專利名稱：反義核酸的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種能夠使人抗肌萎縮蛋白基因的第53號外顯子發(fā)生跳躍的反義寡聚物及含有該寡聚物的醫(yī)藥組合物。
背景技術(shù)：
杜氏肌營養(yǎng)不良癥(DMD)，是在出生男子中約3500人中就會有I人發(fā)病的頻度最高的遺傳性進(jìn)行性肌萎縮 癥。該癥，在乳幼兒期間顯示出與正常人幾乎沒有變化的運(yùn)動機(jī)能，但是，從4 5歲左右開始顯現(xiàn)出肌力低下。然后，肌力低下進(jìn)一步發(fā)展，到12歲左右變得不能歩行，到20多歲會成為由于心不全或呼吸器不全而至死亡的重癥的疾病?，F(xiàn)在，沒有對于DMD的有效的治療方法，在強(qiáng)烈尋求新的治療藥的開發(fā)。對于DMD，已知抗肌萎縮蛋白基因的變異是其原因。抗肌萎縮蛋白基因，存在于X染色體，并且是由220萬堿基對的DNA構(gòu)成的巨大的基因。從DNA轉(zhuǎn)錄至mRNA前驅(qū)體，進(jìn)一步地,通過剪接(splicing)除去內(nèi)含子,合成結(jié)合有79個外顯子的mRNA。從該mRNA翻譯成3，685個的氨基酸，生成抗肌萎縮蛋白質(zhì)。抗肌萎縮蛋白質(zhì)，參與肌細(xì)胞的膜穩(wěn)定性的維持，因此為了使肌細(xì)胞難以破壞，該抗肌萎縮蛋白質(zhì)是必須的。DMD患者的抗肌萎縮蛋白基因產(chǎn)生變異，因此，在肌細(xì)胞中，幾乎沒有發(fā)現(xiàn)具有機(jī)能的抗肌萎縮蛋白質(zhì)。因此，在DMD患者體內(nèi)，不能維持肌細(xì)胞的構(gòu)造，大量的鈣離子流入肌細(xì)胞內(nèi)。其結(jié)果，產(chǎn)生與炎癥相似的反應(yīng)，纖維化發(fā)生推進(jìn)，肌細(xì)胞變得難以再生。貝克型肌營養(yǎng)不良癥(BMD)，其產(chǎn)生原因也是抗肌萎縮蛋白基因的變異，但是，其癥狀雖然也呈現(xiàn)出由于肌萎縮而引起的肌力低下，但是通常比DMD輕，肌力低下的進(jìn)展也慢，在多數(shù)情況下，在成人期發(fā)病。DMD與BMD的臨床癥狀的差異，被認(rèn)為是在于，通過變異而在抗肌萎縮蛋白的mRNA向抗肌萎縮蛋白質(zhì)翻譯時的氨基酸的閱讀框被破壞，或者是被維持(非專利文獻(xiàn)I)。即，在DMD的情形，氨基酸閱讀框具有不對齊變異，因此，幾乎沒有發(fā)現(xiàn)具有機(jī)能的抗肌萎縮蛋白質(zhì)，但是在BMD的情形，雖然由于變異外顯子的一部分發(fā)生缺失，但是氨基酸閱讀框被維持，因此，產(chǎn)生了雖然不完全但是具有機(jī)能的抗肌萎縮蛋白質(zhì)。作為DMD的治療方法，可期待外顯子跳躍法。該方法，是通過改變剪接來修復(fù)抗肌萎縮蛋白的mRNA的氨基酸閱讀框，誘導(dǎo)部分恢復(fù)機(jī)能的抗肌萎縮蛋白質(zhì)的表達(dá)的方法(非專利文獻(xiàn)2)。成為外顯子跳躍的対象的氨基酸序列部分會發(fā)生缺失。因此，在該治療中表達(dá)的抗肌萎縮蛋白質(zhì)比正常蛋白質(zhì)短，但是氨基酸閱讀框被維持，因此，使肌細(xì)胞穩(wěn)定化的機(jī)能被部分保持。因此，通過外顯子跳躍，可以期待DMD顯現(xiàn)出與更輕癥的BMD相同的癥狀。外顯子跳躍法，經(jīng)過通過小鼠或狗進(jìn)行的動物實(shí)驗(yàn)，已應(yīng)用于對于人DMD患者的臨床試驗(yàn)。外顯子跳躍，能夠通過5’或3’剪接位點(diǎn)的任一者或兩者、或以外顯子的內(nèi)部作為靶的反義核酸的結(jié)合進(jìn)行誘導(dǎo)。外顯子，僅在兩者的剪接位點(diǎn)通過剪接體復(fù)合物識別的情形會包含在mRNA中。因此，通過使用反義核酸靶向剪接位點(diǎn)，能夠誘導(dǎo)外顯子跳躍。另外，為了使外顯子被剪接機(jī)構(gòu)識別，認(rèn)為對外顯子剪接增強(qiáng)子(ESE)的SR蛋白質(zhì)的結(jié)合是需要的，在靶向ESE時，也能夠誘導(dǎo)外顯子的跳躍。
抗肌萎縮蛋白基因的變異，根據(jù)DMD患者的不同而不同，因此，需要適用于基因變異的場所或種類的反義核酸。至今為止，西澳大利亞大學(xué)的Steve Wilton等制作了對于所有的79個的外顯子進(jìn)行誘導(dǎo)外顯子跳躍的反義核酸(非專利文獻(xiàn)3)、荷蘭的AnnemiekeAartsma-Rus等制作了對于39種類的外顯子進(jìn)行誘導(dǎo)外顯子跳躍的反義核酸(非專利文獻(xiàn)4)。全DMD患者的8%左右，認(rèn)為通過跳躍第53號外顯子(以下，“稱為“外顯子53”)可進(jìn)行治療。近年來，對于以抗肌萎縮蛋白基因的外顯子53作為外顯子跳躍的靶而進(jìn)行的研究，有多個研究機(jī)構(gòu)做出了報告(專利文獻(xiàn)I 4 ;非專利文獻(xiàn)5)。但是，使外顯子53高效地跳躍的技術(shù)，至今尚未確立。專利文獻(xiàn)1:國際公開公報W02006/000057專利文獻(xiàn)2:國際公開公報W02004/048570專利文獻(xiàn)3:美國專利公開公報US2010/0168212專利文獻(xiàn)4:國際公開公報W02010/048586非專利文獻(xiàn)1:Monaco A.P.etal.，Genomics 1988; 2:ρ.90-95。非專利文獻(xiàn)2:Matsuo Μ., Brain Dev 1996; 18:ρ.167-172非專利文獻(xiàn)3:Wilton S.D., etal., Molecular Therapy 2007:15:p.1288-96非專利文獻(xiàn)4:Annemieke Aartsma-Rus et al., (2002) NeuromuscularDisorders 12:S71 - S77非專利文獻(xiàn)5:L inda J.Popplewell et al., (2010)NeuromuscularDisorders, vol.20, n0.2, p.102-10

發(fā)明內(nèi)容
在上述情形下，希望能夠有一種能夠強(qiáng)烈誘導(dǎo)抗肌萎縮蛋白基因的外顯子53跳躍的反義寡聚物及含有該寡聚物的肌營養(yǎng)不良治療藥物。本發(fā)明人等，仔細(xì)研究抗肌萎縮蛋白基因的結(jié)構(gòu)的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在抗肌萎縮蛋白基因的mRNA前驅(qū)體(以下,稱為“pre-mRNA”)中，通過使用反義寡聚物對由外顯子53的5’末端開始的第32 56號周邊的核苷酸構(gòu)成的序列進(jìn)行靶向，能夠高效率地誘導(dǎo)外顯子53的跳躍。本發(fā)明人等，根據(jù)該認(rèn)識，完成了本發(fā)明。S卩，本發(fā)明如下所示。[I] 一種反義寡聚物，其是能夠使人抗肌萎縮蛋白基因的第53號外顯子跳躍的反義寡聚物，其中，其是由與從人抗肌萎縮蛋白基因的第53號外顯子的5’末端開始的第31 53號、第31 54號、第31 55號、第31 56號、第31 57號、第31 58號、第32 53號、第32 54號、第32 55號、第32 56號、第32 57號、第32 58號、第33 53號、第33 54號、第33 55號、第33 56號、第33 57號、第33 58號、第34 53號、第34 54號、第34 55號、第34 56號、第34 57號、第34 58號、第35 53號、第35 54號、第35 55號、第35 56號、第35 57號、第35 58號、第36 53號、第36 54號、第36 55號、第36 56號、第36 57號、或第36 58號的核苷酸構(gòu)成的序列中的任一者互補(bǔ)的堿基序列構(gòu)成。[2]如前述[I]所述的反義寡聚物，其中，其是寡核苷酸。
[3]如前述[2]所述的反義寡聚物，其中，構(gòu)成前述寡核苷酸的至少一個的核苷酸的糖部分和/或磷酸鍵部分被修飾。[4]如前述[3]所述的反義寡聚物，其中，構(gòu)成前述寡核苷酸的至少一個的核苷酸的糖部分是 2，位的-OH 基被從由 OR、R、R，OR、SH、SR、NH2, NHR、NR2, N3, CN、F、Cl、Br、及 I
構(gòu)成的組中選出的任一者的基團(tuán)取代的核糖。(上述R是表示燒基或者芳基,上述R’是表示亞燒基。)[5]如前述[3]或[4]所述的反義寡聚物，其中，構(gòu)成前述寡核苷酸的至少一個的核苷酸的磷酸鍵部分是從由硫代磷酸酯鍵、二硫代磷酸酯鍵、烷基膦酸酯鍵、酰胺磷酸酯(phosphoroamidate)鍵、及硼燒磷酸酯(boranophosphate)鍵構(gòu)成的組中選出的任一者。[6]如前述[1]所述的反義寡聚物，其中，其是嗎啉寡聚物。[7]如前述[6]所述的反義寡聚物，其中，其是二酰胺磷酸酯(phosphorodiamidate)嗎啉寡聚物。[8]如前述[1Γ[7]中任一項所述的反義寡聚物，其中，5’末端是下述化學(xué)式(1) (3)中的任意的基團(tuán)。
權(quán)利要求
1.一種反義寡聚物，其是能夠使人抗肌萎縮蛋白基因的第53號外顯子發(fā)生跳躍的反義寡聚物，其中，其是由與從人抗肌萎縮蛋白基因的第53號外顯子的5’末端開始的第31 53號、第31 54號、第31 55號、第31 56號、第31 57號、第31 58號、第32 53號、第32 54號、第32 55號、第32 56號、第32 57號、第32 58號、第33 53號、第33 54號、第33 55號、第33 56號、第33 57號、第33 58號、第34 53號、第34 54號、第34 55號、第34 56號、第34 57號、第34 58號、第35 53號、第35 54號、第35 55號、第35 56號、第35 57號、第35 58號、第36 53號、第36 54號、第36 55號、第36 56號、第36 57號、或第36 58號的核苷酸構(gòu)成的序列中的任一者互補(bǔ)的堿基序列構(gòu)成。
2.如權(quán)利要求1所述的反義寡聚物，其中，其是寡核苷酸。
3.如權(quán)利要求2所述的反義寡聚物，其中，構(gòu)成前述寡核苷酸的至少一個的核苷酸的糖部分和/或磷酸鍵部分被修飾。
4.如權(quán)利要求3所述的反義寡聚物，其中，構(gòu)成前述寡核苷酸的至少一個的核苷酸的糖部分是 2，位的-OH 基被從由 0R、R、R，OR、SH、SR、NH2、NHR、NR2、N3、CN、F、Cl、f0.、及 I 構(gòu)成的組中選出的任一者的基團(tuán)取代的核糖， 并且，上述R是表示燒基或者芳基，上述R’是表示亞燒基。
5.如權(quán)利要求3或4所述的反義寡聚物，其中，構(gòu)成前述寡核苷酸的至少一個的核苷酸的磷酸鍵部分是從由硫代磷酸酯鍵、二硫代磷酸酯鍵、烷基膦酸酯鍵、酰胺磷酸酯鍵、及硼燒磷酸酯鍵構(gòu)成的組中選出的任一者。
6.如權(quán)利要求1所述的反義寡聚物，其中，其是嗎啉寡聚物。
7.如權(quán)利要求6所述的反義寡聚物，其中，其是二酰胺磷酸酯嗎啉寡聚物。
8.如權(quán)利要求Γ7中任一項所述的反義寡聚物，其中，5’末端是下述化學(xué)式(I) (3)中的任意的基團(tuán)。
9.如權(quán)利要求廣8中任一項所述的反義寡聚物，其中，其是由與從人抗肌萎縮蛋白基因的第53號外顯子的5’末端開始的第32 56號、或第36 56號的核苷酸構(gòu)成的序列互補(bǔ)的堿基序列構(gòu)成。
10.如權(quán)利要求Γ8中任一項所述的反義寡聚物，其中，其是由從序列號2 37構(gòu)成的組中選出的任一者的堿基序列構(gòu)成。
11.如權(quán)利要求廣8中任一項所述的反義寡聚物，其中，其是由從序列號11、17、23、29及35構(gòu)成的組中選出的任一者的堿基序列構(gòu)成。
12.如權(quán)利要求廣8中任一項所述的反義寡聚物，其中，其是由序列號11或35中的任一者的堿基序列構(gòu)成。
13.一種肌營養(yǎng)不良治療用醫(yī)藥組合物，其中，其是以權(quán)利要求1 12中任一項所述的反義寡聚物、該反 義寡聚物的藥學(xué)上可允許的鹽或水和物作為有效成分。
全文摘要
本發(fā)明的目的是提供能夠高效地使人抗肌萎縮蛋白基因的第53號外顯子發(fā)生跳躍的藥劑。本發(fā)明提供能夠使人抗肌萎縮蛋白基因的第53號外顯子發(fā)生跳躍的寡聚物。
文檔編號C07H21/04GK103154245SQ201180042420
公開日2013年6月12日 申請日期2011年8月31日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月1日
發(fā)明者渡邊直樹, 佐藤洋平, 武田伸一, 永田哲也 申請人:日本新藥株式會社, 國立精神·神經(jīng)醫(yī)療研究中心