專利名稱：一種納米膠原寡肽的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種膠原蛋白的提取方法，具體涉及一種納米膠原寡肽的制備方法。
背景技術(shù)：
膠原蛋白是由三條肽鏈擰成的螺旋形纖維狀蛋白質(zhì)，是一種糖蛋白，分子含糖、及 大量甘氨酸、脯氨酸、羥脯氨酸等，存在所有多細(xì)胞動物體內(nèi)，是體內(nèi)含量最多的一類蛋白 質(zhì)。在人體中約占總蛋白質(zhì)含量的四分之一，存在于幾乎所有組織中，是一種細(xì)胞外蛋白 質(zhì)，以不溶纖維形式存在，對動物和人體皮膚、血管、骨骼、筋骨、軟骨的形成十分重要，是結(jié) 締組織的重要物質(zhì)，是決定結(jié)締組織韌性的主要因素，在動物細(xì)胞中扮演結(jié)合組織的角色。 隨著年齡的增長，人體在25歲之后，體內(nèi)的膠原蛋白就開始逐漸流失，尤其是女性。因此維 持骨骼健康及皮膚彈性就需要及時地補(bǔ)充膠原蛋白。膠原蛋白中蘊(yùn)藏著多種生物活性肽， 如抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶活性、抑制血小板凝集活性、抗氧化活性、抗腫瘤活性等。膠原寡肽是以各種膠原(動物的皮、骨、關(guān)節(jié)等)為原料，經(jīng)多種蛋白酶定向梯度 水解后的產(chǎn)物，其分子量在3000Da以下。膠原寡肽可完全溶解于水(冷水亦可溶解)，水溶 液低粘度，在60%的高濃度下也有流動性，耐酸性能好，在酸、堿的情況下均無沉淀；耐高 溫性能好，200°C加熱亦無沉淀，由于其分子量較小，所以更易被人體吸收。我國是世界上的養(yǎng)禽大國，雞養(yǎng)殖業(yè)已成為農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)化最迅速最典型的行業(yè)，并 以每年5% 10%的速度持續(xù)增長。隨著市場的不斷發(fā)展，雞肉加工過程中，許多雞副產(chǎn)品 如雞內(nèi)臟、雞爪多用來作為食品原料加工制成熟食制品，產(chǎn)品的利用率及附加值較低，2008 年雞爪的產(chǎn)量大約有100萬噸，除了可制成熟食，大部份的雞爪均未被充分利用。目前我國雞爪深加工企業(yè)較少，大部分企業(yè)都是進(jìn)行初級加工就上市銷售，有的 企業(yè)甚至不加工就上市銷售，存在著深加工滯后，科技含量少，現(xiàn)代化程度低下等突出問 題，已嚴(yán)重制約雞爪產(chǎn)品附加值的提升。目前，國外很多文獻(xiàn)報道了關(guān)于雞爪膠原的生理功能一些研究，初步認(rèn)識到了其 在提高人體骨骼強(qiáng)度、保護(hù)胃粘膜、抑制血壓上升、抗衰老和促進(jìn)皮膚膠原代謝等方面的作 用，報道了雞爪膠原不僅在食品、化妝品上有廣泛的應(yīng)用前景，而且還具有預(yù)防高血壓，防 治風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用。因此，利用雞爪提取膠原蛋白作為原料應(yīng)用到食品、化妝 品、藥品上，具有重要的科學(xué)意義和巨大的應(yīng)用與開發(fā)價值?，F(xiàn)有技術(shù)的制備膠原蛋白肽的方法中，脫脂需要用到大量的有機(jī)溶劑或者堿來脫 出原料中的脂肪，有機(jī)溶劑和堿脫脂都存在嚴(yán)重的安全隱患和環(huán)境污染；酶解過程應(yīng)用最 多的是復(fù)合酶水解法，但是現(xiàn)行的酶解工藝方法的主要缺點(diǎn)是酶解過程難以控制，制備的 膠原蛋白肽的分子量分布較廣、且產(chǎn)品有苦味；有的廠家還采用超濾之后將濾液蒸發(fā)濃縮， 蒸發(fā)濃縮需要消耗大量的熱量，且達(dá)不到脫鹽和去除游離氨基酸的目的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種納米膠原寡肽的制備方法，克服現(xiàn)有技術(shù)中的酶解過程難以控制，膠原蛋白肽的分子量分布較廣和產(chǎn)品有苦味等問題。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用如下方案一種納米膠原寡肽的制備方法，包括(1)絞碎將雞爪清洗干凈后絞碎得到雞爪料；(2)脫脂將所述雞爪料置于脫脂罐中，加入一定量的水和脂肪酶，在溫度為 30-50pH為8. 0-10. 0的條件下進(jìn)行脫脂，在脫脂結(jié)束后過濾洗滌得到脫脂雞爪；(3)酶解將所述脫脂雞爪置于酶解罐中，加入一定量的水，在溫度40-50°C，pH 6. 0-7. 0的條件下加入一定量的木瓜蛋白酶水解1-2小時；在溫度50-60°C，pH 6. 0-8. 0的 條件下加入一定量的復(fù)合蛋白酶水解1-2小時；繼續(xù)加入一定量的風(fēng)味蛋白酶水解2-4小 時，在水解結(jié)束后升溫至75-100°C保持10-30分鐘，過濾得到雞爪初濾液；(4)后處理將所述雞爪初濾液進(jìn)行后處理得到所述納米膠原寡肽。通過本發(fā)明的上述技術(shù)方案，采用脂肪酶進(jìn)行脫脂操作，避免了現(xiàn)有技術(shù)中有機(jī) 溶劑和堿脫脂存在的嚴(yán)重的安全隱患和環(huán)境污染，省略了后續(xù)的去除殘留的堿等工序，從 而具有很高的生物安全性。通過首先采用特定的兩種內(nèi)切酶(木瓜蛋白酶和復(fù)合蛋白酶) 酶解，再利用合適的特定的外切酶(風(fēng)味蛋白酶)對疏水性氨基酸進(jìn)行修飾，制備得到的納 米膠原寡肽無任何苦味，提高了納米膠原寡肽的品質(zhì)。通過采用依次添加三種蛋白水解酶 (木瓜蛋白酶、復(fù)合蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶)進(jìn)行酶解，使得酶解過程易于控制，制備得到的 納米膠原寡肽在分子量分布和羥脯氨酸HYP含量上更具優(yōu)勢。根據(jù)本發(fā)明的生產(chǎn)方法，工 藝簡單，獨(dú)特，生產(chǎn)周期短。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施例，所述脫脂操作中加入的水的質(zhì)量是雞爪質(zhì)量的 2-10倍，優(yōu)選為2-5倍，優(yōu)選為4-5倍，更優(yōu)選為4倍。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施例，所述脫脂操作中加入的脂肪酶的質(zhì)量占雞爪質(zhì)量 的 0. 05% -0. 5%，優(yōu)選為 0. 05% -0. 15%，優(yōu)選為 0. 15%。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施例，所述脫脂操作中的溫度優(yōu)選為35-40°C，優(yōu)選為 37 °C。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施例，所述脫脂操作中的pH優(yōu)選為9. 0-10. 0，優(yōu)選為 9. 0，優(yōu)選為9. 5。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施例，所述脫脂進(jìn)行1-2小時，優(yōu)選為1. 5小時，優(yōu)選為 1小時。 根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施例，所述脫脂操作結(jié)束后過濾，將濾出的雞爪料洗滌 30分鐘，優(yōu)選為在常溫下洗至中性。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施例，所述酶解操作中加入的水的質(zhì)量是雞爪質(zhì)量的 1-5倍，優(yōu)選為2-4倍，優(yōu)選為4倍。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施例，所述酶解操作中在加入木瓜蛋白酶水解之前，先 升溫至70°C -90°C保持10-30分鐘。通過本發(fā)明的上述技術(shù)方案，所述酶解操作中在添加 蛋白酶水解之前先升溫至70°C -90°C保持10-30分鐘，使得預(yù)處理后的蛋白能暴露出更多 的酶作用點(diǎn)，能加速之后的蛋白酶解反應(yīng)。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施例，所述木瓜蛋白酶的質(zhì)量占雞爪質(zhì)量的 0. 1% -1%，優(yōu)選為0. 1% -0. 5%，優(yōu)選為0. 2% -0. 3%，優(yōu)選為0. 2% ；所述木瓜蛋白酶的
4反應(yīng)溫度優(yōu)選為40-50°C，優(yōu)選為45°C ；所述木瓜蛋白酶的反應(yīng)pH優(yōu)選為6. 0-7. 0，優(yōu)選為 6. 5 ；所述木瓜蛋白酶的反應(yīng)時間優(yōu)選為1-2小時，優(yōu)選為1小時。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施例，所述復(fù)合蛋白酶的質(zhì)量占雞爪質(zhì)量的 0. 1% -1%，優(yōu)選為0. 1% -0. 5%，優(yōu)選為0. 2% -0. 3%，優(yōu)選為0. 2% ；所述復(fù)合蛋白酶的 反應(yīng)溫度優(yōu)選為50-60°C，優(yōu)選為50°C ；所述木瓜蛋白酶的反應(yīng)pH優(yōu)選為6. 0-8. 0，優(yōu)選為 7 ；所述木瓜蛋白酶的反應(yīng)時間優(yōu)選為1-2小時，優(yōu)選為1小時。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施例，所述風(fēng)味蛋白酶的質(zhì)量占雞爪質(zhì)量的 0.2% -2%,優(yōu)選為0. 2% -1 %，優(yōu)選為0. 4% -0. 6%，優(yōu)選為0.4% ；所述復(fù)合蛋白酶的反 應(yīng)溫度優(yōu)選為50-60°C，優(yōu)選為50°C;所述木瓜蛋白酶的反應(yīng)pH優(yōu)選為6. 0-8. 0，優(yōu)選為7 ； 所述木瓜蛋白酶的反應(yīng)時間優(yōu)選為2-4小時，優(yōu)選為2小時。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施例，所述酶解操作結(jié)束后升溫至75_100°C保持10-30 分鐘，優(yōu)選為85°C保持15分鐘，離心過濾去上層油脂、去下層骨渣后得到粗提液。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施例，所述后處理操作包括加入0.5-2%活性炭 攪拌30-60分鐘進(jìn)行脫色，然后再進(jìn)行板框過濾，得到澄清透明精濾液；通過分子量 3000-10000Da的超濾膜對膠原寡肽溶液進(jìn)行過濾，操作壓力0. 1 IMPa，操作溫度 20-500C ；采用納濾膜分離技術(shù)對濾液進(jìn)行脫鹽和濃縮，操作壓力0. 8 5MPa，操作溫度 20-500C ；噴霧干燥。通過本發(fā)明的上述技術(shù)方案，采用超濾膜分離技術(shù)將雞爪膠原酶解液 進(jìn)行了分子量分級，解決了膠原蛋白肽分子量分布過寬的問題，得到了一種分子量分布集 中的納米膠原寡肽。通過本發(fā)明的上述技術(shù)方案，采用納濾膜分離技術(shù)對超濾液進(jìn)行濃縮 和脫鹽，納濾膜的截留相對分子質(zhì)量介于超濾與反滲透之間，特別適合對低分子量的寡肽 進(jìn)行脫鹽和濃縮，且不影響分離物質(zhì)的生物活性，所以納濾技術(shù)應(yīng)用于寡肽類物質(zhì)的濃縮 和脫鹽具有很好的效果，可實(shí)現(xiàn)工業(yè)化。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施例，根據(jù)本發(fā)明的方法制備的納米膠原寡肽在醫(yī)藥， 保健品，化妝品上的應(yīng)用。


圖1示出了根據(jù)本發(fā)明的納米膠原寡肽分子量分布圖。
具體實(shí)施例方式
以下詳述本發(fā)明的具體實(shí)施例。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例是采用公司自主開發(fā)出的Licpim(脂肪酶脫脂Lipase degrease-蛋白酶酶角軍 Complex protease hydrolysis-超濾膜分離 Ultrafiltration s印aration-納濾膜分離Nanofiltration separation)工藝制備得到納米膠原寡肽。本實(shí)施例中采用的雞爪購白國內(nèi)普通肉雞廠，脂肪酶、蛋白酶均購于丹麥諾維信 生物技術(shù)有限公司。實(shí)施例11)將出冷庫的冷凍雞爪進(jìn)行融冰解凍，用清水將雞爪清洗干凈，浙干。用溫水將雞 爪漂洗干凈，清洗后的雞爪用組織搗碎機(jī)進(jìn)行搗碎。搗碎后的雞爪料移入脫脂罐。2)加入4倍量的水至脫脂罐，調(diào)節(jié)pH至9. 0，加入雞爪量0. 1 %的脂肪酶進(jìn)行脫脂，控制溫度在35_40°C，保持1. 5h進(jìn)行脫脂酶解，脫脂結(jié)束后過濾，將濾出的雞爪料洗滌 30分鐘，洗滌兩次，常溫水洗至中性，再打入酶解罐。3)加入4倍的去離子水，控制溫度在90°C，保持30分鐘后冷卻至40_50°C，調(diào)節(jié)pH 至6. 5，加入雞爪量0. 2%的papain木瓜蛋白酶及雞爪量0. 2%的protamex復(fù)合蛋白酶，水 解2小時后，冷卻至50-60°C ；再按雞爪量0. 4%加入Flavourzyme風(fēng)味蛋白酶，繼續(xù)水解2 小時結(jié)束，水解時緩慢攪拌，水解結(jié)束后升溫至75-10(TC保持10-30分鐘，離心過濾去上層 油脂、去下層骨渣后得到粗提液。4)經(jīng)滅酶降溫后的酶解液降溫至35-40°C加入活性炭進(jìn)行脫色，攪拌30-120 分鐘，然后再進(jìn)行板框過濾，得到澄清透明精濾液。5)將精濾液通過分子量5000Da的超濾膜對膠原寡肽溶液進(jìn)行過濾，操作壓力 0. 1 IMPa，操作溫度25°C，得到超濾液。6)將超濾液采用納濾膜分離技術(shù)對濾液進(jìn)行脫鹽和濃縮，操作壓力0. 8 5MPa， 操作溫度25°C，得到純化后的雞爪膠原寡肽濃縮液。7)將納濾得到的濃縮液進(jìn)行噴霧干燥，即得雞爪納米膠原寡肽粉末。得到的納米膠原寡肽粉末通過凝膠滲透色譜來測定雞爪膠原寡肽的分子量分布 如表1所示表 權(quán)利要求
一種納米膠原寡肽的制備方法，包括(1)絞碎將雞爪清洗干凈后絞碎得到雞爪料；(2)脫脂將所述雞爪料置于脫脂罐中，加入一定量的水和脂肪酶，在溫度為30 50℃，pH為8.0 10.0的條件下進(jìn)行脫脂，在脫脂結(jié)束后過濾洗滌得到脫脂雞爪；(3)酶解將所述脫脂雞爪置于酶解罐中，加入一定量的水，在溫度40 50℃，pH 6.0 7.0的條件下加入一定量的木瓜蛋白酶水解1 2小時；在溫度50 60℃，pH 6.0 8.0的條件下加入一定量的復(fù)合蛋白酶水解1 2小時；繼續(xù)加入一定量的風(fēng)味蛋白酶水解2 4小時，在水解結(jié)束后升溫至75 100℃保持10 30分鐘，過濾得到雞爪初濾液；(4)后處理將所述雞爪初濾液進(jìn)行后處理得到所述納米膠原寡肽。
2.如權(quán)利要求1所述的納米膠原寡肽的制備方法，其特征在于，所述脫脂操作中加入 的水的質(zhì)量是雞爪質(zhì)量的4-5倍。
3.如權(quán)利要求1所述的納米膠原寡肽的制備方法，其特征在于，所述脫脂操作中加入 的脂肪酶的質(zhì)量是雞爪質(zhì)量的0. 05% -0. 15%。
4.如權(quán)利要求1所述的納米膠原寡肽的制備方法，其特征在于，所述酶解操作中加入 的水的質(zhì)量是雞爪質(zhì)量的2-4倍。
5.如權(quán)利要求1所述的納米膠原寡肽的制備方法，其特征在于，在加入木瓜蛋白酶水 解之前，先升溫至70°C -90°C保持10-30分鐘。
6.如權(quán)利要求1所述的納米膠原寡肽的制備方法，其特征在于，所述木瓜蛋白酶的質(zhì) 量占雞爪質(zhì)量的0. 2% -0. 3%;所述復(fù)合蛋白酶的質(zhì)量占雞爪質(zhì)量的0. 2% -0. 3%;所述風(fēng) 味蛋白酶的質(zhì)量占雞爪質(zhì)量的0.4% -0.6%。
7.如權(quán)利要求1所述納米膠原寡肽的制備方法，其特征在于，所述后處理操作包括加 入0. 5-2%活性炭攪拌30-60分鐘進(jìn)行脫色，然后再進(jìn)行板框過濾，得到澄清透明精濾液； 通過分子量3000-10000Da的超濾膜對膠原寡肽溶液進(jìn)行過濾，操作壓力0. 1 IMPa，操作 溫度20-50°C ；采用納濾膜分離技術(shù)對濾液進(jìn)行脫鹽和濃縮，操作壓力0. 8 5MPa，操作溫 度20-50°C ；噴霧干燥。
8.如權(quán)利要求1所述的方法制備的納米膠原寡肽在醫(yī)藥，保健品，化妝品上的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種納米膠原寡肽的制備方法，該方法包括將雞爪絞碎后加入一定量的水和脂肪酶，在溫度為30-50℃，pH為8.0-10.0的條件下脫脂；將脫脂后的雞爪置于酶解罐中并加入一定量的水，升溫至70℃-90℃保持10-30分鐘，在溫度40-50℃，pH 6.0-7.0的條件下加入一定量的木瓜蛋白酶水解1-2小時；在溫度50-60℃，pH 6.0-8.0的條件下加入一定量的復(fù)合蛋白酶水解1-2小時；繼續(xù)加入一定量的風(fēng)味蛋白酶水解2-4小時，在水解結(jié)束后升溫至75-100℃保持10-30分鐘；后處理得到所述納米膠原寡肽。通過本發(fā)明的方法制備的納米膠原寡肽在分子量分布和羥脯氨酸含量上更具優(yōu)勢。
文檔編號C07K1/34GK101948898SQ20101028238
公開日2011年1月19日 申請日期2010年9月15日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月15日
發(fā)明者何會, 榮耀中, 蔡愈杭 申請人:上海東錦飲品有限公司