緩沖液(pH7)透析，透析液上DEAE
5Sepharose Fast Flow陰離子交換色譜柱層析，離子交換柱經(jīng)20mM醋酸緩沖液(pH5. 0，含 50mM NaCl)預(yù)平衡，洗脫液為20mM醋酸緩沖液(pH3.6，含50mM NaGl)，洗脫速度為60mL/ h，收集天藍(lán)色液體即為純化的螺旋藻別藻藍(lán)蛋白。純化的螺旋藻APC純度達(dá)電泳純，純度 指數(shù)A650A280 >5，結(jié)構(gòu)式為(α β)3，分子量約為IlOkDa,最大吸收峰位于650歷，620歷處 有一肩峰，室溫?zé)晒獍l(fā)射峰位于660nm，純化的APC硫酸銨沉淀4°C避光保存，使用前用50mM pH7. 5PBS充分透析除鹽，調(diào)整濃度為5-10mg/mL。APC標(biāo)記抗雞IgG熒光抗抗體的制備抗雞IgG抗體購自Sigma公司，用20mM磷酸 緩沖液(PH6. 8-7. 0)透析，調(diào)整抗體濃度為8mg/mL。交聯(lián)過程為準(zhǔn)確稱取SPDP，以DMSO 溶解配制SPDP母液。將SPDP按摩爾比分別為50 UlOO 1與APC、抗雞IgG抗體混勻， 鋁箔封好后于室溫旋轉(zhuǎn)反應(yīng)2h，超濾離心除去多余的SPDP。取DTT按100 1的摩爾比 與抗抗體衍生物充分混勻，室溫靜置反應(yīng)lh，超濾離心除去多余的DTT?？箍贵w-HS與APC 衍生物以摩爾比1 2混勻，鋁箔封好后于20-25°C振蕩反應(yīng)20h。用10mg/ml的NEM溶液 20ul封閉多余巰基，室溫旋轉(zhuǎn)反應(yīng)60min。反應(yīng)中的NEM不用除去。APC標(biāo)記抗雞IgG熒光抗抗體的純化和交聯(lián)效率分析液相色譜工作站上采 用HPLC法分析交聯(lián)效率和純化，流動(dòng)相為50mM PBS pH 7. 5，流速0. 5mL/min,檢測 波長190-800nm。采用分子篩高壓液相色譜柱純化，液相柱型號(hào)TSK G3000sw(規(guī)格 7. 5mmX60cm)。洗脫順序依次為熒光抗抗體、游離的抗抗體、游離的APC，洗脫時(shí)間分別出現(xiàn) 在19. 57,27. 32,31. 26min(附圖1)。收集19. 57min出現(xiàn)的洗脫峰，即為APC標(biāo)記抗雞IgG 熒光抗抗體。第一個(gè)洗脫峰的面積占所有洗脫峰面積的比例即為交聯(lián)效率，本法制備的熒 光抗抗體的交聯(lián)效率為92%。APC標(biāo)記熒光抗抗體的光譜檢測吸收光譜在紫外_可見光分光光度計(jì)上測定，掃 描波長區(qū)間250-700nm。室溫?zé)晒獍l(fā)射光譜在熒光分光光度計(jì)上測定，激發(fā)波長580nm，熒 光掃描范圍為600-700nm。在紫外區(qū)，APC標(biāo)記熒光抗抗體的吸光度明顯高于對(duì)照APC，吸 收峰位置相同，這是因?yàn)锳PC表面交聯(lián)了抗抗體分子，而抗抗體在280nm有較強(qiáng)的光吸收； 450-600nm范圍內(nèi)，交聯(lián)物的吸收光譜與對(duì)照APC的吸收峰位置及吸光度無差別，因?yàn)榭箍?體在此范圍內(nèi)無光吸收。通過吸收光譜檢測可判定交聯(lián)成功，同時(shí)交聯(lián)反應(yīng)沒有導(dǎo)致APC 變性。APC標(biāo)記熒光抗抗體與對(duì)照APC在580nm激發(fā)光的激發(fā)下，室溫?zé)晒獍l(fā)射波長均位于 660 nm，具有APC的特征熒光發(fā)射光譜，沒有發(fā)生斯托克位移的改變，且熒光亮度無明顯降 低(附圖2)。APC標(biāo)記熒光抗抗體的效價(jià)檢測對(duì)流免疫電泳法檢測APC標(biāo)記熒光抗抗體的免 疫學(xué)活性。取10-15mL熔化的的離子瓊脂(0.03M pH 8. 6的巴比妥緩沖液配制)趁熱 倒在電泳板槽中，待冷卻后打孔。孔直徑約為4mm，孔間距約為5mm。打孔后在酒精燈上烘 烤背面，使瓊脂層與電泳板貼緊。用生理鹽水稀釋雞IgG為0. 5mg/mL,吸取20_40uL注于 正極端各孔；用生理鹽水稀釋APC標(biāo)記熒光抗抗體成lmg/mL，吸取20_40uL，注于負(fù)極端孔 中。在電泳板正、負(fù)電極端與電極槽緩沖液間用濾紙搭橋，150V穩(wěn)壓電泳4h。APC標(biāo)記熒光 抗抗體與雞IgG形成天藍(lán)色免疫沉淀線，不用染色就可清晰地觀察到沉淀線的位置(附圖 3)。天藍(lán)色免疫沉淀線的形成，進(jìn)一步說明抗抗體成功地與APC進(jìn)行了交聯(lián)，同時(shí)也說明交 聯(lián)反應(yīng)對(duì)抗抗體的免疫學(xué)活性影響不大，交聯(lián)物仍然保留較高的抗體活性。APC標(biāo)記熒光抗抗體的電泳檢測=SDS-PAGE在垂直板不連續(xù)電泳裝置上進(jìn)行，分離膠濃度為12. 5%，濃縮膠濃度為5%，218V恒壓電泳，用0. 25% (w/v)考馬斯亮藍(lán)R-250 染色。APC標(biāo)記熒光抗抗體既具有APC的α、β亞基條帶，又具有抗體的H、L鏈條帶(附 圖4)，電泳結(jié)果證實(shí)APC與抗抗體交聯(lián)成功，且純度達(dá)電泳純。APC標(biāo)記熒光抗抗體的穩(wěn)定性檢測純化的APC標(biāo)記熒光抗抗體中加入0. 02 %疊 氮化鈉，4°C避光保存，每隔30天測定一次熒光光譜和抗體效價(jià)，觀察熒光亮度和抗體活性 的變化。研制的APC標(biāo)記熒光抗抗體在0. 05mol/L的磷酸緩沖液中4°C保存60天，熒光抗 抗體的熒光強(qiáng)度保持不變，隨后隨著保存時(shí)間推移熒光強(qiáng)度緩慢降低，但降幅較小。4°C保 存90天，熒光抗抗體的抗體效價(jià)維持在5Log 2，然后抗體效價(jià)隨著保存時(shí)間延長而緩慢降 低(附圖5)。實(shí)施方式2 =APC標(biāo)記的抗豬IgG熒光抗抗體的制備方法別藻藍(lán)蛋白(APC)的制備APC由鈍頂螺旋藻(Spirulina platensis)中分 離純化。藻體細(xì)胞加入5倍體積(V/w)20mM磷酸緩沖液(pH6. 8-7.0)，反復(fù)凍融3次， 40C IOOOOrpm離心，上清液中加入硫酸銨至終濃度為60% (w/v)，4°C冰箱放置24h，離心， 沉淀溶于20mM的磷酸緩沖液(pH7)中，20mM的磷酸緩沖液(pH7)透析，透析液上DEAE Sepharose Fast Flow陰離子交換色譜柱層析，離子交換柱經(jīng)20mM醋酸緩沖液(pH5. 0，含 50mM NaCl)預(yù)平衡，洗脫液為20mM醋酸緩沖液(pH3.6，含50mM NaCl)，洗脫速度為60mL/ h，收集天藍(lán)色液體即為純化的螺旋藻別藻藍(lán)蛋白。純化的螺旋藻APC純度達(dá)電泳純，純度 指數(shù)A650A280 >5，結(jié)構(gòu)式為(α β)3，分子量約為IlOkDa,最大吸收峰位于650歷，620歷處 有一肩峰，室溫?zé)晒獍l(fā)射峰位于660nm，純化的APC硫酸銨沉淀4°C避光保存，使用前用50mM pH7. 5PBS充分透析除鹽，調(diào)整濃度為5-10mg/mL。APC標(biāo)記抗豬IgG熒光抗抗體的制備抗豬IgG抗體購自Sigma公司，用20mM磷 酸緩沖液(PH6. 8-7. 0)透析，調(diào)整抗體濃度為10mg/mL。以DMSO溶解SPDP配制SPDP母液， 現(xiàn)配現(xiàn)用。將SPDP按摩爾比分別為50 1,60 1與APC、抗豬IgG抗體混勻，鋁箔封好后 于室溫旋轉(zhuǎn)反應(yīng)2h，超濾離心除去多余的SPDP。取DTT按60 1的摩爾比與抗抗體衍生 物充分混勻，室溫靜置反應(yīng)lh，超濾離心除去多余的DTT?？箍贵w-HS與APC衍生物以摩 爾比1 1混勻、液相交聯(lián)，鋁箔封好后于20-25°C振蕩反應(yīng)20h。用10mg/ml的NEM溶液 20ul封閉多余巰基，室溫旋轉(zhuǎn)反應(yīng)60min。反應(yīng)中的NEM不用除去。APC標(biāo)記抗豬IgG熒光抗抗體的純化和交聯(lián)效率分析液相色譜工作站上采 用HPLC法進(jìn)行交聯(lián)效率分析和純化，采用分子篩高壓液相色譜柱純化，液相柱型號(hào)TSK G3000sw(規(guī)格 7. 5mmX60cm)，流動(dòng)相為 50mM PBS pH 7. 5，流速 0. 5mL/min，檢測波長 190-800nm。洗脫順序依次為熒光抗抗體、游離的抗抗體、游離的APC，洗脫曲線與APC標(biāo)記 的抗雞IgG熒光抗抗體(附圖1)基本一致，洗脫峰分別出現(xiàn)在19. 57,27. 32,31. 26min。這 是由于抗雞IgG抗體與抗豬IgG抗體分子量相同。收集19. 57min出現(xiàn)的洗脫峰，即為APC 標(biāo)記抗豬IgG熒光抗抗體。第一個(gè)洗脫峰的面積占所有洗脫峰面積的比例即交聯(lián)效率為 90%。APC標(biāo)記抗豬IgG熒光抗抗體的光譜檢測吸收光譜在紫外_可見光分光光度計(jì) 上測定，掃描波長區(qū)間250-700nm。室溫?zé)晒獍l(fā)射光譜在熒光分光光度計(jì)上測定，激發(fā)波長 580nm，熒光掃描范圍為600-700nm。光譜檢測結(jié)果與附圖2相同。APC標(biāo)記熒光抗抗體在紫 外區(qū)的吸光度高于對(duì)照APC，吸收峰位置相同；450-600nm范圍內(nèi)，交聯(lián)物的吸收光譜與APC
7的吸收峰及吸光度無差別。通過吸收光譜檢測可判定交聯(lián)成功，且交聯(lián)反應(yīng)沒有導(dǎo)致APC 變性。APC標(biāo)記熒光抗抗體與對(duì)照APC在580nm激發(fā)光的激發(fā)下，室溫?zé)晒獍l(fā)射波長均位于 660nm,沒有發(fā)生斯托克位移的改變，仍具有APC的特征熒光，且熒光亮度無明顯降低。APC標(biāo)記抗豬IgG熒光抗抗體的效價(jià)檢測取10_15mL熔化的的離子瓊脂 (0. 03MpH 8.6的巴比妥緩沖液配制)趁熱倒在電泳板槽中，待冷卻后打孔。孔直徑約為 4mm，孔間距約為5mm。打孔后在酒精燈上烘烤背面，使瓊脂層與電泳板貼緊。用生理鹽水 稀釋雞IgG為0. 5mg/mL,吸取20_40uL注于正極端各孔；用生理鹽水稀釋APC標(biāo)記抗豬IgG 熒光抗抗體為lmg/ml，吸取20-40uL，注于負(fù)極端孔中。在電泳板正、負(fù)電極端與電極槽緩 沖液間用濾紙搭橋，接通電源，150V穩(wěn)壓電泳4h。APC標(biāo)記抗豬IgG熒光抗抗體與豬IgG抗 體同樣形成天藍(lán)色免疫沉淀線，不用染色就可清晰地觀察到沉淀線的位置。免疫沉淀線的 形成說明抗抗體與APC交聯(lián)成功，同時(shí)交聯(lián)物仍然保留較高的抗體活性。APC標(biāo)記抗豬IgG熒光抗抗體的電泳檢測=SDS-PAGE在垂直板不連續(xù)電泳裝置上 進(jìn)行，分離膠濃度為12. 5%，濃縮膠濃度為5%。218V恒壓電泳，用0. 25% (w/v)考馬斯亮 藍(lán)R-250染色，脫色后觀察結(jié)果。SDS-PAGE電泳發(fā)現(xiàn)APC標(biāo)記熒光抗抗體既具有APC的α、 β亞基條帶，又具有抗體的H、L鏈條帶，表明APC與抗豬IgG抗體交聯(lián)成功。APC標(biāo)記抗豬IgG熒光抗抗體的穩(wěn)定性檢測純化的APC標(biāo)記熒光抗抗體中加入 0. 02%疊氮化鈉，4°C避光保存，每隔30天測定一次熒光光譜和抗體效價(jià)。APC標(biāo)記抗豬IgG 熒光抗抗體穩(wěn)定性與APC標(biāo)記抗雞IgG熒光抗抗體相近，4°C保存60天熒光強(qiáng)度保持不變， 隨后緩慢降低；4°C保存90天，熒光抗抗體的抗體效價(jià)維持在5Log2，然后隨著保存時(shí)間延 長而緩慢降低。
權(quán)利要求
一種別藻藍(lán)蛋白(Allophycocyanin，APC)標(biāo)記的熒光抗抗體的制備方法，包括陰離子交換層析法分離純化螺旋藻APC，分別用摩爾比為20 50∶1、50 100∶1的化學(xué)交聯(lián)劑SPDP將APC、抗抗體衍生，抗抗體的SPDP衍生物經(jīng)摩爾比50 100∶1的DTT還原獲得帶 HS的抗抗體，帶 HS的抗抗體與APC的SPDP衍生物以摩爾比1∶1 2液相交聯(lián)，經(jīng)HPLC純化制備出熒光抗抗體，制備的熒光抗抗體得率高、純度高、穩(wěn)定性好、熒光呈明亮的紅色，可作為通用熒光探針用于雞、豬傳染病的快速免疫熒光檢測。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中APC由鈍頂螺旋藻(Spirulinaplatensis)中分離純 化，制備過稱為藻體細(xì)胞加入5倍體積(v/w) 20mM磷酸緩沖液(pH6. 8 7. 0)，反復(fù)凍融 3次，4°C IOOOOrpm離心，上清液中加入硫酸銨至終濃度為60% (w/v)，4°C冰箱放置24h，離 心，沉淀溶于20mM的磷酸緩沖液(pH7)中，20mM的磷酸緩沖液(pH7)透析，透析液經(jīng)DEAE Sepharose Fast Flow陰離子交換柱層析純化，離子交換柱經(jīng)20mM醋酸緩沖液(pH5. 0，含 50mM NaCl)預(yù)平衡，洗脫液為20mM醋酸緩沖液(pH3.6，含50mM NaCl)，洗脫速度為60mL/ h，收集天藍(lán)色液體即為純化的螺旋藻別藻藍(lán)蛋白，純化的螺旋藻APC純度達(dá)電泳純，純度 指數(shù)A650A280 >5，結(jié)構(gòu)式為(α β)3，分子量約為IlOkDa,最大吸收峰位于650nm，在620nm 處有一肩峰，室溫?zé)晒獍l(fā)射峰位于660nm，純化的APC硫酸銨沉淀4°C避光保存，使用前用 50mM pH7. 5PBS充分透析除鹽，調(diào)整濃度為5_10mg/mL。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中抗抗體為抗雞IgG抗體、抗豬IgG抗體，購自Sigma公 司，電泳檢測純度達(dá)電泳純，對(duì)流免疫電泳法檢測抗抗體具有良好的生物學(xué)活性，使用時(shí)用 PBS透析，調(diào)整蛋白濃度為5-10mg/ml。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中熒光抗抗體采用化學(xué)交聯(lián)法在液相體系中交聯(lián)制備， 制備步驟為調(diào)整APC、抗抗體的濃度為5-10mg/ml，以DMSO準(zhǔn)確配制SPDP母液，分別用雙 功能化學(xué)交聯(lián)劑SPDP衍生APC、抗抗體，SPDP與APC、抗抗體的摩爾比分別為20-50 1、 50-100 1，混勻、鋁箔封好后于室溫旋轉(zhuǎn)反應(yīng)2h，超濾離心除去多余的SPDP。取DTT按 50-100 1的摩爾比與抗抗體衍生物充分混勻，室溫靜置反應(yīng)lh，超濾離心除去多余的 DTT,抗抗體-HS與APC衍生物以摩爾比1 1-2混勻，鋁箔封好后于20_25°C振蕩反應(yīng)20h。 加NEM封閉多余巰基，室溫旋轉(zhuǎn)反應(yīng)60min。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中熒光抗抗體經(jīng)HPLC純化，純化在液相色譜工作站上進(jìn) 行，液相柱型號(hào) TSK G3000SW (規(guī)格 7. 5mmX 60cm)，流動(dòng)相為 50mM pH 7. 5PBS，流速 0. 5ml/ min，檢測波長190-800nm，收集洗脫19. 57min出現(xiàn)的產(chǎn)物峰，經(jīng)光譜、電泳、抗體活性檢測 合格置4°C避光保存。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種別藻藍(lán)蛋白(Allophycocyanin，APC)標(biāo)記的熒光抗抗體的制備方法。制備過程包括陰離子交換層析法分離純化螺旋藻APC，用化學(xué)交聯(lián)劑SPDP分別將APC、抗抗體衍生，兩種衍生物再以適宜摩爾比液相交聯(lián)，經(jīng)高壓液相色譜純化制備出APC標(biāo)記的熒光抗抗體。本發(fā)明制備的熒光抗抗體交聯(lián)效率高、純度高、紅色熒光明亮、穩(wěn)定性好、靈敏度高，可作為通用熒光探針用于雞、豬等動(dòng)物傳染病的間接免疫熒光檢測。
文檔編號(hào)C07K14/405GK101980019SQ20101028433
公開日2011年2月23日 申請(qǐng)日期2010年9月17日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月17日
發(fā)明者呂愛杰, 姚強(qiáng), 朱麗萍, 趙守山, 顏世敢 申請(qǐng)人:顏世敢