專利名稱：一種抗細(xì)胞色素b5異構(gòu)體b抗體及其在純化線粒體中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及免疫學(xué)和細(xì)胞學(xué)等生物技術(shù)領(lǐng)域，具體而言本發(fā)明涉及線粒體外膜蛋白細(xì)胞色素B5異構(gòu)體B(CYB5B)、CYB5B多克隆抗體制備、CYB5B抗體與磁性材料偶聯(lián)后形成免疫磁珠(CYB5B磁珠)、以及利用CYB5B磁珠純化細(xì)胞中線粒體的方法。該方法制備出的線粒體結(jié)構(gòu)完整，富集效率高，可用于生物技術(shù)的各個(gè)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
線粒體是真核生物中的一種重要細(xì)胞器，它的基本生物學(xué)功能是合成細(xì)胞所需的能量化合物，ATP。線粒體還具有許多重要生物功能，包括離子穩(wěn)態(tài)維護(hù)、物質(zhì)代謝和細(xì)胞凋亡等。因此,線粒體功能紊亂可以導(dǎo)致多種疾病,例如引起神經(jīng)肌肉疾病、心血管病、糖尿病、神經(jīng)退行性疾病如帕金森氏病等多種疾病。對(duì)線粒體的分析有助于我們對(duì)上述疾病的 深入研究，而從有限的生物樣品中分離純化得到一定數(shù)量的、純度較高的線粒體是進(jìn)行線粒體生化及功能研究的基礎(chǔ)。目前公認(rèn)的線粒體分離純化技術(shù)包括以下幾種離心分離純化法，自由流電泳分離法，流式細(xì)胞分選法，和免疫磁珠分離法。離心分離純化法是根據(jù)線粒體與其它細(xì)胞器具有不同的沉降系數(shù)和密度通過(guò)離心而將線粒體與其它細(xì)胞組分分開。使用Percoll、Necodenz或鹿糖鋪設(shè)連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度溶液，將細(xì)胞勻漿液置于介質(zhì)溶液中，離心開始后，原來(lái)分布均勻的粒子發(fā)生重新分布。粒子進(jìn)入到一個(gè)與它本身的密度相同的位置，此時(shí)粒子不再移動(dòng)，粒子形成純組份的區(qū)帶。由于離心技術(shù)操作過(guò)程簡(jiǎn)單、省時(shí)，得到的線粒體純度高，一次性可以處理大量的樣品。因此，離心法在線粒體的分離純化中得到很廣泛的應(yīng)用。比如大鼠的腦、肝、肌肉、心等組織的線粒體，人293T細(xì)胞、小鼠LDTK-等細(xì)胞(一般IO8以上)。但是離心法不適合小規(guī)模提取線粒體。首先，微量組織和細(xì)胞中所含的線粒體很少，在離心處理的過(guò)程中容易丟失，造成線粒體回收率顯著下降。其次，由于離心體積過(guò)小，介質(zhì)幾乎無(wú)法形成穩(wěn)定的梯度，也就無(wú)法按照梯度的層次分離線粒體。自由流電泳分離法是根據(jù)不同細(xì)胞器表面的負(fù)電荷密度各不相同，繼而在電場(chǎng)中的電泳遷移率不同而達(dá)到線粒體的分離目的。樣品通過(guò)進(jìn)樣口進(jìn)入分離腔后，被液流所帶動(dòng)流向另一端；而在與液體流動(dòng)方向垂直的方向上同時(shí)加有電場(chǎng)，所以具有不同電泳遷移率的物質(zhì)將在電場(chǎng)中遷移不同的距離，樣品被分為若干束，從而在分離腔另一端的不同出口處得到收集分離。由于自由流電泳是一個(gè)全液相分離過(guò)程，不使用任何固體支持介質(zhì)，分離條件非常溫和，而且一般不使用有機(jī)溶劑.因此對(duì)于線粒體細(xì)胞器等，可以得到良好的分離純化，其生物活性也同時(shí)得到較好的保存。自由流電泳技術(shù)已成功應(yīng)用于酵母和擬南介線粒體的分離。但是相對(duì)于過(guò)氧物酶體、晚期胞內(nèi)體而言，線粒體電遷移能力較差，在電泳的過(guò)程中容易產(chǎn)生沉淀，并且由于電泳本身固有的影響因素(焦耳熱，電動(dòng)力學(xué)變形)夕卜，還有層流(流體力學(xué)變形)以及一些綜合因素的影響(電流體力學(xué)變形等)，而且這些因素又常常相互關(guān)聯(lián)，使整個(gè)過(guò)程變得極為復(fù)雜，導(dǎo)致在電泳后有條帶擴(kuò)散現(xiàn)象和稀釋效應(yīng)。因此，目前自由流電泳一般也只用于大規(guī)模樣品的分離。流式細(xì)胞分選法的原理是將細(xì)胞裂解液用熒光染料偶聯(lián)的抗體標(biāo)記，標(biāo)記后的線粒體與其它組分進(jìn)入流動(dòng)室，形成一連串的均勻小液滴，標(biāo)記有熒光染料線粒體被激光激發(fā)后產(chǎn)生熒光，光學(xué)系統(tǒng)已測(cè)定了它們的信號(hào)，儀器給整個(gè)液流充以電荷。當(dāng)該液滴離開液流后，其中被選定線粒體液滴就帶有電荷，而不被選定的其它組分則不帶電。線粒體液滴通過(guò)高壓偏轉(zhuǎn)板時(shí)發(fā)生偏轉(zhuǎn)，從而得到分離。已有人使用流式細(xì)胞法分離過(guò)大鼠肝臟和脾臟的線粒體。但由于線粒體遠(yuǎn)比細(xì)胞小，線粒體上帶上的熒光染料也較少，使得分選時(shí)的信號(hào)較弱，回收率低，分離效果差。免疫磁珠法分離的一般步驟是將抗體與磁珠混合,磁珠是以順磁性材料如三氧化二鐵(Fe2O3)或四氧化三鐵(Fe3O4)為核心，在其外表面包裹高分子材料如聚苯乙烯、乙基纖維素等，制成直徑從幾十納米到幾十微米的微球，通過(guò)吸附結(jié)合或化學(xué)偶聯(lián)將特異性抗體結(jié)合到磁珠表面，便形成免疫磁珠。免疫磁珠上的抗體能夠?qū)Ｒ坏刈R(shí)別含有抗原的組分，然 后使用磁鐵吸附磁珠，便能夠有效地將該組分與其它組分分離。然后，再利用溫和洗脫液將結(jié)合于磁珠上的組分析脫下來(lái)。在處理少量樣品時(shí)，相對(duì)于前三種方法，免疫磁珠法具有很好的技術(shù)優(yōu)勢(shì)。首先免疫磁珠法沒(méi)有繁瑣的多次離心步驟，避免了線粒體的損失。其次免疫磁珠是通過(guò)免疫吸附作用與線粒體結(jié)合，可以吸附具有不同密度的線粒體，避免了因?yàn)榫€粒體的密度差異而在梯度離心中造成的損失。迄今為止，僅有一篇文獻(xiàn)報(bào)道使用免疫磁珠法分離線粒體(Hue-Tran Hornig-Do,Gritt Giinther,Maria Bust,Patricia Lehnartz,Andreas Bosio, Rudolf J. ffiesner. Isolation of functional pure mitochondria bysuperparamagnetic microbeads. Analytical Biochemistry(2009)389 :1-5)。在該文章中，作者利用直接偶聯(lián)了抗線粒體外膜蛋白T0M22(22-kDa translocase of outermitochondrial membrane)的單抗的磁珠來(lái)分離線粒體。但是,這個(gè)方法仍存在較大的技術(shù)不足。首先，作者顯然忽略了線粒體蛋白質(zhì)具有很大程度的組織特異性。如果無(wú)法找到一個(gè)非組織特異性的線粒體蛋白質(zhì)及其對(duì)應(yīng)的抗體，免疫磁珠方法在線粒體制備上的應(yīng)用將受到很大的限制。事實(shí)上，無(wú)論是本實(shí)驗(yàn)室還是其他實(shí)驗(yàn)室都有充分證據(jù)表明T0M22的確是一個(gè)組織特異性的線粒體蛋白質(zhì)(圖 6), (Mootha VK, Bunkenborg J, Olsen JV, HjerrildM, Wisniewski JR, Stahl E,Bolouri MS, Ray HN,Sihag S, Kamal M,Patterson N,LanderES, MannM. Integrated analysis of protein composition,tissue diversity, and generegulation in mouse mitochondria. Cell. 2003Nov 26 ；115 (5) :629-40)。其次，作者沒(méi)有意識(shí)到線粒體外膜蛋白質(zhì)的豐度高低嚴(yán)重地影響到免疫磁珠的效率。選擇高豐度線粒體蛋白質(zhì)作為抗原是一個(gè)較為重要的技術(shù)考慮。再次，作者沒(méi)有系統(tǒng)地考察在什么規(guī)模的細(xì)胞數(shù)目水平上，免疫磁珠法能夠制備高質(zhì)量和產(chǎn)率的線粒體。因此，發(fā)展一個(gè)適合于制備線粒體的廣譜性免疫磁珠技術(shù)，就必須在這三個(gè)方面有革命性的突破。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決以上技術(shù)難題，本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種特異定位于線粒體外膜，在各個(gè)組織中均穩(wěn)定表達(dá)且具有較高豐度和免疫原活性的抗原細(xì)胞色素B5異構(gòu)體B (Cytochrome b5 type B, CYB5B)。
本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種特異識(shí)別CYB5B線粒體外膜蛋白質(zhì)的多克隆抗體。本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種在少量樣品中純化線粒體及線粒體蛋白質(zhì)的方法。本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供一種用于純化細(xì)胞線粒體蛋白質(zhì)的免疫學(xué)試劑(CYB5B 磁珠)。為解決技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案利用生物信息學(xué)的方法，尋找一種定位于線粒體外膜的、非組織特異性表達(dá)的、豐度適中的、并且其膜外部分的免疫原性較強(qiáng)的候選蛋白，CYB5B。通過(guò)克隆其膜外部分的編碼基因，連接到表達(dá)載體中，在大腸桿菌中表達(dá)并純化重組蛋白作為免疫原。免疫新西蘭大白兔，收集兔血清，利用重組免疫原親和層析純化特異性和高敏感性的CYB5B多克隆抗體。 將CYB5B抗體與磁性材料結(jié)合，生產(chǎn)免疫磁珠材料CYB5B磁珠。把CYB5B磁珠加入到細(xì)胞裂解液中，以富集細(xì)胞中的線粒體。使用免疫印跡方法(Western Blot)和電鏡檢測(cè)所富集得到的線粒體的純度和完整性。以Bradford法定量檢測(cè)制備的線粒體的蛋白質(zhì)含量。具體地，本發(fā)明涉及以下幾方面內(nèi)容I. 一種多克隆抗體，其特征在于能夠特異結(jié)合線粒體外膜蛋白質(zhì)細(xì)胞色素B5異構(gòu)體 B (CYB5B)。2.上述的多克隆抗體，其免疫原含有下述氨基酸殘基之一I)序列表中的 SEQ ID NO 2 ；2)序列表中SEQ ID NO 2的氨基酸序列中任意連續(xù)14個(gè)(或以上)氨基酸的多肽片段；3)與序列表中SEQ ID NO :2序列中任意連續(xù)14個(gè)氨基酸的相似性大于80%的多肽片段。3.上述的多克隆抗體，其在利用抗原抗體結(jié)合的方法純化線粒體蛋白質(zhì)中的應(yīng)用。4.上述的多克隆抗體，將其偶聯(lián)到一個(gè)固相載體上純化線粒體的應(yīng)用。5.上述的多克隆抗體，其作為免疫學(xué)試劑進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)的用途。6. 一種免疫磁珠(CYB5B磁珠)，其特征在于磁珠上偶聯(lián)有上述的多克隆抗體。7.上述的免疫磁珠，其用于抗原抗體結(jié)合的用途。8.上述的免疫磁珠，其用于純化線粒體的用途。9. 一種純化線粒體的方法，其特征在于使用上述的免疫磁珠特異結(jié)合生物樣品中的線粒體蛋白質(zhì)CYB5B。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)及其有益效果I)本發(fā)明所選用的抗原CYB5B為線粒體外膜蛋白，并僅在線粒體上表達(dá)；而且CYB5B表達(dá)不具有組織特異性，與之前報(bào)道的T0M22相比較，具有更為廣譜的表達(dá)范圍。2)本發(fā)明所采用的抗原CYB5B在線粒體中的表達(dá)豐度較高，適合作為免疫法提取線粒體的祀標(biāo)抗原，提聞提取效率。3)本發(fā)明采用免疫純化的多克隆抗體，不僅利用了多識(shí)別位點(diǎn)帶來(lái)的高親和力，也因免疫純化提高了特異性，保證了線粒體提取的效率和純度。
4)本發(fā)明提供的線粒體富集方法-免疫磁珠法富集效率高，能夠從小量樣品中進(jìn)行線粒體的富集。可以在最少IO4個(gè)細(xì)胞中有效提取線粒體。5)本發(fā)明提供的線粒體富集方法純化得到的線粒體富集效率較傳統(tǒng)方法高3-4倍，且該方法富集得到的線粒體純度高，完整性好，有非常高的應(yīng)用價(jià)值。6)本發(fā)明提供的偶聯(lián)方法 是抗體通過(guò)Protein A與載體連接在一起的,相對(duì)于抗體直接與載體連接的方法，本方法既可以避免抗體與載體直接偶聯(lián)帶來(lái)的親和活力降低，又可以使抗體活性基團(tuán)更加充分的暴露，增加其與線粒體蛋白結(jié)合的特異性。7)本發(fā)明提供了一種用于純化線粒體的免疫學(xué)試劑(CYB5B磁珠)。該免疫學(xué)試劑不僅能應(yīng)用于肝癌細(xì)胞和胃癌細(xì)胞中線粒體的純化，而且也可以應(yīng)用于其他細(xì)胞系中線粒體的純化。


圖I :表示pET32a_CYB5B重組質(zhì)粒的構(gòu)建和CYB5B重組蛋白的表達(dá)純化結(jié)果，結(jié)果顯示CYB5B片斷成功的插入到pET32a載體中，表達(dá)后的CYB5B重組蛋白經(jīng)純化后具有較高的純度。圖2 :表示純化前后CYB5B抗體的滴度和特異性的檢測(cè)。具體而言，純化前CYB5B血清滴度為I. 2 X IO4,純化后CYB5B抗體的滴度為2. I X IO5,純化前后抗體都有較好的特異性，純化后抗體僅與線粒體發(fā)生作用。圖3 :表示利用CYB5B磁珠對(duì)線粒體的富集作用。具體而言，磁珠能從人胃癌細(xì)胞系BGC823和人肝癌細(xì)胞系HuH7中富集線粒體，洗脫后的線粒體經(jīng)透射電鏡和WesternBlot檢測(cè)表明其具有較高的特異性和結(jié)構(gòu)完整性。圖4 :表示利用CYB5B磁珠所富集的線粒體的蛋白質(zhì)含量，從I X IO7的BGC823和HuH7細(xì)胞中分別可以提取得到46 μ g和41 μ g的線粒體蛋白。圖5 :表示差速離心法與CYB5B磁珠法富集線粒體效果的比較。具體而言，CYB5B磁珠富集線粒體的效果是差速離心法的3-4倍。圖6 :表示CYB5B與T0M22表達(dá)特異性的比較。Western blot結(jié)果顯示，T0M22具有組織表達(dá)特異性，其在小鼠肝臟組織和人肝臟細(xì)胞系L-02中均表達(dá)量很低，而CYB5B在被檢測(cè)的組織和細(xì)胞水平上都穩(wěn)定表達(dá)且豐度較高。圖7 :表示利用CYB5B磁珠純化線粒體的效率，通過(guò)該方法可以在低至IO4個(gè)細(xì)胞中提取出線粒體。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合圖表和具體實(shí)施的方式對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步闡述，以使本領(lǐng)域技術(shù)人員可以更清楚地得知本發(fā)明的技術(shù)方案，并非對(duì)本發(fā)明的限制。實(shí)施例I CYB5B免疫原的制備一、CYB5B 基因克隆根據(jù)已公布的人CYB5B的基因序列(gi =83921613)設(shè)計(jì)PCR引物CYB5B 5，正向引物5’ CCG GAA TTC ATG TCC GGT TCA ATG GCG 3’CYB5B 3’ 反向引物5’ CCG CTC GAG TTT TGA AGG GTC CTT GCT 3’
以人肝cDNA文庫(kù)為模板，PCR擴(kuò)增出CYB5B基因的1-345位核酸序列(SEQ ID NO 2。PCR 參數(shù)95°C 5min ；94°C 30s 54°C 30s 72°C lmin，共 40 個(gè)循環(huán)；72°C后延伸 IOmin)。二、CYB5B基因片段亞克隆入pET32a載體將上述PCR得到的CYB5B片段和pET32a質(zhì)粒分別用EcoR I和Xho I 37°C雙酶切8小時(shí)，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)酶切效果，然后使用的瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(TianGEN公司)純化酶切后的載體和基因片斷。16°C連接載體和基因片段過(guò)夜，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5ci，挑取單克隆小量培養(yǎng)后提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定。雙酶切結(jié)果(圖I)表明酶切后的片段大小約為300bp，與預(yù)期一致。挑取陽(yáng)性克隆質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明，目的基因正確插入pET32a，并保持正確的讀碼框架。得到的陽(yáng)性克隆即為重組有his-tag的CYB5B的原核表達(dá)重組子，命名為pET32a-CYB5B。 三CYB5B重組蛋白的表達(dá)純化將pET32a-CYB5B轉(zhuǎn)入BL21菌株，當(dāng)菌液的OD值達(dá)到O. 6左右時(shí)，加入Immol/ L IPTG誘導(dǎo)4小時(shí)后收菌，超聲破碎、離心、收集上清。使用Ni-NAT親和層析柱對(duì)表達(dá)的CYB5B蛋白進(jìn)行純化，柱子經(jīng)平衡、上樣、淋洗后，使用IO、20、50mM咪唑進(jìn)行分段洗脫，去除其中的雜蛋白，最后采用IOOmM咪唑洗脫目的蛋白。純化后的蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳，表明純化后的CYB5B重組蛋白具有較高的純度(圖I)，符合抗體制備的要求。實(shí)施例2抗人CYB5B多克隆抗體的制備一、CYB5B多克隆抗體的制備和檢測(cè)取O. 5mL(750ug)的CYB5B重組蛋白與等體積弗氏完全佐劑充分混合，取I只新西蘭大耳白兔進(jìn)行背部及腹股溝皮下多點(diǎn)注射。2周后開始加強(qiáng)免疫，加強(qiáng)免疫劑量為500μ gCYB5B重組蛋白，與等體積弗氏不完全佐劑充分混合后皮下注射，每2周一次。第4次加強(qiáng)免疫后7天取血，分離血清。對(duì)血液中的抗血清進(jìn)行滴度檢測(cè)。取100 μ I (O. Ing)的CYB5B重組蛋白加入96孔板子中，用封口膜覆蓋96孔板，4度冰箱中過(guò)夜。用TPBS洗三次，加入TPBS 200μ1，放置5分鐘，甩去溶液。加200 μ I封閉液(3% BSA in TPBS)，37度溫育I小時(shí)，用封閉液稀釋純化抗體，在相應(yīng)孔中各加入100 μ 1，37度溫育I小時(shí)。用TPBS洗三次，用TPBS按一定比例稀釋辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，37度溫育I小時(shí)。用TPBS洗三次，每孔加入ΙΟΟμ I含O. 1% TMB(Sigma公司)和O. 03% H2O2的檸檬酸-磷酸緩沖液顯色lOmin，加50 μ I O. 5Μ硫酸溶液終止反應(yīng)。用酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)450nm的吸光值。結(jié)果(圖2)表明CYB5B抗血清的滴度為I. 2X 104。對(duì)血液中的抗血清進(jìn)行免疫印跡(Western blot)檢測(cè)。選擇人胃癌細(xì)胞BGC823和人肝細(xì)胞HuH7全蛋白裂解液作為抗原檢測(cè)抗血清的特異性。每種蛋白上樣約20μ g，使用12%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，電泳結(jié)束后立即進(jìn)行電轉(zhuǎn)移，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，冰浴中350mA恒流轉(zhuǎn)移2小時(shí)。雜交過(guò)程如下膜以PBST浸濕，加PBST配制5%脫脂奶粉封閉，室溫?fù)u床上搖2小時(shí)，4°C過(guò)夜，PBST洗膜后加入I : 4000稀釋的兔抗血清，室溫下孵育2小時(shí)，洗膜后加入I : 3000的HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG的二抗，孵育I小時(shí)，再次PBST洗膜，使用ECL增強(qiáng)型免疫印跡檢測(cè)試劑盒(RPN2132，GE Healthcare)顯色。實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖2)顯示，在兔血清中已經(jīng)成功產(chǎn)生了抗CYB5B蛋白的抗體。CYB5B只在細(xì)胞的線粒體上表達(dá)，理論上CYB5B抗體只與線粒體發(fā)生相互作用。因此取小鼠肝細(xì)胞的細(xì)胞核、線粒體、溶酶體、過(guò)氧物酶體、胞漿作為抗原進(jìn)行免疫印跡(Western blot)檢測(cè)，結(jié)果(圖2)表明CYB5B抗體只與線粒體發(fā)生相互作用。二、CYB5B多克隆抗體的純化與檢測(cè)稱取66Omg CNBR-activated sepharose 4B 柱料(GE healthcare 公司)，用 7Oml冷HCl (ImM)溶解，4度lh。將預(yù)處理處理好的柱料先用10倍體積的純水淋洗，然后用10倍柱體積的 IXcoupling buffer A(O. IM NaHC03、0. 5M NaCl pH8. 3)淋洗。在處理好的柱料中加入IOmg純化的CYB5B重組蛋白質(zhì)，在旋轉(zhuǎn)混合儀上混和(4度過(guò)夜)。用O. 2M glycine封閉柱子，在旋轉(zhuǎn)混合儀上混合(室溫下2小時(shí))，用coupling bufferA與c oupling bufferB (O. IM醋酸納、O. 5M NaClpH 4. O)交替洗滌柱子4次。取抗血清3ml，然后加入4倍體積的PBS，混勻后加到平衡好的柱料中，在旋轉(zhuǎn)混合儀上混合(4度過(guò)夜)。用O. IM glycinepH2. 4洗脫樣品，收集樣品，然后分別加入3M Tris-HCl pH8.8和5M NaCl中和溶液至中性。對(duì)純化后的CYB5B抗體進(jìn)行滴度和特異性檢測(cè)。結(jié)果(圖2)表明純化并濃縮后的抗體的滴度為2. I X 105，是純化前的18倍。免疫印跡(Western blot)結(jié)果(圖2)表明抗體具有較好的特異性。實(shí)施例3線粒體的制備一、磁珠與抗體的連接每100 μ I用ρΗ8的0. IM憐酸緩沖液平衡過(guò)的Dynabeads Protein A磁珠(Invitrogen公司)與25 μ g純化后的抗CYB5B抗體在旋轉(zhuǎn)混合儀上室溫混合20分鐘。利用磁架使磁珠貼壁，去除液體。用PH8的0. IM磷酸緩沖液洗3次。二、線粒體的富集及純度檢測(cè)收集IxlO7個(gè)BGC823細(xì)胞，使用PBS清洗細(xì)胞兩次，使用線粒體勻漿液重懸細(xì)胞，在冰上勻漿40-60次。收集細(xì)胞勻漿溶液，500g離心5分鐘，收集上清置于冰上，沉淀使用線粒體勻漿液重懸后再勻漿40-60次，收集上清并合并。合并后上清IOOOg離心10分鐘去除細(xì)胞核，將連接有抗體的磁珠加入到去除細(xì)胞核后的細(xì)胞裂解液中，在旋轉(zhuǎn)混合器上4°C混合2小時(shí)。然后將離心管置于磁架上2分鐘，待磁珠貼壁后去除液體。往離心管中加入
0.5ml線粒體重懸液，在旋轉(zhuǎn)混合器上4°C混合10分鐘，然后將離心管置于磁架上2分鐘，待磁珠貼壁后去除液體。往離心管中加入0.5ml 2M MgCl2溶液，重懸磁珠，然后將離心管置于磁架上2分鐘，待磁珠貼壁后收集溶液，IOOOOg離心10分鐘，收集沉淀，然后使用線粒體重懸液重懸線粒體，IOOOOg離心10分鐘，沉淀即為純化后線粒體。取洗脫前磁珠、洗脫得到的線粒體、洗脫后磁珠進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)(圖3)，可見(jiàn)線粒體得到充分的洗脫。取洗脫后線粒體通過(guò)免疫印跡(Western Blot)來(lái)檢測(cè)線粒體的純度(圖3)，本發(fā)明以Prohibitin作為線粒體標(biāo)志物，以檢測(cè)線粒體組分；采用Aldehyde reductase作為胞漿提取物，以檢測(cè)獲得的線粒體是否存在胞漿的污染。從圖上可見(jiàn)采用免疫磁珠法分離得到的線粒體具有較高的純度。取洗脫的線粒體使用2. 5%的戊二醛固定48小時(shí)，應(yīng)用透射電鏡掃描觀察其形狀(圖3)。結(jié)果表明線粒體的完整度和純度均在90%以上。三、定量純化得到的線粒體蛋白分別使用30 μ g、60 μ g、120 μ g、240 μ g CYB5B抗體與磁珠結(jié)合后純化線粒體，使用Bradford法測(cè)定得到的線粒體蛋白量，從一盤IOcm培養(yǎng)基獲得的BGC823和HuH7細(xì)胞(I X IO7)分別最多可以提取約41 μ g和46 μ g線粒體蛋白(圖4)。實(shí)施例4免疫磁珠法與傳統(tǒng)差速離心法富集線粒體效果的比較收集2xl07個(gè)BGC823細(xì)胞，一半細(xì)胞使用上述的免疫磁珠法進(jìn)行純化線粒體，另一半細(xì)胞使用傳統(tǒng)差速離心法純化線粒體，即使用PBS清洗細(xì)胞兩次，使用線粒體勻漿液重懸細(xì)胞，在冰上勻漿40-60次。收集細(xì)胞勻漿溶液，500g離心5分鐘，收集上清置于冰上，沉淀使用線粒體勻漿液重懸后再勻漿40-60次，收集上清并合并。合并后上清IOOOg離心
10分鐘去除細(xì)胞核，然后取上清IOOOOg離心20分鐘即得到粗提的線粒體。兩種方法得到的線粒體分別用裂解液溶解，定量后使用Western Blot檢測(cè)并比較線粒體的純度(圖5)，選用的線粒體標(biāo)記物為ATP synthase和Prohibitin。通過(guò)ImageQuant ECL的定量計(jì)算，對(duì)于 BGC823，ATP synthase (233759/47370) = 4. 93, Prohibitin (283200/70057 = 4. 04)；對(duì)于 HuH7，ATP synthase (333861/90471) = 3. 69, Prohibitin (388615/123351 = 3. 15)。磁珠親合純化法對(duì)線粒體的富集效果是傳統(tǒng)差速離心法的3-4倍。
實(shí)施例5 CYB5B與T0M22在組織表達(dá)特異性上的比較對(duì)6種小鼠組織心、肝、腎、脾、肺、胃和5種細(xì)胞系H9C2、L-02、TRE293、A549、BGC823進(jìn)行勻漿，通過(guò)差速離心法分別提取線粒體，將得到的粗提線粒體用SM尿素溶解，各取10 μ g線粒體蛋白進(jìn)行WB檢測(cè)(圖6)，分別利用anti-CYB5B (本發(fā)明)和anti_T0M22抗體(Sigma公司)檢測(cè)兩種抗原在各個(gè)組織中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，CYB5B在各種組織中的表達(dá)量均衡，而T0M22存在組織表達(dá)特異性。實(shí)施例6有效純化線粒體的最小細(xì)胞樣品量的確定收集104、105、106個(gè)BGC823細(xì)胞，分別使用上述的偶聯(lián)CYB5B抗體的免疫磁珠法提取線粒體。將得到的線粒體裂解、定量后使用WB檢測(cè)線粒體的有效純化，利用ATPsynthase β和Τ0Μ20作為線粒體特異標(biāo)志物(圖7)。結(jié)果顯示，本方法可以從最少IO4細(xì)胞中提取到線粒體。
權(quán)利要求
1.一種多克隆抗體，其特征在于能夠特異結(jié)合線粒體外膜蛋白質(zhì)細(xì)胞色素B5異構(gòu)體B(CYB5B)。
2.權(quán)利要求I所述的多克隆抗體，其免疫原含有下述氨基酸殘基之一 1)序列表中的SEQID NO 2 ；2)序列表中SEQID NO 2的氨基酸序列中任意連續(xù)14個(gè)(或以上)氨基酸的多肽片段；3)與序列表中SEQID NO :2序列中任意連續(xù)14個(gè)氨基酸的相似性大于80%的多肽片段。
3.權(quán)利要求I所述的多克隆抗體，其在利用抗原抗體結(jié)合的方法純化線粒體蛋白質(zhì)中的應(yīng)用。
4.權(quán)利要求I所述的多克隆抗體，將其偶聯(lián)到一個(gè)固相載體上純化線粒體的應(yīng)用。
5.權(quán)利要求I所述的多克隆抗體，其作為免疫學(xué)試劑進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)的用途。
6.一種免疫磁珠(CYB5B磁珠)，其特征在于磁珠上偶聯(lián)有權(quán)利要求I所述的多克隆抗體。
7.含有權(quán)利要求6所述的免疫磁珠，其用于抗原抗體結(jié)合的用途。
8.含有權(quán)利要求6所述的免疫磁珠，其用于純化線粒體的用途。
9.一種純化線粒體的方法，其特征在于使用權(quán)利要求6所述的免疫磁珠特異結(jié)合生物樣品中的線粒體蛋白質(zhì)CYB5B。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種特異性針對(duì)人線粒體外膜蛋白細(xì)胞色素B5異構(gòu)體B(Cytochrome b5 type B，CYB5B)的多克隆抗體，以及利用固化CYB5B抗體的免疫磁珠(CYB5B磁珠)從細(xì)胞中提取線粒體。具體地說(shuō)，經(jīng)抗原親和層析純化的CYB5B抗體可以特異地識(shí)別各種組織和器官中的線粒體，而幾乎不與其它細(xì)胞器發(fā)生作用。純化的CYB5B抗體與磁珠材料相結(jié)合可產(chǎn)生CYB5B磁珠。利用CYB5B磁珠可以從少量細(xì)胞中提取到完整的線粒體(細(xì)胞數(shù)目≥104)。本發(fā)明特別適合于從實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的細(xì)胞中制備線粒體。較之傳統(tǒng)差速離心法，本方法的富集效果提高了3-4倍。
文檔編號(hào)C07K16/18GK102827276SQ201110158700
公開日2012年12月19日 申請(qǐng)日期2011年6月14日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月14日
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