專利名稱：一種血清多肽及以其作為定量參比物的質(zhì)譜半定量方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，涉及一種血清多肽及以其作為定量參比物的質(zhì)譜半定量方法。
背景技術(shù)：
質(zhì)譜技術(shù)具有高分辨率、高靈敏度、高通量等特點，已經(jīng)成為當前蛋白和多肽定量研究的首選技術(shù)。目前，基于質(zhì)譜技術(shù)定量方法，有相對定量和絕對定量兩個大的方面。其中，相對定量主要有穩(wěn)定同位素標記方法、金屬元素標記方法及基于色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的非標記定量方法等；絕對定量技術(shù)方法主要有同位素稀釋結(jié)合多反應(yīng)監(jiān)測質(zhì)譜技術(shù)、金屬元素標記結(jié)合電感耦合等離子體質(zhì)譜技術(shù)等。穩(wěn)定同位素標記法克服了基于鳥槍法的定量分析中，多肽離子化效率和信號響應(yīng)強度受多重因素干擾，直接用其質(zhì)譜峰強度或者面積進行精確定量存在較大問題的缺陷。 將不同樣品來源的多肽分別標記“輕”質(zhì)和“重”質(zhì)同位素(如13C、15N和180)，由于“輕” 質(zhì)和“重”質(zhì)同位素標記多肽性質(zhì)類似，具有相同色譜保留時間和離子化效率，此時成對出現(xiàn)的質(zhì)譜峰信號可以準確地反映原樣品中多肽及蛋白質(zhì)的比例，從而可以進行精確定量。 但是，準備同位素化合物需大量時間，并且試劑昂貴以及不同的同位素標記法適用范圍的局限性使得同位素標記定量方法的廣泛應(yīng)用受到了限制。對于金屬元素標記方法的研究中，Whetstone等首次以化學性質(zhì)很相近的稀土金屬元素作為質(zhì)量標簽，提出了“元素編碼親和標簽”的新方法，對標記了釔和鋱元素標簽的多肽色譜行為和質(zhì)譜中的裂解行為做了初步的驗證。Liu等使用二乙烯三胺五乙酸(DTPA) 雙酸酐鍵連到多肽的伯胺基，然后螯合稀土金屬離子(Y和Tb)作為質(zhì)譜檢測的質(zhì)量標簽，Y 和Tb標記的多肽在LC中共洗脫，其不同的離子化效率可經(jīng)統(tǒng)計校準而獲得蛋白質(zhì)的相對定量。Ahrends等系統(tǒng)地考察了金屬元素親和標簽(MeCAT)結(jié)合nano-LC/ESI-MSn的研究策略在蛋白質(zhì)相對定量的可行性。四種不同鑭系金屬螯合物(Tb-、Ho-、Tm-和Lu-DOTA)標記的多肽在色譜中具有相同的保留時間，定量的線性動態(tài)范圍為2個數(shù)量級，最低的檢測量可達飛摩爾(10_15mol)，平均標準偏差低于15%，并用LuMeCAT和Ho-MeCAT標記不同溫度生長的酵母細胞的裂解液全蛋白樣本，結(jié)合LC-MS，發(fā)現(xiàn)了 56個表達差異的多肽和確定了相應(yīng)的蛋白質(zhì)的相對量。雖然上述研究得到了良好的結(jié)果，但是目前關(guān)于金屬元素標簽的標記方法研究尚不太多，其應(yīng)用也相對較少。昂貴的同位素標記試劑、繁瑣的標記操作、受樣品來源和樣品數(shù)量的制約等標記方法的不足推動人們發(fā)展非標記的定量方法。非標定量法(Label-free)是通過比較質(zhì)譜分析次數(shù)或質(zhì)譜峰強度，分析不同來源樣品蛋白的數(shù)量變化。在目前廣泛使用的HPLC/MS/ MSdata-dependent分析技術(shù)中，多肽的質(zhì)譜分析次數(shù)與蛋白的豐度具有相關(guān)性，包括蛋白的肽段序列覆蓋率、肽段匹配數(shù)、PMSS模型、emPAI等參數(shù)模型。但是，非標記定量技術(shù)同樣也面臨嚴峻的挑戰(zhàn)(1)要求LC-MS/MS分析具有良好的重現(xiàn)性；(2)對大量LC-MS/MS分析數(shù)據(jù)進行歸一化處理和科學的統(tǒng)計。目前多種數(shù)據(jù)分析軟件大大促進了非標記定量技術(shù)的應(yīng)用，但非標記定量技術(shù)要達到精確和可靠的定量結(jié)果，還需進一步的完善及發(fā)展。同位素稀釋結(jié)合多反應(yīng)監(jiān)測質(zhì)譜技術(shù)的定量方法，是目前高通量地對目標蛋白質(zhì)進行絕對定量的重要方法之一。MRM-MS的基本工作原理是在第一級四極桿0)1)中選擇性檢測特定母離子，在第二級四極桿中將母離子進行碰撞解離，在第三級四極桿中選擇性檢測特定子離子。這樣，只有符合設(shè)定值的母離子-子離子信號被特異性地檢測到，有效地去除了大量干擾離子，而且M R M質(zhì)譜掃描能同時監(jiān)測多至300對的母-子離子對，因此MRM-MS具有靈敏度高、重現(xiàn)性好、準確度高和通量高等優(yōu)點。將穩(wěn)定同位素標記的內(nèi)標肽加入到蛋白質(zhì)酶切產(chǎn)生的內(nèi)源性多肽中，由于內(nèi)標肽和內(nèi)源性肽具有相同的序列， 因此它們具有相同的液相色譜保留時間、質(zhì)譜離子化效率和二級碎裂離子。通過比較兩者子離子信號強度，可計算出內(nèi)源性多肽的量和對應(yīng)蛋白質(zhì)的量。但是，由于同位素試劑的昂貴，使得許多研究者不得不另辟蹊徑。近幾年，一種元素質(zhì)譜技術(shù)-電感耦合等離子體質(zhì)譜技術(shù)應(yīng)用于蛋白質(zhì)絕對定量的文獻報道不斷增加。與生物質(zhì)譜不同的是，ICP-MS是一種“硬”電離模式，其工作原理簡單概括為樣品被引入氬氣流等離子體中心區(qū)，等離子體的高溫(6000 10000K)使樣品去溶劑化、汽化并離子化成正離子，各元素的正離子在真空系統(tǒng)內(nèi)按照其質(zhì)荷比分離，元素的同位素離子給出的信號與該元素在樣品中的濃度成線性關(guān)系，如果加入含有該元素的某種化合物作為內(nèi)標，就可對該元素進行準確的絕對定量。與生物質(zhì)譜相比，ICP-MS具有的優(yōu)點是(1)線性動態(tài)范圍寬，可高達8 10個數(shù)量級；( 檢測不受樣品基質(zhì)的影響，所以特別適合復(fù)雜體系中痕量或微量元素的定量。其缺點是在ICP-MS技術(shù)在定量的同時無法定性鑒定化合物的結(jié)構(gòu)。ICP-MS技術(shù)應(yīng)用于蛋白質(zhì)組學規(guī)?；窟€存在很多亟待解決的問題，如進一步發(fā)展ICP-MS與高效的分離技術(shù)(如高效液相色譜、毛細管電泳或二維凝膠電泳)的聯(lián)用技術(shù)，發(fā)展高效的金屬標記方法，發(fā)展生物質(zhì)譜技術(shù)和ICP-MS技術(shù)的聯(lián)用以實現(xiàn)結(jié)構(gòu)的鑒定和定量的結(jié)合等。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種血清多肽及以其作為定量參比物的質(zhì)譜半定量方法。為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的一種血清多肽，其質(zhì)核比為m/z4466-4469。本發(fā)明還提供以上述血清多肽作為定量參比物的質(zhì)譜半定量方法，包括以下步驟1)血清經(jīng)過免疫學方法處理；向血清樣品中加入適量PBS緩沖液，然后與含有多肽抗體的固相載體混合，固相載體經(jīng)乙酸洗脫后，離心取上清液；其中，所述固相載體為包被蛋白G或蛋白A的瓊脂糖顆粒；所述多肽抗體為抗多肽5抗體或抗多肽6抗體，其中多肽5和多肽6的氨基酸序列分別為NLGHGHKHERDQGHGHQ、 NLGHGHKHDRDHGHGHQ。抗多肽5抗體(或抗多肽6抗體)制備方法采用偶聯(lián)載體蛋白匙孔血藍蛋白 (KLH)的多肽5(或多肽6)作為免疫原，免疫BALB/C小鼠，然后篩選出雜交瘤細胞株，制備純化腹水單克隆抗體；或者采用偶聯(lián)載體蛋白KLH的多肽5 (或多肽6)作為免疫原，結(jié)合弗氏完全佐劑與不完全佐劑免疫大耳白兔；3-4周后耳緣靜脈采血檢測滴度，達到取血標準后頸動脈取血，分離并純化多克隆抗體。
2)采用高通量的基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜對步驟1)處理后的上清液進行檢測。3)根據(jù)質(zhì)譜檢測結(jié)果計算得出標志物峰相對于參比物峰的相對強度，并將其作為反映血清中標志物含量的指標。具體地，血清經(jīng)過免疫學方法處理為取15-25 μ L固相載體置于Eppendorf管中， 加入1. 5μ g-Μμ g多肽抗體，4°C混合5分鐘-4小時，放置l-5min，移出上清液，用0. OlM PH7. 4的PBS緩沖液清洗所得固相載體沉淀2-5次，每次PBS緩沖液用量為100-200 μ L ；將 10-40 μ L血清樣品和10-50 μ L上述PBS緩沖液與清洗后的所述固相載體混合，4°C旋轉(zhuǎn)混合8-Mh ；放置l-5min，移出上清液，用上述PBS緩沖液清洗沉淀2-5次，每次PBS緩沖液用量為100-200 μ L ；加入10-15 μ L5%乙酸洗脫液，吸排混合l-5min ；離心，取上清液。優(yōu)選地，血清經(jīng)過免疫學方法處理為取20 μ L固相載體置于0. 2mL Eppendorf管中，加入1. 5 μ g-24 μ g多肽抗體，4°C，轉(zhuǎn)速5rpm混合15分鐘，放置l-5min，移出上清液，用 0. OlM pH7. 4的PBS緩沖液清洗所得固相載體沉淀3次，每次PBS緩沖液用量為100 μ L ；將 10 μ L血清樣品和30 μ L上述PBS緩沖液與清洗后的所述固相載體混合，4°C旋轉(zhuǎn)混合他； 放置l-5min，移出上清液，用100 μ L上述PBS緩沖液清洗沉淀3次；加入10yL5%乙酸洗脫液，吸排混合anin ；離心，取上清液。進一步地，本發(fā)明的以上述血清多肽作為定量參比物的質(zhì)譜半定量方法，包括以下步驟1)采用前述的免疫學方法處理血清，得上清液；幻采用高通量的基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜對步驟1)處理后的血清進行檢測，檢測次數(shù)為η ；其中，η為》1的整數(shù)；3)根據(jù)η次質(zhì)譜檢測結(jié)果得到的參比物峰高&的算術(shù)平均數(shù)除以待定量標志物峰高Xm 的算術(shù)平均數(shù)，即得計算標志物的相對含量。本發(fā)明中所述的參比物并不僅僅局限于本發(fā)明中所涉及的多肽，只要是在血清中穩(wěn)定存在的蛋白或多肽均可作為參比物。本發(fā)明應(yīng)用血清中本身含有的物質(zhì)作為參比物來對待定量的標志物進行相對定量，為世界范圍內(nèi)首次提出，保證了參比物與待定量標志物來源的同一性，避免了外來參比物可能產(chǎn)生的干擾，操作方法簡單，較之采用常規(guī)的同位素標記法，節(jié)省了大量時間及實驗成本。本發(fā)明涉及的基于采用高通量、高靈敏度、高精確度的MALDI-T0F-MS質(zhì)譜檢測方法， 不僅適用于血清中蛋白或多肽的相對定量，對于其它體液或組織中的蛋白或多肽同樣適用。


圖1為本發(fā)明經(jīng)過免疫學方法處理的某肝癌病人血清的質(zhì)譜圖。圖2為本發(fā)明經(jīng)過免疫學方法處理的某肝硬化病人血清質(zhì)譜圖。圖3為本發(fā)明經(jīng)過免疫學方法處理的某正常人血清質(zhì)譜圖。圖4為本發(fā)明肝癌血清組ROC曲線分析結(jié)果。圖5為本發(fā)明正常血清組ROC曲線分析結(jié)果。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，以下實施例中使用的 MALDI-T0F-MS質(zhì)譜儀購自美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司，型號為ABI 4700。實施例1 4中使用的血清樣品于2010年10月采集自解放軍302醫(yī)院志愿者確診病例。實施例1肝癌血清中標志物的定量1)血清經(jīng)過免疫學方法處理，包括1)取20μ L固相載體，即包被蛋白G的瓊脂糖顆粒(Protein G Agarose, Santa Cruz)，置于 Eppendorf 管中，加入 IOyg 抗多肽 5 抗體，40C，5rpm旋轉(zhuǎn)混合30分鐘，放置5min，移出上清液，用0. OlM pH7. 4的PBS緩沖液清洗所得固相載體沉淀4次，每次PBS緩沖液用量為150 μ L ；取10 μ L血清樣品和30 μ L上述 PBS緩沖液與清洗后的所述固相載體混合，4°C旋轉(zhuǎn)混合12h ；放置5min，移出上清液，用上述PBS緩沖液清洗沉淀4次，每次PBS緩沖液用量為150 μ L ；加入5 μ L5%乙酸，吸排混合 5min ；離心，取上清液，用MALDI-T0F-MS檢測，測定血清樣品中的多肽標志物抗原；抗多肽5抗體的制備方法采用偶聯(lián)載體蛋白匙孔血藍蛋白(KLH)的多肽5(氨基酸序列NLGHGHKHERDQGHGHQ)作為免疫原，免疫BALB/C小鼠，然后篩選出雜交瘤細胞株，該雜交瘤細胞株為AP0105，已于2011年9月27號在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址北京市朝陽區(qū)大屯路甲3號，中國科學院微生物研究所，郵編100101)保藏，保藏號為CGMCC No. 5269.制備純化腹水單克隆抗體；2)質(zhì)譜采集過程中，同一份血清共計采集15次，得到15張質(zhì)譜圖，代表圖如圖1 所示；3)應(yīng)用“Data Explore”軟件查看所得質(zhì)譜圖，在相同的讀圖參數(shù)下，找出15張圖中各自所顯示的標志物的峰高Xm與參比物的峰高X,，分別為(20. 71，100)、(25. 13， 100)、(28. 08,100), (16. 55，100)、(29.82,99.15)、(19. 53，100)、(17. 22，100)、(23.35， 100)、(11. 79,98. 89)、(27. 26，100)、(25. 31,94. 55)、(21. 46,97. 32)、(17. 9，100)、(25. 32， 79. 51)、(30. 27,90. 89)；4)根據(jù)上述數(shù)據(jù)和公式N = Xm/X，計算得出標志物的相對含量為=N1 = 0. 207, N2 =0. 251，N3 = 0. 281，N4 = 0. 166，N5 = 0. 301，N6 = 0. 195，N7 = 0. 172，N8 = 0. 234，N9 = 0. 119，N10 = 0. 273，N11 = 0. 268，N12 = 0. 221，N13 = 0. 179，N14 = 0. 318，N15 = 0. 333 ；5)對上述15個值取算術(shù)平均值，得到標志物的相對含量為N = 0. 235。實施例2肝硬化血清中標志物的定量1)血清經(jīng)過免疫學方法處理，包括1)取20 μ L固相載體，即包被蛋白G的瓊脂糖顆粒(Protein G Agarose, Santa Cruz)，置于 Eppendorf 管中，加入 IOyg 抗多肽 5 抗體， 40C，5rpm旋轉(zhuǎn)混合30分鐘，放置5min，移出上清液，用0. OlM pH7. 4的PBS緩沖液清洗所得固相載體沉淀3次，每次PBS緩沖液用量為100 μ L ；取10 μ L血清樣品和30 μ L上述PBS 緩沖液與清洗后的所述固相載體混合，4°C旋轉(zhuǎn)混合他；放置5min，移出上清液，用上述PBS 緩沖液清洗沉淀3次，每次PBS緩沖液用量為100 μ L ；加入5 μ L5%乙酸，吸排混合5min ； 離心，取上清液，用MALDI-T0F-MS檢測，測定血清樣品中的多肽標志物抗原；其中，抗多肽5 抗體同實施例1 ；2)質(zhì)譜采集過程中，同一份血清共計采集15次，得到15張質(zhì)譜圖，代表圖如圖2 所示；
3)應(yīng)用“Data Explore”軟件查看所得質(zhì)譜圖，在相同的讀圖參數(shù)下，找出15張圖中各自所顯示的標志物的峰高Xffl與參比物的峰高Xr,分別為(71. 98，94. 28)、(24. 68， 100)、(69. 09，100)、(46. 74，94. 1)、(46. 52，85. 68)、(42. 23，100)、(42. 78，100)、(31. 53， 96.11)、(59. 42，100)、(54.39,100)、(55. 43，100)、(39.43,92.77)、(37.31,94.61)、 (57. 78，100)、(31. 75，100)；4)根據(jù)上述數(shù)據(jù)和公式N = Xm/X，計算得出標志物的相對含量為=N1 = 0. 763, N2 =0. 247，N3 = 0. 691，N4 = 0. 497，N5 = 0. 543，N6 = 0. 422，N7 = 0. 428，N8 = 0. 328，N9 = 0. 594，N10 = 0. 544，N11 = 0. 554，N12 = 0. 425，N13 = 0. 394，N14 = 0. 578，N15 = 0. 318 ；5)對上述15個值取算術(shù)平均值，得到標志物的相對含量為N = 0. 488。實施例3正常血清中標志物的定量1)血清經(jīng)過免疫學方法處理；方法同實施例2 ；2)質(zhì)譜采集過程中，同一份血清共計采集15次，得到15張質(zhì)譜圖，代表圖如圖3 所示；3)應(yīng)用“Data Explore”軟件查看所得質(zhì)譜圖，在相同的讀圖參數(shù)下，找出15張圖中各自所顯示的標志物的峰高Xm與參比物的峰高\，分別為(75. 21，71. 86)、(79. 52， 97.57)、(59.78,83.67)、(67.45,100)、(20. 99，22. 76)、(20. 55，23. 57)、(19.39,18.57)、 (21. 05,25. 99)、(74. 31,97. 42)、(96. 34，93. 16)、(85. 88，96)、(84. 4，100)、(100,97. 18)、 (54. 6,96. 19)、(18. 01,27. 36)；4)根據(jù)上述數(shù)據(jù)和公式N = Xm/X，計算得出標志物的相對含量為=N1 = 1.047, N2 =0. 815，N3 = 0. 714，N4 = 0. 675，N5 = 0. 922，N6 = 0. 872，N7 = 1. 044，N8 = 0. 810，N9 = 0. 763，N10 = 1. 034，N11 = 0. 895，N12 = 0. 844，N13 = 1. 029，N14 = 0. 568，N15 = 0. 658 ；5)對上述15個值取算術(shù)平均值，得到標志物的相對含量為N = 0. 846。實施例4肝癌血清中標志物的定量1)血清經(jīng)過免疫學方法處理，包括1)取20μ L固相載體，即包被蛋白A的瓊脂糖顆粒(ProteinAAgarose, Santa Cruz)，置于 Eppendorf 管中，加入 IOyg 抗多肽 6 抗體， 40C，5rpm旋轉(zhuǎn)混合30分鐘，放置5min，移出上清液，用0. OlM pH7. 4的PBS緩沖液清洗所得固相載體沉淀3次，每次PBS緩沖液用量為100 μ L ；取10 μ L血清樣品和30 μ L上述PBS 緩沖液與清洗后的所述固相載體混合，4°C旋轉(zhuǎn)混合他；放置5min，移出上清液，用上述PBS 緩沖液清洗沉淀3次，每次PBS緩沖液用量為100 μ L ；加入5 μ L5%乙酸，吸排混合5min ； 離心，取上清液，用MALDI-T0F-MS檢測，測定血清樣品中的多肽標志物抗原；抗多肽6抗體的制備方法采用偶聯(lián)載體蛋白KLH的多肽6 (NLGHGHKHDRDHGHGHQ) 作為免疫原，結(jié)合弗氏完全佐劑與不完全佐劑免疫大耳白兔；3-4周后耳緣靜脈采血檢測滴度，達到取血標準后頸動脈取血，分離并純化多克隆抗體。2)質(zhì)譜采集過程中，同一份血清共計采集15次，得到15張質(zhì)譜圖。3)應(yīng)用“Data Explore”軟件查看所得質(zhì)譜圖，在相同的讀圖參數(shù)下，找出15張圖中各自所顯示的標志物的峰高Xm與參比物的峰高X,，分別為(23. 21，100)、(27. 49, 95.65)、(27. 34，100)、(26. 77，100)、(29. 55，100)、(19. 52，99. 15)、(20. 54，100)、(15. 88， 100)、(28. 23，100)、(13. 98,87. 79)、(28. 36，100)、(19. 46,95.52)、(14. 19，100)、(26. 22， 87. 39)、(29. 58,85. 79)。
4)根據(jù)上述數(shù)據(jù)和公式N = Xm/X，計算得出標志物的相對含量為=N1 = 0. 232, N2 =0. 287，N3 = 0. 273，N4 = 0. 268，N5 = 0. 296，N6 = 0. 197，N7 = 0. 205，N8 = 0. 159，N9 = 0. 282，N10 = 0. 159，N11 = 0. 284，N12 = 0. 204，N13 = 0. 142，N14 = 0. 300，N15 = 0. 345。5)對上述15個值取算術(shù)平均值，得到標志物的相對含量為N = 0. 2420采用實施例1 3的方法分別定量檢測70例肝癌、70例肝硬化、70例正常血清中各標志物相對含量，并進行ROC曲線分析，結(jié)果如圖4和圖5所示，肝癌血清與正常血清兩組診斷陽性標準為N <= 0. 378，分析結(jié)果為敏感度100%，特異度100% ；肝硬化血清與正常血清兩組診斷陽性標準為N < = 0. 578，分析結(jié)果為敏感度86. 7%，特異度100%。實施例1 4中使用的參比物為質(zhì)核比m/z4466-4469的血清多肽，其在正常人及肝病患者血清中均存在，因此，可將其作為參比物來定量正常人與肝病患者血清中某些差異性多肽標志物的含量。雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。
權(quán)利要求
1.一種血清多肽，其質(zhì)核比為m/z4466-4469。
2.以權(quán)利要求1所述的血清多肽作為定量參比物的質(zhì)譜半定量方法，其特征在于，包括以下步驟1)血清經(jīng)過免疫學方法處理；向血清樣品中加入適量PBS緩沖液，然后與含有多肽抗體的固相載體混合，固相載體經(jīng)乙酸洗脫后，離心取上清液；其中，所述固相載體為包被蛋白G或蛋白A的瓊脂糖顆粒；所述多肽抗體為抗多肽 5抗體或抗多肽6抗體，其中多肽5和多肽6的氨基酸序列分別為NLGHGHKHERDQGHGHQ、 NLGHGHKHDRDHGHGHQ ；2)采用高通量的基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜對步驟1)處理后的上清液進行檢測；3)根據(jù)質(zhì)譜檢測結(jié)果計算得出標志物峰相對于參比物峰的相對強度，并將其作為反映血清中標志物含量的指標；其中，作為參比物的是權(quán)利要求1所述的血清多肽。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，血清經(jīng)過免疫學方法處理為取15-25μ L 固相載體置于Eppendorf管中，加入1. 5 μ g-24 μ g多肽抗體，4°C混合5分鐘-4小時，放置 l-5min，移出上清液，用0. 01MpH7. 4的PBS緩沖液清洗所得固相載體沉淀2_5次，每次PBS 緩沖液用量為100-200 μ L ；將10-40 μ L血清樣品和10-50 μ L上述PBS緩沖液與清洗后的所述固相載體混合，4°C旋轉(zhuǎn)混合8-Mh ；放置l-5min，移出上清液，用上述PBS緩沖液清洗沉淀2-5次，每次PBS緩沖液用量為100-200 μ L ；加入10-15 μ L5%乙酸洗脫液，吸排混合 l-5min ；離心，取上清液。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，血清經(jīng)過免疫學方法處理為取20yL固相載體置于0. 2mL Eppendorf管中，加入1. 5μ g-Μμ g多肽抗體，4°C，轉(zhuǎn)速5rpm混合15 分鐘，放置l-5min，移出上清液，用0. OlM pH7. 4的PBS緩沖液清洗所得固相載體沉淀3次， 每次PBS緩沖液用量為100 μ L ；將10 μ L血清樣品和30 μ L上述PBS緩沖液與清洗后的所述固相載體混合，4°C旋轉(zhuǎn)混合他；放置l-5min，移出上清液，用上述PBS緩沖液清洗沉淀3 次，每次PBS緩沖液用量為100 μ L ；加入10 μ L 5%乙酸洗脫液，吸排混合^iin ；離心，取上清液。
5.根據(jù)權(quán)利要求2-4任一項所述的方法，其特征在于，包括以下步驟1)采用權(quán)利要求2-4任一項所述的免疫學方法處理血清，得上清液；2)采用高通量的基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜對步驟1)處理后的上清液進行檢測，檢測次數(shù)為η;其中，η為彡1的整數(shù)；3)根據(jù)η次質(zhì)譜檢測結(jié)果得到的參比物峰高\的算術(shù)平均數(shù)除以待定量標志物峰高 Xffl的算術(shù)平均數(shù)，即得計算標志物的相對含量。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種血清多肽及以其作為定量參比物的質(zhì)譜半定量方法，該血清多肽的質(zhì)核比為m/z4466-4469。本發(fā)明提供的質(zhì)譜半定量技術(shù)方法包括如下步驟血清經(jīng)過免疫學方法處理后，運用高通量的基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)進行檢測，在所得質(zhì)譜圖中，計算得出標志物峰相對于參比物峰的相對強度，并將其作為反映血清中標志物含量的指標，由此建立完整的質(zhì)譜半定量技術(shù)方法。
文檔編號C07K2/00GK102492017SQ20111035814
公開日2012年6月13日 申請日期2011年11月11日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月11日
發(fā)明者付海媛, 侯利平, 原劍, 周曉明, 孫云波, 張拓, 楊保安, 王東茂, 甄蓓, 肖漢族, 鄭俊杰, 魏開華, 黃亞娟 申請人:北京正旦國際科技有限責任公司, 湖南金健藥業(yè)有限責任公司