專利名稱：一種擬穴青蟹抗菌肽Sphistin及其應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及甲殼類動物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種擬穴青蟹抗菌肽 Sphistin及其應用。
背景技術(shù)：
近年來，隨著世界人口的快速增長，以及人們對水產(chǎn)品消費水平的提高，水產(chǎn)業(yè)得到迅速發(fā)展，但是高密度養(yǎng)殖卻引起水產(chǎn)動物病害的頻繁發(fā)生，有些病害甚至對水產(chǎn)業(yè)造成毀滅性打擊。在對病害防治途徑的探索中，傳統(tǒng)抗生素引起致病菌的抗藥性和對環(huán)境的負面作用，使其面臨嚴重挑戰(zhàn)，其應用越來越受到限制。由于抗菌肽具有特異殺滅病原微生物，不會使病原菌產(chǎn)生抗藥性，也不會污染環(huán)境等優(yōu)點，因而越來越受到人們的重視，在水產(chǎn)養(yǎng)殖動物病害防治中展現(xiàn)出重要應用潛力?？咕氖莿游锩庖叻烙到y(tǒng)產(chǎn)生的一類對外源性致病微生物具有免疫活性的多肽物質(zhì)，是動物非特異性免疫防御系統(tǒng)的一個重要組成部分。從1981年開始，人們相繼從細菌、真菌、兩棲類、昆蟲、高等植物、哺乳動物乃至人類中發(fā)現(xiàn)并分離獲得具有抗菌活性的多肽?？咕淖鳛樾滦蜌⒕镔|(zhì)的突出特點是分子量小，活性強，功能廣泛，具有廣譜殺菌作用?？咕目山M成性表達，如人的β防御素1 (Human beta defensins, HBD)；亦可在創(chuàng)傷或感染后誘導表達，如LL237，HBD22, HBD23, HBD24等。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的大多數(shù)抗菌肽對革蘭氏陽性菌有較強的殺滅作用，有的則對革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌都有作用。隨著人們研究工作的深入開展，發(fā)現(xiàn)某些抗細菌肽對部分真菌、原蟲、病毒及癌細胞等均具有強有力的殺傷作用。某些抗菌肽甚至有抗病毒活性，如抗人類HIV病毒、抗沙眼衣原體病毒等，能破壞腫瘤細胞的細胞膜并選擇性地殺傷腫瘤細胞。組蛋白histone是存在于真核細胞核內(nèi)的一類堿性蛋白質(zhì)。易溶于水和稀酸，在稀氨水中沉淀。含精氨酸和賴氨酸比例很高，在細胞核中與脫氧核糖核酸緊密結(jié)合，形成球形的核小體結(jié)構(gòu)，是染色質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)。維持其特定的立體結(jié)構(gòu)，使大量遺傳信息壓縮在細胞核內(nèi)。1958年小牛胸腺組蛋白的抗菌活性首次得到證實(U Hirsch JG. Bactericidal action of histone. JExp Med 1958 ； 108 :925-944.), Buforin I 是第一個報道的源于 Histone2A 的抗菌月太(2> Park CB, Kim MS, Kim SC. A novel antimicrobial peptide from Bufo bufo gargarizans. Biochem Biophy ResComm 1996 ;218 :408-413)，近年來多種物種體內(nèi)源于Histone2A的抗菌肽已被報道，如鯰魚、蝦、貝類、鮑魚(3、Park IY, Park CB, Kim MS, Kim SC. Parasin I, an antimicrobial peptide derivedfrom histone H2A in the catfish Parasilurus asotus. FEBS Lett 1998 ；437 :258-262 ；4>Patat SA,Carnegie RB, Kingsbury C,Gross PS,Chapman R,Schey KL. Antimicrobial activity of histonesfrom hemocytes of the pacific white shrimp. Eur J Biochem 2004 ；271 :4825-4833 ；5> Li C, Song L, Zhao J, Zhu L, Zou H, Zhang H, et al. Preliminary study ona potential antibacterial peptide derivedfrom histone H2A in hemocytes of scallop Chlamys farreri. Fish Shellfish Immunol2007 ;22 :663-672.)。組蛋白的乙酰化和甲基化等翻譯后修飾大部分發(fā)生在其N端，本發(fā)明根據(jù)擬穴青蟹Histone 2A序列，合成了擬穴青蟹組蛋白Histone 2AN端前38個氨基酸，發(fā)現(xiàn)其是一種具有廣譜抗細菌、抗酵母的抗菌肽，命名為 Sphistin。本發(fā)明為擬穴青蟹體內(nèi)源于HistondA的抗菌肽的首次報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一目的在于提供一種擬穴青蟹抗菌肽Sphistin及其制備方法。本發(fā)明的第二目的在于提供一種擬穴青蟹抗菌肽Sphistin在制備抗菌劑中的應用。本發(fā)明的第二目的在于提供一種擬穴青蟹抗菌肽Sphistin在制備飼料添加劑中的應用。所述擬穴青蟹抗菌肽Sphistin的氨基酸序列為Met Ala Gly Gly Lys Ala Gly Lys Asp Ser Gly Lys Ala Lys Ala Lys151015Ala Val Ser Arg Ser Ala Arg Ala Gly Leu Gln Phe Pro Val Gly Arg202530lie His Arg His Leu Lys35所述擬穴青蟹抗菌肽Sphistin的核苷酸序列為atggctggtg gcaaggcagg caaggactcc ggcaaggcga aagccaaggc agtatcacgc 60tcggccaggg ctggtctgca gtttcctgtc ggtcgtatcc atagacacct gaag 114所述擬穴青蟹抗菌肽Sphistin的分子式為C17tlH293N61O46S1,分子量為3959. 61道爾頓。所述擬穴青蟹抗菌肽Sphistin由38個氨基酸組成，來源于擬穴青蟹組蛋白 Histone 2A蛋白的N端部分序列，是一種具有抗菌功能的多肽。該抗菌肽38個氨基酸中包含10個帶正電的氨基酸殘基和1個帶負電荷的氨基酸殘基，根據(jù)氨基酸殘基電荷預測該抗菌肽等電點為12. 12，在pH為7. 0時帶有9. 236個正電荷。該抗菌肽具有很強的水溶性，總平均親水性為-0. 684，是一種帶有強正電荷的陽離子多肽。采用現(xiàn)有的固相化學合成的方法即可獲得純度達95%以上擬穴青蟹抗菌肽 Sphistin。所述擬穴青蟹抗菌肽Sphistin對多種革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌有顯著的抗菌效果，同時該抗菌肽對酵母也有較高的抗性效果，其中對重要致病菌金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度為< 1. 5 μ M，對水產(chǎn)致病菌嗜水氣單胞菌的最小抑菌濃度為< 1. 5μΜ ；對多種革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌的最小殺菌濃度為1. 5 3μΜ，因此與許多已知的海洋動物抗菌肽比較，其抗菌效果好、抗菌譜寬、殺菌速率快，顯示出極大的醫(yī)用價值，在制備抗菌劑方面具有良好的應用。細胞毒性試驗證明，該抗菌肽對小鼠成骨細胞MC3T3-E1無細胞毒性，預示其可安全用于藥物治療或者作為飼料添加劑使用。
依據(jù)海洋動物擬穴青蟹的組蛋白的N端部分蛋白序列，本發(fā)明人工合成了一種具有廣譜而且顯著抗菌的抗菌肽，同時該蛋白無細胞毒性，具有安全性。該抗菌肽來源于水產(chǎn)甲殼動物，既可以應用于水產(chǎn)作為添加劑，也可能用于研制用于哺乳動物的抗菌藥物，因而具有廣泛的應用前景。


圖1為擬穴青蟹抗菌肽Sphistin對金黃葡萄球菌的殺傷指數(shù)圖。在圖1中，橫坐標為時間(min)，縱坐標為菌落存活率(％ )。圖2為擬穴青蟹抗菌肽Sphistin對大腸桿菌MC1061的殺傷指數(shù)圖。在圖1中， 橫坐標為時間(min)，縱坐標為菌落存活率(％ )。圖3為擬穴青蟹抗菌肽Sphistin對谷氨酸棒桿菌的殺傷指數(shù)圖。在圖1中，橫坐標為時間(min)，縱坐標為菌落存活率(％ )。圖4為抗菌肽Sphistin的細胞毒性實驗圖，在圖4中，A為正常小鼠成骨纖維細胞MC3T3-E1，B為50 μ g/ml抗菌肽Sphistin與小鼠成骨纖維細胞MC3T3-E1共孵Mh，C為 100 μ g/ml抗菌肽Sphistin與小鼠成骨纖維細胞MC3T3-E1共孵Mh。圖5為MTT法檢測抗菌肽Sphistin的細胞毒性實驗圖。在圖5中，橫坐標為 Sphistin蛋白濃度(μ g/ml)，縱坐標為細胞存活率(％ )。
具體實施例方式以下實施例可以使本專業(yè)技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員更加全面的了解本發(fā)明，本發(fā)明并不限于下述實施例。本實施例所涉及的菌種有大腸桿菌(Escherichia coli)、表皮葡萄球菌 (Staphylococcusepidermidis)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)、溶壁微球菌(Micrococcus lyodeikticus Fleming)、 枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、蠟狀芽胞桿菌(Bacillus cereus)、熒光假單胞菌 (P. Fluorescens)、嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)、藤黃微球菌(Micrococcus luteus)、福氏志賀氏菌(Shigella flexneri)、施氏假單胞菌(Pseudomonas stutzeri)、 綠膿桿菌(P. aeruginosa)、河流弧菌(Vibrio fluvial is)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemloyticus)、角軍藻朊酸弧菌(Vibrio alginolyticus)、哈氏弧菌(Vibrioharveyi)、 白假絲酵母(Candida albicans)等，均購自中國科學院微生物研究所菌種保藏中心。大腸桿菌 MC1061 (Escherichia coli MC1061)購自 Gene Power 公司，畢赤酵母(Pichia pastorisGS115)購自 Invitrogen 公司。實施例1擬穴青蟹抗菌肽Sphistin的制備Sphistin來源于擬穴青蟹組蛋白HistoneffiA的N端部分序列，由38個氨基酸組成，具體氨基酸序列為Met Ala Gly Gly Lys Ala Gly Lys Asp Ser Gly Lys Ala Lys Ala Lys151015Ala Val Ser Arg Ser Ala Arg Ala Gly Leu Gln Phe Pro Val Gly Arg202530
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lie His Arg His Leu Lys35擬穴青蟹抗菌肽Sphistin的核苷酸序列為atggctggtg gcaaggcagg caaggactcc ggcaaggcga aagccaaggc agtatcacgc 60tcggccaggg ctggtctgca gtttcctgtc ggtcgtatcc atagacacct gaag 114該抗菌多肽分子式為C17tlH293N61O46S1,分子量為3959. 61?？咕?8個氨基酸中包含10個帶正電的氨基酸殘基和1個帶負電荷的氨基酸殘基，根據(jù)氨基酸殘基可知該抗菌肽等電點為12. 12，在PH為7. 0時帶有9. 236個正電荷。該抗菌肽具有很強的水溶性，總平均親水性為-0. 684，是一種帶有強正電荷的陽離子多肽。采用現(xiàn)有的固相化學合成的方法即可獲得純度達95%以上擬穴青蟹抗菌肽 Sphistin，本實施例中的擬穴青蟹抗菌肽Sphistin委托上海肽仕生物科技有限公司合成獲得。實施例2擬穴青蟹抗菌肽Sphistin最小抑菌濃度(MIC minimum inhibition concentration)的測定(a)將保種的大腸桿菌、大腸桿菌MC1061、表皮葡萄球菌、金黃色葡萄球菌、谷氨酸棒桿菌、溶壁微球菌、枯草芽孢桿菌、蠟狀芽胞桿菌、藤黃微球菌、志賀氏菌、施氏假單胞菌、綠膿桿菌在營養(yǎng)肉湯平板上劃線，副溶血弧菌、解藻朊酸弧菌、哈氏弧菌在2216海水肉湯平板上劃線，在相應溫度倒置培養(yǎng)12 16h ；白假絲酵母、畢赤酵母在YPG平板上劃線，于培養(yǎng)1 2周。全部用接種于相應的斜面上，繼續(xù)培養(yǎng)12 16h，酵母則繼續(xù)培養(yǎng)3 7天；IOmM磷酸鈉鹽緩沖液(pH 7. 4)沖洗新鮮制備的細菌斜面培養(yǎng)物，調(diào)整稀釋至OD6tltl = 0. 003 ；弧菌用海水培養(yǎng)基調(diào)整稀釋至OD6tltl = 0. 0006 ；酵母則調(diào)整至OD6tltl = 0.00067，使其濃度為3.3 X 104SpOreS/mL備用。準備好的細菌需在20min內(nèi)使用。(b)將合成抗菌肽粉末用滅菌MilliQ水溶解，Bradford法測定蛋白濃度，倍比稀釋蛋白濃度為3，6，12，M，48，96 μ M，4°C保存?zhèn)溆谩?c)參JM Belen LG.等(Belen LG, Wimal Ubhayasekera, Richard L. Gallo, et al.Parallelevaluation of antimicrobial peptides derived from the synthetic PAF26 and the human LL37, Biochemical and Biophysical Research Communications, 2007(356) :107-113)的方法，在96孔細胞培養(yǎng)板上進行，每種被測細菌和真菌按照以下操作設置空白對照組、陰性對照組和待測樣品實驗組，每組設置3個平行樣①陽性對照組加50 μ L滅菌MilliQ水和30 μ L菌懸液；②空白對照組加50 μ L待測蛋白樣品和30 μ L磷酸鈉鹽緩沖液；③樣品實驗組加50 μ L待測蛋白樣品和30 μ L菌懸液。對于細菌，每孔加入20 μ L MH液體培養(yǎng)基，28°C培養(yǎng)Mh，觀察結(jié)果。對于酵母，每孔加入20 μ L YPG液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)48h，觀察結(jié)果。對于弧菌，按照以下操作設置空白對照組、陰性對照組和待測樣品實驗組，每組設置3個平行樣①陽性對照組加50 μ L滅菌MilliQ水和50 μ L菌懸液；
②空白對照組加50 μ L待測蛋白樣品和50μ L2216海水培養(yǎng)基；③樣品實驗組加50 μ L待測蛋白樣品和50 μ L菌懸液。280C培養(yǎng)24h，觀察結(jié)果。觀察結(jié)果如表1所示。表 權(quán)利要求
1.一種擬穴青蟹抗菌肽Sphistin，其特征在于，所述擬穴青蟹抗菌肽Sphistin的氨基酸序列為
2.如權(quán)利要求1所述的一種擬穴青蟹抗菌肽Sphistin，其特征在于其核苷酸序列為 atggctggtg gcaaggcagg caaggactcc ggcaaggcga aagccaaggc agtatcacgc 60 tcggccaggg ctggtctgca gtttcctgtc ggtcgtatcc atagacacct gaag1140
3.如權(quán)利要求1所述的一種擬穴青蟹抗菌肽Sphistin的制備方法，其特征在于所述擬穴青蟹抗菌肽Sphistin通過固相化學法合成。
4.如權(quán)利要求1所述的一種擬穴青蟹抗菌肽Sphistin在制備抗菌劑中的應用。
5.如權(quán)利要求1所述的一種擬穴青蟹抗菌肽Sphistin在制備飼料添加劑中的應用。
全文摘要
一種擬穴青蟹抗菌肽Sphistin及其應用。涉及甲殼類動物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，提供一種擬穴青蟹抗菌肽Sphistin及其應用。所述擬穴青蟹抗菌肽Sphistin的分子式為C170H293N61O46S1，分子量為3959.61道爾頓。由38個氨基酸組成，來源于擬穴青蟹組蛋白Histone 2A蛋白的N端部分序列，是一種具有抗菌功能的多肽。采用現(xiàn)有的固相化學合成的方法即可獲得純度達95％以上擬穴青蟹抗菌肽Sphistin。所述擬穴青蟹抗菌肽Sphistin對多種革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌有顯著的抗菌效果，抗菌譜寬、殺菌速率快，顯示出極大的醫(yī)用價值，在制備抗菌劑方面具有良好的應用。
文檔編號C07K1/04GK102167736SQ20111012901
公開日2011年8月31日 申請日期2011年5月17日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月17日
發(fā)明者王克堅, 范丹青, 蔡靈 申請人:廈門大學