專利名稱：提高棉花耐鹽與干旱能力的GbWD1基因及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種能夠提高棉花耐鹽與干旱能力的(ibWDl基因及其編碼的多肽。
背景技術：
土壤鹽漬化是一個世界性的資源問題和生態(tài)問題，越來越引起人們的重視。聯(lián)合國糧農組織的調查結果顯示，全球6 %的陸地面積遭受著土壤鹽漬化的侵蝕，20 %的灌溉農業(yè)受到不同程度的鹽害威脅。當前，全球鹽堿地面積已達9.5X108hm2。中國鹽漬土總面積約1億hm2，其中已經(jīng)鹽漬化土壤約0. 37億hm2，殘余鹽漬化土壤約0. 45億hm2，潛在鹽漬化土壤約0. 17億hm2。土壤鹽漬化吞噬著有限的土地資源，成為嚴重制約農業(yè)生產(chǎn)的一個全球性問題。大量研究證明，運用分子生物學手段從耐鹽的種質(例如海島棉)中分離耐鹽基因，通過轉基因分子育種手段獲得耐鹽作物新品種可以有效解決上述問題。土壤鹽漬化對植物的傷害主要包括3個方面(1)對植物的萌發(fā)和生長產(chǎn)生抑制作用。(2)影響植物對營養(yǎng)物質的吸收與利用。(3)影響植物的細胞結構的穩(wěn)定性。為了應對土壤鹽漬化對植物的傷害，植物發(fā)展一系列的耐鹽與避鹽機制(1)平衡金屬離子的吸收以減少毒性離子(Na+)的傷害；(2)形成大量的調節(jié)滲透物質如小分子的氨基酸(脯氨酸)、甘露醇、山梨醇等來調節(jié)細胞的滲透壓力。近年來，通過分子生物學方法克隆了大量有關編碼植物信號傳導蛋白(例如堿性磷酸酶互作蛋白激酶cira等)、滲透物質合成酶(甜菜堿合成酶)以及離子轉運蛋白(例如鈉離子轉運蛋白等)的基因，并通過轉基因的手段將這些基因轉化到不同的植物中，獲得了具有一定耐鹽水平的轉基因植物。但遺憾地是，到目前為止還沒有上述轉基因作物的商業(yè)化報道。因此，分離新的耐鹽/抗旱基因對于植物的耐鹽和抗旱轉基因育種仍然具有重要的意義。WD重復蛋白(WD repeats protein)是一類含有色氨酸-天門冬氨酸(WD)重復序列的蛋白。已有的研究證明WD重復蛋白參與植物液泡形成和運輸，從而實現(xiàn)在細胞信號轉導、蛋白質運輸、細胞骨架的動態(tài)組裝以及染色質的修飾及轉錄等不同的生物化學過程中的功能。盡管WD重復蛋白在植物發(fā)育方面的研究比較詳細，但是有關WD重復蛋白如何參與植物抗逆性(耐鹽與抗旱)的研究、以及WD重復蛋白是否具有耐鹽和抗旱的功能沒有報道。本申請利用分子生物學的方法從海島棉中克隆了一個WD重復蛋白基因(ibWDl。在此基礎上，進一步通過表達譜分析、蛋白質互作分析以及轉基因植株的耐鹽與抗旱能力分析證實WD重復蛋白基因(ibWDl具有抗旱和耐鹽功能，從而構成此發(fā)明。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種新的能夠提高棉花耐鹽與干旱能力的基因，并得到所述基因表達的蛋白產(chǎn)物。本發(fā)明首次采用分子克隆方法，從構建的海島棉根部cDNA文庫中分離獲得了新的(ibWDl基因，并且通過轉基因實驗證實了它具有提高棉花耐鹽與干旱能力的功能，從而達到了發(fā)明目的。本發(fā)明利用滲透壓誘導表達啟動子在棉花中特異表達(^bWDl基因提高在干旱、高鹽土壤條件下棉花合成新的液泡數(shù)目，從而提高棉花對有毒Na+離子的分配能力以及調節(jié)細胞滲透壓力的能力。本發(fā)明包括以下內容1、提供了一種新的分離出的(ibWDl蛋白質多肽，包含具有SEQ ID NO :2氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。較佳地，該多肽選自下組(a)具有SEQ ID NO :2氨基酸序列的多肽；(b)將 SEQ ID NO :2氨基酸序列經(jīng)過一個或多個(較佳地1-20個)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有提高棉花耐鹽與干旱能力功能的(^bWDl蛋白質活性的由(a)衍生的多肽。2、提供了編碼上述多肽的多核苷酸，選自(a)編碼上述(ibWDl蛋白質多肽的多核苷酸；和(b)與多核苷酸(a)互補的多核苷酸。較佳地，該多核苷酸編碼具有SEQ ID NO :2所示氨基酸序列的多肽。更佳地，該多核苷酸的序列是選自下組的一種(a)具有SEQ ID NO :1中160-1404位的序列；(b)具有SEQ ID NO :1中1-1591位的序列。3、提供了含有上述多核苷酸的載體，以及被該載體轉化或轉導的宿主細胞或者被上述多核苷酸直接轉化或轉導的宿主細胞。4、提供了制備上述(ibWDl蛋白質多肽的方法，該方法包含(a)在適合表達的條件下，培養(yǎng)上述被轉化或轉導的宿主細胞；(b)從培養(yǎng)物中分離出具有活性的多肽。5、提供了上述多核苷酸和(ibWDl蛋白質多肽的用途，即，在培育提高棉花耐鹽與干旱能力的棉花品種方面的應用。6、提供了一種提高棉花耐鹽與干旱能力的方法，它包括步驟(1)提供攜帶表達載體的農桿菌，所述的表達載體含有SEQ ID NO :1所示序列的多核苷酸，所述的(^bWDl選自下組(a)具有SEQ ID NO 2氨基酸序列的多肽；(b)將SEQ ID NO :2氨基酸序列經(jīng)過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有提高棉花耐鹽與干旱能力的由(a)衍生的多肽；(2)將植物細胞或組織或器官與步驟⑴中的農桿菌接觸，從而使(^bWDl基因編碼序列轉入植物細胞，并且整合到植物細胞的染色體上；(3)選擇出轉入(ibWDl基因的DNA編碼序列的植物細胞或組織或器官；(4)將步驟(3)中的植物細胞或組織或器官再生成植株。在本發(fā)明中，術語“(ibWDl蛋白質”、“(ibWDl多肽”或者“提高棉花耐鹽與干旱能力蛋白”可互換使用，都指具有提高棉花抗旱、耐鹽能力的(^bWDl蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO 2)的蛋白或多肽。它們包括含有或不含起始甲硫氨酸的(^bWDl蛋白質。如本文所用，“分離的”是指物質從其原始環(huán)境中分離出來(如果是天然的物質，原始環(huán)境即是天然環(huán)境)。如活體細胞內的天然狀態(tài)下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態(tài)中同存在的其他物質中分開，則為分離純化的。如本文所用，“分離的(ibWDl蛋白或多肽”是指(ibWDl多肽基本上不含天然與其相關的其它蛋白、脂類、糖類或其它物質。本領域的技術人員能用標準的蛋白質純化技術純化GbffDl蛋白質。本發(fā)明的多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優(yōu)選重組多肽。本發(fā)明的多肽可以是天然純化的產(chǎn)物，或是化學合成的產(chǎn)物，或使用重組技術從原核或真核宿主(例如，細菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動物細胞)中產(chǎn)生。根據(jù)重組生產(chǎn)方案所用的宿主， 本發(fā)明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本發(fā)明的多肽還可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。本發(fā)明還包括(ibWDl蛋白質的片段、衍生物和類似物。如本文所用，術語“片段”、 “衍生物”和“類似物”是指基本上保持本發(fā)明的天然(^bWDl蛋白質相同的生物學功能或活性的多肽。本發(fā)明的多肽片段、衍生物或類似物可以是(i)有一個或多個保守或非保守性氨基酸殘基(優(yōu)選保守性氨基酸殘基)被取代的多肽，而這樣的取代的氨基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的，或(ii)在一個或多個氨基酸殘基中具有取代基團的多肽， 或(iii)成熟多肽與另一個化合物融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前導序列或分泌序列或用來純化此多肽的序列)。根據(jù)本文所述，這些片段、衍生物和類似物屬于本領域熟練技術人員公知的范圍。在本發(fā)明中，術語“(ibWDl多肽”指具有能夠與液泡形成蛋白質相互作用、能夠提高棉花耐鹽與干旱能力的SEQ ID NO. 2序列的多肽。該術語還包括具有與(ibWDl蛋白質相同功能的、SEQ ID NO. 2序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個(通常為20個以內，較佳地為10個以內， 更佳地為5個以內)氨基酸。例如，在本領域中，用性能相近或相似的氨基酸進行取代時， 通常不會改變蛋白質的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個氨基酸通常也不會改變蛋白質的功能。該術語還包括(^bWDl蛋白的活性片段和活性衍生物。該多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導突變體、在高或低的嚴謹程度條件下能與(^bWDl雜交的DNA、cDNA所編碼的蛋白、以及利用抗(ibWDl多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發(fā)明還提供了其他多肽，如包含(^bWDl多肽或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的多肽外，本發(fā)明還包括了 (^bWDl多肽的可溶性片段。 通常，該片段具有(^bWDl多肽序列的至少約10個連續(xù)氨基酸，通常至少約30個連續(xù)氨基酸，較佳地至少約50個連續(xù)氨基酸，更佳地至少約80個連續(xù)氨基酸，最佳地至少約100個連續(xù)氨基酸。發(fā)明還提供(ibWDl蛋白質或多肽的類似物。這些類似物與天然(ibWDl多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導的遺傳變異體。誘導變異體可以通過各種技術得到。表 權利要求
1.一種能夠提高棉花耐鹽與干旱能力的多肽，包含具有SEQ ID NO :2所示氨基酸序列的多肽，或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。
2.權利要求1所述的多肽，所述保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物是 SEQ ID NO :2序列被一個或多個氨基酸殘基取代、缺失或添加而形成的，且具有提高棉花耐鹽與干旱能力功能的多肽。
3.權利要求1或2所述的多肽在提高耐鹽能力方面的功能與應用。
4.權利要求1或2所述的多肽與液泡形成蛋白AtVCl互作的功能。
5.一種能夠提高棉花耐鹽與干旱能力的基因，包含(a)編碼權利要求1或2所述多肽的多核苷酸；或(b)與(a)互補的多核苷酸。
6.權利要求5所述的基因，其特征在于，其序列選自(a)具有SEQID NO :1中160-1404位的序列；或(b)具有SEQ ID NO :1 中 1-1591 的序列。
7.權利要求5或6所述的基因在提高棉花耐鹽能力方面的功能與應用。
8.一種載體，其特征在于含有權利要求5或6所述的基因。
9.一種遺傳工程化的宿主細胞，其特征在于含有權利要求8所述的載體。
10.一種提高棉花耐鹽與干旱能力的方法，包括(a)提供攜帶權利要求7所述的表達載體的農桿菌；(b)將植物細胞或組織或器官與步驟(a)中的農桿菌接觸，從而使所攜帶的表達載體中的DNA編碼序列轉入植物細胞，并且整合到植物細胞的染色體上；(c)選擇出轉入有(ibWDl蛋白質的DNA編碼序列的植物細胞或組織或器官；(d)將步驟(c)中的植物細胞或組織或器官再生成植株。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種能夠在干旱、鹽堿條件下促進棉花液泡形成GbWD1基因及其編碼的GbWD1蛋白質多肽，本發(fā)明經(jīng)實驗證實了所述多肽與液泡形成蛋白AtVC1互作的功能，以及在棉花植株中超量表達GbWD1基因具有顯著提高棉花耐鹽與干旱能力的功能。
文檔編號C07K14/415GK102399276SQ20111040692
公開日2012年4月4日 申請日期2011年12月8日 優(yōu)先權日2011年12月8日
發(fā)明者代其林, 左開井, 王勁 申請人:左開井, 王勁