專利名稱：抗b細胞淋巴瘤的雙特異性抗體及其用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及基因工程和蛋白質(zhì)工程技術領域，具體地說，涉及編碼包含人源⑶19 抗體可變區(qū)與人源CD3抗體可變區(qū)片段的重組融合蛋白的DNA、其所編碼的融合蛋白、該融合蛋白的生產(chǎn)方法、該融合蛋白的藥物用途和該融合蛋白的治療方法。
背景技術：
B細胞淋巴瘤是一種發(fā)病率較高的惡性腫瘤，嚴重危害人類健康，目前其抗體藥物療法已經(jīng)被肯定，已有抗體藥物如美羅華(Rituximab)等上市。針對B細胞淋巴瘤的抗體藥物靶點主要是B淋巴瘤細胞特異表達增高的⑶分子，如⑶19、⑶20和⑶22等。針對這些⑶分子的抗體藥物能夠誘導B淋巴瘤細胞凋亡，從而達到治療疾病的目的。免疫療法也是一種比較常用的抗腫瘤治療方法，其中細胞免疫在抗腫瘤方面具有十分重要的作用。免疫細胞中的τ淋巴細胞是殺傷腫瘤的重要細胞，其表面有CD3、白介素-2受體等表面分子。研究表明，CD3抗體和白介素-2配體可以有效地激活T淋巴細胞， 誘導其活化和增殖，從而提高殺傷腫瘤細胞的活性，這些已被應用于腫瘤的免疫療法。然而，由于缺乏靶向腫瘤細胞的功能，因此激活的T淋巴細胞難以十分有效地富集于腫瘤部位，導致其殺傷腫瘤效能不足。因此，可以把CD3抗體等能夠激活T淋巴細胞的分子與靶向 B淋巴瘤細胞的分子如CD19抗體融合，這樣就能夠有效地在B淋巴瘤細胞周圍富集和激活 T淋巴細胞，從而大大提高了殺傷腫瘤細胞的效果。人體內(nèi)天然抗體由重鏈和輕鏈組成，其中的重鏈和輕鏈可變區(qū)結(jié)構(gòu)在抗原的識別中發(fā)揮關鍵作用。近年來人源抗體的出現(xiàn)，克服了原來鼠源抗體療法引起的HAMA(Human antimousantibody)發(fā)生，大大提高了臨床治療效果。人源抗體相對與人源化的抗體相比， 不但具有全人的氨基酸序列，而且空間結(jié)構(gòu)上也與人抗體結(jié)構(gòu)一致，其免疫原性很低，因此比鼠源改造的人源化的抗體更有優(yōu)勢，具有極大的臨床應用前景。鑒于此，本發(fā)明提供了一種雙特異性抗體，其不但能夠靶向B淋巴瘤細胞，而且能夠激活T淋巴細胞，大大提高了殺傷B淋巴瘤細胞的效果。而且，此雙特異性抗體為全人源蛋白序列，具有極低的免疫原性，極大地提高了本發(fā)明雙特異性抗體的應用價值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術問題之一是提供一種包含⑶19scFv和⑶3scFv的人源雙特異性抗體蛋白，其在體內(nèi)外都具有良好的生物活性和穩(wěn)定性，能夠結(jié)合CD19和CD3陽性的細胞，并且能夠激活人T淋巴細胞，殺傷B淋巴瘤細胞。本發(fā)明解決技術問題的技術方案是提供一種抗B細胞淋巴瘤的雙特異性抗體。該抗B細胞淋巴瘤的雙特異性抗體，由來自抗CD19抗體的可變區(qū)與抗CD3抗體的可變區(qū)構(gòu)成，之間由一條連接肽(Linker)相連。其中，上述抗B細胞淋巴瘤的雙特異性抗體中的CD19抗體可變區(qū)由輕鏈可變區(qū) (VL)和重鏈可變區(qū)(VH)融合而成。⑶19抗體可變區(qū)可表示為⑶19scFv，⑶19抗體可變區(qū)的輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)的排列方式，可以為VL-VH，也可以為VH-VL。進一步的，輕鏈可
3變區(qū)(VL)和重鏈可變區(qū)(VH)間由連接肽連接形成抗體可變區(qū)。常用的連接肽的氨基酸序列為 GGGGSGGGGSGGGGS，可表示為(G4S)3。優(yōu)選的，上述抗B細胞淋巴瘤的雙特異性抗體中的CD19抗體可變區(qū)的氨基酸序列如 SEQID NO. 2 所示。其中，上述抗B細胞淋巴瘤的雙特異性抗體中的CD3抗體可變區(qū)由輕鏈和重鏈融合而成。表示為CD3scFv。⑶3抗體可變區(qū)可表示為⑶3scFv，⑶3抗體可變區(qū)的輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)的排列方式，可以為VL-VH，也可以為VH-VL。進一步的，輕鏈可變區(qū)(VL)和重鏈可變區(qū)(VH) 間由連接肽連接。常用的連接肽的氨基酸序列為GGGGSGGGGSGGGGS，可表示為(G4S)3。優(yōu)選的，上述抗B細胞淋巴瘤的雙特異性抗體中的CD3抗體可變區(qū)的氨基酸序列如 SEQ IDN0. 4 所示。其中，上述抗B細胞淋巴瘤的雙特異性抗體中連接肽的目的在于提供更好的柔韌性，以避免CD19scFv和CD3scFv或者在scFv內(nèi)的輕鏈可變區(qū)和重鏈輕鏈可變區(qū)間形成結(jié)構(gòu)上的空間位阻，因此連接肽氨基酸序列和長度均可以有一定的變化。常用的連接肽的氨基酸序列為GGGGSGGGGSGGGGS，可表示為(G4S)3。進一步的，上述抗B細胞淋巴瘤的雙特異性抗體(1)其氨基酸序列如SEQ ID NO. 8所示；或在SEQ ID No. 8所示的蛋白的氨基酸序列中經(jīng)過取代和/或缺失和/或添加一個或幾個氨基酸所得的與SEQ ID No. 8所示的雙特異性抗體的功能相同或相似的抗體。本發(fā)明還提供了編碼上述的抗B細胞淋巴瘤的雙特異性抗體的核苷酸序列。進一步的，編碼抗B細胞淋巴瘤的雙特異性抗體的核苷酸序列(1)核苷酸序列為SEQ ID NO. 7所示；或者為SEQ ID NO. 7的簡并序列；或者O)在(1)限定的核苷酸序列中經(jīng)過取代、缺失或添加一個或幾個核苷酸衍生所得的核苷酸序列，且與(1)中的核苷酸序列編碼功能相同或相似的抗體。本發(fā)明還提供了含有上述編碼抗B細胞淋巴瘤的雙特異性抗體的核苷酸序列的基因載體。該載體可選自質(zhì)?；虿《尽１景l(fā)明還提供了含有上述基因載體的宿主細胞。該宿主細胞可選自真核細胞或原核細胞。本發(fā)明另外還提供了上述抗B細胞淋巴瘤的雙特異性抗體在制備抗B細胞淋巴瘤藥物中的應用。本發(fā)明另外還提供了一種抗B細胞淋巴瘤藥物組合物，是由上述抗B細胞淋巴瘤的雙特異性抗體為活性成分。當然，其可以添加藥用輔料。所述抗B細胞淋巴瘤藥物組合物的劑型可以是注射劑、粉針劑、冷凍干燥劑等常用劑型。進一步的，上述抗B細胞淋巴瘤藥物組合物還包括至少一種其他的抗B細胞淋巴瘤藥物。上述抗B細胞淋巴瘤藥物組合物還可以用于和其他治療方法一起治療B細胞淋巴瘤，所述其他治療方法選自化學療法、放射療法、基因療法。本發(fā)明設計并構(gòu)建了一種含有⑶19scFv和⑶3scFv的雙特異性抗體，使其具有足夠的靶向性和生物活性。更重要的是，此雙特異性抗體具有全人源序列，有效地避免了臨床治療應用中的HAMA發(fā)生，從而能夠更有效地減少了耐藥現(xiàn)象的發(fā)生，提高了藥物的利用效率和治療效果。人體內(nèi)的天然抗體是由重鏈和輕鏈組成，其中重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)結(jié)構(gòu)對于抗原的結(jié)合特別重要。本發(fā)明的研究表明，由重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)組成的融合蛋白 (即單鏈抗體)仍然具有良好的抗原結(jié)合活性。此單鏈抗體分子量僅約25kD，體積僅為天然抗體的1/6，因此具有較好的組織滲透能力。天然抗體可變區(qū)是由重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)兩條肽鏈組成的異二聚體，而scFv是由重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)組成的融合單鏈，可能會形成空間位阻，難以形成有效的抗原結(jié)合構(gòu)象。因此，需要在重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)之間插入一條柔性連接肽，從而保證單鏈抗體能夠形成正確的空間構(gòu)想，具備有效的抗原結(jié)合活性。此外，為保證雙特異性抗體的兩個不同的scFv具有各自的抗原結(jié)合活性，還需在兩個scFv之間插入一條柔性連接肽，以此避免兩個scFv之間可能形成的空間位阻。為了能夠有效純化本發(fā)明的雙特異性抗體，本發(fā)明在雙特異性抗體的N端融合了 His6和Flag標簽蛋白，由于Flag標簽氨基酸序列(DYKDDDDK)包含有腸激酶(EK酶)的酶切位點DDDDK，因此可在利用His6和Flag標簽純化蛋白后，進一步利用EK酶切掉His6和 Flag標簽，以獲得不含標簽蛋白的雙特異性抗體。本發(fā)明的雙特異性抗體的設計也可以用于其他抗腫瘤抗體的scFv與CD3scFv融合，所形成的雙特異性抗體一方面可以發(fā)揮靶向腫瘤細胞的作用，另一方面可以激活T淋巴細胞，從而發(fā)揮其殺傷腫瘤靶細胞的作用。本發(fā)明描述的雙特異性抗體可通過常規(guī)的基因重組技術所構(gòu)建，具體實驗步驟如 《分子克隆》第三版(Jowph Sambrook，科學出版社)及類似的實驗手冊所記載。所用的 ⑶19單鏈抗體、⑶3單鏈抗體和連接肽可分別是1.⑶19人源抗體的可變區(qū)，表示為⑶19scFv，氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO. 2 所示，編碼核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。2.⑶3人源抗體的可變區(qū)，表示為⑶3scFv，氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO. 4 所示，編碼核苷酸序列如SEQ ID N0. 3所示。3. CD19scFv和CD3scFv之間的所用的連接肽，表示為(G4S) 3，氨基酸序列如序列表中SEQ IDN0. 6所述，編碼核苷酸序列如SEQ ID N0. 5所示。上述雙特異性抗體的DNA可以通過常規(guī)的基因重組技術獲得。所需編碼⑶19scFv 和⑶3scFv的DNA序列分別來自天然的人源⑶19和⑶3抗體。將編碼上述scFv的DNA序列用PCR獲得后分別克隆到載體中，所用載體可以是分子生物學常用的質(zhì)粒、病毒或DNA片段。在編碼上述雙特異性抗體的DNA序列前端加上蛋白分泌信號肽序列，以保證雙特異性抗體能夠從細胞中分泌。載體序列中包括用于基因表達的啟動子、蛋白質(zhì)翻譯起始和終止信號、以及多聚腺苷酸(PolyA)序列。載體中含有抗生素抗性基因，以利于載體在宿主細胞如細菌和真核細胞中的復制和表達。另外，載體中還包括真核細胞選擇性基因，用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染宿主細胞株的選擇。本發(fā)明雙特異性抗體發(fā)揮作用的區(qū)段為兩個獨立的scFv，因此在保證scFv完整的情況下，scFv兩端的氨基酸序列和長度可以有一定的變化而不減弱其生物活性，它們都屬于本發(fā)明的范疇。本發(fā)明雙特異性抗體中scFv中輕鏈可變區(qū)(VL)和重鏈可變區(qū)(VH)的排列方式，可以是VL-VH，也可以是VH-VL，兩個scFv的排列方式可以是⑶19scFv_⑶3scFv，也可以是 CD3scFv-CD19scFv，它們都屬于本發(fā)明的范疇。本發(fā)明雙特異性抗體內(nèi)部連接肽的目的在于提供更好的柔韌性，以避免CD19scFv 和CD3scFv形成結(jié)構(gòu)上的空間位阻，因此連接肽氨基酸序列和長度均可以有一定的變化， 它們都屬于本發(fā)明的范疇。在完成含編碼上述雙特異性抗體的DNA序列的質(zhì)粒構(gòu)建以后，即可用該重組載體轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化宿主細胞，表達相應的蛋白質(zhì)。能夠用于表達這些雙特異性抗體的表達系統(tǒng)有多種，可以是真核細胞，也可以是原核細胞，它們包括哺乳動物細胞、昆蟲細胞、酵母、細菌等。由于原核細胞表達雙特異性抗體容易形成包涵體，因此哺乳動物細胞是表達該蛋白的優(yōu)選系統(tǒng)?？捎糜诖笠?guī)模表達雙特異性抗體的哺乳動物細胞有多種，例如CHO細胞、293細胞、NSO細胞、COS細胞等，它們都包括在本發(fā)明所能使用的細胞之列。含有編碼上述雙特異性抗體基因的重組質(zhì)?？山?jīng)轉(zhuǎn)染進入宿主細胞，轉(zhuǎn)染細胞的方法有多種，其中包括電穿孔法、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法和磷酸鈣轉(zhuǎn)染法等。一種較佳的蛋白表達方法是利用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的宿主細胞表達。例如，用含有新霉素 (Neomycin)抗性基因的重組載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染無新霉素抗性的宿主細胞后，可在細胞培養(yǎng)液中增加新霉素的濃度以篩選出高表達的穩(wěn)定細胞株；又例如用含有二氫葉酸還原酶(DHFR) 基因的重組載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染缺乏DHFR的宿主細胞后，可在細胞培養(yǎng)液中增加氨甲喋呤(MTX) 的濃度以篩選出高表達的穩(wěn)定細胞株。哺乳動物細胞以外的其他表達系統(tǒng)，例如昆蟲細胞、酵母、細菌等也可以用于表達本發(fā)明的雙特異性抗體，它們也被包含本發(fā)明所能使用的宿主細胞之列。這些表達系統(tǒng)的蛋白質(zhì)產(chǎn)量比哺乳動物細胞的較高，但是容易形成包涵體，因此需要進一步蛋白復性。由于本發(fā)明的雙特異性抗體含有His和Flag標簽，因此雙特異性抗體表達后，可用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)或其他方法測定細胞培養(yǎng)液中的雙特異性抗體蛋白濃度，也可以用鎳柱或免疫親和層析法來純化所表達的雙特異性抗體。此外，與其它蛋白純化方法如離子交換層析等聯(lián)合使用，可進一步純化本發(fā)明的雙特異性抗體。從重組體培養(yǎng)液中獲得相應的雙特異性抗體后，可以用細胞ELISA和流式細胞術來檢測其對CD19和CD3的結(jié)合活性，實驗結(jié)果表明，本發(fā)明的雙特異性抗體能夠結(jié)合CD19 陽性的細胞如Raji細胞，也能夠結(jié)合CD3陽性的細胞如Jurkat細胞，因此本發(fā)明所構(gòu)建的雙特異性抗體可以有效靶向B淋巴細胞和T淋巴細胞。應用純化方法獲得高純度的雙特異性抗體后，可在體外檢測其對T淋巴細胞的激活作用，還可利用體外細胞模型和體內(nèi)動物模型來檢測其對B細胞淋巴瘤生長的抑制作用。在體外實驗中，可用MTT等方法檢測本發(fā)明雙特異性抗體對CD3表達陽性的外周血T 淋巴細胞的增殖作用，或用MTT等方法檢測其對D19表達陽性的淋巴瘤細胞如Raji細胞的生長抑制作用。在體內(nèi)實驗中，上述CD19陽性的腫瘤細胞可以用來構(gòu)建小鼠腫瘤模型，腫瘤模型可通過腹背側(cè)皮下、腹腔、尾靜脈等方法構(gòu)建，以用于觀察雙特異性抗體的抗腫瘤或抗轉(zhuǎn)移實驗。本發(fā)明的雙特異性抗還可以病毒載體來運載和表達，這些病毒載體包括但不 P艮 1 _ _ 本(adenoviral vectors) > 1 ^； ^ ^ ΙΦ (adeno-associated viral vectors)、反轉(zhuǎn)錄病毒載體(retroviral vectors)、單純皰疫病毒載體(herpes simplexvirus-based vectors)、t曼病毒載體(lentiviral vectors)。本發(fā)明還提供了含有本發(fā)明雙特異性抗體和藥用載體的藥物組合物。該藥物組合物可以按照藥劑學常規(guī)技術制備成各種形式的藥物制劑，較優(yōu)選的是注射劑，最優(yōu)選的是冷凍干燥注射劑。本發(fā)明的藥物組合物，其中還包括任何一種或幾種其它的具有協(xié)同作用的抗腫瘤藥物，所述組合物可以和其它治療方法一起治療腫瘤，所述其它治療方法包括化學療法、放射療法、生物療法。本發(fā)明的有益效果在于提供了一種人源的⑶19scFv-⑶3scFv雙特異性抗體，可以結(jié)合CD19和CD3陽性的細胞，并且能夠激活人T淋巴細胞，從而達到突出的抗B細胞淋巴瘤的作用，具有很好的應用前景


圖1.⑶19-⑶3雙特異性抗體的結(jié)構(gòu)模式圖。圖 2. CD19scFv-CD3scFv/pcDNA3. 1 (+)重組載體示意圖。圖3.重組載體雙酶切鑒定。1，重組載體；2，載體經(jīng)HindIIIAhoI雙酶切；M，分子 Marker0圖4.免疫印跡檢測CHO細胞分泌表達雙特異性抗體。1，未轉(zhuǎn)染的CHO細胞培養(yǎng)上清；2 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的CHO細胞培養(yǎng)上清。圖5.親和層析獲得高純度的雙特異性抗體蛋白。1，純化前；2，純化后。圖6.流式細胞術檢測雙特異性抗體對Raji的結(jié)合效應。A，PBS ；B, CD19scFv-CD3scFv(10ug/ml)。圖7.流式細胞術檢測雙特異性抗體對Jurkat的結(jié)合效應。A，PBS ；B, CD19scFv-CD3scFv(10ug/ml)。圖8.本發(fā)明雙特異性抗體對T淋巴細胞的激活作用G^1)。圖9.本發(fā)明雙特異性抗體對Raji細胞的體外生長抑制作用。(T細胞與Raji細胞數(shù)目比為10 1 ；96h)。圖10.本發(fā)明雙特異性抗體抑制小鼠體內(nèi)移植瘤的生長的實驗結(jié)果，縱坐標為腫瘤體積。1 :PBMC+PBS ;2 :PBMC+CD19scFv-CD3scFv(0. lug) ;3 PBMC+CD19scFv-CD3scFv(Iug) ；4 =PBS ；5 :CD19scFv_CD3scFv(Iug)。圖11.雙特異性抗體抑制小鼠體內(nèi)移植瘤的生長從而延長延長荷瘤小鼠的生存時間的實驗結(jié)果，橫坐標為時間，縱坐標為小鼠數(shù)目。1 :PBMC+PBS ；2 PBMC+CD19scFv-CD3scFv (0. lug) ；3 :PBMC+CD19scFv-CD3scFv (lug) ；4 :PBS ；5 CD19scFv-CD3scFv(lug)。圖12.本發(fā)明雙特異性抗體對小鼠重要臟器的組織的影響。結(jié)果表明其對小鼠重要臟器的組織形態(tài)無明顯影響。
具體實施例方式以下實例對本發(fā)明所涉及的雙特異性抗體的構(gòu)建、試驗和應用作了詳細說明。但是本發(fā)明的內(nèi)容和用途并不僅限于實例的范疇。
實施例一克隆編碼雙特異性抗體的DNA序列及構(gòu)建重組載體本發(fā)明中編碼雙特異性抗體的基因片段可以通過經(jīng)典的分子生物技術獲得，并且該基因序列可針對哺乳表達系統(tǒng)優(yōu)化，以便得到更佳的表達量。雙特異性抗體基因片段與相應的表達載體重新連接可獲得重組載體，以適應哺乳細胞的表達和篩選。1、獲得編碼⑶19-⑶3雙特異性抗體的基因片段本發(fā)明中的人源CD19抗體可變區(qū)基因和人源CD3抗體可變區(qū)基因分別是通過篩選全人源抗體庫所得(全人源抗體庫構(gòu)建方法可Sl^derlind E， et al. Recombininggermline-derived CDR sequences for creating diverse single-framework antibodylibraries. Nat Biotechnol. 2000 Aug ； 18(8) :852-6.等已知技術實現(xiàn))。本優(yōu)選實施例所構(gòu)建的雙特異性抗體的結(jié)構(gòu)見附圖1。本發(fā)明的雙特異性抗體由⑶19scFv和⑶3scFv融合而成，在⑶19scFv與⑶3scFv之間有一包含連續(xù)3個(GGGGS) 重復序列的連接肽。雙特異性抗體N端加上了白介素2(ILD的分泌信號肽以及和His6和 Flag標簽，不但能夠保證其分泌到哺乳細胞外，而且還能夠利用親和層析純化，并能夠進一步利用EK酶切除標簽而只保留活性雙特異性抗體蛋白。本發(fā)明中CD19-CD3雙特異性抗體基因片段是通過上述幾個片段由拼接PCR擴增所得。2、表達雙特異性抗體重組載體的構(gòu)建編碼本發(fā)明優(yōu)化融合蛋白的基因克隆是由上述包括信號肽的雙特異性抗體片段通過HindIII和XhoI酶切位點插入到質(zhì)粒載體pcDNA3. 1(+) (Invitrogen公司)的HindIII 和)(h0I酶切位點所得(見圖2)。該重組質(zhì)粒利用CMV啟動子來表達融合蛋白，并包含SV40 的多聚腺苷酸(PolyA)序列以保證其表達最佳的表達量。該重組質(zhì)粒還包括氨芐青霉素 (Ampicillin)抗性基因以利于在細菌中的復制，和新霉素(Neomycin)抗性基因以用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞的篩選。將編碼所述雙特異性抗體的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E. coli (DH5 α )后加入LB 培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜，以獲取大量重組質(zhì)粒的拷貝，用質(zhì)粒提取試劑盒(Qiagen公司)提取質(zhì)粒后進行酶切和測序鑒定(見圖3)，所獲得的編碼雙特異性抗體的DNA序列如SEQ ID Ν0. 7 所示。實施例二本發(fā)明雙特異性抗體在細胞中的表達和純化本發(fā)明中雙特異性抗體是在CHO細胞中表達并分泌到培養(yǎng)液中的，并利用鎳柱親和層析的方法純化所得。1、雙特異性抗體在CHO細胞中的瞬時表達獲得高純度編碼雙特異性抗體的重組質(zhì)粒后，利用Lipofectamine 2000質(zhì)粒轉(zhuǎn)染試劑盒anvitrogen公司)將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO細胞(ATCC)，在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)三天后收集CHO細胞上清液，可以用免疫印跡檢測雙特異性抗體的表達(見圖4)。此方法可用于快速地獲取少量的雙特異性抗體蛋白，其濃度可以用ELISA法定量檢測，所用一抗可以為抗His6或Flag抗體。2、雙特異性抗體在CHO細胞中的穩(wěn)定表達將編碼雙特異性抗體的重組質(zhì)粒用Lipofectamine 2000質(zhì)粒轉(zhuǎn)染試劑盒 (Invitrogen公司)轉(zhuǎn)染CHO細胞，在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)兩天后加入新霉素，采用有限稀釋法進行細胞克隆培養(yǎng)，大約14天后挑取新霉素抗性的細胞克隆進行細胞的擴大培養(yǎng)，并選取狀態(tài)良好的細胞在液氮中冷凍保存。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后的CHO細胞可以在滾動細胞培養(yǎng)瓶中進一步擴大培養(yǎng)以生產(chǎn)大量的雙特異性抗體蛋白，此方法可用于獲取大量的雙特異性抗體蛋白，其濃度可以用ELISA法定量檢測，所用一抗可以為抗His6或Flag抗體。3、雙特異性抗體的純化包含雙特異性抗體的細胞培養(yǎng)液可采用鎳柱親和層析的方法進行純化(見圖5)。 將鎳層析柱以緩沖液平衡后，將超濾器濃縮過的CHO細胞培養(yǎng)液上清液進樣，以A^O (nm) 進行監(jiān)測，用清洗液洗至未結(jié)合的蛋白全部被洗脫，然后用洗脫液洗脫結(jié)合蛋白。純化后的雙特異性抗體可以用ELISA法檢測濃度。包含雙特異性抗體的洗脫液經(jīng)脫鹽純化后可以凍干，凍干后可置于-20 V長期保存。實施例三本發(fā)明雙特異性抗體與細胞的體外結(jié)合實驗本發(fā)明的雙特異性抗體在體外可以能夠結(jié)合相應的靶細胞。本發(fā)明以Raji細胞作為CD19陽性的細胞，以Jurkat細胞作為CD3陽性的細胞，并以本發(fā)明中的雙特異性抗體來檢測其細胞結(jié)合活性。1、流式細胞術檢測雙特異性抗體與Raji細胞的結(jié)合活性雙特異性抗體與Raji細胞混合于的牛血清白蛋白(BSA)和0. 02%疊氮鈉的 PBS(染色緩沖液)中，至冰上孵育1小時。細胞用PBS緩沖液洗滌2次，然后與鼠抗His6 抗體至冰上孵育1小時。細胞用PBS緩沖液洗滌后，與異硫氰酸熒光素(FITC)標記的兔抗鼠抗體在染色緩沖液中冰上孵育30分鐘。細胞用流動緩沖液洗滌2次，并用流式細胞儀 (ESP Elite, Coulter)進行分析，以平均對數(shù)熒光乘以陽性群體的百分數(shù)計算平均熒光強度。結(jié)果顯示，本發(fā)明的雙特異性抗體能夠結(jié)合CD19陽性的Raji細胞(見圖6)。2、流式細胞術檢測雙特異性抗體與Jurkat細胞的結(jié)合活性此實例過程與上述實例基本相同。雙特異性抗體與Jurkat細胞至冰上孵育1小時后，用PBS緩沖液洗滌2次，然后繼續(xù)與鼠抗His6抗體至冰上孵育1小時。細胞用PBS緩沖液洗滌后，與異硫氰酸熒光素(FITC)標記的兔抗鼠抗體在染色緩沖液中冰上孵育30分鐘。細胞用流動緩沖液洗滌2次，并用流式細胞儀(ESP Elite,Coulter)進行分析，以平均對數(shù)熒光乘以陽性群體的百分數(shù)計算平均熒光強度。結(jié)果顯示，本發(fā)明的雙特異性抗體能夠結(jié)合⑶3陽性的Jurkat細胞(見圖7)。實施例四本發(fā)明雙特異性抗體的體外腫瘤細胞生長抑制活性檢測本發(fā)明利用外周血T淋巴細胞和Raji細胞作為細胞模型來檢測雙特異性抗體對 Raji細胞的體外生長抑制作用。1、雙特異性抗體有效激活T淋巴細胞抽取健康自愿者的外周血，用T淋巴細胞分離液分離外周血T淋巴細胞。在96孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)接種τ淋巴細胞細胞(1 X IO4/孔，200ul)，將不同濃度的雙特異性抗體加入到細胞培養(yǎng)孔。繼續(xù)培養(yǎng)細胞48小時后，每孔加20ul濃度為5mg/ml的MTT噻唑藍溶液。 繼續(xù)孵育4小時后，吸棄細胞培養(yǎng)孔內(nèi)的上清液，每孔加150ul 二甲基亞砜(DMSO)，振搖10 分鐘，使結(jié)晶物充分融解。用酶聯(lián)免疫檢測儀測定各孔490nm波長的吸收值，繪制細胞生長曲線。結(jié)果顯示，本發(fā)明的雙特異性抗體能夠有效激活T淋巴細胞(見圖8)。2、雙特異性抗體有效抑制Raji細胞的體外生長在96孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)接種Raji細胞(1 X IO4/孔，200ul)，待細胞貼壁后，按照T 淋巴細胞與Raji細胞10 1的比例，將外周血T淋巴細胞加入到培養(yǎng)板內(nèi)，同時將不同濃
9度的雙特異性抗體加入到細胞培養(yǎng)孔。繼續(xù)培養(yǎng)細胞96小時后，每孔加20ul濃度為5mg/ ml的MTT噻唑藍溶液。繼續(xù)孵育4小時后，吸棄細胞培養(yǎng)孔內(nèi)的上清液，每孔加150ul 二甲基亞砜(DMSO)，振搖10分鐘，使結(jié)晶物充分融解。用酶聯(lián)免疫檢測儀測定各孔490nm波長的吸收值，繪制細胞生長曲線。結(jié)果顯示，本發(fā)明的雙特異性抗體能夠有效誘發(fā)T淋巴細胞對Raji細胞的生長抑制(見圖9)。實施例五本發(fā)明雙特異性抗體對小鼠體內(nèi)移植瘤生長抑制的檢測本發(fā)明利用Raji細胞和人外周血單個核細胞PBMCs來接種SCID小鼠以檢測雙特異性抗體對Raji細胞的體內(nèi)生長抑制作用，并觀察重要臟器的組織形態(tài)。1、雙特異性抗體可以抑制小鼠體內(nèi)移植瘤的生長5-6周齡雌性非孕SCID小鼠(體重為18_20g/只)分為2組。一組腹背側(cè)接種 Raji細胞(1 X IO5/只)，另一組腹背側(cè)混合接種Raji細胞(1 X IO5/只)和非激活的人外周血單個核細胞PBMCs (IX IO6/只)。單獨Raji接種組接受vehicle(PBS)或1 μ g雙特異性抗體(CD19/CD3BsAb)處理；Raji和PBMCs混合接種組接受vehicle (PBS)、0· 1 μ g或 ι μ g雙特異性抗體處理；處理方案為連續(xù)尾靜脈注射7次(ι次/天，IOOuI/只)。腫瘤體積計算采用如下公式(寬徑2X長徑)/2。結(jié)果顯示，本發(fā)明的雙特異性抗體能夠有效抑制Raji移植瘤的生長(見圖10)，并且能夠延長荷瘤小鼠的生存(見圖11)。2、雙特異性抗體對小鼠重要臟器的組織形態(tài)無明顯影響取雙特異性抗體治療后的小鼠，處死后分離心、肝、脾、肺、腎等重要臟器，10%中性福爾馬林固定M小時，梯度酒精脫水后進行石蠟包埋。采用組織切片和蘇木素伊紅(HE) 染色后，中性樹膠封片，于顯微鏡下觀察組織形態(tài)。結(jié)果顯示，本發(fā)明的雙特異性抗體對小鼠重要臟器的組織形態(tài)無明顯影響(見圖12)。上述實例表明，本發(fā)明的人源⑶19-⑶3雙特異性抗體可以在CHO細胞中表達，能夠進一步通過親和層析純化。所得到的雙特異性抗體可以結(jié)合CD19陽性的Raji細胞和 ⑶3陽性的Jurkat細胞，并且可以激活人外周血T淋巴細胞，從而達到抗B細胞淋巴瘤的作用。具有很好的作用。
權利要求
1.抗B細胞淋巴瘤的雙特異性抗體，由來自抗CD19抗體的可變區(qū)與來自抗CD3抗體的可變區(qū)構(gòu)成，之間由一條連接肽相連。
2.如權利要求1所述的抗B細胞淋巴瘤的雙特異性抗體，其特征在于所述的CD19抗體可變區(qū)由輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)融合而成。
3.如權利要求2所述的抗B細胞淋巴瘤的雙特異性抗體，其特征在于所述的CD19抗體可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
4.如權利要求1所述的抗B細胞淋巴瘤的雙特異性抗體，其特征在于所述的CD3抗體可變區(qū)由輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)融合而成。
5.如權利要求4所述的抗B細胞淋巴瘤的雙特異性抗體，其特征在于其所述的CD3抗體可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO. 4所示。
6.如權利要求1 5任一項所述的抗B細胞淋巴瘤的雙特異性抗體，其特征在于所述連接肽的氨基酸序列為GGGGSGGGGSGGGGS。
7.如權利要求1 6任一項所述的抗B細胞淋巴瘤的雙特異性抗體，其特征在于(1)其氨基酸序列如SEQ ID NO. 8所示；或者O)在SEQ ID No. 8所示的蛋白的氨基酸序列中經(jīng)過取代和/或缺失和/或添加一個或幾個氨基酸所得的與SEQ ID No. 8所示的雙特異性抗體的功能相同或相似的抗體。
8.編碼權利要求1 6任一項所述的抗B細胞淋巴瘤的雙特異性抗體的核苷酸序列。
9.如權利要求8所述的核苷酸序列，其特征在于(1)核苷酸序列為SEQ ID NO. 7所示；或者為SEQ ID NO. 7的簡并序列；或者O)在(1)限定的核苷酸序列中經(jīng)過取代、缺失或添加一個或幾個核苷酸衍生所得的核苷酸序列，且與(1)限定的核苷酸序列編碼功能相同或相似的抗體。
10.含有權利要求8或9任一項所述核苷酸序列的基因載體。
11.含有權利要求10所述基因載體的宿主細胞。
12.權利要求1-7任一項所述抗B細胞淋巴瘤的雙特異性抗體在制備抗B細胞淋巴瘤藥物中的應用。
13.抗B細胞淋巴瘤藥物組合物，其特征在于由權利要求1-7任一項所述抗B細胞淋巴瘤的雙特異性抗體為活性成分。
14.如權利要求13所述的藥物組合物，其特征在于，還包括至少一種其他的抗B細胞淋巴瘤藥物。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因工程和蛋白質(zhì)工程技術領域，具體涉及編碼包含人源CD19抗體可變區(qū)與人源CD3抗體可變區(qū)片段的重組融合蛋白的DNA、其所編碼的融合蛋白、該融合蛋白的生產(chǎn)方法、該融合蛋白的藥物用途和該融合蛋白的治療方法。本發(fā)明提供了包含人源CD19scFv-CD3scFv雙特異性抗體蛋白，其能夠結(jié)合CD19和CD3陽性的細胞，在體內(nèi)外都具有良好的生物活性，并且能夠激活人T淋巴細胞，殺傷B淋巴瘤細胞，具有良好的應用前景。
文檔編號C07K16/46GK102250245SQ20111013908
公開日2011年11月23日 申請日期2011年5月26日 優(yōu)先權日2010年5月27日
發(fā)明者勾藍圖, 楊莉, 楊金亮, 魏于全 申請人:四川大學