專(zhuān)利名稱(chēng)：控制植物葉綠體發(fā)育的基因序列及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物葉綠體發(fā)育領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明涉及控制植物葉綠體發(fā)育的基因序列及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
葉綠體是植物進(jìn)行光合作用的場(chǎng)所，因此，延長(zhǎng)葉綠體的功能對(duì)于提高生物產(chǎn)量或者經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量具有重要的意義。另外，在園藝觀(guān)賞植物中，觀(guān)葉植物也是越來(lái)越受到人們的重視。目前，這些觀(guān)賞植物都是從自然突變體或者通過(guò)人工誘變后篩選獲得的突變體。隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，通過(guò)轉(zhuǎn)基因定向培育植物新品種具有快速、效率高等特點(diǎn)。本發(fā)明將促進(jìn)葉色變化新品種的培育。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種分離的多肽，所述多肽選自(I)SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列；和(2)在(I)所述的氨基酸序列中經(jīng)過(guò)取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸，且具有改變植物葉片顏色、改變植物斑葉的形成或改變植物光合作用效率的活性的由(I)衍生的多肽。本發(fā)明提供一種多核苷酸，所述多核苷酸選自(I)編碼本發(fā)明所述的多肽的多核苷酸；和(2)與(I)所述多核苷酸互補(bǔ)的多核苷酸。在一具體實(shí)施例中，所述多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示。本發(fā)明提供一種載體，所述載體含有本發(fā)明所述的多核苷酸。本發(fā)明提供一種遺傳工程化的宿主細(xì)胞，其特征在于，所述宿主細(xì)胞含有本發(fā)明所述的載體。本發(fā)明提供一種多核苷酸序列，所述多核苷酸序列選自(I)SEQ ID N0:83所示的核苷酸序列；(2)與⑴互補(bǔ)的序列。本發(fā)明提供一種改變植物葉片顏色的方法，所述方法包括提高或降低該植物中的本發(fā)明所述多核苷酸或其同源基因的表達(dá)，或使植物中的本發(fā)明所述多核苷酸或其同源基因發(fā)生突變。本發(fā)明提供一種改變植物斑葉的形成的方法，所述方法包括提高或降低該植物中的本發(fā)明所述多核苷酸或其同源基因的表達(dá)，或使植物中的本發(fā)明所述多核苷酸或其同源基因發(fā)生突變。本發(fā)明提供一種改變植物光合作用效率的方法，所述方法包括提高或降低該植物中的本發(fā)明所述多核苷酸或其同源基因的表達(dá)，或使植物中的本發(fā)明所述多核苷酸或其同源基因發(fā)生突變。在一具體實(shí)施例中，所述提高該植物中的本發(fā)明所述多核苷酸或其同源基因的表達(dá)的步驟包括將本發(fā)明所述多核苷酸或其同源基因的多核苷酸轉(zhuǎn)入該植物中以使該植物高表達(dá)或過(guò)表達(dá)本發(fā)明所述多核苷酸或其同源基因。在一具體實(shí)施例中，所述使植物中的本發(fā)明所述多核苷酸或其同源基因發(fā)生突變的步驟包括誘導(dǎo)本發(fā)明所述多核苷酸或其同源基因發(fā)生點(diǎn)突變或插入突變，從而降低本發(fā)明所述多核苷酸或其同源基因的表達(dá)。本發(fā)明提供一種制備轉(zhuǎn)基因植物的方法，其特征在于，所述的方法包括(I)將本發(fā)明所述多核苷酸或其同源基因轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞、組織、器官或種子，獲得轉(zhuǎn)化入的植物細(xì)胞、組織、器官或種子；和(2)將步驟(I)獲得的轉(zhuǎn)入了所述的多核苷酸的植物細(xì)胞、組織、器官或種子再生成植物。 在一具體實(shí)施例中，所述的方法包括步驟
(Si)提供攜帶表達(dá)載體的農(nóng)桿菌，所述的表達(dá)載體含有本發(fā)明所述多核苷酸或其同源基因；(s2)將植物細(xì)胞、組織、器官或種子與步驟(Si)中的農(nóng)桿菌接觸，從而使本發(fā)明所述多核苷酸或其同源基因轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞，并且整合到植物細(xì)胞的染色體上；(s3)選擇出轉(zhuǎn)入了所述基因的植物細(xì)胞、組織、器官或種子；以及(s4)將步驟(S3)中的植物細(xì)胞、組織、器官或種子再生成植物。本發(fā)明提供一種制備轉(zhuǎn)基因植物的方法，所述的方法包括(I)誘導(dǎo)植物中的本發(fā)明所述多核苷酸或其同源基因發(fā)生突變，獲得本發(fā)明所述多核苷酸或其同源基因發(fā)生突變的植物細(xì)胞、組織、器官或種子；和(2)將步驟(I)獲得的轉(zhuǎn)入了所述干擾分子的植物細(xì)胞、組織、器官或種子再生成植物。本發(fā)明涉及本發(fā)明所述多核苷酸或其同源基因或其所編碼的蛋白質(zhì)在改變植物葉片顏色、改變植物斑葉的形成或改變植物光合作用效率中的應(yīng)用。在一具體實(shí)施例中，本發(fā)明所述多核苷酸的同源基因包括S0T2基因。


圖I顯示斑葉抑制株系sotl thfl真葉較野生型稍小，呈現(xiàn)淡綠色，沒(méi)有斑葉表型；SOtl單突變體表型與sotl thfl相似。將SOTl全長(zhǎng)基因組DNA轉(zhuǎn)化sotl thfl，轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株呈現(xiàn)斑葉表型，表明在斑葉回復(fù)株系sotl thfl中確實(shí)是SOTl的突變導(dǎo)致了thfl的斑葉表型被抑制。圖2顯示sotl thfl的葉綠體雖然大小較野生型稍小、數(shù)量較野生型少，但其超微結(jié)構(gòu)正常，并未見(jiàn)類(lèi)似于thfl突變體中發(fā)育停滯的質(zhì)體。圖3顯示在正常生長(zhǎng)條件下，sotl、sotl thfl和sot2的光系統(tǒng)II (PSII)最大光化學(xué)效率Fv/Fm顯著低于野生型和thfl ;然而隨著強(qiáng)光處理，thfl的？/ _ 顯著下降，而sotUsotl thfl和sot2則較thfl更耐受強(qiáng)光。同時(shí),在6h強(qiáng)光處理后在黑暗條件下進(jìn)行恢復(fù)，sotl、sotl thfl和sot2的Fv/Fm thfl恢復(fù)的更好,可以達(dá)到野生型水平。因此，雖然在正常生長(zhǎng)條件下sot I、sot I thfl和sot2的PSII活性只有thfl的80%左右，但它們卻較thfl更能抵抗強(qiáng)光所引起的PSII光抑制。
圖4顯示S0T1是定位于葉綠體的蛋白質(zhì)。圖5顯示S0T1在除根以外的各個(gè)器官和組織中均有表達(dá)，特別是在綠色組織中。圖6顯示S0T1和S0T2的T-DNA插入突變體sotl-2和sot2都是插在基因的外顯子區(qū)域，沒(méi)有檢測(cè)到RNA轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)，而在sotl-1中RNA轉(zhuǎn)錄本的量與野生型相當(dāng)，這與sotl-1是由點(diǎn)突變引起是吻合的。同時(shí)，sotl-2的表型較sotl-1更嚴(yán)重，新葉輕微黃化且植株生長(zhǎng)較sotl-1稍慢；sot2葉片呈現(xiàn)淡綠色，生長(zhǎng)速率較野生型稍慢，總體表型類(lèi)似于sotl-1。遺傳上，SOTl和S0T2的突變均能恢復(fù)thfl和var2的斑葉表型。
具體實(shí)施例方式如本文所用，所述的“植物”包括農(nóng)作物以及園藝植物，包括但不限于十字花科、禾本科、薔薇科。比如，所述的“植物”包括但不限于十字花科蕓薹屬的擬南芥(Arabidopsis thaliana)、禾本科的水稻、玉米、薔薇科的樓桃,此外還包括煙草、瓜果、蔬 菜、油菜等等。如本文所用，“分離的”是指物質(zhì)從其原始環(huán)境中分離出來(lái)(如果是天然的物質(zhì)，原始環(huán)境即是天然環(huán)境)。如活體細(xì)胞內(nèi)的天然狀態(tài)下的多聚核苷酸和多肽是沒(méi)有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態(tài)中同存在的其他物質(zhì)中分開(kāi)，則為分離純化的。如本文所用，“分離的SOTl蛋白”或“分離的SOTl多肽”是指SOTl蛋白基本上不含天然與其相關(guān)的其它蛋白、脂類(lèi)、糖類(lèi)或其它物質(zhì)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能用標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)純化技術(shù)純化SOTl蛋白?；旧霞兊亩嚯脑诜沁€原聚丙烯酰胺凝膠上能產(chǎn)生單一的主帶。"AtSOTl蛋白”或“AtSOTl多肽”是指擬南芥的“SOTl蛋白”或“S0T1多肽”。本發(fā)明的多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優(yōu)選的是重組多肽。本發(fā)明的多肽可以是天然純化的產(chǎn)物，或是化學(xué)合成的產(chǎn)物，或使用重組技術(shù)從原核或真核宿主(例如，細(xì)菌、酵母、高等植物、昆蟲(chóng)和哺乳動(dòng)物細(xì)胞)中產(chǎn)生。在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“S0TI蛋白”指具有SOTl蛋白活性的SEQ ID NO :2序列的多肽。該術(shù)語(yǔ)還包括具有與SOTl蛋白相同功能的、SEQ ID NO :2序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(gè)(通常為1-50個(gè)，較佳地1-30個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè)，還更佳如1-8個(gè)、1-5個(gè))氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)(通常為20個(gè)以?xún)?nèi)，較佳地為10個(gè)以?xún)?nèi)，更佳地為5個(gè)以?xún)?nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時(shí)，通常不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。又t匕如，在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸通常也不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語(yǔ)還包括SOTl蛋白的活性片段和活性衍生物。上述性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代最好根據(jù)表I進(jìn)行氨基酸替換而產(chǎn)生。表I
權(quán)利要求
1.一種分離的多肽，其特征在于，所述多肽選自 (1)SEQID NO 2所不的氣基酸序列；和 (2)在(I)所述的氨基酸序列中經(jīng)過(guò)取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸，且具有改變植物葉片顏色、改變植物斑葉的形成或改變植物光合作用效率的活性的由(I)衍生的多肽。
2.一種多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸選自 (1)編碼權(quán)利要求I所述的多肽的多核苷酸；和 (2)與(I)所述多核苷酸互補(bǔ)的多核苷酸。
3.如權(quán)利要求2所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸的核苷酸序列如SEQIDNO 1所示或如SEQ ID NO :1第1-2136位所示。
4.一種載體，其特征在于，所述載體含有權(quán)利要求2或3所述的多核苷酸。
5.一種遺傳工程化的宿主細(xì)胞，其特征在于，所述宿主細(xì)胞含有權(quán)利要求4所述的載體。
6.一種多核苷酸序列，其特征在于，所述多核苷酸序列選自 (1)SEQID NO :83所示的核苷酸序列;和 (2)與(I)互補(bǔ)的序列。
7.一種改變植物葉片顏色的方法，其特征在于，所述方法包括 提高或降低該植物中的如權(quán)利要求2所述多核苷酸或其同源基因的表達(dá)，或使植物中的如權(quán)利要求2所述多核苷酸或其同源基因發(fā)生突變，或者改變?cè)撝参镏械娜鐧?quán)利要求I所述多肽的表達(dá)，或者改變植物中的如權(quán)利要求I所述多肽的活性。
8.一種改變植物斑葉的形成的方法，其特征在于，所述方法包括 提高或降低該植物中的如權(quán)利要求2所述多核苷酸或其同源基因的表達(dá)，或使植物中的如權(quán)利要求2所述多核苷酸或其同源基因發(fā)生突變，或者改變?cè)撝参镏械娜鐧?quán)利要求I所述多肽的表達(dá)，或者改變植物中的如權(quán)利要求I所述多肽的活性。
9.一種改變植物光合作用效率的方法,其特征在于,所述方法包括 提高或降低該植物中的如權(quán)利要求2所述多核苷酸或其同源基因的表達(dá)，或使植物中的如權(quán)利要求2所述多核苷酸或其同源基因發(fā)生突變，或者改變?cè)撝参镏械娜鐧?quán)利要求I所述多肽的表達(dá)，或者改變植物中的如權(quán)利要求I所述多肽的活性。
10.如權(quán)利要求7-9中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述提高該植物中的如權(quán)利要求2所述多核苷酸或其同源基因的表達(dá)的步驟包括將如權(quán)利要求2所述多核苷酸或其同源基因的多核苷酸轉(zhuǎn)入該植物中以使該植物高表達(dá)或過(guò)表達(dá)如權(quán)利要求2所述多核苷酸或其同源基因。
11.如權(quán)利要求7-9中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述使植物中的如權(quán)利要求2所述多核苷酸或其同源基因發(fā)生突變的步驟包括誘導(dǎo)如權(quán)利要求2所述多核苷酸或其同源基因發(fā)生點(diǎn)突變或插入突變，從而降低如權(quán)利要求2所述多核苷酸或其同源基因的表達(dá)。
12.—種制備轉(zhuǎn)基因植物的方法，其特征在于，所述的方法包括 (I)將如權(quán)利要求2所述多核苷酸或其同源基因轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞、組織、器官或種子，獲得轉(zhuǎn)化入的植物細(xì)胞、組織、器官或種子；和(2)將步驟(I)獲得的轉(zhuǎn)入了所述的多核苷酸的植物細(xì)胞、組織、器官或種子再生成植物。
13.如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，所述的方法包括步驟 (si)提供攜帶表達(dá)載體的農(nóng)桿菌，所述的表達(dá)載體含有如權(quán)利要求2所述多核苷酸或其同源基因； (s2)將植物細(xì)胞、組織、器官或種子與步驟(Si)中的農(nóng)桿菌接觸，從而使如權(quán)利要求2所述多核苷酸或其同源基因轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞，并且整合到植物細(xì)胞的染色體上； (s3)選擇出轉(zhuǎn)入了所述基因的植物細(xì)胞、組織、器官或種子；以及 (s4)將步驟(s3)中的植物細(xì)胞、組織、器官或種子再生成植物。
14.一種制備轉(zhuǎn)基因植物的方法，所述的方法包括 (1)誘導(dǎo)植物中的如權(quán)利要求2所述多核苷酸或其同源基因發(fā)生突變，獲得如權(quán)利要求2所述多核苷酸或其同源基因發(fā)生突變的植物細(xì)胞、組織、器官或種子；和 (2)將步驟(I)獲得的轉(zhuǎn)入了所述干擾分子的植物細(xì)胞、組織、器官或種子再生成植物。
15.如權(quán)利要求2所述多核苷酸或其同源基因或其所編碼的蛋白質(zhì)或如權(quán)利要求6所述的多核苷酸在改變植物葉片顏色、改變植物斑葉的形成或改變植物光合作用效率中的應(yīng)用。
16.權(quán)利要求I所述的多肽在改變植物葉片顏色、改變植物斑葉的形成或改變植物光合作用效率中的應(yīng)用。
17.權(quán)利要求7-14中任一項(xiàng)所述的方法或權(quán)利要求15所述的應(yīng)用，其特征在于，所述同源基因包括SEQ ID N0:84所示基因。
全文摘要
本發(fā)明涉及控制植物葉綠體發(fā)育的基因序列及其應(yīng)用。具體而言，本發(fā)明涉及利用AtSOT1基因改變植物葉片顏色、抑制植物斑葉的形成和提高植物光合作用效率。本發(fā)明的蛋白對(duì)于植物培植領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值，可用于調(diào)節(jié)植物葉片的顏色性狀，或調(diào)節(jié)植物光合作用效率，為轉(zhuǎn)基因技術(shù)改良農(nóng)作物或者園藝植物提供了很好的基因資源。
文檔編號(hào)C07K14/415GK102816219SQ201110156539
公開(kāi)日2012年12月12日 申請(qǐng)日期2011年6月10日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月10日
發(fā)明者黃繼榮, 吳文娟 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院